Gen tedavisi - biyologlar.com

XIII. TPOG Ulusal Pediatrik Kanser Kongresi, Non-Hodgkin Lenfoma
Gen tedavisi
Dr. Ayşe Kars
G
en tedavisi, genetik defektlerin düzeltilmesi amacıyla somatik hücrelere nükleotid dizilerinin aktarımı olarak tanımlanmaktadır, etik açıdan germ hücrelerine genetik madde aktarılması halen tartışmalı
bir konudur. Bu tanıma göre gen tedavisi eksik genlerin yerine
konması, yanlış veya fazla çalışan genlerin susturulması ve bazı
genlerin işlevlerinin değiştirilmesini kapsar. Aslında klinikte
kullanılan ilaçların çoğu gen düzeyinde kontrol sağlamaktadır.
Aspirin ve benzeri non steroidal antiinflammatuar ilaçlar Cox1 ve Cox-2 genlerini inhibe etmekte, ve Cox-2 inhibisyonu ile
tümör proliferasyonu, anjiogenez baskılanmaktadır. Bu özelliği nedeniyle aspirin, kolon kanseri kemoprevansiyonunda
kullanılmaktadır. Kolesterol sentezinde ve Ras onkogeni sinyal iletiminde rol oynayan farnezil transferaz enzimini inhibe
eden ilaçlar lösemi ve akciğer kanserlerinin tedavisinde önem
kazanmaktadır. Son 25 yılda özellikle moleküler biyolojide, rekombinan DNA tekniklerinde kaydedilen gelişmeler, gen tedavisini kuramsal bir kavram olmaktan çıkarıp, uygulanabilir
bir yöntem haline getirmiştir.
Gen tedavisi, kistik fibrozis, Fanconi anemisi gibi tek
gen defektinin söz konusu olduğu kalıtsal hastalıklarda yoğun araştırma konusudur. İlk faz 1 gen tedavisi klinik deneyi 1990’da adenozin deaminaz (ADA) enzim eksikliği olan
bir kız çocuğuna uygulanmıştır. Bu enzimin eksikliğine bağlı
olarak ortaya çıkan “ciddi kombine immün yetmezlik sendromu” çok nadir görülen bir hastalık olmasına karşın, hastalığa neden olan “ADA” geninin klonlanmış olması; genin “in
vitro” koşullarda kolayca aktarılabileceği hematopoietik hücrelerin kemik iliği, hatta çevre kandan kolayca elde edilebilir olmaları; genin aktarıldığı hedef hücre olan T lenfositlerde %10 düzeyinde ekspresyon sağlanması durumunda bile
etkinlik olması ve bu hücrelerin bozuk T lenfositlere göre yaşama şanslarının daha fazla olması ve son olarak bu hastalığın
çok kötü gidişli ve tedavisi olmayan bir hastalık olması gibi
nedenlerle seçilmiştir. Kalıtsal genetik hastalıkların tedavisi
amacıyla 1989-1994 yılları arasında 100 gen tedavisi protokolu onay almıştır. Bunların hepsi faz 1 çalışma niteliğinde
olup, terapötik etkinlikten çok, kullanılan yöntemlerin toksisitesini belirlemeye yöneliktir. Bu çalışmalarda tedavi edilen başlıca genetik hastalıklar; ADA eksikliği, kistik fibrozis,
hemofili B, alfa-1 antitripsin eksikliği, Fanconi anemisi, Gaucher hastalığı, Hunter sendromu ve LDL-reseptör eksikliği
olan ailesel hiperkolesterolemidir.
Gen tedavisi, kalıtsal hastalıklar dışında kardiyomyopatiler, nörolojik hastalıklar, kanser ve AIDS’de uygulanmaktadır,
kanser tedavisine yönelik gen tedavi protokollerinin çoğunluğu oluşturması dikkat çekicidir. Çok aşamalı bir süreç sonunda
çok sayıda gen değişikliğinin birikimiyle ortaya çıkan kanser,
aslında gen tedavi yaklaşımı için uygun bir hedef gibi görünmemektedir. Kanserli hücrelerde mevcut genetik bozukluğu
tümüyle düzeltmek veya organizmada bulunan tüm kanser
hücrelerini hedeflemek var olan teknoloji ile şimdilik olanaksızdır. Bununla birlikte kanserde gen tedavi stratejileri halen
uygulanmakta olan tedavi yöntemlerine destek olmak, etki ve
seçiciliklerini arttırmak gibi hedefler taşımaktadır. Gen tedavisi geliştirme programlarında en çok vektör tasarımında, bunu
izleyerek genin regülasyonu ve immün yanıtın engellenmesinde sorun yaşanmaktadır.
