ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK
advertisement
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Ayşe KÜSTÜ ALLOGENEİK PERİFERİK KÖK HÜCRE TRANSPLANTASYONUNDA VERİCİLERE (DONÖR) EŞİT DOZDA UYGULANAN İKİ FARKLI REKOMBİNANT BÜYÜME FAKTÖRÜNÜN (rHuG-CSF) KARŞILAŞTIRMALI ÇALIŞMASI BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2008 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ALLOGENEİK PERİFERİK KÖK HÜCRE TRANSPLANTASYONUNDA VERİCİLERE (DONÖR) EŞİT DOZDA UYGULANAN İKİ FARKLI REKOMBİNANT BÜYÜME FAKTÖRÜNÜN (rHuG-CSF) KARŞILAŞTIRMALI ÇALIŞMASI Ayşe KÜSTÜ YÜKSEK LİSANS BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez ..../...../…... Tarihinde Aşağıdaki Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. Jüri Üyeleri Tarafından İmza............…………… İmza...................…. ….. İmza.................…………. Prof.Dr İskender EMRE Prof.Dr. Seyhan TÜKEL Doç.Dr.Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No : Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir. ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ ALLOGENEİK PERİFERİK KÖK HÜCRE TRANSPLANTASYONUNDA VERİCİLERE (DONÖR) EŞİT DOZDA UYGULANAN İKİ FARKLI REKOMBİNANT BÜYÜME FAKTÖRÜNÜN (rHuG-CSF) KARŞILAŞTIRMALI ÇALIŞMASI Ayşe KÜSTÜ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. İskender EMRE Yıl : 2008 Sayfa : 47 Jüri : Prof. Dr. İskender EMRE Prof.Dr. Seyhan TÜKEL Doç.Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Bu çalışmada; allojeneik periferik kök hücre transplantasyonu amacıyla iki farklı rekombinant büyüme faktörü ile mobilize edilmiş toplam 16 (filgrastim;11, lenograstim; 5) donöre uygulanan 29 seans kök hücre aferezi işlemi, mobilizasyon ilişkili yan etkiler ve mobilizasyona etkili faktörler açısından değerlendirildi. Her iki grupta da, gerek mobilizasyonun 4. gününde gerekse 5. gününde periferik kan ve elde edilen kök hücre ürününde, beyaz küre (p>0,05) ve CD34+ kök hücre sayısının (p>0,05) eşit olduğu hesaplandı. Yaş, cinsiyet ve kilonun mobilizasyona olan etkisi istatistiksel olarak anlamlı değildi. Hem lenograstim hem de filgrastimin ciddi komplikasyonlara neden olmadığı, yan etkiler açısından önemsiz farklılıklar gösterdiği, ayrıca; maliyet açısından eşit oldukları bulundu. Anahtar Kelimeler: Allojeneik Periferik Kök Hücre Transplantasyonu (AKHT), mobilizasyon teknikleri, rekombinant büyüme faktörleri (rHuG-CSF), granülosit koloni uyarıcı faktörler (G-CSF). I ABSTRACT MSc THESIS COMPARISON OF EFFICIENCY BIOEQUIVALENT DOSES OF TWO DİFFERENT RECOMBİNANT HUMAN GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTORS (rHuG-CSF) IN STEM CELL MOBILISATION FROM HEALTHY DONORS IN ALLOGENEIC BLOOD STEM CELL TRANSPLANTATION Ayse KUSTU DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENSES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Iskender EMRE Year : 2008 Pages : 47 Juri : Prof. Dr. Iskender EMRE Prof.Dr. Seyhan TUKEL Doç.Dr. Hatıce KORKMAZ GUVENMEZ In this study, 29 stem cell apheresis procedures performed on a total of 16 donors mobilized with two different recombinant human granulocyte colony stimulating factors (filgrastim; 11, lenograstim; 5) for the purpose of allogeneic peripheral blood stem cell transplantation were evaluated with regard to complications related to growth factors and of factors that influence mobilization processes. On both of the 2 groups, it has been observed that the quantity of white blood cell (p>0,05) and CD34+ cells in peripheral blood and stem cell product are the same on the 4th and 5th days of the mobilization. There was no statistical difference in the effect of age, gender and weight on mobilization process. In this study, it has been shown that lenograstim and filgrastim do not cause serious complications and have inconsiderable differences in terms of side effects. Not to mention that both of the growth factors have the equivalent cost. Key Words: Allogeneic Stem Cell Transplantation (ASCT), Mobilization techniques, Recombinant Growth Factors, Granulocyte Colony- Stimulating Factors (G-CSF) II TEŞEKKÜR Tezimin her basamağında bilgisi ve tecrübesinden yararlanmamı sağlayan, desteğini ve yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen danışman hocam, Sayın Prof. Dr. İskender EMRE’ye, ayrıca sayın hocalarım Prof. Dr. Atila TANYELİ ve Doç. Dr. Birol GÜVENÇ’e sonsuz saygılarımı sunarım. Tez yazımım sırasında yardımlarını esirgemeyen ve görüşlerini bildirerek gelişimime katkıda bulunan, ayrıca; hasta / yakınlarına olan özel ilgi ve alakalarından dolayı, Bio. Ferda TEKİNTURHAN ve Dr. Fatih ERBEY’e teşekkür eder, şükranlarımı iletirim. Aferez işlemlerinin başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesinde emeği geçen Aferez Ünitesi çalışanlarına, hasta ve donörün bakımını yapan tüm Pediatrik KİT Ünitesi hemşire ve personellerine, Yardımlarını ve manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen değerli arkadaşlarıma, Sadece çalışma süresince değil, hayatımın her anında bana verdikleri destek ve güvenle kendimi iyi hissetmemi sağlayan, annem Hatice KÜSTÜ ve kardeşlerime, Ayrıca; çalışkanlığını ve sabrını her zaman örnek aldığım, sevgisi ve desteği ile bu günlere gelmemi sağlayan, rahmetli babam A. Kenan KÜSTÜ’ye… sonsuz sevgi ve teşekkürlerimi sunarım. III İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ........................................................................................................................... I ABSTRACT........................................................................................................... II TEŞEKKÜR........................................................................................................... III İÇİNDEKİLER...................................................................................................... IV ÇİZELGELER DİZİNİ........................................................................................ VI ŞEKİLLER DİZİNİ.............................................................................................. VII FORMÜLLER DİZİNİ…………………………………………………………. VII SİMGELER VE KISALTMALAR……………………………………….……. IX 1.GİRİŞ................................................................................................................... 1 1.1. Kök Hücrenin Tanımı……….................................................................... 1 1.2. Kök Hücre Tipleri ...................................................................................... 1 1.2.1. Embriyonik Kök Hücreler (EKH)...................................................... 1 1.2.2. Erişkin Tip Kök Hücreler................................................................... 2 1.3 Hematopoez………….................................................................................. 3 1.3.1. Hematopoezin Kontrolü.................................................................... 6 1.3.1.1. Sitokinler................................................................................ 7 1.3.1.2. Hematopoietik Büyüme Faktörleri.......................................... 7 1.3.1.2.(1). G-CSF (Granulocyte-Colony Stimulating Factor)... 8 1.4. Hematopoietik Kök Hücre Transplantasyonu (HKHT).............................. 9 1.4.1. Tarihçesi…………………………………………………………... 9 1.4.2. Tanımı……………………………………………………………... 10 1.4.3. Tipleri……………………………………………………………… 11 1.4.3.1. Otolog Kök Hücre Transplantasyonu……………………... 11 1.4.3.2. Allojeneik Kök Hücre Transplantasyonu…………………. 12 1.4.4. Mobilizasyon Teknikleri…………………………………………... 12 1.4.4.1. Rekombinant Hematopoietik Büyüme Faktörleri………… 13 1.4.4.1.(1). Lenograstim (Glikolize - rHuG-CSF)……………… 13 1.4.4.1.(2). Filgrastim (non-Glikolize-rHuG-CSF)…………….. 14 1.4.5. Kök Hücre Toplanması……………………………………………. 14 IV 1.4.5.1. Toplama Zamanı…………………………………………... 16 1.4.5.2. Toplanacak Ürün Miktarı...................................................... 16 1.4.6. Yan Etkiler….……………………………………………………... 17 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR................................................................................. 18 3. MATERYAL VE METOD............................................................................... 20 3.1. Materyal...................................................................................................... 20 3.1.1. Filgrastim (non-Glikolize-rHuG-CSF)……………………………. 20 3.1.2. Lenograstim (Glikolize rHuG-CSF)………………………………. 20 3.1.3. Donör Karakteri ………………………….………………………... 21 3.2. Metod ……………………………………………………………………. 22 3.2.1. Mobilizasyon………………………………………………………. 22 3.2.2. Kök Hücre Toplanması……………………………………………. 23 3.2.3. Kalite-Kontrol……………………………………………………... 25 3.2.3.1. TMNH Sayısının Hesaplanması…………………………… 25 3.2.3.2. CD34+ Hücre Miktarının Hesaplanması…………………... 26 3.2.4. Kök Hücre İnfüzyonu……………………………………………… 26 3.2.5. Analiz……………………………………………………………… 27 4. BULGULAR VE TARTIŞMA......................................................................... 28 4.1. Bulgular....................................................................................................... 28 4.2. Tartışma…………………………………………………………………... 35 4.3. Sonuçlar ve Öneriler……………………………………………………… 40 KAYNAKLAR....................................................................................................... 41 ÖZGEÇMİŞ............................................................................................................ 47 V ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 1.1. HKHT Endikasyon Kategorisi……………………………...................11 Çizelge 3.1 Filgrastim Ürün İçeriği………………………………………………....20 Çizelge 3.2 Lenograstim Ürün İçeriği……………………………………………....21 Çizelge 4.1 Donör Karakterleri ve İşlem Bilgileri………………………………......28 Çizelge 4.2. İkinci Gün Kök Hücre Ürün Değerleri ….………..