PLEVRAL SIVI ANAL‹Z‹ –5 Genetik Tan› Çal›flmalar›

PLEVRAL SIVI ANAL‹Z‹ –5
Genetik Tan› Çal›flmalar›
Metin GÖRGÜNER
Plevra hastal›klar›, son y›llarda gelifltirilen birçok tan›sal yönteme ra¤men hâlâ önemli bir sorun olarak devam etmektedir. Özellikle plevral efüzyonlar›n
ay›r›c› tan›s›nda, baz› durumlarda zorluklarla karfl›lafl›labilmektedir. Örne¤in,
malign ya da benign s›v› ayr›m›nda yaln›zca morfolojik inceleme baz›nda sitolojinin tan›sal do¤rulu¤u her zaman yeterli olmamaktad›r. Akci¤er kanserinin tan›s› biyopsi ya da plevral efüzyon gibi örneklerde farkl› hücre tiplerinin varl›¤› nedeniyle ço¤u kere zor olmaktad›r. Ayn› flekilde, mezotelyoma,
primer adenokarsinoma ve plevral metastazlar›n ay›r›c› tan›s› immünohistokimyasal tan› yöntemlerine ra¤men zordur. ‹nfeksiyon orijinli efüzyonlar da
ayr› bir problemdir.
‹nsan kromozomlar›n›n ilk olarak 1879 y›l›nda Arnold taraf›ndan bölünen tümör hücrelerinde gösterilmesinden sonra genetik biliminde çok önemli ilerlemeler kaydedilmifltir. 1956’da Melander ve arkadafllar›n›n metastatik over sistokarsinomlu bir hastadan asit s›v›s› alarak incelemeleriyle bafllayan sitogenetik çal›flmalar, bantlama yöntemlerinin kullan›m›yla daha da gelifltirilmifl ve
plevral efüzyonlarda da özgün kromozom anomalileri saptanmaya bafllanm›flt›r (1). Sister chromatid exchange (SCE), fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), flow cytometry
(FCM), image cytometry (ICM), polymerase chain reaction (PCR) gibi yöntemlerin gelifltirilmesi, gen problar›n›n kullan›lmas›, son zamanlarda telomerase aktivitesinin gösterilmesi ile birlikte genetik tan› çal›flmalar› plevra hastal›klar›nda giderek daha fazla önem kazanmaya bafllam›flt›r.
Plevra hastal›klar›nda genetik tan› ile ilgili olarak literatüre bak›ld›¤›nda; çal›flmalar›n hemen hepsinin plevral efüzyonlarda yap›lm›fl oldu¤u görülmektedir. Klinikte en s›k karfl›lafl›lan tan› problemlerinden biri, bu s›v›lar›n malign
bir hastal›¤a ba¤l› olup olmad›¤›n›n ay›rt edilmesidir. Kanser hücrelerinin çe84
Plevral S›v› Analizi –5 (Genetik Tan› Çal›flmalar›)
85
Resim 1. Hiperdiploidili bir
metafaz pla¤› (Dr. S›tk› Öztafl’›n
arflivinden izinle al›nm›flt›r)
flitli say›sal ve yap›sal kromozom anomalileri tafl›malar› nedeniyle, çal›flmalar
da de¤iflik malign hastal›klarda kromozom analizi esas›na dayanan sitogenetik incelemeler ile bafllam›flt›r (2,3). Bu yöntemde ya do¤rudan örnekler, ya
da bu örneklerden elde edilen hücreler kültüre konulduktan sonra incelenmektedir. Sitogenetik incelemelerde de¤erlendirilen materyalin malign olarak kabul edilebilmesi için hangi kriterlerin kullan›lmas› gerekti¤i konusu
uzun zaman tart›fl›lm›fl ve bu durum de¤iflik çal›flmalarda farkl› sonuçlar›n ortaya ç›kmas›na neden olmufl, ancak International System for Human
Cytogenetic Nomenclature’›n (ISHCN) tan›mlad›¤› kriterler do¤rultusunda
bir görüfl birli¤ine var›labilmifltir. Buna göre malignite kriteri olarak en az 3
ayr› metafaz pla¤›nda ayn› say›sal ve/veya yap›sal kromozom anomalisinin
saptanmas› esas al›nmakta, say›sal anomali olarak hiperdiploidi yap›lar (Resim 1), yap›sal anomali olarak da anormal kromozom yap›lar› pozitif bulgu
olarak de¤erlendirilmekte, hipodiploidiler ise ancak yap›sal anomaliler ile
birlikte oldu¤u zaman anlaml› olarak kabul edilmektedir (4). Say›sal anomalilerin saptanmas›nda önemli olmasa da, küçük yap›sal anomalilerin gözlenebilmesi için her örnekte bantlama tekni¤inin kullan›lmas› gereklidir, bununla birlikte malign olgularda istenilen ölçüde bantlar elde edilebilmesi güç
olmaktad›r (1,2).