Gen transfer modelleri
Genetik madde hücreye fiziksel, kimyasal yöntemler ve viral vektörler kullanılarak gönderilebilir. Gen tedavi modellerinde en önemli sorun vektörlerin uygun hücreye yönlendirilebilmesidir. Yaygın olarak kullanılan gen transfer sistemlerinin
özellikleri tablo 1’de özetlenmiştir.
DNA ve oligonükleotidler memeli hücrelerine, ex vivo
veya in vivo olarak değişik vektörler kullanılarak yerleştirilebilir. Retrovirüsler, adeno-assosiye virüs (AAV), adenovirüs, herpes simpleks virüs en sık kullanılan virüsler olup, lentivirüsler,
insan sitomegalovirüs, alfa-virüs ve herpesvirüs saimiri geliştirilmekte olan diğer viral vektörlerdir.
Non-viral yöntemler arasında katyonik lipozomlar ve reseptöre yönlendirilen polilizin DNA kompleksleri en çok kullanılan vektör sistemleridir .
Vektör tasarımında emniyetli gen aktarımı, in vivo gen aktarımında etkinliğin sağlanması, transdüksiyondan sonra gen
kontrolünün sağlanması gibi aşılması gereken sorunlar mevcuttur. Kalıtsal hastalıklarda ve kanserde vektör, hücrelere aktarım in vitro ortamda yapıldıktan sonra vücuda verilmektedir
ancak kistik fibroziste inhalasyonla adenovirüslar, katyonik lipozomlar veya AAV gibi vektörler, in vivo olarak akciğere yönlendirilmektedir. In vivo aktarımda yeterli terapötik etki oluşturma konusunda kuşkular mevcuttur.
In vivo gen aktarımında, adenovirüsler, AAV ve lentivirüsler bölünmeyen hücreleri infekte edebilmeleri nedeniyle retrovirüslerin seçiciliğinden yoksun olup kanserli hücrelerin yanısıra normal hücreleri de infekte etme tehlikesi taşırlar. Çeşitli
yöntemlerle vektörlerin seçiciliğinin artırılması ile bu sorunun
üstesinden gelinebilir. Adenovirüslerin konakçıda immün yanıt uyarması aktarılan genin kısa ömürlü olmasına yol açmaktadır.
Lipozomal vektörlerin toksisitesi düşüktür ama DNA’ya
integre olmadıkları için uzun süreli ekspresyon sağlanamamaktadır ve in vivo uygulama güçlükleri vardır.
59
Gen tedavisi
In vitro uygulamalar daha emniyetli olmakla birlikte in
vivo yöntemlere göre dezavantajları vardır. Gen aktarımı yapılacak hücrelerin cerrahi yöntemle çıkarılması, in vitro olarak
hücrenin transdüksiyonu ve daha sonra hastaya verilmesi hasta
açısından rahatsızlık ve ekonomik sorun yaratmaktadır.
Viral vektörler
Retrovirüsler
RNA genomlarının DNA kopyasını ters transkriptaz enzimleri ile sentezleyerek konakçı hücrenin DNA’sına integre
olan retrovirüsler, viral vektörlerin prototipleridir.
Çoğalma yeteneklerinin ortadan kaldırılması için özel yöntemler uygulanmaktadır. Yapısal genler olan gag, pol, env iki
ayrı plazmid üzerinde ve virüsün kendi RNA’sını sentezledikten sonra viral zarfın içine konmasını (paketlenmesini) sağlayan Ψ sekansı olmaksızın yardımcı hücreye gönderilmektedir.
Bu yolla virüsün bağımsız çoğalması engellenirken, yapısal elemanlarını sentezlemesi sağlanır. Transdüksiyonu amaçlanan
gen, Ψ sekansı ile aynı plazmidde yardımcı hücreye gönderildiğinde bu plazmidin taşıdığı genin virüsun zarfı içine girmesi sağlanmaktadır (Şekil 1). Böylece virüsün gerçek bir retrovirüs olarak çoğalması engellenirken istenen geni sentezleyen
bir üretici hücre oluşturulmaktadır. Üretici hücrede retrovirüs vektörler kullanılarak yüksek titrede vektör üretimi başlatılmaktadır.
