PVA-Aljinat Küreler Üzerine α-Amilaz Enziminin İmmobilizasyonu

Tralleis Elektronik Dergisi
http://dergi.etralleis.com
e-TRALLEIS
1 (2013) 45-50
©ADÜ
PVA-Aljinat Küreler Üzerine α-Amilaz Enziminin İmmobilizasyonu
Murat UYGUN1, Deniz AKTAŞ UYGUN2, Arife Alev KARAGÖZLER2
1
Adnan Menderes Üniversitesi Koçarlı Meslek Yüksekokulu
Bitkisel ve Hayvansal Üretim Bölümü, Aydın
2
Adnan Menderes Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü, Aydın
ESER BİLGİSİ
Araştırma Makalesi – Fen Bilimleri
Sorumlu Yazar: Murat UYGUN, [email protected]
Yayına Kabul Tarihi: 12 Aralık 2012
Özet: Yapılan bu çalışmada Aspergillus oryzae α-amilaz enzimi PVA-aljinat kürelere immobilize edilmiştir. Serbest ve
immobilize α-amilaz aktivitesi üzerine pH’ın etkisi incelenmiş ve optimum pH’lar sırasıyla 6.0 ve 7.0 olarak bulunmuştur.
Serbest ve immobilize enzimin optimum sıcaklığı 60 °C olarak ölçülmüştür. Buna ek olarak serbest ve immobilize α-amilazın
kinetik parametreleri ve enzimin tekrar kullanılabilirliği araştırılmıştır. Serbest α-amilazın Km değeri 2.71 mg mL-1 iken
immobilize α-amilazın Km değeri 0.41 mg mL-1 olarak bulunmuştur. Serbest ve immobilize α-amilazın Vmax değeri sırasıyla
9.24 x 10-5 U mg-1 ve 5.94 x 10-5 U mg-1 olarak belirlenmiştir. PVA-aljinat kürelere tutuklanmış α-amilaz tekrar
kullanılabilirliği incelendiğinde immobilize α-amilazın 10 döngü boyunca kullanımı sonunda başlangıç aktivitesinin %
76’sını koruduğu görülmüştür.
Anahtar Sözcükler: α-amilaz, immobilizasyon, PVA, aljinat, tutuklama
Immobilization of α-Amylase onto PVA-Alginate Beads
Abstract: Aspergillus oryzae -amylase was immobilized onto PVA-alginate beads. The effects of pH on activities of free
and immobilized -amylase were investigated and optimum pH were found to be 6.0 and 7.0 respectively. The optimum
temperature for both free and immobilized enzyme was measured as 60 °C. Kinetic parameters for free and immobilized amylase along with the reusability of the enzyme were also investigated. Free -amylase showed Km of 2.71 mg mL-1,
whereas immobilized -amylase showed Km of 0.41 mg mL-1. Vmax values of free and immobilized -amylases were found
to be 9.24x10-5 U mg-1 and 5.94x10-5 U mg-1 respectively. The -amylase entrapped in PVA-alginate beads could be reused
and retained 76 % activity at the end of ten cycles.
Key words: -amylase, immobilization, PVA, alginate, entrapment
Giriş
yolu ile immobilize edilebilirler (Varavinit ve ark.,
2002).
Enzimlerin immobilizasyonu, enzimleri katalitik
aktivitelerinin korunması şartı ile belirli bir alan
içerisinde fiziksel olarak hapsetmek veya sınırlamak
yoluyla tekrar ve sürekli olarak kullanılabilmelerini
sağlamak işlemi olarak tanımlanabilir. Doğal formları
ile karşılaştırıldığında immobilize enzimler daha
yüksek bir kararlılık, daha kolay ürün ve enzim
kazanımı, enzimin tekrar kullanılabilme olasılığı ve
reaksiyonun hızlı sonlanması gibi avantajlara sahiptir.