SCE, ayn› kromozomun kardefl kromatidleri aras›nda homolog segmentlerin replikasyon sürecinde karfl›l›kl› yer de¤ifltirmesidir (Resim 2). Mekanizmas› tam olarak anlafl›lamam›fl olmakla birlikte, SCE oluflmas›nda DNA hasar›
ve tamir mekanizmalar›n›n rol oynad›¤› san›lmaktad›r. Birçok kimyasal ve fiziksel ajan›n SCE üzerinde etkili oldu¤u bilinmekle birlikte, de¤iflik maligniteler, tüberküloz, ankilozan spondilit, Behçet hastal›¤› gibi baz› kronik hastal›klar ile viral ve bakteriyel infeksiyonlarda da SCE frekans›nda de¤ifliklikler ortaya konmufltur (5). Bu çal›flmalar›n hepsi periferik kan örneklerinde
yap›lm›fl olup, literatürde plevral efüzyonlar ile ilgili olarak ülkemizde gerçeklefltirilmifl bir çal›flmada, malign mezotelyomal› olgularda SCE s›kl›¤› kontrol
grubuna göre anlaml› olarak daha yüksek bulunmufltur (6). Bu konuda ileri-
86
Plevra Hastal›klar›
Resim 2. BrdU-Hoechst-Giemsa metodu ile SCE boyamas› yap›lm›fl bir metafaz pla¤›nda kardefl kromatidler aras›nda karfl›l›kl› yer de¤ifltirme görülmektedir (Dr. Mevlut ‹kbal’in arflivinden izinle al›nm›flt›r)
Resim 3. Yedinci kromozoma ait
sentromerik prob kullan›larak yap›lm›fl olan interfaz FISH’i. Hücrede
tek sinyal al›nmas›yla monozomi 7
tan›s› konulmufltur (Dr. Mevlut ‹kbal’in arflivinden izinle al›nm›flt›r)
de yap›lacak çal›flmalar plevra hastal›klar›nda genetik tan› için ›fl›k tutabilir.
Sonraki y›llarda malign plevral efüzyonlarda hiperdiploid yap›lar›n varl›¤›n›
ortaya ç›karmada FISH tekni¤i kullan›lmaya bafllanm›flt›r (Resim 3). Bu teknikte, kromozom yap› anomalilerinde anomalinin hangi kromozomdan kaynakland›¤› ortaya koyulabilmekle birlikte, tüm kromozomlara ait problar›n
ayr› ayr› kullan›lmas› gerekti¤inden maliyet de artmaktad›r. Bununla birlikte
son zamanlarda kopya say›s› de¤iflikliklerini karfl›laflt›rmak amac›yla CGH
tekni¤i tan›mlanm›flt›r ve kromozomlardaki yap›sal anomaliler de saptanabilmektedir.