Adenoviral Vektörler
Retrovirüslerle birlikte en gelişmiş gen aktarım sistemlerinden birini oluştururlar. Çift sarmal DNA virüsleri olup,
genomları 36 kb’dır ve 49 serotipi mevcuttur. Deneysel modellerde ciddi hastalık ve tümör yapmadıkları için vektör sistemlerinde en çok 2. ve 5. serotipler kullanılmaktadır. Adenoviral vektörler, 1990’da ilk gen transfer deneyleri ile birlikte
kistik fibrozisin gen tedavisinde akciğer dokusuna afiniteleri nedeniyle kullanılmışlardır. Bölünmeyen hücrelere genetik
materyali nakletme yetenekleri nedeniyle ailesel hiperkolesterolemide, nörolojik ve kardiyovasküler sistem hastalıklarında
kullanılmaları amacıyla çalışmalar yapılmaktadır. İmmünojeniteleri nedeniyle konakçıda inflammasyon ve toksik tepkilere yol açabilmektedirler. Bu etkilerden sorumlu olan E2 geni
çıkarılarak vektör üretme çalışmaları yapılmaktadır. Adenovirüslerle yüksek titrede vektör oluşturulabilmekte (1012 pfn/ml)
ve 7-8 kb genetik madde taşıyabilmektedirler. Adenovirüs genomundan daha fazla gen çıkarılarak kapasiteleri arttırılmaktadır. Adeno-retrovirüs vektör kimeraları oluşturularak her iki
sistemin avantajları birleştirilmeye çalışılmaktadır.
Adeno-assosiye Virüs
Gen tedavisinde sık kullanılan en küçük virüstür. Küçük olduğu için normalde bile çoğalmak için yardımcı virüse gereksinim duyar ve taşıyabileceği genetik madde küçüktür
(4kb). Bölünmeyen hücrelere genomunu integre edebilmektedir. Normal virüsün 19. kromozom q kolunda özgün integrasyon bölgesi olduğu halde vektör halindeyken bu özellik kaybolmaktadır. Bu bölgeye affinite virüsün kendi genleri olduğu
sürece korunmaktadır. Hepatosit ve nöronlara integre olabilir.
Herpes virüs ve Vaksiniya virüs
Büyük genomik yapıları nedeniyle vektör hazırlanması zor
ve sıkıntılı bir süreçtir. Herpes virüsün nörotrop olması bir seçicilik yaratır. Bu virüslerle gen tedavisi kısa süreli ama yüksek
titrede sağlanabilmektedir. İmmünojeniteleri ve sitopatik özellikleri sınırlayıcı faktörlerdir.
Şekil 1. ψ Sekansı eksikliğinde viral partiküller kapside giremez.
ψ Sekansı ile aynı plazmid üzerinde bulunan gen viral kapside girebilir.
Katyonik lipozomlar ve diğer non viral vektör sistemleri
Retrovirüsler DNA’ya integre oldukları için kalıcı, uzun
süreli infeksiyon sağlamaktadır. Deneysel modellerde retroviral
vektör 108 hücrede transdüksiyon sağlayabilmektedir. Kuramsal olarak retrovirüsün DNA’nın rastgele bir bölgesine integrasyonu mutajenik bir etkiye yol açabilir bu çok nadir görülen
bir durumdur ama gen tedavisi konusunda ciddi engel yaratmıştır. Retrovirüsler konakçıda immün tepki oluşturmadıkları halde kompleman ile hızla yıkılabilirler ve bu özellikleri bir
dezavantaj oluşturmaktadır. Küçük olmaları nedeniyle taşıyabilecekleri genetik madde 4-8 kb kadardır.
Retrovirüsler nükleer membrandan geçemedikleri için sadece bölünen hücrelere integre olabilirler. Retrovirüslerin HIV
dahil bir alt grubu olan lentivirüsler bölünmeyen hücrelere integre olabilmektedirler. Lentivirüslerin çoğalmalarını sağlayan
ve konakçıya zararlı diğer genleri de çıkarıldıktan sonra retrovirüslerle kimerik vektör sistemleri geliştirilebilir. Lentivirüslerin güvenilir bir vektör sistemi haline gelmesi için daha çok çalışmaya gereksinim olduğu bilinmektedir.
60
DNA’ya integre olmadıkları için kısa süreli tedaviler için
uygun olan katyonik lipozomlar değişik işlemlerle sınırsız genetik madde taşıyabilmektedirler. Oligonükleotidlerin taşınmasında kullanılmaktadırlar. Katyonik lipozomlar kistik fibrozis faz 1 çalışmalarda kullanılmıştır. Diğer non-viral vektör
sistemleri reseptör aracılığıyla hücreye girip DNA bağlayan
elemanlar, reseptörleri hedefleyen molekülleri kapsar. İnfeksiyöz olmadıkları için toksisiteleri düşüktür. Düşük titrede ve
geçici gen ekspresyonu yapmaları dezavantajlarıdır. Reseptör
hedefleyen sistemlerin avantajı hedefe seçicilik sağlayabilmeleridir. Örnek olarak folat reseptörlerinin yoğun olarak bulunduğu over kanser hücrelerine yönelik hazırlanan folat kapsayan
vektörler bu tür bir seçicilik örneği oluşturmaktadırlar.