Enzimler
çeşitli
taşıyıcılara
tutuklama,
adsorpsiyon,iyonik bağlanma ve kovalent bağlanma
Enzim
immobilizasyonunda
kullanılan
çeşitli
materyaller bulunmaktadır. Bu destek materyalleri jel
matriks, membran formunda polimerik veya inorganik
katı, partikül veya mikroküre formunda bulunabilirler
(Aksoy ve ark., 1998). Aljinat mannurik ve guluronik
asit birimlerinden meydana gelen doğal bir
polimerdir. Kolay ulaşılabilir oluşu ve düşük maliyeti
nedeniyle immobilizasyon matriksi olarak yaygın bir
45
şekilde kullanılmaktadır. Ayrıca aljinat enzimlere
inert sulu bir ortam sağlaması ve geniş gözenekleri
sayesinde moleküllerin hızlı difüzyonuna izin vermesi
nedeniyle tercih edilen bir enzim immobilizasyon
destek materyalidir (Kumar ve ark., 2006).
α-Amilazın İmmobilizasyonu
α-amilaz PVA-aljinat küreler üzerine tutuklanma
metodu ile immobilize edilmiştir. Bu amaçla, PVA (%
10.0’luk w/v)-aljinat (%1.0 w/v) karışımının 4.5
mL’si 0.5 mL α-amilaz çözeltisi (20.0 mg/mL) ile
karıştırılmıştır. Karışım daha sonra borik asit (% 7.5
w/v)-CaCl2 (% 2.0 w/v) çözeltisinin 25 mL’sine bir
enjektör yardımı ile damlatılmıştır. Oluşan kürecikler
+ 4 °C’de 24 saat olgunlaştırılmış ve distile su ile
yıkanarak kullanılmıştır.
Polivinil alkol (PVA) enzim immobilizasyonunda
sıkça kullanılan, toksik olmayan, ucuz ve sentetik bir
materyaldir. PVA’e immobilizasyon basit ve ucuz
olan PVA-borik asit metodu ile gerçekleştirilir. Bu
metodun tek dezavantajı çökmeye meyilli oluşudur.
Bu dezavantaj ortama aljinat eklenmesi ile
giderilebilmektedir (Idris ve ark., 2008).
Serbest ve İmmobilize α-Amilazın Aktivite Ölçümleri
Serbest ve immobilize α-amilazın aktivitesi DNS
metodu ile saptanmıştır (Bernfeld, 1955). Bu amaçla
α-amilaz aktivitesi için, 0.5 mL α-amilaz çözeltisi 0.5
mL nişasta çözeltisi ile
(% 1.0 w/v; 20 mM pH 6.9
fosfat tamponunda) karıştırılmış ve 25 °C’de 3 dakika
inkübe edilmiştir ve 1.0 mL DNS reaktifinin
eklenmesi ve ardından kaynayan suda 5 dakika ısıtma
ile enzimatik reaksiyon durdurulmuştur. Karışımın
soğutulmasından sonra, karışıma 10.0 mL distile su
ilave
edilmiş
ve
karışımın
absorbansı
spektrofotometrik
(Shimadzu
UV-Vis
Spectrophotometer, Model 1601) olarak ölçülmüştür.
Kontrol denemesi olarak yukarıdaki işlem enzim
çözeltisi olmaksızın tekrarlanmıştır. İmmobilize αamilaz aktivitesi için enzim çözeltisi yerine 30 adet
immobilize α-amilaz küreciği kullanılmıştır. Bir ünite,
25 °C’de dakikada 1.0 µmol indirgen şeker üretmek
için gerekli enzim miktarı olarak tanımlanmıştır.
Spesifik aktivite aktivitenin protein miktarına (mg)
bölünmesi ile bulunmuştur.
α-amilaz
(EC
3.2.1.1;
1,4-α-D-glukan
glukanohidrolaz)
nişasta
ve
diğer
benzer
karbohidratlardaki α-1,4 glikozidik bağlarının
hidrolizini katalizler. Etanol ve yüksek fruktozlu mısır
şurubu üretiminde, deterjanlarda, tekstil endüstrisinde,
modifiye nişasta üretiminde ve kağıt endüstrisinde
sıkça kullanılır (Kumar ve ark., 2006).