ThinPrep lamlar üzerinde hiperdiploidiyi saptamak amac›yla 3, 8, 10 ve
12. kromozomlar için spesifik problar kullan›larak yap›lan bir çal›flmada,
FISH tekni¤i ile efüzyonlardaki hiperdiploid malign hücrelerin saptanabilece¤i ve özellikle majör hücre toplulu¤unun tam olarak ay›rt edilemeyen
malign hücrelerden ibaret oldu¤u durumlarda faydal› olaca¤›, buna karfl›l›k
inflamatuar ya da reaktif hücre zemininde sakl› kalm›fl küçük malign hücre topluluklar›n›n ortaya ç›kar›lmas›nda daha az yararl› oldu¤u kan›s›na var›lm›flt›r (7). Meme kanserli hastalar›n efüzyonlar›ndaki malign hücrelerin
Plevral S›v› Analizi –5 (Genetik Tan› Çal›flmalar›)
87
saptanmas› için yap›lan bir baflka çal›flmada 7, 11, 12, 17 ve 18. kromozomlar için sentromer spesifik problar kullan›lm›fl, anöploid hücre topluluklar› sitolojik olarak pozitif efüzyonlar›n % 94’ünde gözlenebilirken, sitolojik olarak negatif efüzyonlar›n ise sadece % 48’inde gözlenebilmifltir. Az
say›da anöploid hücrenin bulundu¤u olgularda maligniteyi do¤rulamak
amac›yla ilave olarak dual-colour FISH yap›lm›fl ve esas olarak tek nükleus içerisinde heterojen kromozomal anöploidi gösterilerek, sonuçta yöntemin tan›da yararl› oldu¤u ileri sürülmüfltür (8). Ayn› teknikle 7, 8, 11, 12,
17 ve 18. kromozomlar için sentromer spesifik problar›n kullan›ld›¤› son
bir çal›flmada da, yöntemin konvansiyonel sitolojiye göre daha duyarl› oldu¤u ve özellikle meme kanseri metastazlar›ndan ayr›mda faydal› oldu¤u
bulunmufltur (9).
Akci¤er kanserinin tan›s› biyopsi ya da plevral efüzyon gibi örneklerde farkl› hücre tiplerinin varl›¤› nedeniyle ço¤u kere zor olmaktad›r. Son y›llarda akci¤erde interfaz dönemindeki tümör hücrelerinin imaj sitometrisi için 3. kromozomun k›sa kolunun kayb›na dayanan yeni bir marker saptanm›flt›r. Metot her iki kol üzerinde multi-colour FISH uygulanarak 3. kromozomun k›sa
ve uzun kollar› aras›ndaki fark›n belirlenmesi esas›na dayan›r. Böylelikle örnek içerisinde normal hücreler malign hücrelerden ay›rt edilebilmektedir
(10).
Mezotelyoma, primer adenokarsinoma ve plevral metastazlar›n ay›r›c› tan›s›
da ayr› bir problemdir. Bir çal›flmada, akci¤er karsinomlar› ile mezotelyomalar›n ayr›m›nda CGH tekni¤inin sensitivitesi % 81, spesifisitesi % 77 olarak
bildirilmekte, iki tümör tipi aras›nda DNA kopya say›s› de¤ifliklikleri bak›m›ndan farkl›l›klar olmas›, bunlar›n genetik olarak farkl› tümörler oldu¤unu desteklemekle birlikte, CGH’n›n kesin bir ay›r›c› metot olarak kullan›lamayaca¤› da ifade edilmektedir (11).
Sonuç olarak plevral efüzyonlarda sitogenetik incelemelerin konvansiyonel
sitopatolojik inceleme ve di¤er laboratuvar yöntemlerinin yan›nda tan›ya
önemli katk›lar sa¤layabilece¤i genel olarak kabul görmektedir.
FCM seröz s›v›lardaki hücrelerin h›zl› ve do¤ru flekilde analiz edilmesine olanak sa¤layan bir yöntemdir. Plevral efüzyonlar›n FCM analizinde malign
efüzyonlarda DNA indeksi artm›fl olarak saptanmakta, malign efüzyonlarda
hücrelerin G1/G0 ve S gibi hücre siklusu da¤›l›mlar›, benign efüzyonlara göre farkl› de¤ilken, G2+M malign efüzyonlarda anlaml› bir flekilde artm›fl olarak bulunmaktad›r (12). Multipl miyelomlu hastalarda malign plazma hücrelerinin saptanmas› tedavi ve prognoz aç›s›ndan önemlidir. Plazma hücrelerinin görünüm olarak matür ya da say›ca az olmas› durumunda saptanmas›
güç olabilir. ‹leri dönemdeki 8 multipl miyelomlu hastan›n plevral ve perikardiyal efüzyonlar›nda sitolojik ve flow sitometrik bulgular›n araflt›r›ld›¤› bir çal›flmada, sitoplazmik immünoglobülin hafif zincir art›fl› ile plazma hücre top-
88
Plevra Hastal›klar›
lulu¤undaki DNA plöidi FCM ile de¤erlendirilmifl ve s›v›lar›n s›ras›yla % 87
ve %90’›nda malignite do¤ru bir flekilde tan›mlanm›flt›r (13).