Asialoglikoprotein-polilizin molekülünde, polilizinin pozitif
yükü nedeniyle plazmid DNA bağlama ve asialoglikoproteinin,
sialik asidlerini kaybetmiş proteinler için reseptörleri olan karaciğer hücrelerince bağlanma özellikleri kullanılarak, nonviral bir
vektör sistemi oluşturulmaktadır. Hücreye giren DNA’nın kalı-
XIII. TPOG Ulusal Pediatrik Kanser Kongresi, Non-Hodgkin Lenfoma
A. Kars
cılığının sağlanması hala çözümlenemeyen bir sorundur, bunda
DNA’nın büyük olasılıkla episomal bir yapı olarak taşınması rol
oynamaktadır. Çıplak DNA ise çizgili kasa enjekte edildiğinde
şaşırtıcı olarak 1 yıl süre ile eksprese edilmekte ve kas dokusu bir
gen fabrikası gibi kullanılabilmektedir.
Tablo 1. Başlıca vektör sistemlerinin özellikleri
Vektörler
Özellikler
Dezavantajlar
Retrovirüsler
Yüksek titre (106-107 cfu/ml)
Bölünen hücrelere gen transfer ve
integrasyon oranı yüksek, stabil
ekspresyon .
Toksik etki yok. 4-8 kb transfer
edilebilir.
Rastlantısal insersiyona
bağlı mutajenite olasılığı.
Homolog rekombinasyon
sonucu çoğalabilen virüs
ortaya çıkabilir.
Adenovirüslar
Çok yüksek titre (1010 pfu/ml)
Geçici olarak yüksek düzeyde gen
ekspresyonu.
Bölünmeyen hücreleri infekte
edebilir. 7-8 kb transfer edilebilir.
Konakçıda immün yanıt
uyardığı ve integrasyon
olmadığı için uzun süreli
ekspresyon olmaz.
Genomu komplikedir.
Adeno-assosiye virüsler Bölünen ve bölünmeyen hücreleri
infekte edebilir.
Latent infeksiyon insan 19.
kromozunda, vektörde bu bölgeye
affinite kayboluyor. Patojen ve toksik
değil.
Genom 5kb çok küçük.
Yüksek titrede hazırlamak
zor; yardımcı virüse
(adeno veya herpesvirüs)
gereksinim duyuyor.
Genomik madde taşıma
kapasitesi düşük (4kb).
Lentivirüsler
Bölünmeyen hücreleri infekte
edebilirler. Virüse VSV veya retrovirüs
zarfı takılabilir ve hücre tropizmi
genişletilebilir.
İntegrasyon nedeniyle stabil gen
ekspresyonu (10 kb genomik transfer
mümkün
Serum da HIV-1’e
dönüşebilir. İnsersiyonel
mutagenez olasılığı var.
HIV-1’de olan tat, rev ve
bazı yardımcı proteinlerin
genleri var.
Katyonik Lipozomlar
İnfeksiyöz değil. Toksisitesi düşük.
Aktarılacak DNA kapasitesi teorik
olarak sınırsız.
Hedefe özgüllük yok.
Transfeksiyon düşük ve
geçici, in vivo uygulama
zor.
Kanserde gen tedavisi stratejileri
Kanserin çok aşamalı ve kümülatif özellik gösteren bir süreç sonunda ortaya çıkması ve çok sayıda genomik değişiklik
içermesi gen tedavisi için uygun olmadığı izlenimi vermekle
birlikte, halen gen tedavi protokollerinin büyük çoğunluğu
kanser tedavisinde kullanılmaktadır. Kanser tedavisinde kullanılan başlıca stratejiler tablo 2’de özetlenmiştir.
Tablo 2. Kanserde Gen Tedavisi Stratejileri
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Gen işaretleme
İmmünmodülasyon-Kanser aşıları, polinükleotid immünizasyon
Biyoterapötik gen tedavisi
Normal doku toleransının artırılması
Seçici ilaç aktivasyonu- intihar genleri
Genetik defektin düzeltilmesi
Onkogenler için antisens oligonükleotidler
Tümör baskılayıcı genler için normal gen kopyaları
Kanserli dokularda viral yöntemlerle transdüksiyon normal dokulara göre daha başarılı olmaktadır. Viral vektörler kanserli doku kültürlerinde her yönde kolayca yayılmak18-22 Mayıs 2004
ta ve infekte olmayan hücrelerde de “bystander etki” nedeniyle
ölüm sağlanabilmektedir. Bunun yanısıra tek gen lezyonunun
düzeltilmesi bile oldukça etkili yanıta yol açmakta ve tümörde
gerileme sağlanabilmektedir.