Literatürde α-amilazın çeşitli tiplerde destek
materyallerine immobilizasyonuna ilişkin çalışmalar
bulunmaktadır (Aksoy ve ark., 1998; Kumar ve ark.,
2006; Tripathi ve ark., 2007; Tien ve Chiang, 1999;
Shewale ve Pandit; 2007, Kara ve ark., 2005; Saville
ve ark., 2004; Reshmi ve ark., 2007). Bu çalışmada, αamilaz enzimi tutuklama metodu ile PVA aljinat
küreciklere immobilize edilmiştir. Serbest ve
immobilize α-amilaz aktivitesi üzerine pH’ın etkisi
incelenmiş, söz konusu enzimin optimum sıcaklığı,
kinetik parametreleri ve tekrar kullanılabilirliği
araştırılmıştır.
Serbest ve İmmobilize α-Amilaz Aktivitesi Üzerine
pH’ın ve Sıcaklığın Etkisi
pH ve sıcaklık enzim aktivitesi etkileyen en önemli
parametrelerdendir. Serbest ve immobilize α-amilaz
üzerine pH’ın etkisi pH 3.0-9.0 aralığında
incelenmiştir. Bu amaçla, substrat çözeltileri farklı
pH’lardaki asetat tamponu (100 mM, pH 3.0-5.0),
fosfat tamponu (100 mM, pH 6.0-8.0) ve karbonat
tamponu içinde (100 mM, pH 9.0) hazırlanmış ve
yukarıda anlatıldığı şekilde aktivite ölçümleri
yapılmıştır. En yüksek spesifik aktivite 100 kabul
edilerek % aktivite değerleri bulunmuştur. pH
değerlerine karşılık % aktivite grafikleri çizilerek
Materyal ve Yöntem
Kimyasallar
α-amilaz (Aspergillus oryzae’den), aljinik asit sodyum
tuzu, kalsiyum klorür, PVA, borik asit, nişasta, DNS
(3,5-dinitrosalisilik
asit)
Sigma
Firmasından
(Steinheim, Almanya), diğer tüm kimyasallar ise
Merck Firmasından (Darmstadt, Almanya) temin
edilmiştir.
46
M. UYGUN, D. A. UYGUN, A. A. KARAGÖZLER
serbest ve immobilize α-amilaz için optimum pH
değerleri saptanmıştır.
Serbest ve İmmobilize α-Amilaz Aktivitesi Üzerine
pH’ın ve Sıcaklığın Etkisi
Serbest ve immobilize α-amilazın optimum pH
grafikleri Şekil 1’de gösterilmiştir. Görüldüğü üzere,
serbest ve immobilize α-amilazın optimum pH’ları
sırasıyla 6.0 ve 7.0 olarak bulunmuştur. Bilindiği gibi
poliiyonik matriksler optimum pH değerlerinde bir
kaymaya yol açan enzim mikroçevresi ile yığın fazı
arasında proton dağılımına neden olur (Kobayashi ve
ark., 1992). α-amilazın PVA-aljinat üzerine
immobilizasyonu sonucu bazik bölgeye doğru 1.0
birimlik bir kayma meydana gelmiştir. Bu kayma
matriksin yüküne bağlıdır ve bu çalışmadaki bazik
bölgeye kayma PVA-aljinat matriksinin polianyonik
karakterinden kaynaklanmaktadır.
Serbest ve immobilize α-amilaz için farklı sıcaklarda
(4-75 °C) aktivite ölçümleri yapılmıştır. Serbest ve
immobilize α-amilaz için sıcaklıklara karşı % aktivite
grafikleri çizilmiş ve optimum sıcaklık değerleri
belirlenmiştir.
Kinetik Parametreler
Serbest ve immobilize α-amilaz aktivitesine substrat
derişiminin etkisinin araştırılması için farklı
derişimlerde (0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 2.50,
5.00, 7.50, 10.0 mg mL-1) nişasta çözeltisi hazırlanmış
ve bu çözeltilerde aktivite ölçümleri yapılmıştır.
Aktivite ölçümlerinden yararlanarak serbest ve
immobilize enzime ait Lineweaver-Burk grafikleri
çizilmiş ve bu grafikler kullanılarak serbest ve
immobilize α-amilaz için Vmax ve Km kinetik sabitleri
bulunmuştur.