ICM bir baflka analiz yöntemidir. Atipik efüzyonlarda DNA ICM yönteminin
araflt›r›ld›¤› bir çal›flmada, 33 atipik (muhtemelen benign) ve 21 malignite
flüpheli örnek saptanm›flt›r. Sonuçta yöntemin sitolojik tan›s› kesin olmayan
olgularda ilave tan›sal de¤eri s›n›rl› olarak bulunmufltur (14). Buna karfl›l›k bir
baflka çal›flmada, 100 plevral efüzyonda rutin sitoloji, DNA FCM ve seçilmifl
baz› olgularda ICM ifllemleri yap›lm›fl, tüm olgular klinik olarak takip edilmifl,
sitolojik 22 malign olguda DNA FCM ile 11 anöplöid ve diploid olgu saptan›rken, sitolojik 72 benign olgunun DNA FCM ile yaln›zca 6’s› anöplöid olarak bulunmufltur (%7.7). Bu olgular›n takibinde ise, biri hariç hepsi, sonradan malign özellikler göstermifltir. Sonuçta DNA FCM’nin sensitivitesi ve
spesifitesi s›ras›yla %59.25 ve %98.63 olarak saptanm›flt›r (15). Yüz bir tümör pozitif ve 53 negatif efüzyonun 12 farkl› antikor ile boyand›¤› bir çal›flmada da ayr›ca DNA ICM yap›lm›fl, Ber-EP4 ile metastatik karsinom ve mezotelyoma aras›nda %98 oran›nda do¤ru bir flekilde ayr›m yap›labilmifl,
DNA anöplöidi prevalans› metastatik karsinomalarda %95.4, mezotelyomalarda %57.1 ve reaktif efüzyonlarda %0 olarak bulunmufltur. ‹mmünositokimya (Ber-EP4 pozitifli¤i) ve DNA ICM (anaploidi) kombine edilmesi ile metastatik karsinomlarda %100, mezotelyomalarda %57.1 oran›nda tan› konulmufltur (16).
Sonuç olarak bütün bu çal›flmalarda, FCM, ICM ve sitolojinin tan›da birbirinin tamamlay›c›s› oldu¤u ve zor olgularda birlikte kullan›lmalar› gerekti¤i ortak görüflü bulunmaktad›r.
Gen analizi yöntemlerinden biri de PCR ile mutasyon bölgelerinin ço¤alt›lmas›d›r. Uzun zamandan beri kullan›lan bu teknikte, bilindi¤i gibi abl, erb-B,
fes, src, myc, K-ras gen gibi onkojenler ile p53 gibi çok iyi bilinen tümör
süpressör genlerdeki mutasyonlar araflt›r›lmaktad›r. Son bir çal›flmada, önceden cerrahi tedavi uygulanan daha sonra malign plevral efüzyonla birlikte
rekürrens saptanan 16 olguda önce PCR-based single-strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) analizi ile rezeke edilen tümör dokusunda
K-ras gen ve p53 tümör süpressör gen anomalileri incelenmifl, daha sonra
sitolojik örneklerde rekürrensin saptanmas› için mikrodisseksiyon metodu
kullan›larak bafllang›çta rezeke edilen tümör dokusunda gözlenen ayn› mutasyon bulgular› efüzyonda da araflt›r›lm›flt›r. Sonuçta ayn› mutasyonlar baflar› ile gösterilmifl ve p53 ve K-ras gen mutasyon paternlerinin rekürren akci¤er karsinomunda sitolojik örneklerde etkili markerler oldu¤u kan›s›na var›lm›flt›r (17).