Gen İşaretleme Yöntemi
İlk gen aktarımı deneylerinden olan gen işaretleme yöntemi, T lenfositlere neomisin direnç geninin aktarımını takiben
işaretli hücrelerin izlenmesidir. Bu deney, gen aktarımının sürekliliğinin gösterilmesi açısından önem taşımaktadır ve kemik
iliği aktarımı yapılan hastalarda, özellikle otolog nakillerde relaps durumunda hastalığın aktarılan hücrelerden kaynaklandığının gösterilmesi ve minimal rezidüel hastalığın izlenmesinde yararlı olmuştur.
Genetik İmmünmodülasyon
Tümör immünolojisi konusunda bilgilerin birikimi sonucu, immün sistemin tümör antijenlerini tanıyıp tümör
hücrelerinin öldürülmesini amaçlayan gen tedavi stratejileri
geliştirilmeye başlanmıştır. Bu başlık altında aktif ve pasif immünoterapi bulunmaktadır.
Pasif immünoterapide, tümör hücrelerinin yüzeylerinde tipI HLA molekülerince taşınan peptidler aracılığıyla T-hücre bağımlı hücresel bağışıklık uyarılması kullanılan bir yöntemdir.
Bu küçük protein parçaları, peptid transkripsiyon birimlerinin
vektörler aracılığıyla tümör hücrelerine transdüksiyonu ile sentezlenmektedir. Bu amaçla kanser hücreleri veya tümör infiltre
eden lenfositler in vitro koşullarda hazırlandıktan sonra hastaya
geri verilmektedir. Pasif immünoterapi çalışmaları, lenfositlere
IL-2, IL-12, IFN-γ, TNF, GM-CSF gibi sitokin genlerinin aktarımı ile CD8+ tümör infiltre eden lenfositlerin, antikor/T hücre reseptör kimerik genleri ile transdüksiyonundan sonra tümörlere yönlendirilmeleri konularında yoğunlaşmıştır. Sitokinlerin
sistemik kullanımında hipotansiyon vb. istenmeyen yan etkiler
nedeniyle tümörlü bölgeye yönlendirilen sitokin salınımı hem
yerel etki sağlamakta hem de antitümör etkiyi ve tümöre karşı
immünlojik savunma sistemlerini güçlendirmektedir. Bu amaçla otolog tümör hücreleri, fibroblastlar, tümör infiltre eden lenfositler kullanılmaktadır. GM-CSF hematopoietik öncü hücreleri, antijen tanıtıcı hücre olan dendritik hücrelere dönüştürür
ve immünojeniteyi arttırır. Lenfositlerin, tümör antijenlerini tanıması için antijen-majör doku uygunluk kompleksi (MHC) ile
kostimülatör moleküller, örneğin B7-1 ve 2 etkileşimleri gereklidir. Tümör hücrelerinde bu moleküllerin olmayışı immün yanıtın oluşmasını engeller. Tümör hücrelerinin B7-1 ve 2 ile transfeksiyonu immünojenitelerini arttırmakta kullanılmaktadır.
Tümör antijenlerinin ve onları kodlayan genlerin belirlenmesi ile tümör hücrelerine bu genlerin transfeksiyonu ve dolayısı ile daha immünojenik olmaları sağlanabilmektedir. Bu bir
aktif immünizasyon yöntemidir. Malign melanomda, MART1 antijeni bu amaçla kullanılmaktadır. Sitokinler ve kostimülatör moleküllerde bu amaçla kullanılmakta olmalarına rağmen,
tüm bu yöntemlerin ışınlanmış tümör hücrelerinin verilmesinden daha etkili olduklarına dair veri yoktur.
Normal doku toleransının arttırılması
İlaç direnci ve normal dokuların ilaçlara duyarlı oluşu kemoterapötiklerin başarısız olmalarında en önemli etkenlerdir.
61
Gen tedavisi
Tümör hücrelerini daha yüksek doz ilaçla öldürmek mümkün
olsa bile normal doku toleransının aşılması bu yöntemi geçersiz kılmaktadır. Çoklu ilaç direnç geni (MDRI) hematopoietik kök hücrelere transfekte edildiğinde kemik iliği kemoterapötiklere dirençli hale gelmekte ve yüksek doz ilaç kullanmak
mümkün olmaktadır fakat bu kez ilik-dışı organ toksisitesi sınırlayıcı olabilmektedir.