İmmobilize α-Amilazın Tekrar Kullanılabilirliği
İmmobilize α-amilazın tekrar kullanılabilirliğinin
incelenmesi için immobilize α-amilaz ile 10 kez
aktivite ölçümü yapılmıştır. Bunun için substrat içeren
ortama immobilize α-amilaz ilave edilmiş ve yukarıda
anlatıldığı şekilde aktivite ölçümleri yapılmıştır.
İmmobilize α-amilaz her bir aktivite ölçümünden
sonra tampon çözelti ile yıkanmış ve tekrar aktivite
ölçümleri için kullanılmıştır. Döngü sayısına karşılık
% aktivite grafiği çizilerek immobilize α-amilazın
tekrar kullanılabilirliği incelenmiştir.
Şekil 1. Serbest ve immobilize α-amilaz üzerine ortam
pH’ının etkisi.
Hem serbest ve hem de immobilize enzimin optimum
sıcaklığı 60 °C olarak okunmuştur (Şekil 2). αamilazın optimum sıcaklığı immobilizasyon ile
değişmemiştir. Şekil 2’den de görüldüğü üzere,
immobilize
α-amilaz
serbest
formu
ile
karşılaştırıldığında test edilen tüm sıcaklıklarda daha
kararlıdır. Bu sonuçlar immobilizasyonun enzim
kararlılığını sıcaklık değişimlerine karşı arttırdığını
göstermektedir.
Protein Tayini
Deneylerdeki protein tayinleri Bradford (1976)
yöntemine göre yapılmıştır. Bu yöntem için piyasadan
hazır alınan Bradford boya çözeltisi kullanılmıştır. Bu
amaçla örnek tüpüne 2.5 mL boya çözeltisi ve 50 µL
örnek çözeltisi, kontrol tüpüne ise 2.5 mL boya
çözeltisi ve 50 µL saf su eklenerek vortekslenmiştir.
İki dakika beklenerek 595 nm’de absorbans okuması
yapılmıştır. Okunan absorbanslara karşılık gelen
protein derişimleri kalibrasyon grafiğinden elde
edilmiştir.
Bulgular ve Tartışma
47
Şekil 2. Serbest ve immobilize α-amilaz üzerine sıcaklığın
etkisi.
M. UYGUN, D. A. UYGUN, A. A. KARAGÖZLER
daha avantajlı kılar (Hung ve ark., 2003). Bu
çalışmada immobilize α-amilaz enziminin tekrar
kullanılabilirliği ard arda aktivite ölçümleri yapılarak
belirlenmiş ve immobilize α-amilaz enziminin 10
döngüden sonra aktivitesinin sadece % 24’ünü
kaybettiği görülmüştür (Şekil 5). İmmobilize
enzimlerin aktivitelerinde önemli bir azalma olmadan
gösterdikleri bu tekrar kullanılabilirlik özelliği,
endüstriyel uygulamaların ekonomisi açısından
oldukça önemlidir.
Enzim destek materyaline kimyasal olarak bağlı
olmadığı ve bu polimer yapısı yüksek miktarda su
sağladığı için kendi üç-boyutlu yapısını korumaktadır.
Bu nedenle immobilizasyon işlemi sonucu optimum
parametreler dramatik olarak değişmemektedir
(Yabushita, 1988).
Kinetik Parametreler
Enzimler bir desteğe immobilize edildiklerinde
desteğin doğası, sistemin heterojenliği ve substratın
enzime ulaşılabilirliği gibi faktörler nedeniyle kinetiği
farklılaşır. Yapılan bu çalışmada, serbest ve
immobilize α-amilazın Lineweaver-Burk grafikleri
çizilmiş (Şekil 3; Şekil 4) ve serbest ve immobilize αamilazın Vmax değerleri sırasıyla 9.24 x 10-5 U mg-1 ve
5.94 x 10-5 U mg-1 olarak bulunmuştur. Serbest
enzimin katalizlediği reaksiyonun maksimum hızının,
immobilize enzimin katalizlediği reaksiyonun
maksimum hızından büyük olması genellikle beklenen
ve gözlenen bir durumdur (Zhou ve ark., 2010). Vmax,
enzimin tümü substratına doygun olduğundaki olası
en yüksek hızdır ve bu parametre immobilize enzimin
gerçek özelliklerini yansıtır fakat difüzyonel
sınırlamalardan etkilenir (Reshmi ve ark., 2007).