……………….......31 Çizelge 4.3. Yaş Dağılımına Göre Periferik Kan Sonuçları ……………………......33 Çizelge 4.4. Cinsiyet Dağılımına Göre Periferik Kan Sonuçları…………………....33 VI ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. Hematopoietik Kök Hücre Farklılaşması………………………………….5 Şekil 1.2. Kök ve Progenitör Hücrelere Etkili Sitokinler; Lokal ve Humoral Faktorlerin Etkinlikleri…………………………………………………...6 Şekil 1.3. İnsan G-CSF’inin Moleküler Yapısı…..……………………………….….8 Şekil 4.1. Kök Hücre Aferezinin I. Gününde Periferik Kan Değerleri……….….…29 Şekil 4.2. I. Gün Kök Hücre Ürün Değerleri………………………….…………….31 Şekil 4.3. Filgrastim ve Lenograstim Grubunda I. ve II. Gün Ürün Değerleri……..32 Şekil 4.4. Mobilizasyona Bağlı Karşılaşılan Yan Etkiler ve Görülme Sıklıkları…...34 VII FORMÜLLER DİZİNİ SAYFA Formül 3.1. Periferik Kandaki TMNH Sayısının Hesaplanması……...……………23 Formül 3.2. Periferik Kandaki CD34+ Kök Hücre Sayısının Hesaplanması………24 Formül 3.3. TMNH (108 / Kg) Sayısının Hesaplanması……………………….......26 Formül 3.4. CD34+ Kök Hücre (106/Kg) Miktarının Hesaplanması……………….26 VIII SİMGELER ve KISALTMALAR AA : aplastik anemi ACD-A : asit sitrat dekstroz formül A AKHT : allojeneik kök hücre transplantasyonu ALL : akut lenfoblastik lösemi APKHT : allojeneik periferik kök hücre transplantasyonu BK : beyaz küre sayısı CD : cluster designation CFU : colony forming unit (koloni oluşturan ünite) CHO : chinese hamster ovary Cys : sistein aminoasiti DNA : deoksiribonükleik asit EKH : embriyonik kök hücre EPO : eritropoietin ETKH : erişkin tip kök hücre G-CSF : granlocyte colony stimulating factor (granulosit koloni uyarıcı faktör) GM-CSF : granulocyte macrophage colony stimulating factor (granulositmakrofaj koloni uyarıcı faktör) GVHH : graft versus host hastalığı HBF : hematopoietik büyüme faktörü Hct : hematokrit (kırmızı kan yüzdesi) HKH : hematopoietik kök hücre HKHT : hematopoietik kök hücre transplantasyonu HLA : human leucocyte antigen (insan lökosit antijeni) HPH : hematopoietik progenitör hücre ICM : ınner cell mass (iç hücre tabakası) IL : interlökin İCa : iyonize kalsiyum KİT : kemik iliği transplantasyonu LT-CIC : long term culture initiating cell (uzun zamanlı kültür başlatıcı hücre) IX M-CSF :megacaryocyte colony stimulating factor (megakaryosit koloni uyarıcı faktör) MEPH : multipotent erişkin progenitör hücre MKH : mezenkimal kök hücre MNH : mononükleer hücre sayısı MNS : mutlak nötrofil sayısı NHL : non-hodgin lenfoma OKHT : otolog kök hücre transplantasyonu OPKHT : otolog periferik kök hücre transplantasyonu PKHT : periferik kök hücre transplantasyonu rHuG-CSF :recombinant human granulocyte colony stimulating (rekombinant insan granulosit koloni uyarıcı faktör) SCF : stem cell factor (kök hücre faktörü) Thr : treonin aminoasiti TKH : toplam kan hacmi TM : talasemi major TMNH : toplam mononükleer hücre sayısı TPO : trombopoietin X factor 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ 1. GİRİŞ 1.1 Kök Hücrenin Tanımı Canlılarda kendini yenileyebilme, farklılaşabilme kabiliyeti bulunan hücrelere kök hücre denir. Bu hücrelerin; dokuya has özellikleri yoktur, spesifik değillerdir ve uygun bir sinyalle karşılaşmadıkları sürece farklılaşmazlar. Kök hücreler; • Uygun bir çevreye yerleşme, • Çoğalma, • Kendini yenileme ve idame ettirme, • Hasarlanmış dokuyu yeniden oluşturma özelliklerine sahiptir. 1.2 Kök Hücre Tipleri Kök hücreler başlıca Embriyonik Kök Hücre (EKH) ve Erişkin Tip Kök Hücre (ETKH) olarak iki gruba ayrılırken, farklılaşma kapasitelerine göre de üç sınıf altında toplanırlar. Bunlar; • Totipotent Kök Hücre; vücuttaki tüm hücrelere dönüşebilecek potansiyele sahip, ilk embriyonel hücredir. Erken embriyonel dönemde 4 hücreden 8 hücreye kadar olan blastomerleri içerir, • Pluripotent Kök Hücre; tüm germ dizisine (endoderm-ektoderm-mezoderm) ait dokuları oluşturabilme kapasitesinde olan hücrelerdir. • Multipotent Kök Hücre; daha sınırlı farklılaşma kapasitesine sahip hücrelerdir. 1.2.1 Embriyonik Kök Hücreler Blastokistin (1 haftalık embriyo) Inner Cell Mass (ICM) olarak adlandırılan iç hücre tabakasından elde edilerek kültür ortamında üretilen hücrelerdir. Ancak, kültür ortamında embriyonun normal gelişimindeki gibi hareket etmezler. Pluripotent özellikte olan bu hücreler; ektoderm, endoderm ve mezodermden oluşan yaklaşık 1 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ 250 çeşit hücreyi oluşturabilirler. Farklılaşma ve kendini yenileme kapasitesine sahiptirler. Kültür ortamlarında, farklılaşmadan 1-2 yıl üremelerini sürdürebilirler (Herzog ve ark., 2003). 1.2.2 Erişkin Tip Kök Hücreler Erişkinde farklılaşmış bir dokuda bulunan farklılaşmamış hücre grubudur. Kendilerini yenileme potansiyeli olan bu hücreler, kaynaklandıkları dokunun özelleşmiş hücre tiplerini oluşturdukları gibi başka dokuların da hücrelerine dönüşebilirler. Çizgili kas, beyin, karaciğer ve kemik iliği gibi birçok dokuda bulunmaktadır. ETKH’nin en iyi tanımlanmış örneği Hematopoietik Kök Hücrelerdir (HKH). Oldukça heterojen bir grup olarak kabul edilen HKH’ler; kemik iliğinden, umbilikal kord kanından ve büyüme faktörleri ile mobilize edilmiş periferik kandan izole edilebilirler. Bu hücreler, ın-vivo engraft olabilme (yamalanma) özelliğine sahiptir. Multipotent özellik taşıyan HKH’ler, kemik iliğinde 1 / 10–15 bin, periferik kanda 1 / 105 oranında bulunurlar. En önemli özellikleri; Lineage belirteçlerinin olmaması (Lin-) ve hücre yüzey antijeni olarak CD34+, CD38- ve CD33- olmalarıdır. Hematopoietik potansiyelli kök hücrelerin saflaştırılmasında kullanılan diğer önemli belirteçler VEGFR-2, CD90, CD117, CD164, CXC-Kemokin Reseptör 4, pglikoprotein, Sca-1, AA4, CD133 ve CD45’dir. Ayrıca, HLA-DR (Human Leukocyte Antigen) ekspresyonu zayıf (+) veya negatiftir (Watt, 2003). HKH’ler, progressif olarak, daha olgunlaşmış hematopoietik progenitör hücreleri (HPH) oluştururlar. Kök hücreler, genellikle hücre siklusunun G0 (dinlenme) fazında bulunurken, progenitörler siklusa girmiş, proliferasyon ve diferansiyasyon kapasiteleri daha sınırlı hücrelerdir. Lineage dizileri belirlenmiş (Lin+) bu hücreler, sınırlı sayıda sitokinlere yanıt verirler. HPH’nin matürasyonu ile olgun kan ve immün sistem hücreleri ve endotel hücreleri meydana gelir. Bu hücreler morfolojik olarak normal görünümlü lenfositlere benzerler ve onlardan ayırt edilemezler (Quesenberry ve Colvin, 2001). 2 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ Hematopoietik organlardan elde edilen HKH’ler; kemik, kıkırdak, nöral hücreler, pnömositler, kas, deri, endotel, epitel hücreleri ve hepatositler gibi hücreleri oluşturma kapasitesine sahiptirler (Lakshmipathy ve Verfaillie, 2005). HKH’lerin yanında, hematopoietik organlarda farklı progenitör/kök hücre tipleri de bulunur ve Mezenkimal Kök Hücreler (MKH), Multipotent Erişkin Progenitör Hücresi (MEPH) ile Hemanjioblast olarak sınıflandırılır. MKH’ler; kemik iliği kökenli hücrelerdir. Osteoblastik, adipositik ve kondrositik seriye farklılaşabilirler. İnsanda HLA-A,B,C ekspresyonu gösterirken HLA-DR ekspresyonu göstermezler, bu nedenle hipo-immünojenik veya non-immünojenik olarak nitelendirilirler. Doku mühendisliğinde kemik, kıkırdak, kemik iliği stroması, kas, yağ ve tendon rejenerasyonunda, gen tedavisinde, vasküler destek ve nöronal çevre temininde önemlidirler. MEPH; besin desteği fakir kültür ortamında çok yavaş büyüme gösterir. MHCKlas1 antijeni içermezler, aktif telomerlerini korudukları için yaşlılık işareti göstermeden çoğalırlar. Osteoblast, kondroblast, adipoblast, iskelet, miyoendotel seri ve hepatosite farklılaşırlar. Hemanjioblastlar; hematopoezde (kan yapımı) ve damar endotelinin yapımında görev alırlar (Reyes ve ark., 2002 ). 1.3 Hematopoez (Kan Yapımı) Kan dokusu; yaşam süreleri birkaç saatten (nötrofiller) birkaç yıla kadar (hafıza hücreleri) değişen, 8 farklı hücre grubundan oluşmaktadır. Bunlar; T-lenfositler, B-lenfositler, Monosit / Makrofajlar, Nötrofiller, Eozinofiller, Bazofiller, Eritrositler ve Trombositler olarak adlandırılmaktadır (Hampson ve ark., 1996). Tüm bu kan hücrelerinin hayat boyu çoğalması, farklılaşması ve olgunlaşması hematopoietik sistem tarafından gerçekleştirilir. İlk 6 haftalık dönemde embriyonik yolk kesesinde (ilk hematopoietik organ), daha sonra, fetal karaciğer ve dalakta (6-28 hafta), son olarak da, hayat boyu devam edecek şekilde kemik iliğinde gerçekleşen hematopoez; pluripotent kök hücreler, kemik iliği mikroçevresi ve büyüme faktörleri/düzenleyici proteinler arasında 3 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ gerçekleşen interaksiyon ve denge ile sağlanır. Kemik iliği mikroçevresi; HKH’ler, fibroblast, endotelyal hücreler, makrofajlar ve adiposit/yağ hücrelerini içeren stromal hücrelerden oluşur (Liffick, 1997). Tüm kan hücreleri, kemik iliğinde bulunan pluripotent kök hücrelerden oluşur. Bu orijinal, tanımlanabilen prekürsör hücreler, tüm lenfositlerin oluştuğu lenfoid kök hücrelere ve diğer tüm kan hücrelerinin öncüsü myeloid kök hücrelere dönüşür. Lenfositler, olgunlaşmasını kemik iliği ve lenf bezlerinde tamamladıktan sonra dalak, lenf bezleri ve diğer lenfoid organlara giderler ve gerekli durumlarda salınırlar. Diğer tüm kan hücreleri ise kemik iliğinde olgunlaşır ve buradan salınırlar (Haen, 1995 ) . Hematopoez sırasında, kök hücreler progenitör hücrelere dönüşür. Progenitörler, kemik iliği aspiratlarında morfolojik olarak tanımlanabilen prekürsör hücreleri oluşturur ve son olarak da matürasyon ile olgun kan hücreleri meydana gelir (Şekil 1.1.). Bu dönüşüm sırasında, ilkel hücrelerden olgunlara gidildikçe proliferatif kapasite azalmakta, diferansiyasyon artmaktadır (Williams, 2000). 4 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ Şekil 1.1. Hematopoietik Kök Hücre Farklılaşması (Williams, 2000) Kİ; Kemik iliği, CFU; Colony-Forming Unit, S; spleen; GEMM; Granulosit, Eritrosit, Monosit, Megakaryosit; BFU; Burst-Forming-Unit, GM; GranulositMonosit, EOS; Eozinofil, BASO; Bazofil, MEG; Megakaryosit. 