Seçici ilaç aktivasyonu
Kanser hücrelerine yerleştirilen özel intihar genleri aracılığıyla sistemik olarak verilen ve organizmaya toksik olmayan
ilacın, sadece bu geni taşıyan hücrelerde aktivasyonu ve seçici toksik etki sağlanması stratejisidir. Kemoterapötiklerin klasik uygulanması sırasında normal doku-kanser dokusu arasında seçiciliğin olmaması ve ortaya çıkan yan etkiler bu yöntemi
çekici hale getirmektedir.
En çok kullanılan model herpes simpleks virüs tip I timidin kinaz (HSV-tk) genidir. Çoğalan hücrelere affiniteleri nedeniyle tercihen retrovirüsler kullanılarak kanserli dokulara HSV-tk transfeksiyonu yapıldıktan sonra, memeli timidin
kinaz enziminin iyi bir sübstratı olmadığı için normal dokuda toksik olmayan gansiklovir sistemik olarak verilir. Sistemik
gansiklovir HSV-tk geni olan hücrelerde sitotoksik gansiklovir
trifosfata metabolize olup hücreleri öldürmektedir. Genin bulunmadığı uzak ve yakın kanser hücrelerinin ölmesi, “bystander” etkiye bağlanmaktadır. Uzak hücreler için immünolojik
mekanizmalar, örneğin apoptozise uğrayan kanser hücrelerinin kalıntılarının antijen-sunan hücreler tarafından immün
sisteme tanıtıldığını düşündürmektedir. Bu yöntemin aynı zamanda immünmodülasyon yöntemi olarak çalıştığı öne sürülebilir. Ölen tümör hücrelerine komşu ve transdüksiyonun olmadığı diğer kanser hücrelerinde ise farklı bir “bystander” etki,
toksik metabolitin hücreden hücreye kanallar aracılığı ile geçmesi ile ortaya çıkmaktadır. HSV-tk modeli ile gen tedavisi,
beyin tümörleri, mezotelyoma, akciğer kanseri, kolon kanseri, lenfoma ve lösemilerde uygulanmaktadır. Sitozin deaminaz,
bakteri ve mantarlarda bulunan fakat memelilerde bulunmayan bir enzimdir. 5-fluorositozinin amin grubunu alarak toksik 5-fluorourasil haline getirir. Bu gen de intihar geni olarak
kullanılmaktadır ve tümör hücrelerine yerleştirildiğinde selektif toksisite sağlamaktadır. Bu toksisiteyi daha selektif hale getirmek için bazı yöntemler geliştirilmektedir. Kolon kanser
hücrelerinde bulunan karsinoembryonik antijen (CEA) geninin transkripsiyon kontrol bölgesi ve sitozin deaminaz geni
kullanılarak kimerik gen oluşturulup 5-fluorositozin sistemik
olarak verilerek sadece CEA taşıyan kanser hücrelerinde aktive
olması sağlanmaktadır.
Bu stratejide kullanılan diğer ilaçlar ve enzimler tablo 3’te
özetlenmiştir.
Tablo 3. İntihar genleri
Gen
HSV-tk
Sitozin deaminaz
GPT
VZV-tk
B-laktamaz
62
Toksik metabolit
GCV→GCV trifosfat
5FC→5FU
6-thioguanin→6tg-trifosfat
Ara M→Ara M-MP
Vinka sefaloid→vinka alkaloid
Bystander etki
+
+
+
?
?
Genetik defektin düzeltilmesi stratejisi
• Tümör Baskılayıcı Genler
Mutasyonlar veya kromozomal kopmalar, kayıplar sonucu bazı genlerin eksikliği tümör oluşması sürecinde etkili olabilir veya tümörün hızla büyümesine yol açabilir. Tümör baskılayıcı genler çekinik özellik gösterdiği için söz
konusu genin her iki kopyasının da kaybı gereklidir. Bu durumda kuramsal olarak eksik genin yerine konması bu süreci durdurabilir veya yavaşlatabilir. Bir çok tümörde p53 geninin mutasyonu bilinmektedir, p53 geni 393 aa’ten oluşan bir
fosfoprotein kodlamaktadır ve bu protein büyük-T antijeni
ve EIB gibi viral proteinlerle kompleks oluşturabilmektedir.
Bu kompleksler p53’ün işlevsel olarak etkisiz hale gelmesine
yol açabilmektedirler. Missens mutasyonlar veya p53’ün belli
bölgelerinin çeşitli proteinlerle etkileşimi DNA’ya özgül bir
şekilde bağlanan oligomerlerin ortaya çıkmasına yol açmaktadır. Bu mekanizmaların herhangi birisi p53’ün işlev kaybına ve dolayısıyla transformasyona veya tümörün hızlı büyümesine yol açabilir. Retroviral-p53 vektörleri kullanılarak
akciğer tümör hücre dizilerinde büyümenin baskılandığı çalışmalar bildirilmiştir .