Son zamanlarda telomeraz aktivitesinin gösterilmesi malignite için muhtemel
bir marker olarak önerilmektedir. Çünkü telomeraz vücut hücrelerinin ço¤unda inaktif bir durumda iken, kanserlerin ço¤unda reaktive edilmifl olarak bu-
Plevral S›v› Analizi –5 (Genetik Tan› Çal›flmalar›)
89
lunmaktad›r. Plevral efüzyonlar ile ilgili olarak yay›nlanm›fl iki çal›flmadan ilkinde 58 seröz efüzyonda reverse transcription-polymerase chain reaction
(RT-PCR) yöntemi kullan›larak telomeraz aktivitesi tayini yap›lm›flt›r; basit ve
h›zl› bir metot olmas›na ra¤men aktive lenfositler ve ço¤alan mezotelyal hücrelerden kaynaklanan yanl›fl pozitif PCR sonuçlar› olabilece¤i de vurgulanmaktad›r (18). Di¤er çal›flmada da rastgele seçilmifl 91 plevral efüzyonda telomeric repeat amplification protocol (TRAP) ve sitolojik inceleme yap›lm›flt›r. Telomeraz aktivitesi tayininde TRAP metodunun plevral efüzyonlar›n
analizinde ümit vaat etmekle birlikte, pozitif prediktif de¤erinin konfirmasyonu bak›m›ndan çal›flmalara ihtiyaç oldu¤u üzerinde durulmaktad›r (19).
Tümör anjiyogenezisi son y›llar›n ilgi çekici konular›ndan biridir. Thrombospondin-1’in (TSP-1) tümör anjiyogenezis ve progresyonundaki rolü tart›flmal›d›r. Bir çal›flmada malign plevral mezotelyomada (MPM) prognostik bir
gösterge olarak TSP-1’in etkisi araflt›r›lm›flt›r. 5 normal plevral örnek, 78
MPM tümör ve 43 normal akci¤er örne¤inde RT-PCR yöntemi ile a盤a ç›kan TSP-1 tayin edilmifl, MPM tümörlerde vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) düzeyi de ayr›ca çal›fl›lm›flt›r. TSP-1’nin MPM tümörlerin %
95’inde yüksek düzeylerde a盤a ç›kt›¤›, yüksek düzeylerde VEGF salg›layan
tümörlerde ortalama TSP-1 düzeyinin düflük düzeylerde VEGF salg›layan tümörlerle karfl›laflt›r›ld›¤›nda anlaml› olarak daha yüksek oldu¤u ve TSP-1 düzeyinin Evre 1 ve 2 hastalar ile karfl›laflt›r›ld›¤›nda Evre 3 ve 4’teki hastalarda, yine lenf nodu metastaz› olanlarda olmayanlara göre daha düflük düzeylerde oldu¤u saptanm›flt›r. Düflük düzeylerde VEGF salg›layan tümöre sahip
hastalarda yüksek düzeyde TSP-1 a盤a ç›kmas› daha iyi prognoz ile iliflkili
olmakla birlikte, TSP-1’in bizzat kendisinin yaflam beklentisi üzerine etkisi
gösterilememifltir (20). Öte yandan daha yeni bir baflka çal›flmada da MPM’li
hastalar›n plevral efüzyonlar›nda malign olmayan efüzyonlara göre daha
yüksek VEGF düzeyleri bulunmufltur. VEGF’nin MPM ilerlemesinde anahtar
bir rol oynayabilece¤i ve yine VEGF üretiminin tümör anjiyogenezisi d›fl›nda
direkt olarak tümör büyümesini uyarma yoluyla da hastan›n yaflam beklentisi üzerinde bir etkisi olabilece¤i düflünülmektedir (21). Bu konuyla ilgili ileri
çal›flmalara ihtiyaç vard›r.