5 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ 1.3.1. Hematopoezin Kontrolü Hematopoietik sistem; kanama ve infeksiyon gibi fizyolojik streslere karşı doğru ve hızlı cevap verebilmek için, iki düzenleyici sistemden oluşan, esnek bir kontrol mekanizmasına sahiptir. Bunlardan ilki, birçok hücre tarafından sentezlenerek dolaşıma verilen sitokinler ve büyüme faktörleri gibi düzenleyiciler tarafından gerçekleştirilen humoral kontrol mekanizmasıdır. İkinci bir kontrol sistemi ise, kemik iliği mikroçevresinde stromal ve hematopoietik hücreler arasında hücre-hücre etkileşimi ile gerçekleşen lokal kontrol mekanizmasıdır. Hematopoez; başlangıçta lokal, olgunlaşma ilerledikçe humoral kontrol mekanizmalarının etkisi ile farklı büyüme faktörlerinin ve/veya sitokinlerin rol aldığı bir feedback mekanizması ile yönetilir (Şekil 1.2.) (Teseta ve Dexter, 1999). Şekil 1.2. Kök ve Progenitör Hücrelere Etkili Sitokinler; Lokal ve Humoral Faktorlerin Etkinlikleri (Teseta ve Dexter, 1999) SCF = Stem Cell Factor; LIF = Leukemia Inhibitory Factor; IL= Interlökinler; Epo=Eritropoetin 6 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ 1.3.1.1 Sitokinler Günümüzde, hematopoietik gelişimin düzenlenmesinde görev alan büyüme faktörü ve sitokinlerin, 20’den fazla çeşidi tanımlanmış, dizi analizi yapılmış ve klonlanabilmiştir. Tüm sitokinler, hücre spesifik membran reseptörlerini bağlayarak bir veya daha fazla intraselülar sinyal iletim sistemini aktive ederler. Birçoğu, 20-40 kD moleküler ağırlığa sahip küçük proteinlerdir ve genellikle glikolize formdadır. Glikolizasyon, sitokinlerin plazma yarı ömrü, çözünürlüğü ve protein yapısı üzerinde önemli rol oynar. Ayrıca sitokinler, hücrelerin diziye spesifikleşmesinden çok çoğalmasını ve progenitör hücrelerin yaşam sürelerinin sürdürülmesini sağlarlar. Farklı sitokinler, progenitör hücre gelişiminin farklı basamaklarında görev alır. Örneğin, EPO (Eritropoietin), TPO (Trombopoietin) ve M-CSF (Macrophage-colony stimulating factor); eritroid, megakaryosit ve makrofaj progenitörlerinin maturasyonu üzerinde etkinken, IL-3 (Interleukin-3), GM-CSF (Granulocytemacrophage colony stimulating factor), G-CSF (Granulocyte-colony stimulating factor) ve IL-4 (Interleukin-4); hücre siklusunun G0 fazında etkinliğini göstererek hücrelerin çoğalmasında rol oynar (Ogawa, 1993). 1.3.1.2 Hematopoietik Büyüme Faktörleri Hematopoietik büyüme faktörleri (HBF), glikoproteinlerin kompleks bir ailesidir. Pluripotent kök hücrelerin farklılaşıp çoğalmasını +/- yönde düzenlerken, spesifik reseptörleri aracılığıyla, olgun kan hücrelerinin fonksiyonlarını da regüle eder (Groopman ve ark., 1989). Reseptörler, plazma membranındaki sinyal proteinleri ve stoplazmik protein kinazların yanında, hücredeki gen aktivasyonunu da sağlarlar (Taniguchi, 1995). HBF’ler, genellikle tek bir seriye ait hücrelere farklılaşmayı sağlamazken G-CSF ve GM-CSF gibi daha spesifik olanları da bulunmaktadır (Groopman ve ark., 1989). 7 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ 1.3.1.2.(1). G-CSF (Granulocyte-Colony Stimulating Factor) İnsan G-CSF geni, 17. kromozomun q11-q22 bölgesinde kodlanır. 174 aminoasit içeren (Demetri ve Griffin, 1991) ve 20 kD’luk moleküler ağırlıkta (Groopman ve ark., 1989), Sistein (Cys) 36 ve 42 ile 64 ve 74 arasında bulunan iki adet disülfid bağa sahip, Treonin 133 (Thr133)’ den glikolizasyona uğramış bir glikoproteindir (Şekil 1.3.) (Asano, 1991). Şekil 1.3. İnsan G-CSF’inin Moleküler Yapısı (Asano, 1991) Gal: D-galaktoz, GalNAc:N-asetilgalaktozamin, NeuAc: N-asetilnöraminikasit G-CSF; granülosit seriye ait progenitör hücrelerin çoğalmasını, farklılaşmasını ve aktivasyonlarını arttıran büyüme faktörüdür. Kemik iliğinin uyarılması ile prekürsör ve olgun nötrofilik granülositlerin üretilmesi ve fonksiyonlarının düzenlenmesini sağlar. Endotelyum, makrofajlar ve diğer immun sistem hücreleri tarafından üretilir. Normalde, G-CSF üretimi çok düşük bir miktarda gerçekleştirilir ve nötrofil sayısına bağlı olarak feed-back mekanizması ile kontrol edilir (Demetri ve Griffin, 1991). Moleküler kontrol cyclin-D1’in aktivasyonu ile sağlanır. cyclin-D1, hücre döngüsü sırasında G0/G1 fazını kısaltarak S fazına geçişi hızlandırır. Ayrıca, hücre 8 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ olgunlaşmasını indükleyerek olgun granülositlerin aktivasyonlarını arttırır, apoptozisi engelleyerek granülositik hematopoietik hücrelerin canlılığını sağlar (Metcalf, 1996). G-CSF, etkisini spesifik reseptörleri aracılığıyla göstermektedir. Bu reseptörler, 759-812 aminoasit içeren tek zincirli polipeptidlerdir, intrinsik tirozin kinaz aktivitesi yoktur ve G-CSF’ye yüksek affinite ile bağlanırlar (Demetri ve Griffin, 1991). G-CSF; • Nötrofil koloni hücrelerinin farklılaşmasını ve çoğalmasını, • Megakaryositik ve granülosit-makrofaj koloni büyüme faktörlerinin (M-CSF, GM-CSF) uyarılmasını, • Myelositlerin kısa süreli çoğalıp gelişmesini, • HKH’lerin sayısının arttırılmasını, • Nötrofillerin olgunlaşma süresinin kısalması, kana geçmelerinin tetiklenmesi, yaşam süreleri ve aktivitelerinin arttırılmasını sağlar (Adachi ve ark., 1994). 1.4 Hematopoietik Kök Hücre Transplantasyonu 1.4.1 Tarihçesi Dünyada ilk olarak 1960’lı yıllarda başlamış ve 1980’lı yıllarda yaygınlaşmış olan kemik iliği transplantasyonu (KİT), Türkiye’de 1980’lı yıllarda bir tedavi olarak klinik uygulamalara girmiştir. Ülkemizde, ilk KİT merkezi, 1984 yılında Gülhane Askeri Tıp Akademisi (GATA)’nde TUBİTAK Projesi ile kurulmuştur. Tıp literatürüne geçmiş olan kayıtlı ilk Otolog KİT, 1984 yılında GATA’da solid tümörlü, erişkin bir hastaya yapılmıştır. Yine aynı merkezde, 1985 yılında Akut Lenfoblastik Lösemili (ALL) erişkin bir hastaya, doku grubu kısmen uygun bir akrabasından Allojeneik KİT uygulanmıştır. İlk pediatrik nakil ise, Talasemi Majör (TM) tanısı ile takip edilen bir hastaya aynı merkezde, 1988 yılında yapılmıştır. Farklı HKH kaynaklarının bulunması, hazırlama rejimlerindeki yeni uygulamalar, monoklonal antikorların kullanımı ve non-myeloablatif hazırlama rejimlerinin uygulanması ile KİT, yerini periferik kök hücre transplantasyonu (PKHT)’na bırakmıştır. 1990’lı yıllardan sonra bu alanda önemli gelişmeler 9 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ kaydedilmiş, böylelikle, HKHT’na bağlı komplikasyonlar ve ölüm oranları ciddi derecede azalmıştır. Ülkemizde, ilk Otolog Periferik Kök Hücre Transplantasonu (OPKHT), Ankara Ünv., Tıp Fakültesi, İbn-i Sina Hastanesi’nde, Non-Hodgin Lenfoma’lı (NHL) bir hastaya 1992 yılında uygulanmıştır. İlk Allojeneik Periferik Kök Hücre Transplantasyonu (APKHT) ise, aynı merkezde, doku uygunluğu tam, kardeş vericiden Aplastik Anemili (AA) bir hastaya 1993 yılında yapılmıştır (Arpacı, 2006). . 1.4.2 Tanımı HKHT, bir çok hematolojik hastalığın tedavisinde başvurulan son yöntem olarak geliştirilmiştir (Çizelge 1.1.) (EBMT, 2000) ve HKH’lerin kullanımı ile tüm hematopoietik sistemin yeniden yapılandırılması amaçlanmıştır (Duncombe, 1997). Özellikle, standart doz kemoterapiye yanıt vermeyen (refrakter) ya da yeterli cevabın alınamadığı hastalarda, yüksek doz kemoterapi uygulaması ile mevcut hastalığı yok etmek, tümör yükünü azaltmak, immunsupresyon sağlamak ve kemik iliğinde yeterli boşluk oluşturmak hedeflenir (Appelbaum, 2000). Kemik iliğinden, mobilize periferik kandan ve/veya umbilikal kordon kanından toplanan kök hücreler, yüksek doz kemoterapi sonrasında hastaya infüze edilir. Bu hücreler, hastanın kemik iliğine göç eder ve yerleşir (Srour ve ark., 2001). Uygun mikroçevre sağlandığında, 7-10 gün içerisinde kemik iliğini tekrar yapılandırmaya ve olgun kan hücrelerini oluşturmaya (engrafman) başlar. Engrafmanın uygun sürede sağlanması, kemoterapi sonrası derin pansitopenideki hastanın hayatta kalabilmesi için, klinik açıdan son derece önemlidir (To ve ark., 1997). 10 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ Çizelge 1.1. HKHT Endikasyon Kategorisi (EBMT, 2000) Allojeneik Kök Hücre Transplantasyonu Otolog Kök Hücre Transplantasyonu • Ciddi aplastik anemi (AA) • Akut lenfoblastik lösemi • Talasemi majör (TM) • Hodgin Lenfoma (II. tam • Orak hücreli anemi (OHA) • Kronik myeloid lösemi (KML) • Multiple Myeloma • Akut myeloid lösemi (AML- I. • Solid tümörler (meme, rahim, remisyon) nöroblastoma) ve II. tam remisyon) Akut lenfoblastik lösemi (ALL- • Otoimmün hastalıklar I. ve II. tam remisyon) • Kronik lenfositik lösemi • Ciddi immün yetmezlik • Kronik myeloid lösemi • Multiple myeloma (MM) • Akut myeloid lösemi • Metabolik hastalıklar • Hodgin ve non-Hodgin lenfoma • Hodgin ve non-Hodgin lenfoma • (I. tam remisyon) (HL-NHL) 1.4.3 Tipleri HKHT; Otolog Kök Hücre Transplantasyonu (OKHT) ve Allojeneik Kök Hücre Transplantasyonu (AKHT) olarak iki ana başlık altında incelenmektedir; 1.4.3.1 Otolog Kök Hücre Transplantasyonu Yüksek doz kemoterapi sonrasında pansitopeniye girmiş (eritrosit, trombosit ve beyaz küre yapımı baskılanmış) hastaların kemik iliğini desteklemek amacıyla, daha önce hastadan elde edilmiş, mobilize periferik kan veya kemik iliği kaynaklı kök hücrelerin, hastanın kendisine verilmesidir. OKHT’de amaç kür değil, hastalıksız sağ kalım süresini uzatmak ve yaşam kalitesini arttırmaktır. 