Deneysel tümör modellerinde p53-adenoviral vektörler,
Rb genleri veya p16 gibi tümör baskılayıcı genlerin ürünleri kullanılarak tümör büyümesinin baskılanabildiği bilinmektedir.
Over ve meme kanserinde sıklıkla mutasyona uğrayan BRCA-1 geninin, normal kopyasının gen teknolojisi
ile transferinin sağlandığı modellerde, tümör büyümesinin
baskılandığı veya gerilediği de bildirilmektedir. Bu nedenle
over ve meme kanserinde BRCA-1 ile yürütülen faz 1çalışmalar vardır.
• Aktif onkogenlerin baskılanması
Kanserlerin çoğunda ras, myc, fos gibi dominant onkogenlerde mutasyon veya ekspresyon artışı olduğu bilinmektedir.
Bu genlerin çalışmaları DNA düzeyinde oligonükleotidlerle
üçlü sarmal oluşturularak engellenebilir. Bunun için hedeflenen genlerin regülatör bölgelerine yönelik oligonükletid şeriti
çift sarmal DNA ile bu özgül bölgelerde birleşerek DNA yapısını bozar. Myc, H-ras ve epidermal büyüme faktörü reseptör
geninin başlatıcı kontrol bölgelerine yönelik tripleks-oluşturan
oligonükleotidler kullanılmaktadır. Gen ürünü olan proteinlerin sentezinin baskılanması ise yine antisens oligonükleotidlerle mRNA düzeyinde sağlanmaktadır.
Ribozimler mRNA’yı endoribozomal olarak parçalayan
enzimlerdir. Çekiç başlı ribozimler kıvrılma özellikleri nedeniyle bu şekilde adlandırılırlar, ve hedef RNA’yı GUA, GUC
veya GUU kodonlarının bittiği yerden parçalarlar. Ribozimlerle hedeflenen dominant onkogenler H-ras ve bcr-abl füzyon
geni mRNA’ larıdır.
Endoplazmik retiküluma yerleştirilen tek zincirli antikor
molekülleri ile hedef proteinler tutulup, hücre yüzeyine erişmeleri engellenerek otokrin büyüme faktör döngüsü ve dolayısıyla tümör büyümesi engellenebilir. Çeşitli büyüme faktörlerinin hücre düzeyinde reseptörlerinin sentezini mutasyonlu
gen kopyaları ile bozmak benzer bir yaklaşımdır.
XIII. TPOG Ulusal Pediatrik Kanser Kongresi, Non-Hodgkin Lenfoma
A. Kars
Gen tedavisinde vektörün hedefe yönlendirilmesi ve
seçicilik
Mevcut vektörlerin gelişme aşamaları ve çeşitleri tedavide etkin bir şekilde kullanılmaları için yeterli değildir. Bunu
sağlamak için, vektörün hedefe yönlendirilmesi, dokuya özgül promoterler kullanılması, vektörün verilme yolu, reseptörlerin modifikasyonu gibi aşamalarda yoğun çalışmalar yapılmaktadır.
Viral vektörlerin, doku tropizminden kaynaklanan seçiciliklerinden yararlanılmaktadır. Adenovirüsler akciğer epiteli ve
karaciğer parankimine yönelik tropizm gösterirler. Retrovirüslerin doku tropizmi yoktur ama bölünen hücrelerin DNA’sına
integre olmaları nedeniyle seçicilik göstermektedirler. Herpes
simpleks virüsü birçok hücreyi infekte eder ama nöronlardaki infeksiyonları uzun süreli olmaktadır. Retrovirüslerin zarflarında değişiklikler yapılarak hedef hücrelere affiniteleri arttırılabilir.
Non-viral vektörlerin özgüllükleri moleküler konjugatlar
ve protein/DNA kompleksleri kullanılarak arttırılabilir. Folat
reseptörünü eksprese eden over kanser hücrelerine yüzeyinde
folat bulunan vektörler kullanılarak seçicilik arttırılabilir.
Asialoglikoprotein-polilizin molekülünde, asialoglikoproteinin, sialik asidlerini kaybetmiş proteinler için reseptörleri olan karaciğer hücrelerince bağlanma özellikleri kullanılarak, nonviral seçici bir vektör sistemi oluşturulmuştur.
EGF/DNA kompleksleri, yüzeylerinde epidermal büyüme
faktörü reseptörü taşıyan akciğer kanseri hücreleri tarafından hızla tutulur, burada reseptör aracılığıyla olan endositoz söz konusudur.