Yapılan bu çalışmada serbest ve immobilize α-amilaz
enzimlerinin Km değerleri sırasıyla 2.71 mg mL-1 ve
0.41 mg mL-1 olarak bulunmuştur. Km değeri bir
enzimin substratına olan ilgisi olarak bilinir (Park ve
ark., 2005) ve immobilizasyondan sonra genellikle
Km’de bir artış beklenir. Ancak bu çalışmada tersi bir
durum yani Km değerinde bir azalma (yaklaşık 5 kat)
görülmektedir. Km değerindeki bu azalma substrat ve
polimer
materyali
arasındaki
elektrostatik
etkileşimlerden
ve
difüzyonel
etkilerden
kaynaklanmış
olabilir.
Bununla
beraber
immobilizasyon sonunda enzimin üç boyutlu
yapısında meydana gelebilecek değişimler de enzim
aktivitesi üzerine olumlu yönde etki gösterip Km
değerini azaltabilir (Kara ve ark., 2006; Demirel ve
ark., 2006).
Şekil 3. Serbest α-amilaza ait Lineweaver-Burk grafiği.
Şekil 4. İmmobilize α-amilaza ait Lineweaver-Burk grafiği.
İmmobilize α-Amilazın Tekrar Kullanılabilirliği
İmmobilize enzimlerin tekrar kullanılabilirliği, seçilen
taşıyıcının ya da metodun etkinliğini değerlendirmede
oldukça önemlidir. Ayrıca, tekrar kullanılabilirlik
ekonomik açıdan ve kararlılığın korunması
bakımından immobilize enzimleri serbest enzimlerden
Şekil 5. İmmobilize α-amilazın tekrar kullanım kapasitesi.
48
M. UYGUN, D. A. UYGUN, A. A. KARAGÖZLER
Sonuç
(IPNs) for entrapment of glucose isomerase. Reactive and
Bir canlı hücreden enzim izolasyonu ve saflaştırılması
oldukça pahalı süreçlerle yapılmaktadır. Bu nedenle
enzimler genellikle pahalıdır ve endüstriyel
uygulamalarda
serbest
enzimin
aktivitesini
kaybetmeden geri kazanılması oldukça zordur. Serbest
enzimin reaksiyon ortamından istenildiği anda
uzaklaştırılamaması
reaksiyonun
kontrolünü
güçleştirir. Serbest enzimi reaksiyon ortamında etkisiz
hale getirebilmek için kullanılan inhibitörler ise
serbest enzim tarafından kirletilen reaksiyon
ürünlerine yeni bir kirlilik unsuru olarak eklenir.
Reaksiyon ortamındaki bu kirlilik unsurlarının
uzaklaştırılmaya çalışılması maliyeti artırmaktadır.
Bunun yanı sıra serbest enzimler sürekli üretim
işlemlerinde de tercih edilmezler. Enzimlerin birçok
alanda çeşitli amaçlarla kullanılmaya başlanması
nedeniyle, enzimleri daha ekonomik ve kullanışlı hale
getirme çalışmaları artmıştır. Bu nedenle serbest
enzimlerden daha fazla yararlanabilmek için
immobilizasyon teknikleri geliştirilmiştir.
Çalışmadan elde edilen bulgular immobilizasyondan
sonra immobilize α-amilazın optimum pH’ı bazik
bölgeye doğru 1.0 pH birimi kayarken optimum
sıcaklığın değişmediğini göstermiştir. İmmobilize αamilazın Km değeri serbest enziminkinden düşük
bulunmuştur. Serbest α-amilaz için Vmax 9.24 x 10-5 U
mg-1’dır ve bu değer immobilizasyondan sonra 5.94 x
10-5 U mg-1’a düşmüştür. PVA-aljinat kürelere
tutuklanan α-amilaz tekrar kullanılabilmektedir ve 10
döngü sonunda başlangıç aktivitesinin % 76’sını
korumaktadır.
Functional Polymers, 66: 389-394.
Hung, T.C., Giridhar, R., Chiou, S.H., Wu, W.T. 2003. Binary
immobilization of Candida rugosa lipase on chitosan.
Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 26: 69-78.