11 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ 1.4.3.2 Allojeneik Kök Hücre Transplantasyonu Hematolojik malignansilerde, kemik iliği yetmezliklerinde ve doğuştan immün yetmezliklerde sıklıkla kullanılan bir tedavi yöntemidir. HLA uyumlu vericiden toplanan kemik iliği, mobilize periferik kan ve/veya kordon kanı kaynaklı kök hücrelerin, hazırlama rejimi ile myeloablatif (kemik iliği baskılanmış) hale getirilmiş hastaya verilmesi ve hastada vericinin hemato-immünopoietik sisteminin yapılandırılmasıdır (Lanier ve ark., 1997). HLA sistemi; insanlarda 6. kromozomun kısa kolunda bulunan ve HLA-loci olarak adlandırılan 12 genetik bölgeden oluşmaktadır. HLA allelleri Klas-I (HLAA,B,C) ve Klas-II (HLA-DR, DQ, DP) antijenlerini kodlamaktadır. Klas-I antijenleri vücuttaki tüm çekirdekli hücre yüzeylerinde, Klas-II antijenleri ise monositler, B-lenfositler, T-lenfositler ve dendritik hücre gibi savunma hücrelerinin yüzeylerinde kodlanmaktadır. HLA molekülleri antijenik peptidleri bağlayarak spesifik immün cevabın oluşmasını sağlarlar (Benichou ve ark., 1997). Kemik iliği, B ve T lenfositler ile makrofajları da içerir. Bundan dolayı, AKHT’da hasta ile donör arasındaki HLA doku uygunluğunun tam veya neredeyse tam olması tercih edilmekte, böylelikle transplantasyona bağlı komplikasyonlar büyük oranda önlenerek transplantasyonun başarısını arttırmak hedeflenmektedir. HLA uygunsuz AKHT yapıldığında ise hem donörün hem de hastanın T-hücreleri harekete geçecek, sonuçta oldukça fatal seyreden, şiddetli ve akut graft rejeksiyonu ile GVHH (Graft Versus Host Hastalığı) gözlenecektir (Lanier ve ark., 1997). AKHT sonrası, ilk 3-12 ayda hastada derin immün yetmezlik gözlenir. T-hücre düzeyleri azalmıştır. Hastanın kan grubu yaklaşık 60 gün içerisinde vericinin kan grubuna değişir (Schmitz ve ark., 1996). 1.4.4. Mobilizasyon Teknikleri Normalde periferik kanda dolaşan kök hücre sayısı, transplantasyon için yetersiz miktardadır (1 / 105). Kemoterapi ve/veya rekombinant insan büyüme faktörlerinin (rHuG-CSF) kullanılması; kök-progenitör 12 hücrelerin kemik iliğinden 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ mobilizasyonunu sağlar ve periferik kandaki miktarlarını yaklaşık 100 kat arttırır. Kemoterapi, OKHT planlanan hastalarda tek başına da bir mobilizan ajan olarak kullanılabilmektedir. Ancak, sağlıklı vericilerde sadece büyüme faktörleri kullanılmalıdır (Kessinger ve Armitage, 1987). Büyüme faktörleri ve sitokinler kullanılarak; granülosit seriye ait kök-progenitör hücrelerin periferik kana mobilizasyonu, çoğalması, farklılaşması, aktivasyonu, apoptozisin engellenmesi ile hücrelerin yaşam süresinin uzatılması sağlanabilmektedir. Ek olarak, PKHT sonrası derin nötropenide olan hastaların kemik iliğinin hareketlenmesi, olgunlaşma süresinin kısaltılması (7 günden 1,5 güne kadar) ve olgun nötrofillerin kemotaksis ile fagositoz yeteneklerinin arttırılması mümkün olabilmektedir (Lieschke ve Burgess, 1992). G-CSF ve GM-CSF; mobilizasyonda en sık kullanılan büyüme faktörleridir. Görülen yan etkiler ve mobilizasyon etkinliği açısından G-CSF, GM-CSF’e göre daha avantajlı bulunduğundan G-CSF kullanımı daha yaygındır (Kröger ve ark., 2000). Bunların dışında kullanılan diğer sitokinler ise; TPO, FLT 3 Ligand (FLT3L), Stem Cell Factor (SCF) ve IL-8’dir (Filshie, 2002). Günümüzde, klinik kullanımda yaygın olarak uygulanmakta olan iki çeşit rHuGCSF bulunmaktadır. 1.4.4.1. Rekombinant Hematopoietik Büyüme Faktörleri 1.4.4.1.(1). Lenograstim (Glikolize - rHuG-CSF) Yapı ve konformasyonu, normal insan G-CSF’sinin aynısı olarak oluşturulmuş, rekombinant formdur (Kubota ve ark., 1990). Tek polipeptid zincirden oluşmuş, 174 aminoasit içeren, 20 kD ağırlığa sahip bir glikoproteindir. Cys36 ve Cys42 ile Cys64 ve Cys74 arasında oluşan iki adet disülfid köprüye sahiptir. Serbest bir sisteini (Cys 17) ile Thr133‘e bağlı bir karbonhidrat zinciri bulunmaktadır. Bu karbonhidrat yapı, moleküler ağırlığın yaklaşık olarak % 4’ünü oluşturmakta ve D-galaktoz (Gal), N-asetilgalaktozamin (GalNAc) ve N-asetilnöraminikasit (NeuAc) içermektedir. İnsan hücre dizisinden mRNA’nın ayrıştırılması ve cDNA laboratuarlarında bir 13 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ vektör aracılığıyla memeliye (CHO-Chinese hamster ovary) verilmesi ile üretilmektedir. Yapısında bulunan karbonhidrat zincir, stabilite, farmakokinetik, reseptör affinitesi, antijenite ve glikoproteinlerin biyolojik aktivitesi için önemli rol oynamaktadır. Değişik sıcaklık ve pH değerlerinde etkinliğini kaybetmez, proteolizlere karşı dayanıklıdır. Böylelikle oda sıcaklığında birkaç yıl saklanabilir. Ayrıca, granülositlerin süperoksit üretimini de düzenlemektedir (Lenograstim Product Monograph). 1.4.4.1.(2). Filgrastim (non-Glikolize-rHuG-CSF) Escherichia coli (E. coli)’ye insan G-CSF geninin yerleştirilmesi sonucu, rekombinant DNA teknolojisi ile kültür ortamında üretilmiştir. 175 aminoasit içeren 18,8 kD ağırlığında, insan DNA dizi analizine göre düzenlenmiş, N-terminal ucuna metionin (met) eklenmiş, non-glikolize formda bir proteindir. Bakterilerin protein üretimi, memelilerinkine oranla tam gelişmemiş olduğundan, Filgrastim, doğal molekül ile yapısal olarak tam özdeş değildir. Normal insan G-CSF’si etkisini diziye spesifik gösterirken, Filgrastim; doza bağlı olarak nötrofilde, alkalen fosfataz seviyesinde ve kemik iliğinde myeloid:eritroid oranında artış gösterir (Filgrastim Product Monograph). 1.4.5. Kök Hücre Toplanması HKHT amacıyla kemik iliğinin elde edilmesi, ameliyathane koşullarında ve genel anestezi ile mümkündür. Kemik iliği, pelvis kemiğinden aspirasyon yöntemi ile elde edilir (hasta/donörün toplam kan hacminin en fazla %10’u oranında) ve steril koşullarda heparin ile antikoagüle edilir. İçerdiği artefakt, eritrosit ve yağ hücrelerini uzaklaştırmak amacıyla, laboratuar koşullarında saflaştırıldıktan sonra hastaya infüze edilir. 1971 yılında, insan periferik kanında kök/progenitör hücrelerin görülmesi, daha sonrasında aferez cihazlarının kullanıma girmesi ve büyüme faktörleri ile mobilize 14 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ edilmiş periferik kandan yüksek miktarda kök hücre toplanabildiğinin gösterilmesi ile 1985-86 yıllarından sonra PKHT kullanımının önemi artmıştır. Günümüzde, OKHT’nın neredeyse tamamı, AKHT’nın ise büyük bir bölümü periferik kan kök hücreleri ile yapılmaktadır. Bunun en önemli nedenleri; • Kemik iliği toplama işleminin genel anestezi altında gerçekleştirilmesi, • Toplama (aspirasyon) işlemine bağlı uzun süreli ağrı ve infeksiyon tehlikesi, • Ürünün işlenmesi sırasında meydana gelen kök hücre kayıpları, • Otolog transplantlarda, rezidüel tümörlerden kaynaklanan metastaz/relaps görülme olasılığı, • Periferik kandan toplanan üründe daha fazla CD34+ hücre bulunması ve buna bağlı olarak trombosit ile nötrofil engrafman süresinin daha kısa olmasıdır. • Ayrıca, PKHT’de daha yüksek oranda akut ve kronik GVHH görülmesine rağmen, birçok çalışmada transplanta bağlı mortalite, relaps oranı ve yaşam süresi üzerinde önemli farklılıklar olmadığı gösterilmiştir. Periferik kandan kök hücre toplama işlemlerinde kullanılan çeşitli aferez cihazları bulunmasına rağmen, tüm cihazlar, antikoagüle edilen kanın santrifüj yöntemi kullanılarak komponentlerine ayrılması prensibi ile çalışmaktadır. Hasta/donörden alınan tam kan, antikoagüle edilir ve cihazın santrifüj sistemine gönderilir. Santrifugasyon ile tam kan; plazma, trombosit, lenfosit-monositgranülosit (Buffy coat) ve eritrosit tabakası olarak, spesifik gravitelerine göre, farklı katmanlara ayrılır. Kök/progenitör hücrelerin morfolojik olarak lenfositlere benzediği düşünüldüğünden, toplama işlemlerinde trombosit ile granülositlerin arasındaki tabaka toplanır. Toplanan ürünün Hematokrit düzeyi (Hct) %2-3 arasında olmalıdır. Burada amaç, dondurularak saklanan ve daha sonra eritilen ürünlerin infüzyonunda hemolizi ve hemolize bağlı gelişen böbrek fonksiyon bozukluğunu önlemektir. Ayrıca Hct yükseldikçe ürünün granülosit içeriği artmakta ve lenfosit içeriği azalmaktadır. Bu da, aferez tekniğiyle elde edilen ürünün CD34+ hücre miktarında düşüşe neden olmaktadır. Üründe trombosit içeriği de düşük tutulmalıdır. Böylece, hasta/donörün trombositopeniye girmesi ve üründe agregasyon/ pıhtılaşma olasılığı engellenmiş olmaktadır (Ramakrishna, 2005). 15 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ 1.4.5.1. Toplama Zamanı Toplama işlemlerinde temel amaç, az sayıda aferez işlemi ile yeterli miktarda CD34+ hücre toplanmasını sağlamaktır. Bundan dolayı, uygun toplama zamanına karar vermek çok önemlidir. OPKHT ile ilgili yapılan çok merkezli çalışmalar; günlük 5-10 µg/Kg G-CSF enjeksiyonunu takiben ve hasta nötropeniden çıkarken, beyaz küre (BK) sayısı ≥1.0X109/L ve CD34+ kök hücre sayısı ≥20/µL olduğunda afereze başlamanın gerektiğini ortaya koymuştur. APKHT’da ise, donöre 10µg/Kg/gün’den 5 gün G-CSF verildiğinde ve 5-6. günlerde toplama işlemi yapıldığında, tek seansta yeterli miktarda (4-5X106/Kg) CD34+ hücre toplanabileceği gösterilmiştir (Ramakrishna, 2005). 1.4.5.2. Toplanacak Ürün Miktarı Başarılı bir engrafmanın sağlanabilmesi için, uygun sayıda ve canlı kök hücrenin infüze edilmesi gereklidir. Kök hücre miktarını ölçmek amacıyla mononükleer hücre (MNH), CD34+ hücre tayini, koloni sayımı (CFU; colony forming unit), LT-CIC (Long term-culture initiating cells) ve viabilite (canlılık) testleri gibi farklı yöntemler kullanılmaktadır. CFU ve LT-CIC sonuçlarının tanımlanabilmesi zaman gerektirdiği için klinikte kullanılmamaktadır. Engrafmanın sağlanması, mutlak nötrofil sayısı (MNS) ≥0.5X109/L ve trombosit sayısı ≥20 X109/L olması ile tanımlanmaktadır. Bir çok merkezde bu değerlerin sağlanabilmesi için hastanın kilosu başına minimum 2-2.5 X 106/ Kg CD34+ hücre ve 2-6 X 106/ Kg MNH toplanmasının gerekliliği vurgulanmıştır. Bir çalışmada ise HLA uygun vericiden yapılan APKHT sonrası ≥8.3 X 106/ kg CD34+ hücre verilmesinin kronik GVHH riskini arttırdığı bildirilmiştir (Jansen ve ark., 2002). 