Dokuya özgül promoterler kullanılarak hedefe yönlendirme daha etkili hale getirilebilmektedir. Kanser hücrelerine özgül CEA, AFP ve benzeri tümör belirleyicilerin promoter
bölgeleri, intihar genleri olan TK, CD ile kimerik gen oluşturularak hedefe gönderilir. Bu genler seçici olarak tümör belirleyicilerin promoter bölgelerini aktif hale getiren transkripsiyon
faktörleri ve proteinleri sitoplazmalarında barındıran kanser
hücrelerinde çalışır duruma geçebilirler.
Vektörlerin veriliş yolu ile seçicilik sağlamanın örnekleri,
beyin tümörlerinde intrakraniyal, akciğer kanseri ve mezotelyomada, intraplevral ve over kanserinde intraperitoneal yolun
kullanılmasıdır.
Gen tedavisi ve kanserin ilaçlarla tedavisinde, ilacın verilmesi, hedefe ulaşması, seçiciliği ve etkisi gibi bazı ortak sorunlar vardır. Bu sorunlar kanserin genetik kökenleri ve kanser
hücresinin biyolojisinin anlaşılmasıyla daha kolay aşılabilecektir. Bu konuda çalışmaların vektör tasarımı teknolojisine yoğunlaşmış olması, vektörlerin transgenlerini daha çok tümör
hücresine aktarmalarını sağlamak ve tümör hücrelerinde tedavinin seçiciliğini arttırmayı hedeflemektedir. Bununla birlikte
vektörler, gen transferi ve ekspresyonu konusunda bilinmeyenler, bilinenlerden daha fazladır.
Sonuç olarak gen tedavisinin genel kabul gören tıbbi tedavi konumuna gelmesi için:
1. Vektör raftan alınıp hastaya injekte edilebilmeli ve bu
vektör metabolik bozukluğun bulunduğu dokuya hedeflenmiş olmalıdır.
2. Vektör hücreye ulaştığı zaman ya kromozomda emniyetli bir bölgeye yerleşmeli veya bozuk gen ile homolog
rekombinasyon sonucu doğru yere oturmalıdır.
3. Aktarılan gen metabolik değişikliklere uygun yanıt verebilmelidir. Örnek olarak kan şekeri değişikliklerine
uygun yanıt verecek insülin genleri gibi.
Bu koşullar sağlandığı zaman gen tedavisi, ilaç tedavisinin
yüksek teknolojik uygulaması haline gelecektir. Tüm güçlüklere ve bilinmeyenlere karşın önümüzdeki yüzyıl gen tedavisinin
yaygın kullanılacağı bir dönem olmaya adaydır.
Kaynaklar
1. Berns A. Good news for gene therapy N Engl J Med 350;16791680,2004
2. Kay MA, Glorioso JC, Naldini L. Viral vectors for gene therapy: the art
of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Med
7:33-40, 2001
3. Marchisone C, Pfeffer U, Del Grosso F ve ark. Progress towards gene
therapy for cancer. J Exp Clin Cancer Res 19(3): 261-270, 2000
4. Rustgi AK. Cyclooxygenase-2: the future is now. Nature Med 4:773774, 1998
5. Brenner MK. Gene Transfer and the treatment of haematological
malignancy. J Int Med 249:345-358,2001
6. Dilber MS & Gahrton G. Suicide gene therapy: possible applications
in haematopoietic disorders. J Int Med 249:359-367,2001
Gen tedavisinin etik yönü ve geleceği
Halen gen aktarımı germ hücrelerine değil, somatik hücrelere yöneliktir. Genel olarak in vitro koşullarda aktarılan geni
taşıyan hücreler hastaya daha sonra verilmektedir. Tedavi olanağı kısıtlı veya olmayan ciddi hastalıkların gen tedavisi etik
kurallara uymaktadır. Genetik hastalıkların tedavisinde germ
hücrelerinin manipülasyonu durumunda kişinin genetik yapısının parçası olacak bu değişiklik çocuklarına da aktarılacaktır,
bu sakıncalı olabilir.
Genetik mühendislik yöntemleri ile somatik hücrelerde ve
hatta germ hücrelerinde yapılabilecek değişikliklerle boy, göz
rengi ve zeka gibi özelliklerle oynamak ilerde mümkün olabilir
ama bu tür yaklaşımın yoğun tartışmalara yol açacağı kesindir.
Gen tedavisinin somatik hücrelere yönelik ve ciddi hastalıklarla sınırlı kalması bugün için en uygun durumdur.
18-22 Mayıs 2004
63