Plevran›n bakteriyel ya da viral infeksiyon orijinli hastal›klar›nda tan› her zaman önemli bir sorundur. PCR tekni¤inin gelifltirilmesinden sonra bu konudaki çal›flmalar da artm›flt›r. Plevra tüberkülozu, üzerinde en çok çal›fl›lan
hastal›kt›r. Plevra s›v›s›nda PCR ile Mycobacterium tuberculosis için spesifik DNA’n›n (IS6110) saptanmas›n›n, özellikle adenozin deaminaz ve interferon-gamma düzeyi ile birlikte de¤erlendirildi¤inde h›zl› ve güvenilir bir tan›
yöntemi oldu¤u kabul edilmektedir (22). Plevra biyopsi örneklerinde de PCR
tekni¤i ile yüksek sensitivite ve spesifite de¤erleri elde edilmifltir ve yöntemin
mikrobiyolojik ve histopatolojik incelemelerle kombine edildi¤i zaman faydal› bir tan› metodu olabilece¤i ileri sürülmektedir (23).
90
Plevra Hastal›klar›
PCR tekni¤i ile Legionella pneumophila’n›n 16SrRNA geni içerisindeki
386-bp yap›s› ço¤alt›labilmektedir. ‹çerisinde plevra s›v›s› örneklerinin de
yer ald›¤› bir çal›flmada, yöntemin % 100 ve % 93 gibi yüksek sensitivite
ve spesifite de¤erlerine sahip oldu¤u ve bu teknikle ayr›ca klinik olarak
farkl› Legionella türlerinin de spesifik olarak belirlenebilece¤i bildirilmifltir
(24).
Uzun süreli asbest maruziyetinin mezotelyoma gelifliminden sorumlu oldu¤u
genel olarak kabul edilmekle birlikte, son y›llarda hastalarda PCR tekni¤i ile
Simian virus 40 (SV40) DNA’s›n›n gösterilmesi, bu virüsün baz› tümörlerin
gelifliminde hem ilave bir faktör, hem de önemli bir prognostik kofaktör olarak rol oynayabilece¤ini düflündürmektedir (25,26).
Plevra hastal›klar› içerisinde yer alan spontan pnömotoraks›n genetikle iliflkisi üzerine yay›nlanm›fl bir çal›flmada aflikar otozomal dominant geçiflten
bahsedilmifl ve izole otozomal dominant pnömotoraks tan›m› kullan›larak
bunun farkl› bir klinik durum oldu¤u ileri sürülmüfltür (27).
Sonuç olarak, plevra hastal›klar›nda genetik tan› çal›flmalar› klinik pratikte
henüz rutin olarak kullan›lmamakla birlikte, bu konudaki çal›flmalar›n say›s›
giderek artmaktad›r ve yak›n bir gelecekte bu yöntemlerin, özellikle noninvazif olmas›, h›zl› sonuç vermesi ve yüksek sensitivite ve spesifite de¤erlerine sahip olmas› gibi nedenlerle rutin tan› yöntemleri aras›na girebilece¤i düflünülmektedir.
Kaynaklar
1. Temoçin AK, Demirtafl H. Malign efüzyonlar›n sitogenetik yöntemlerle incelenmesi. Tr J
of Medical Sciences 1992; 16: 897-906.
2. Falor WH, Ward RM, Brezler MR. Diagnosis of pleural effusions by chromosome analysis.
Chest 1982; 81: 193-7.
3. Metintafl M, Özdemir N, Solak M, et al. Chromosome analysis in pleural effusions: Efficiency of this method in the differential diagnosis of pleural effusions. Respiration 1994; 61:
330-5.
4. Mitelman F. ISHCN: An International System for Human Cytogenetics Nomenclature,
Tennessee; Karger, 1995: 78-85.
5. Öztafl S, Görgüner M, Görgüner ‹, ‹kbal M. Akci¤er tüberkülozunda kardefl kromatid de¤iflimi s›kl›¤›n›n araflt›r›lmas›. Tüberküloz ve Toraks Dergisi 1999; 47: 336-9.
6. Atalay F, Baltaci V, Alpas I, et al. Sister chromatid exchange rate from pleural fluid cells
in patients with malignant mesothelioma. Mutat Res 2000; 465: 159-63.
7. Florentine BD, Sanchez B, Raza A, et al. Detection of hyperdiploid malignant cells in body
cavity effusions by fluoresence in situ hybridization on ThinPrep slides. Cancer 1997; 81:
299-308.
8. Zojer N, Fiegl M, Angerler J, et al. Interphase fluorescence in situ hybridization improves
the detection of malignant cells in effusions from breast cancer patients. Br J Cancer
1997; 75: 403-7.