16 1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ 1.4.6. Yan Etkiler APKHT’da donörde görülebilecek yan etkiler mobilizasyona bağlı olabileceği gibi aferez işlemine de bağlı olabilir. Mobilizasyonda kullanılan, G-CSF’e bağlı olarak gelişebilecek yan etkiler sıklıkla omurga, kalça ve leğen kemiğinde oluşabilen kemik ağrısı, baş ağrısı, kas ağrısı, mide bulantısı-kusma, halsizlik, uyku hali ve injeksiyon yerinde kızarıklıktır. Ayrıca serum LDH, ALP ve BUN değerlerinde artış olabilir. BK ve MNH’deki artışlar ile trombosit miktarındaki düşüş doza bağlı oluşabileceğinden, G-CSF dozu düşürülerek komplikasyon riski önlenebilir. Aferez işlemleri sırasında ise, iğne giriş yerlerinde kızarıklık, şişlik ve hafif kanama olabilir. İşlemlerde genellikle antikoagülan olarak Asit-Sitrat-Dekstrozformül-A (ACD-A) kullanılır. ACD-A; etkinliğini, bileşiminde bulunan sitratın kandaki iyonize kalsiyumu (İ.Ca) bağlaması sonucu, koagülasyon kaskadını bozarak gösterir. Bundan dolayı, aferez işlemleri sırasında, kandaki İ.Ca seviyesi düşeceğinden, donörlerde hipokalsemi gözlenebilir. Hipokalsemi sonucunda, bulantıkusma, kas krampları, hipotansiyon da gelişebilir. Bu tarz durumlarda, damar içine ve/veya oral alım ile kalsiyum desteği yapılması önerilmektedir. Donörün total kan hacmine bağlı olarak, ekstrakorporeal dolaşımdaki kan miktarının yüksek olması da hipotansiyon riskini arttırır. Ayrıca, toplanan aferez ürününün hacmine, içeriğine ve kullanılan aferez cihazının ekstrakorporeal hacmine bağlı olarak, geçici bir süre için, Hct ve trombosit sayısı da azalabilir (Anderlini ve ark., 1996) Bu çalışmada, günümüzde başta hematolojik malignansiler olmak üzere birçok hastalıkta tedavi seçeneği olarak kullanılan APKHT’de elde edilen kök hücre ürününün daha kaliteli olmasını, böylelikle transplantın daha başarılı sonuçlanabilmesini ve donörlerin minimal etkilenmesini sağlamak için kullanılan iki farklı büyüme faktörünün (Lenograstim&Filgrastim) etkinliğini değerlendirmek ve varsa olası farklılıkları belirlemek amaçlanmıştır. 17 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşe KÜSTÜ 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR De Arrıba ve ark. (1997), akciğer kanseri (Evre-II,III,IV) tanısı ile takip edilen, yaş ortalaması 43 (31-57) olan toplam 30 hastaya eşit dozda glikolize ve nonglikolize rHuG-CSF uygulamış ve uygulamanın 3. gününde kök hücre toplama işlemine başlamıştır. Aynı miktarda CD34+ hücre toplandığı zaman sonuçları değerlendirdiklerinde, ne toplanan ürünün içeriğinde ne de mobilizasyon ve toplama işlemlerinin maliyetlerinde bir farklılık olmadığını gözlemlemişlerdir. Hoglund ve ark. (1997), yaş ortalaması 27 (19-44) olan, 32 sağlıklı, erkek vericinin sonuçlarını değerlendirdikleri çalışmada, 5 gün boyunca 10 µg/Kg/gün, filgrastim ve lenograstim kullanımında karşılaşılan yan etkilerde önemli bir farklılık olmadığını kaydetmişlerdir. Ayrıca, her iki ajanın da CD34+ hücre mobilizasyonunda aynı kinetiğe aynı zaman diliminde ulaştığını göstermişlerdir. Chaisiripoomkere ve ark. (2001), yaşları 21-41 olan, 26 sağlıklı vericinin sonuçlarını analiz etmiştir. Buna göre; beyaz küre, granülosit, lenfosit, monosit, CD34+ hücre ve CFU-GM miktarları mobilizasyonun 5. gününde maksimuma ulaşmakta, fakat kırmızı küre, hematokrit ve trombosit sayısı 0. güne göre daha düşük olarak tespit edilmektedir. Sonuçta; kök hücre toplanması için en uygun zamanın mobilizasyonun 5. günü olduğunu belirtmişlerdir. Shimizu ve ark. (2002), 49 vericinin sonuçları üzerinde yapmış oldukları çalışmada; 45 yaş altındaki vericilerden, 45 yaş üstü olanlara göre çok daha fazla miktarda CD34+ hücre toplandığı sonucuna varmıştır. Fischer ve ark. (2005), donör karakterleri ve mobilizasyon tekniği arasında farklılık olmayan, 191 kadın, 409 erkek donörü değerlendirdikleri ve 18 yaş üstünü erişkin olarak kabul ettikleri bir çalışma sonucunda; yaş, boy ve kilonun mobilizasyon üzerine etkili olmadığını, fakat cinsiyetin çok önemli bir faktör olduğunu belirtmiş ve özellikle lenograstim alan erkek grubunda, kadınlara oranla daha fazla sayıda periferik CD34+ kök hücre bulunduğunu vurgulamıştır. Hüttmann ve ark. (2005), farklı tanılarla takip edilen ve yüksek doz kemoterapi sonrasında otolog kök hücre transplantasyonu olan 261 hastanın sonuçlarını değerlendirdikleri çalışmada; G-CSF tedavisi, lökosit engrafmanı ve hastanede kalış 18 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşe KÜSTÜ süresi ile işlemlerin toksisitelerini karşılaştırmışlardır. Sonuç olarak; lenograstim ve filgrastim gruplarında farklılık olmadığını, klinik kullanımda eşit olduklarını sunmuşlardır. Martino ve ark. (2005), yaş ortalamaları 42 (16-63), vücut ağırlıklarının ortalaması ise 72 Kg (47-113) olan 101 sağlıklı vericiye yapılan 230 seans kök hücre aferezi işleminin sonuçlarına ilişkin yapmış oldukları değerlendirmede, Lenograstim (n=46) ve Filgrastim (n=55)’in periferik CD34+ hücre sayısını ve toplanan CFU-GM miktarını eşit etkilediğini göstermiştir. Ayrıca; vericiler üzerindeki yan etkilerin (kemik ağrısı, başağrısı, mide bulantısı, ateş, splenomegali) aynı oranda geliştiğini vurgulamışlardır. Ings ve ark. (2006), yapmış oldukları karşılaştırmalı çalışmada, Lenograstim ile Filgrastim’in, 400 sağlıklı verici üzerindeki etkisini değerlendirmiştir. Sonuçta; yaş, cinsiyet ve ağırlığın mobilizasyona minimal etki yaptığını, toplanan CD34+ hücre miktarının önemsiz derecede farklı olduğunu, buna karşılık yalnız Lenograstim kullanıldığında, daha fazla miktarda CFU-GM toplandığını gözlemlemişlerdir. 19 3. MATERYAL VE METOD Ayşe KÜSTÜ 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal 3.1.1. Filgrastim (non glikolize rHuG-CSF) Ticari adı Neupogen (Amgen, Thousand Oaks, CA, USA)’dir. Spesifik aktivitesi 100.000 IU/µg’dır. Tek kullanımlık, 1 mL veya 1.6 mL’lik şırıngalarda, 300 µg veya 480 µg aktif madde içeren formlarda bulunmaktadır. Filgrastim ürün içeriği Çizelge 3.1.’de özetlenmiştir (Filgrastim Product Monograph). Çizelge 3.1. Filgrastim Ürün İçeriği 300 µg / 480 µg / 300 µg / 480 µg / 0.5 mL şırınga 0.8 mL şırınga 1.0 mL vial 1.6 mL vial Filgrastim 300 µg 480 µg 300 µg 480 µg Asetat 0.59 mg 0.94 mg 0.295 mg 0.472 mg Sorbitol 50.0 mg 80.0 mg 25.0 mg 40.0 mg Tween 80 0.04 mg 0.064 mg 0.02 mg 0.032 mg Sodyum 0.035 mg 0.056 mg 0.0175 mg 0.028 mg 3.1.2. Lenograstim (Glikolize rHuG-CSF) Ticari adı Granocyte (Aventis Pharma, Maisons Aalfort Cedex, France)’dır. Daha önceleri formülünde insan albumini bulunan Granocyte, patojenlerle kontaminasyonu engellemek amacı ile yeniden formüle edilmiştir. 1.4 mL steril su içeren viallerde 368 µg bulunur, final konsantrasyonu 263 µg/mL’ dir. Spesifik aktivitesi 127.760 IU/µg’dır. Ürün içeriği Çizelge 3.2.’de özetlenmiştir. Tek kullanımlık şırıngalarda bulunmakla birlikte iki farklı dozda pazarlanmaktadır (Lenograstim Product Monograph). 20 3. MATERYAL VE METOD Ayşe KÜSTÜ Çizelge 3.2. Lenograstim Ürün İçeriği Granocyte 13 Granocyte 34 Lenograstim 105 µg 263 µg D-mannitol 25 mg 25 mg L-arjinin 10 mg 10 mg L-fenilalanin 10 mg 10 mg L-metionin 1 mg 1 mg Tween 20 0.1 mg 0.1 mg Hidroklorikasit pH 6.5 pH 6.5 3.1.3. Donör Karakteri AKHT’de; kök hücre toplanacak, uygun donörün belirlenmesindeki en önemli parametre; HLA doku grubu uygunluğudur. Bundan sonra ise, klinik hekimi tarafından yapılan fizik muayene sonucunda donörün, gerek mobilizasyon gerekse aferez işlemi için uygun bulunmasıdır. Bu çalışmaya; 9’u kadın, 7’si erkek olmak üzere 16 donörde yapılan 29 allojeneik periferik kök hücre toplama işlemi dahil edildi. Donörlerin; 6’sı erişkin, 10’u ise pediatrikti. Yaş ortalamaları 19.1 (8-35), ortalama vücut ağırlıkları ise 53.1 Kg (24.3-79.5)’dı. HLA doku uygunluğu tüm donörler için %100’dü (HLA fullmatch). Yapılan fiziksel muayenede donörlerin mobilizasyon rejimi uygulanarak kök hücre toplanması için uygun olduğuna karar verildi. Mobilizasyona başlamadan önce tüm donörlerin viral profilleri (HbSAg, anti-HbS, anti-HCV, anti-HIV-1,2, antiCMV) araştırıldı, hepsi negatif olarak tespit edildi. Alıcı ile vericiler arasında, majör kan grubu antijenleri, minör eritrosit antijenleri ve Rh subgrupları açısından uygunluk testleri yapıldı. Sadece 2 donörde majör uygunsuzluk belirlendi. Uygunsuzluk tespit edilenlerde, sırasıyla: Donör; A Rh (+), AB Rh (+), hasta ise; 0 Rh (+), B Rh (+) idi. 21 3. MATERYAL VE METOD Ayşe KÜSTÜ 3.2. Metod Retrospektif olarak tasarlanan bu çalışmada, iki farklı rekombinant büyüme faktörü (glikolize rHuG-CSF ve non-glikolize rHuG-CSF) ile mobilize edilerek allojeneik periferik kök hücre toplanan sağlıklı donörler değerlendirildi. G-CSF’in uygulanma şekli ve dozu, klinik doktoru tarafından, daha önce yapılan çalışmaların sonuçlarına göre belirlendi. Bu çalışmada değerlendirilen işlemler; Çukurova Üniversitesi Balcalı Hastanesi Pediatrik KİT Ünitesi ve Terapötik Aferez, Kök Hücre ve Kriyoprezervasyon Ünitesi’nin işbirliği ile gerçekleştirildi. Yapılan çalışmada amaç; sağlıklı vericilere eşit dozda uygulanan lenograstim ve filgrastimin, allojeneik periferik kök hücre mobilizasyonunda; 1. Periferik kanda ve toplanan üründeki CD34+ hücre miktarında, 2. Elde edilen üründeki mononükleer hücre (MNH) sayısında, 3. Hedef doza ulaşmak için gerekli aferez işlem sayısında ve 4. Büyüme faktörü uygulamasına bağlı yan etkilerde, etkinliğini ve varsa farklılığını araştırmak, 5. Aynı zamanda mobilizasyona etkili diğer faktörleri (Yaş, cinsiyet, vb.) değerlendirmektir. Tüm donörler, G-CSF mobilizasyonunun yan etkileri ve olası riskler hakkında bilgilendirildi. Yasal olarak, 18 yaş üstü donörlerin kendisinden, 18 yaşından küçük olanların ise yasal vasisinden, mobilizasyon protokolü için onay formu alındı. Periferik kök hücre aferezi işlemi için ayrıca hasta ve/veya velisinden yazılı/bilgilendirilmiş onay formu temin edilerek dosyalandı. Ek olarak, retrospektif olarak tasarlanan bu çalışma için, Ç.Ü Tıp Fakültesi Etik Kurulu’nun yazılı onayı alındı. 