Idris, A., Zain, N.A.M., Suhaimi, M.S. 2008. Immobilization of
Baker's yeast invertase in PVA–alginate matrix using
innovative
immobilization
technique.
Process
Biochemistry, 43: 331-338.
Kara, A., Osman, B., Yavuz, H., Besirli, N., Denizli A. 2005.
Immobilization
of
α-amylase
Cu2+
on
chelated
poly(ethylene glycol dimethacrylate-n-vinyl imidazole)
matrix via adsorption. Reactive & Functional Polymers,
62: 61-68.
Kara, F., Demirel, G., Tümtürk, H. 2006. Immobilization of urease
by using chitosan–alginate and poly(acrylamide-co-acrylic
acid)/κ-carrageenan supports. Bioprocess and Biosystems
Engineering, 29: 207-211.
Kobayashi, T., Miyama, H., Kawata, S., Nosaka, Y., Fujii, N.
1992. Immobilization of enzymes on electrostatic medium
of positively charged dimethylamino nylon gel. Journal of
Applied Polymer Science, 46: 2183-2188.
Kumar, R.S.S., Vishwanath, K.S., Singh, S.A., Rao, A.G.A. 2006.
Entrapment of α-amylase in alginate beads: Single step
protocol for purification and thermal stabilization. Process
Biochemistry, 41: 2282-2288.
Park, D., Haam, S., Jang, K., Ahn, I.S., Kim, W.S. 2005.
Immobilization of starch-converting enzymes on surfacemodified carriers using single and co-immobilized
systems: properties and application to starch hydrolysis.
Process Biochemistry, 40: 53-61.
Reshmi, R., Sanjay, G., Sugunan, S. 2007. Immobilization of αamylase on zirconia: A heterogeneous biocatalyst for
KAYNAKLAR
starch hydrolysis. Catalysis Communication, 8: 393-399
Aksoy, S., Tumturk, H., Hasirci, N. 1998. Stability of α-amylase
Saville, B.A., Khavkine, M., Seetharam, G., Marandi, B., Zuo,
immobilized on poly(methyl methacrylate-acrylic acid)
Y.L.
microspheres. Journal of Biotechnology, 60: 37-46.
immobilized amylase and cellulase. Applied Biochemistry
Bernfeld, P. 1955. Amylase alpha and beta. Methods in
2004.
Characterization
and
performance
of
and Biotechnology, 113: 251-259.
Enzymology, 1: 149-158.
Shewale, S.D., Pandit, A.B. 2007. Hydrolysis of soluble starch
Bradford, M. 1976. A rapid and sensitive method for the
using Bacillus licheniformis α-amylase immobilized on
quantitation of microgram quantities of protein utilizing
superporous CELBEADS. Carbohydrate Research, 342:
the
997-1008.
principle
of
protein-dye
binding.
Analytical
Biochemistry, 72: 248–254.
Tien, C.J., Chiang, B.H. 1999. Immobilization of α-amylase on a
Demirel, G., Ozcetin, G., Sahin, F., Tumturk, H., Aksoy, S.,
zirconium dynamic membrane. Process Biochemistry, 35:
Hasirci, N. 2006. Semi-interpenetrating polymer networks
377-383.
49
M. UYGUN, D. A. UYGUN, A. A. KARAGÖZLER
Tripathi, P., Kumari, A., Rath, P., Kayastha, A.M. 2007.
Yabushita, I. 1988. Studies on the properties of immobilized
Immobilization of α-amylase from mung beans (Vigna
urokinase: effects of pH and temperature. Biotechnology
radiata) on Amberlite MB 150 and chitosan beads: A
comparative study.
and Applied Biochemistry, 10: 294-300.
Journal of Molecular Catalysis B:
Zhou, Z-D., Li, G-Y., Li, Y-J. 2010. Immobilization of
Enzymatic, 49: 69-74.
Varavinit,
S.,
Saccharomyces cerevisiae alcohol dehyrogenase on hybrid
Chaokasema,
Immobilization
of
a
N.,
Shobsngob,
thermostable
S.
2002.
alginate-chitosan
alpha-amylase.
beads.
International
Biological Macromolecules, 47: 21-26.
ScienceAsia, 28: 247-251.
50
Journal
of