9. Fiegl M, Kaufmann H, Zojer N, et al. Malignant cell detection by fluorescence in situ hybridization (FISH) in effusions from patients with carcinoma. Hum Pathol 2000; 31: 448-55.
Plevral S›v› Analizi –5 (Genetik Tan› Çal›flmalar›)
91
10. Truong K, Gerbault-Seureau M, Guilly MN, et al. Quantitative fluorescence in situ hybridization in lung cancer as a diagnostic marker. J Mol Diagn 1999; 1: 33-7.
11. Bjorkqvist AM, Tammilehto L, Nordling S, et al. Comparison of DNA copy number changes in malignant mesothelioma, adenocarcinoma and large cell anaplastic carcinoma of
the lung. Br J Cancer 1998; 77: 260-9.
12. Ceyhan BB, Demiralp E, Celikel T. Analysis of pleural effusions using flow cytometry. Respiration 1996; 63: 17-24.
13. Palmer HE, Wilson CS, Bardales RH. Cytology and flow cytometry of malignant effusions
of multiple myeloma. Diagn Cytopathol 2000; 22: 147-51.
14. Thunnisen FB, Buchholtz RT, Woutersen DP, et al. Clinical value of DNA image cytometry
in effusions with atypia. Diagn Pathol 1999; 21: 112-6.
15. Saha I, Dey P, Vhora H, Nijhawan R. Role of DNA flow cytometry and image cytometry
on effusion fluid. Diagn Cytopathol 2000; 22: 81-5.
16. Motherby H, Kube M, Friedrichs N, et al. Immunocytochemistry and DNA-image cytometry in diagnostic effusion cytology I. Prevalence of markers in tumour cell positive and
negative smears. Ann Cell Pathol 1999; 19: 7-20.
17. Dai Y, Morishita Y, Mase K, et al. Application of the p53 and K-ras gene mutation patterns for cytologic diagnosis of recurrent lung carcinomas. Cancer 2000; 90: 258-63.
18. Nagel H, Schlott T, Schulz GM, Droese M. Gene expression analysis of the catalytic subunit of human telomerase (hEST2) in the differential diagnosis of serous effusions. Diagn
Mol Pathol 2001; 10: 60-5.
19. Braunschweig R, Yan P, Guilleret I, et al. Detection of malignant effusions: comparison of
a telomerase assay and cytologic examination. Diagn Cytopathol 2001; 24: 174-80.
20. Ohta Y, Shridhar V, Kalemkerian GP, et al. Thrombospondin-1 expression and clinical
implications in malignant pleural mesothelioma. Cancer 1999; 85: 2570-6.
21. Strizzi L, Catalano A, Vianale G, et al. Vascular endothelial growth factor is an autocrine
growth factor in human malignant mesothelioma. J Pathol 2001; 193: 468-75.
22. Villegas MV, Labrada LA, Saravia NG. Evaluation of polymerase chain reaction, adenosine deaminase, and interferon-gamma in pleural fluid for the differential diagnosis of pleural tuberculosis. Chest 2000; 118: 1355-64.
23. Takagi N, Hasegawa Y, Ichiyama S, et al. Polymerase chain reaction of pleural biopsy specimens for rapid diagnosis of tuberculous pleuritis. Int J Tuberc Lung Dis 1998; 2: 33841.
24. Cloud JL, Carroll KC, Pixton P, et al. Detection of legionella species in respiratory specimens using PCR with sequencing confirmation. J Clin Microbiol 2000; 38: 1709-12.
25. Arrington AS, Lednicky JA, Butel JS. Molecular characterization of SV40 DNA in multiple samples from a human mesothelioma. Anticancer Res 2000; 20: 879-84.
26. Procopio A, Strizzi L, Vianale G, et al. Simian virus-40 sequences are a negative prognostic cofactor in patients with malignant pleural mesothelioma. Genes Chromosomes Cancer 2000; 29: 173-9.
27. Morrison PJ, Lowry RC, Nevin NC. Familial primary spontaneous pneumothorax consistent with true autosomal dominant inheritance. Thorax 1998; 53: 151-2.