3.2.1. Mobilizasyon Filgrastim veya lenograstim alacak donörler random seçildi. Hastaya (Alıcı) kök hücre naklinin yapılacağı gün (yüksek doz kemoterapinin bitiminden 24 saat sonra), 22 3. MATERYAL VE METOD Ayşe KÜSTÜ donörün (verici) periferik kök hücre aferezi işlemine alındığı ilk veya ikinci gün olarak ayarlandı ve buna göre mobilizasyona başlandı. Tüm donörlere; günlük 10 µg/kg/gün, tek doz ve subkutan olarak G-CSF enjeksiyonu yapıldı. Günlük G-CSF uygulamasına, kök hücre toplama işlemi bitene kadar devam edildi. Donör, bu süre boyunca, olası komplikasyonlara karşı hastanede gözlem altında tutuldu. 3.2.2. Kök hücre toplanması G-CSF uygulamasının 4. gününden başlayarak, donör periferik kanındaki MNH ve CD34+ hücre miktarı belirlendi. Bu amaçla; her sabah, G-CSF enjeksiyonundan tam 2 saat sonra alınan ve EDTA içeren tüplere konulan, 1-2 mL’lik periferik kan örnekleri kullanıldı. Kan sayımı ve CD34+ hücre düzey ölçümü, Ç.Ü. Balcalı Hastanesi Merkez Laboratuarı’nda yapıldı. CD34+ hücre düzey ölçümü, akım sitometrik (FACSCalibur, Becton Dickinson, Germany, EPICS XL-MCL, Fa Beckman Coulter, Germany) yöntemle tayin edildi. Alınan sonuçlara göre periferik kök hücre miktarı hesaplandı. Periferde yeterli miktarda CD34+ kök hücre (≥ 20/µL) bulunduğu gün, toplama işlemine başlandı. Periferik kandaki CD34+ kök hücre miktarını belirlemek için, öncelikle periferde bulunan, toplam mononükleer hücre (TMNH ) sayısı (tam kan sayımında belirtilen, BK alt gruplarından mononükleer hücrelerin toplamı) bulundu (Formül 3.1.). Formül 3.1. Periferik Kandaki TMNH Sayısının Hesaplanması TMNH (103 / µL) = Lenfosit (Lym) (103 / µL) + Monosit (Mono) (103 / µL) Bu sonuçla birlikte, akım sitometrik analizde belirlenen, TMNH içerisindeki CD34+ kök hücre yüzdesinin değerlendirilmesi ile CD34+ kök hücre sayısı hesaplandı (Formül 3.2.) 23 3. MATERYAL VE METOD Ayşe KÜSTÜ Formül 3.2. Periferik Kandaki CD34+ Kök Hücre Sayısının Hesaplanması CD34+ kök hücre sayısı / µL = MNH (103 / µL) x (%) CD34+ hücre Tüm işlemlerden önce ve sonra, donörden, tam kan sayımı (Hemogram) yapıldı. Koagülasyon parametreleri (PTZ, INR, aPTT, Fibrinojen) ve böbrek ile karaciğer fonksiyon testlerini de içeren bazı biyokimyasal testler (BUN, Kreatinin, AST, ALT, Sodyum, Potasyum, Total/İyonize Kalsiyum (T/İ.Ca)) çalıştırıldı. Hiçbir donörün laboratuar testlerinde anormal bir sonuç gözlenmedi. Aferez işlemi için, donörlerin periferik venleri kontrol edildi ve uygun bulunanlara 16-18G (gauge) intraket kullanılarak damar yolu açıldı. Periferik venleri uygun olmayanlara ise, çift lümenli 9-12 F (French) hemodiyaliz kateteri takıldı. İşlemler; sürekli akım tekniği ile çalışan hücre ayırım cihazları (CS-3000 Plus, Baxter, Germany, AS.TEC 204, Fresenius, Germany) kullanılarak yapıldı. Cihazlarda yapılan işlem ayarları; donörün giriş BK, Hct ve trombosit değerine göre hesaplandı. Ayrıca, cihazın tam kan alış hızı, donörün toplam kan hacmi (TKH) ve damar yolunun yeterli çalışmasına göre ayarlandı. Her işlemde, ortalama 7.0 L (4.2 – 10 L) kan işlendi ve donörlere 1-3 seans işlem yapıldı. Aferez işlemleri sırasında, antikoagülan olarak ACD-A kullanıldı. ACD-A : kan oranı 1:10-13 arasında tutuldu. Böylelikle hem üründe agregat oluşması engellendi, hem de yeterli antikoagülasyon sağlanmış oldu. Fazla miktarda ACD-A kullanıldığından, donörlerin hipokalsemiye girmesini engellemek amacı ile donörün kilosuna oranla kalsiyum infüzyonu yapıldı. İki işlem dışında donör TKH’sinin 2-3 katı işlendi. Bu işlemlerde, hasta ile donörün vücut ağırlıkları göz önüne alınarak yapılan hesaplamalara göre, TKH’nin 1.5 ve 3.7 katı işlendi. TKH’leri; cinsiyet ve boy:kilo oranına bağlı olarak vücut yağ kitle indeksinin değerlendirildiği, Gilcher’in 5’ler Kuralına (Gilcher, 1996 ) göre hesaplandı. İşlemlere, kök hücrelerin periferde en fazla sayıda bulunduğu zaman olarak düşünülen, G-CSF verilmesinden 3 saat sonra başlandı. Ortalama 3-4 saat süren 24 3. MATERYAL VE METOD Ayşe KÜSTÜ işlemler boyunca, donörler, kardiyolojik olarak monitörize edildi ve her 30 dakikada bir vital bulguları takip edilerek kaydedildi. İşlem sonlarında, ortalama 169 mL (50 – 386 mL) kök hücre ürünü toplandı. Ürün hacimleri, kullanılan aferez sistemine ve işlenen kan hacmine bağlı olarak farklılık gösterdi. Toplanan ürünün etkinliğini değerlendirmek amacı ile 1 mL’lik örnekler alındı. Örnek alma sırasında, bakteri kontaminasyonunu engellemek amacıyla, steril yöntemler kullanıldı. Alınan örnekler, tam kan sayımı yapılabilmesi için, yoğunluklarına göre 1:5 1:10 oranında dilüe edildi. Dilüsyon, serum fizyolojik veya sistemlerin özel solüsyonları kullanılarak yapıldı. Tam kan sayımı sonucuna göre, ürün; CD34+ hücre miktarı ölçümünün sağlıklı bir şekilde yapılabilmesi için, 20000 BK / µL olacak şekilde PBS (Phospate Buffer Saline) ile dilüe edildi. Alınan sonuçlara göre, üründen, hastanın her bir kilosu için toplanan TMNH 8 (10 / Kg) ve CD34+ kök hücre (106 / Kg) miktarı hesaplandı. Ç.Ü. Balcalı Hastanesi Pediatrik KİT Merkezi’nin ön gördüğü yeterli doz miktarı; 4 X 108 TMNH / Kg ve 5 X 106 CD34+ kök hücre / Kg’dır. Bu miktardan az ürün toplandığı durumlarda, hastada uygun zamanda engrafman sağlanamayacağı düşünüldüğünden, aferez işlemleri tekrarlanarak yeterli doz tamamlandı. 3.2.3. Kalite ve Kontrol 3.2.3.1. TMNH (108/Kg) Sayısının Hesaplanması Kök hücre ürünü içerisindeki toplam mononükleer hücre miktarı, üründen alınan tam kan sayımı sonucunda elde edilen değerlere göre hesaplanır. Bu amaçla, beyaz küre alt gruplarının da (Lenfosit, monosit, granülosit, bazofil ve eozinofil) analiz edilebildiği, 18-20 parametre çalışabilen, modern cihazlar (Becton Dickinson, Germany) tercih edildi. Hastanın her bir kilosu için toplanan TMNH miktarı Formül 3.3.’ e göre hesaplandı. 25 3. MATERYAL VE METOD Ayşe KÜSTÜ Formül 3.3. TMNH (108 / Kg) Sayısının Hesaplanması TMNH (106 / ml) = Lenfosit (Lym) (106 / ml) + Monosit (Mono) (106 / ml) TMNH (108) / Kg = TMNH (106 / ml) X Aferez ürün hacmi (ml) Hastanın vücut ağırlığı (Kg) 3.2.3.2. CD34+ Hücre (106/Kg) Miktarının Hesaplanması Akım sitometrik yöntemle yapılan analiz sonucu elde edilen yazılı sonuç, TMNH içerisinde bulunan kök hücrelerin yüzdelik oranını verir. Hastanın her bir kilosuna düşen kök hücre sayısının hesaplanması Formül 3.4. kullanılarak yapıldı. Formül 3.4. CD34+ Hücre (106/Kg) Miktarının Hesaplanması CD34+ hücre (106) / Kg = TMNH (108) / Kg X (%) CD34+ hücre 3.2.4 Kök Hücre İnfüzyonu Toplanan kök hücre ürününün infüzyonu, steril ortam koşullarında, doktor gözetiminde yapıldı. İnfüzyon sırasında hasta monitörize edildi. İnfüzyondan 30 dakika önce hastaya premedikasyon tedavisi (antihistaminik, steroid) uygulandı. İnfüzyon, ilk 5-10 dakikası oldukça yavaş, sonra daha hızlı olacak şekilde, damar yolundan normal kan transfüzyonu gibi yapıldı. Bu sırada, üründen alınan birkaç damla örnek, özel kültür şişelerine alınarak bakteri kültürü için Ç.Ü. Balcalı Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuarı’na gönderildi. Bir hafta sonrasında alınan sonuçlarda, hiçbir üründe üreme gözlenmedi. İnfüzyon sırasında alınan vital bulgu takibi, karşılaşılan komplikasyonlar, hazırlama rejimi ve infüzyon sonrası engrafman takibi yapılarak kaydedildi. 26 3. MATERYAL VE METOD Ayşe KÜSTÜ Kök hücre ürünleri, infüze edilinceye kadar, +4 °C’lik buzdolabına kaldırıldı. 72 saatten fazla korunması gerekli durumlarda ise kriyoprezervasyon (kök hücre dondurulması) yöntemi kullanılarak saklandı. Kriyoprezervasyonda, santrifügasyon ile hacmi azaltılan ürüne 1:1 oranda, içerisinde %20 DMSO (Dimetilsülfoksit) bulunan, kriyoprotektan solüsyon eklendi. Burada, DMSO kullanılarak kök hücrelerin düşük sıcaklıklarda canlı kalabilmesini sağlamak amaçlandı. Kriyoprezervasyon ile dondurulan ürünler, -196 °C’lik sıvı nitrojen tanklarında muhafaza edildi. İki vakada birinci gün yeterli miktarda ürün toplandığı halde, ikinci gün tekrar kök hücre aferezi uygulandı ve kriyoprezervasyon yöntemi kullanılarak saklandı. Her iki hastada da engrafman yetersizliği gözlendiğinden bu ürünler daha sonra infüze edildi. 3.2.5 Analiz Donörlere ait bilgiler, G-CSF mobilizasyonu süresince karşılaşılan yan etkiler açısından gözlemlenerek ve sorgulanarak verilerin kaydedildiği kayıt dosyalarından, Donörün aferez işlemi öncesi, sonrası ve toplanan aferez ürününden çalıştırılan laboratuar parametreleri, Terapötik Aferez, Kök Hücre ve Kriyoprezervasyon Ünitesi tarafından, allojeneik periferik kök hücre aferezi işlemi için özel olarak, tasarlanmış hasta kayıt formlarından elde edildi. İstatiksel hesaplamalar; SPSS (11.5, Windows, 2002 software-United Kingdom) istatistik programı kullanılarak yapıldı. Veriler; ortalama ± SD (Standart Deviation) veya ortalama ve değer aralığı şeklinde sunuldu. Tartışma bölümünde ise, ‘p’ (probability) değerinin hesaplanabilmesi için ortalama ± SEM (Standart Error of Mean) değerleri kullanıldı. 27 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Ayşe KÜSTÜ 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Bulgular Retrospektif olarak hazırlanan bu çalışmada, allojeneik periferik kök hücre transplantasyonu amacı ile kök hücre toplanan donörlerin verileri değerlendirildi. Random seçilen donörlerde, kök hücre mobilizasyonu için rekombinant insan büyüme faktörünün, (rHuG-CSF) klinikte en sık kullanılan iki formu (filgrastim, lenograstim) uygulandı. Donörler; filgrastim (n=11) ve lenograstim (n=5) almalarına göre iki gruba ayrıldı. Her donöre 10 µg/Kg/Gün dozunda G-CSF uygulandı. Filgrastim grubunda; cinsiyetleri tabloda belirtilen, 7 pediatrik (%63.6), 4 erişkin (%36.4) donör bulunurken, lenograstim grubunda; 3 pediatrik (%60), 2 erişkin (%40) donör bulunmaktadır. Donörlere ait genel bilgiler ve işlem bilgileri Çizelge 4.1.’ de özetlenmiştir. Çizelge 4.1. Donör Karakterleri ve İşlem Bilgileri Filgrastim (n=11) Lenograstim (n=5) Cinsiyet 4E / 7K 3E / 2K Yaş 18 ( 8-30 ) 20.2 ( 12 – 35 ) Kilo 48.2 (24.3-79.5) 58 ( 37 – 79.5 ) TKH (L) 3.0 ( 1 - 4.4 ) 3.8 ( 2.5 - 5.4 ) G-CSF Dozu 10 µg/Kg/Gün 10 µg/Kg/Gün Aferez Günü 4.2 ( 4 - 6) 4.6 ( 4 - 5) İşlem Sayısı 1.9 ( 1 – 3 ) 1.6 ( 1 – 2 ) İKH / TKH 2.3 ( 2 – 3.7 ) 1.8 ( 1.5 – 2.3 ) İKH (L) 6.9 ( 3.7 – 10 ) 7.1 ( 5.1 – 9.2 ) TMNH (10 ) / Kg 4.2 ( 1 – 8.9 ) 4.6 ( 2.2 – 5.8) TMNH (1010) / Lt 19 ( 4.2 - 36.3 ) 27.2 ( 21.1 - 40 ) CD34+ (106) / Kg 9.8 ( 1.3 – 22.3 ) 9.7 (2.6 – 17.9 ) CD34+ (108) / Lt 44.4 ( 2.3 – 92.4 ) 31.3 ( 11.3 – 60.2 ) 8 TKH: Total Kan Hacmi, İKH: İşlenen Kan Hacmi, TMNH: Total Mononükleer Hücre, 28 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Ayşe KÜSTÜ Mobilizasyonun 4. gününden itibaren, aferez işlemi süresince alınan kan örnekleri kan sayımı ve CD34+ hücre tayini için Ç.Ü Balcalı Hastanesi Merkez Laboratuarı’na gönderildi ve sonuçlar değerlendirildi. Periferik kan örneklerinin sonuçlarına bakıldığında, BK sayıları; filgrastim grubunda, 32.5 ± 9.7 (103/ µL) , lenograstim grubunda ise 33.3 ± 10.5 (103/ µL) olarak gözlendi. Flow sitometri analizinde belirtilen, MNH içerisindeki CD34+ hücre yüzdesi; filgrastimde %1.3 ± 1.1, lenograstimde ise %0.5 ± 0.40 idi. Bu değerlere göre µL’deki CD34+ kök hücre miktarı hesaplandığında, filgrastim grubunda; 74.7 ± 57.6 bulunurken, lenograstim grubunda 36.5 ± 15.4 olarak hesaplandı (Şekil 4.1.). 74.7 120 100 80 60 32.5 36.5 33.3 40 1.3 20 0.5 0 BK CD34+ Filgrastim CD34+% Lenograstim Şekil 4.1. Kök Hücre Aferezinin Birinci Gününde Periferik Kan Değerleri Alınan değerlere bağlı olarak gerekli hesaplamalar yapıldı ve filgrastim grubundan, 5 donör (%45.5) mobilizasyonun 4. gününde, 6 donör (%54.5) ise 5. gününde aferez işlemine alındı. Yine aynı şekilde, lenograstim grubundan, 4 donöre (%80) mobilizasyonun 5. gününde, bir donöre (%20) ise 4. gününde kök hücre aferezi işlemine başlandı. Donörler; aldıkları mobilizan ajana bakılmaksızın, kök hücre aferezinin, mobilizasyonun 4. veya 5. gününde başlamasına göre iki gruba ayrılarak incelendi. 4. gün ve 5. gün başlayanlarda periferik kan sonuçları sırasıyla; BK: 36.9 ± 9.9 (103/ µL) , 30.2 ± 9.0 (103/ µL) , CD34+ hücre yüzdesi, 4. gün grubunda %0.6 ± 0.3, 29 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Ayşe KÜSTÜ 5. gün grubunda ise %1.3 ± 1.2 olarak gözlendi. Gerekli hesaplamalar yapıldığında, µL’deki CD34+ hücre sayısı sırasıyla; 67.9 ± 28.0 ile 96.3 ± 84.8 olarak bulundu. Ayrıca, lenograstim ve filgrastim alanlar olarak iki grup altında toplandığında, aferezin 1. günündeki periferik kan değerleri; lenograstim grubunda, BK; 33.3 ± 10.5 (103/ µL) , CD34+ hücre yüzdesi %0.5 ± 0.4 ve µL’deki CD34+ hücre sayısı 36.5 ± 15.4 bulundu. Filgrastim grubunda ise BK; 32.5 ± 9.7 (103/ µL) , CD34+ hücre yüzdesi %1.3 ± 1.1 ve µL’deki CD34+ hücre sayısı 74.7 ± 57.6 bulundu. Bu sonuçlar değerlendirildiğinde, donörlerin periferik kök hücre aferezi için uygun olduğuna karar verildi ve kök hücre toplama işlemine başlandı. Aferez işleminin etkinliğinde, donörlerin giriş BK ve CD34+ hücre sayısının yanında Hct ve trombosit sayıları da çok önemlidir. Bu sonuçlar göz önüne alınarak, aferez cihazlarında program bilgileri ayarlanmakta ve en iyi sonuç alınması sağlanmaktadır. Tam kan sayım sonuçlarına bakıldığında, filgrastim grubunda Hct; %35.1 ± 5.1 , trombosit sayısı 256.07 ± 45.4 (10³/µL) , lenograstim grubunda ise Hct; %35.7 ± 7.1, trombosit sayısı 297.7 ± 52.5 (10³/µL) olarak gözlendi. Bu değerler hem işlem etkinliği hem de donörün sağlığı açısından risk taşımıyordu. İşlem tamamlandığında, aferez ürününden alınan örnekler, merkez laboratuarına gönderildi ve sonuçlar değerlendirildi. Filgrastim grubunda BK; 148.5 ± 130.4 (10³/µL) ve CD34+ hücre yüzdesi; %2.4 ± 2.2 olarak gözlenirken, lenograstim grubunda BK; 131.2 ± 74.1 (10³/µL) ve CD34+ hücre yüzdesi; %1.4 ± 1.2 olarak görüldü. Toplanan ürün miktarı ve sonuçları, hastanın kilosuna göre hesaplandı (Bakınız; TMNH/Kg ve CD34+ hücre/Kg hesaplanması). Hesaplamalar sonucunda; filgrastim grubunda, TMNH/Kg; 4.2 ± 2.2 (108 /Kg) ve CD34+ hücre/Kg; 9.8 ± 8.5 (106/Kg) olarak hesaplandı. Lenograstim gubunda ise, TMNH/Kg; 4.6 ± 0.9 (108 /Kg) ve CD34+ hücre/Kg; 9.7 ± 6.6 (106/Kg) (Şekil 4.2.) şeklinde hesaplandı. 30 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 160 140 120 100 80 60 40 20 Ayşe KÜSTÜ 148.5 131.2 4.2 4.6 2.4 1.4 9.8 9.7 0 BK TMNH/kg CD34+% Filgrastim CD34+/kg Lenograstim Şekil 4.2. I. Gün Kök Hücre Ürün Değerleri Bu hesaplamaların değerlendirilmesi sonucunda, donörlerin ikinci kez kök hücre aferezi işlemine alınıp alınmayacağına karar verildi. Filgrastim grubunda ilk seansta 6 donörden (%54.5), hasta için yetersiz miktarda TMNH (108 /Kg) toplandı. Bu hastaların, 3’ünde sadece TMNH (108/Kg) sayısı yetersiz miktardaydı. 3 hasta için ise hem TMNH (108 /Kg) hem de CD34+ hücre sayısı (106/Kg) yetersiz miktarda toplandı. Lenograstim grubunda ise 1 hasta (%20) için, TMNH (108 /Kg) ve CD34+ hücre sayısı (106/Kg), bir hasta (%20) için ise sadece CD34+ hücre sayısı (106/Kg) yetersiz miktarda bulunduğundan aferez işlemi tekrarlandı. İşlemlerin sonunda kök hücre ürünlerinden alınan örneklerin laboratuar sonuçlarına göre yapılan hesaplamalar Çizelge 4.2.’de özetlenmiştir. Çizelge 4.2. İkinci Gün Kök Hücre Ürün Değerleri BK (10³/µL) TMNH (108 /Kg) CD34+ hücre (106/Kg) Filgrastim (n=11) 107.1 (10³/µL) (10.6-442X10³/µL) 3.8x108 /Kg (1-6.8X108 /Kg) 17.9x106/Kg (1.4-56.3 X106/Kg) Lenograstim (n=5) 122.7 (10³/µL) (68-167X10³/µL) 3.9x108 /Kg (2.2-4.7X108 /Kg) 5.4x106/Kg (2.6-6.5X106/Kg) 31 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Ayşe KÜSTÜ Hem filgrastim hem de lenograstim grubundan ikişer donöre, hasta için yeterli miktarda TMNH (4.5-5.9 X 108 /Kg) ve CD34+ kök hücre sayısı (12.5-24.5 X106/Kg) tek seansta toplandığı halde, ikinci defa kök hücre aferezi uygulandı. Her iki gruptan da birer hastaya iki günlük ürün, double (iki) doz olarak infüze edildi, birer hastanın ürünleri ise kriyoprezervasyon yöntemi ile saklandı. Kriyoprezerve edilen ürünler, her iki hastada da engrafman yetmezliği gözlendiğinden, daha sonra infüze edildi. 160 140 120 148.5 131.2 122.7 107.1 100 80 60 40 20 4.2 4.6 3.9 3.9 9.8 9.7 17.9 5.4 0 BK I.Gün BK II.Gün TMNC/kg I.Gün Filgrastim TMNC/kg II.Gün CD34+/kg CD34+/kg I.Gün II.Gün Lenograstim Şekil 4.3. Filgrastim ve Lenograstim Grubunda I. ve II. Gün Ürün Değerleri Sadece, filgrastim grubundan bir donöre 3. seans aferez işlemi uygulandı. Aferez işlemleri, mobilizasyonun 4. , 5. ve 6. günlerinde TKH’nin 2 katı işlenerek gerçekleştirildi. Ürünlerden 1. , 2. ve 3. günlerde sırasıyla 1 , 1 ve 1.2 (108 / Kg) TMNH elde edilirken 1.3 , 1.4 ve 1.6 (106 / Kg) CD34+ kök hücre elde edildi. Toplamda 3.2 X 108/Kg TMNH ve 4.3 X 106/Kg CD34+ kök hücre infüze edilen hastada uygun zamanda engrafman sağlandı. 10 µg/Kg/Gün dozunda filgrastim alan, 21 yaşındaki kadın donör, kötü mobilizasyon olarak seçildi. Ayrıca, üründeki toplam TMNH ve CD34+ hücre sayısı, işlenen kanın her bir litresi için orantılandı. Sonuç olarak; işlenen her bir litre kan için TMNH (1010/L), filgrastim grubunda; 19.0 ± 10.0 (1010/L) bulunurken, lenograstim grubunda 27.2 ± 8.1 ( 1010/L) bulundu. Yine aynı şekilde, CD34+ (108/L) hücre sayısı hesaplandı ve 32 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Ayşe KÜSTÜ filgrastim grubunda 44.4 ± 25.3 (108/L), lenograstim grubunda ise 31.3 ± 23.2 (108/L ) sonuçları bulundu. Donörler, yaş ve cinsiyetlerine göre sınıflandırıldı. 18 yaşından küçük (8–15 yaş) 10 donör pediatrik ve 18 yaşından büyük (21-35 yaş) 6 donör ise erişkin olarak ayrıldı. Filgrastim veya lenograstim almasına bakılmaksızın, I. gün periferik kan sonuçları değerlendirildi (Çizelge 4.3.). Pediatrik donörlerde BK: 31.9 ± 10.7 (103/ µL) , CD34+hücre yüzdesi % 1.2 ± 0.9 ve µL/deki CD34+ hücre sayısı 56.0 ± 55.0 olarak bulunurken, erişkinlerde, sırası ile BK: 34.0 ± 8.2 X 103 , kök hücre yüzdesi % 1.3 ± 0.6 ve µL/deki CD34+ hücre sayısı 120.0 ± 85.0 sonuçları alındı. Çizelge 4.3. Yaş Dağılımına Göre Periferik Kan Sonuçları BK (103 /µL) % CD34+ CD34+ / µL Min. Max. Ort. Min. Max. Ort. Min. Max Ort. Pediatrik 18.8 47.5 31.9 0.13 3.6 1.2 13.0 173 56.0 Erişkin 23.4 42.6 34.0 0.96 2.2 1.3 34.0 226 120 Cinsiyet dağılımına göre kadın ve erkek olarak gruplandırıldıklarında, elde edilen sonuçlara (Çizelge 4.4.) bakıldığında; kadın ve erkekte sırası ile, BK; 34.1 ± 9.3 – 30.9 ± 10.5 (103/µL) , CD34+ hücre yüzdesi; %1.4 ± 1.0 – 1.5 ± 1.0 ve µL’deki CD34+ hücre sayısı 83.3 ± 39.6 – 62.8 ± 45.5 olarak gözlemlenmiştir. Çizelge 4.4. Cinsiyet Dağılımına Göre Periferik Kan Sonuçları BK (103 /µL) % CD34+ CD34+ / µL Min. Max. Ort. Min. Max. Ort. Min. Max Ort. Erkek 18.8 43.2 30.9 0.13 2.4 1.5 12.0 221 62.8 Kadın 23.4 47.1 34.1 0.62 3.6 1.4 34.0 150 83.3 Filgrastim ve lenograstim grubundan, aynı kiloya sahip donörlerin sonuçlarına bakıldığında; filgrastim grubunda, vücut ağırlığı 60 Kg olan, biri kadın biri erkek iki donörün mobilizasyonun 4. gününde periferik kan sonuçları; BK; 44.4 – 43.2 (103 /µL) , CD34+ hücre yüzdesi %0.62-2.4 , CD34+ hücre sayıları 60.7 – 221.5 /µL 33 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Ayşe KÜSTÜ olarak gözlendi. Yine aynı şekilde, 60 Kg olan biri filgrastim biri lenograstim ile mobilize edilen ve mobilizasyonun 4. gününde aferez işlemine alınan iki kadın donörün verileri değerlendirildiğinde; periferik kan BK sayısı filgrastimde 44.4 (103 /µL), lenograstimde 47.1 (103 /µL) , CD34+ hücre yüzdeleri sırasıyla % 0.62 ve %0.68 olarak geldi. µL ‘deki CD34+ hücre sayısı hesaplandığında ise 60.7/µL ve 54 /µL sonucu bulundu. Mobilizasyon ve aferez işlemleri süresince gözlemlenen ve sorgulanan donörlerde, mobilizasyona bağlı karşılaşılan komplikasyonlar; iskelet ağrısı, baş ağrısı, mide ağrısı, halsizlik ve bulantı olarak kaydedildi. Analjezik ve anti-emetik tedavi verildi. Hiçbir donörde ciddi yan etkilerle karşılaşılmadı ve ilaç kullanım gereksinimi gözlenmedi. Filgrastim ve lenograstim grubu için karşılaşılan yan etkiler ve görülme sıklığı Şekil 4.4.’de sunulmuştur. Uzun dönemde karşılaşılabilecek yan etkiler açısından her hangi bir değerlendirme yapılamadı. Komplikasyonlar 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% İskelet Ağrısı Baş Ağrısı Mide Ağrısı Filgrastim Halsizlik Bulantı Lenograstim Şekil 4.4. Mobilizasyona Bağlı Karşılaşılan Yan Etkiler ve Görülme Sıklıkları 34 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Ayşe KÜSTÜ 4.2 Tartışma Son yıllarda, mobilize periferik kök hücre kullanılarak yapılan transplantlara ilginin artmasındaki en önemli etkenler; kemik iliği toplanmasında olduğu gibi, genel anestezi altında cerrahi bir girişim gerektirmemesi, donör açısından daha az risk taşıması, donörün günlük yaşam kalitesini etkilememesi, daha fazla miktarda kök hücre toplanabilmesi ve buna bağlı olarak engrafman süresinin kısalmasıdır. Kemik iliğinden periferik kana kök hüre mobilizasyonunu sağlamak amacı ile farklı sitokinler kullanılmaktadır. Yan etkiler ve mobilizan etkisi açısından değerlendirme yapıldığında, kullanılmaktadır. Filgrastim klinikte en (non-glikolize sık olarak rHuG-CSF, G-CSF’in E.coli iki formu kültürü) ve Lenograstim (glikolize rHuG-CSF, memeli hücresi kültürü); rekombinant-DNA teknolojisi ile üretilmiş olup, üretimlerindeki farklılıktan dolayı amino asit dizisi ve glikolizasyonda farklılık göstermekte, bu da spesifik özelliklerini ve aktivitelerini değiştirmektedir. Bunun anlaşılabilmesi için, hem in-vitro hem de in-vivo olarak gerçekleştirilen bazı çalışmalar yapılmıştır. Yapmış olduğumuz çalışmada; daha önce yapılan değerlendirmelerden de faydalanarak; filgrastim ve lenograstimin periferik kanda ve toplanan üründeki CD34+ hücre miktarında, elde edilen üründeki mononükleer hücre sayısında, hedef doza ulaşmak için gerekli aferez işlem sayısında ve büyüme faktörü uygulamasına bağlı yan etkilerde etkinliğini ve varsa farklılığını araştırmak, aynı zamanda mobilizasyona etkili diğer faktörleri (yaş, cinsiyet, vb.) değerlendirmektir. Çalışmamızda, yaşları 8-35 arasında değişen, 9’u kadın 7’si erkek, eşit dozda, randomize olarak filgrastim (n=11) veya lenograstim (n=5) uygulanan toplam 16 donöre ait veriler kullanıldı. Özellikle, lenograstim grubunun örnek sayısı az olduğundan, bazı değerlendirmeler gerçekleştirilemedi. Nissen ve ark. (1994), eşit dozda uygulanan lenograstim ve filgrastimi karşılaştırdıklarında, insan kemik iliği granülosit kolonilerinin filgrastim kullananlarda daha iyi uyarıldığını bulmuştur. Pedrazzoli ve ark. (1996) ise, yapmış oldukları çalışmada; lenograstimin, filgrastime göre periferik kandaki CFU-GM ve CD34+ kök hücre sayısını arttırmada daha etkin olduğunu göstermiştir. Yapmış oldukları in-vitro çalışmada ise, iki G-CSF’in farklı 35 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Ayşe KÜSTÜ spesifik aktiviteye sahip olduğunu bulmuştur. Çalışmamızda, 60 Kg olan biri filgrastim biri lenograstim ile mobilize edilen ve mobilizasyonun 4. gününde aferez işlemine alınan iki kadın donörün verileri değerlendirildiğinde; periferik kan BK sayısı filgrastimde 44.4 (103 /µL), lenograstimde 47.1 (103 /µL) , CD34+ hücre yüzdeleri sırasıyla %0.62 ve %0.68 olarak gözlemlenmiştir. µL’deki CD34+ hücre sayısı değeri hesaplandığında ise 60.7/ µL ve 54/ µL sonucu bulunmuştur. Etkinlik; eşit olarak görülmüş fakat tek örnek olduğundan istatistiksel değerlendirilmeye alınmamıştır. Martino ve ark. (2005) tarafından yapılan çalışmada, filgrastim grubunda 55, lenograstim grubunda 46 olmak üzere toplamda 101 donörün verileri değerlendirilmiştir. Donörlerin yaş, cinsiyet ve kilo dağılımı dengelenmiş, eşit dozda (µg/kg/gün) G-CSF desteği ortalama 5 (4-7) gün yapılmıştır. Donörler, hem filgrastim hem de lenograstim grubunda 4. gün veya 5. gün afereze başlananlar olarak iki gruba ayrılmıştır. Sonuçta; hem 4. hem de 5. gün periferik kan CD34+ kök hücre sayısı, filgrastim grubunda daha yüksek oranda bulunurken, aferez ürünü CD34+ kök hücre sayısı ise lenograstim grubunda daha fazla miktarda bulunmuştur. Fakat sonuçlar istatiksel olarak önemsiz derecede farklılık göstermiştir. Yapmış olduğumuz çalışmada ise, lenograstim grubunda sadece bir donörde mobilizasyonun 4. gününde aferez işlemi başladığından, istatiksel bir karşılaştırma yapılamamıştır. Chaisiripoomkere ve ark. (2001) tarafından, yaşları 21-41 olan, 26 sağlıklı vericinin sonuçlarını analiz ettikleri bir çalışmada, beyaz küre ve CD34+ hücre sayısının mobilizasyonun 5. gününde maksimuma ulaştığı, bu nedenle kök hücre toplanması için en uygun zamanın mobilizasyonun 5. günü olduğu belirtilmiştir. Kendi verilerimiz, filgrastim ve lenograstim grubundaki tüm bireyler 4. ve 5. gün aferez işlemine başlananlar olarak iki gruba ayrıldığında; periferik kan sonuçlarından; ortalama BK miktarının I. grupta (36.9±4.0, 30.2±2.8, p>0.05), CD34+ hücre yüzdesinin ise, II. grupta daha yüksek (0.6±0.1, 1.3±0.4, p>0.05) olduğu gözlenmiştir. CD34+ kök hücre sayısı, II. grupta daha yüksek (67.9±12.5 , 96.3±28.2, p>0.05) sayıda bulunmuştur. Her ne kadar 4. gün periferik kök hücre sayısı daha yüksek görünse de, istatistiksel değerlendirme yapıldığında, iki grup arasındaki farklılıklar önemsiz olarak kabul edilmiştir. 36 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Ayşe KÜSTÜ De Arriba ve ark. (1997), eşit dozda uygulanan lenograstim ve filgrastimin biyolojik aktivitesini karşılaştırmak amacı ile yapmış oldukları prospektif çalışmada, 30 akciğer kanseri hastasının verilerini değerlendirmiştir. Bu çalışmanın sonucunda, eşit dozda uygulanan (MU/Kg/Gün) filgrastim ve lenograstimin; periferde dolaşan BK, monosit, total CD34+ hücre miktarının artışını istatiksel olarak aynı oranda artırdığını gözlemlemiştir. Verilerimiz, filgrastim ve lenograstim grubunda, aferezin birinci gününde, periferik kan değerleri alınarak karşılaştırıldığında; filgrastim alan donörlerin, lenograstim alanlara göre daha fazla sayıda CD34+ hücre bulundurduğunu (74.7±18.2 , 36.5±8.9 , p>0.05 ) göstermiştir. Yapılan değerlendirme sonucunda aradaki farklılığın, BK sayısına (32.5±2.9 , 33.3±4.6 , p>0.05) değil de, CD34+ hücre yüzdesindeki (1.3±0.4 , 0.5±0.2 , p>0.05 ) farklılığa bağlı olduğu gözlenmiştir. Fakat, hesaplamalar yapıldığında, farklılıkların istatistiksel yönden anlamsız olduğu bulunmuştur. Hoglund ve ark. (1997), eşit dozda iki farklı G-CSF ile mobilize edilen, 32 erkek donörü değerlendirmiştir. Sonuçta; lenograstim ile mobilize edilen grupta, toplanan CFU-GM (Colony forming unit-granulocyte macrophage) ve CD34+ hücre sayısında önemli derecede üstünlük olduğunu gözlemiştir. Benzer bir karşılaştırmalı çalışmada ise, Watts ve ark. (1997), 5 µg/kg/gün dozunda lenograstim uygulanan grupta, filgrastim grubuna göre çok daha fazla miktarda CFU-GM ve CD34+ hücre toplandığını rapor etmiştir. Çalışmamızda, toplanan kök hücre ürünlerinin TMNH ve CD34+ kök hücre sonuçları, hem hastanın kilosu hem de işlenen kan hacminin her bir litresi için ayrı ayrı hesaplanmıştır. Birimimizde, CFU-GM tayini yapılamadığı için, değerlendirmeye alınmamıştır. Sonuçlara bakıldığında, lenograstim ile filgrastim gruplarında ürün BK sayısı (131.2±33.1 , 148.5±39.3 , p>0,05) ve CD34+ hücre yüzdesinin (1.4±0.6 , 2.4±0.7 , p>0.05) önemsiz derecede faklılık gösterdiği gözlemlenmiştir. Bu değerlere göre hesaplamalar yapıldığında lenograstim ve filgrastim gruplarında hem TMNHx108 /Kg (4.6±0.4 , 4.2± 0.6 , p>0,05 ) hem de TMNHx1010/Lt (27.2±3.6 , 19.0±2.6 , p>0.05) eşit miktarlarda bulundu. Aynı zamanda, CD34+ kök hücre miktarı da hem hastanın kilosu (9.7±2.9x106, 9.8±2.7x106 , p>0.05), hem de işlenen her bir litre kan (31.3±10.3x108, 44.4±11.6x108 , p>0.05) için orantılandığında eşit miktarlarda olduğu görülmüştür. 37 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Ayşe KÜSTÜ Martino ve ark. (2005) yapmış oldukları çalışmada, istenilen değerde (4x106 / Kg) CD34+ kök hücre sayısının hem filgrastim hem de lenograstim grubunda büyük oranda (%50.9 - 55.5) tek aferez işlemi ile toplanabildiğini, fakat lenograstim grubunda daha fazla miktarda kan işlenmesi gerektiğini sunmuştur. Merkezimizde, CD34+ hücre yanında TMNH sayısının da yeterli olması istenmektedir. Verilerimiz değerlendirildiğinde, önceki çalışmadan farklı olarak, aynı hacimde kan işlenmesi ile; hem TMNH hem de CD34+ kök hücre sayısının yeterli miktarda toplanabildiği görülmüştür (Çizelge 4.1) (p>0,05). Hem aferez işlem sayısı ve buna bağlı artan işlem ücretleri, hem de mobilizasyon ücreti araştırmacıların ilgisini çekmiştir. De Arrıba ve ark. (1997), eşit miktarda kök hücre toplanan gruplarda maliyetin her iki grup içinde aynı olduğunu hesaplamıştır. Sonuçlarımıza bakıldığında, G-CSF verilen gün sayısı ve aferez işlem sayısının (Çizelge 4.1.) istatistiksel olarak (p>0,05) aynı olduğunun görülmesi, hem lenograstim hem de filgrastimin maliyette eşit olduğu sonucunu desteklemiştir. De La Rubia ve ark. (2001), yapmış oldukları bir çalışmada, G-CSF ile mobilize edilen pediatrik hastalardan erişkinlere göre çok daha fazla sayıda CD34+ kök hücre toplandığını bulmuştur. Fischer ve ark. (2005), donör karakterleri ve mobilizasyon tekniği arasında farklılık olmayan, 191 kadın, 409 erkek donörü değerlendirdikleri ve 18 yaş üstünü erişkin olarak kabul ettikleri bir çalışma sonucunda; yaş, boy ve kilonun mobilizasyon üzerine etkili olmadığını, fakat cinsiyetin çok önemli bir faktör olduğunu belirtmiş ve özellikle lenograstim alan erkek grubunda, kadınlara oranla daha fazla sayıda periferik kök hücre bulunduğunu vurgulamıştır. Ings ve ark. (2006), karşılaştırmalı çalışmalarında, Lenograstim ile Filgrastim’in, 400 sağlıklı verici üzerindeki etkisini değerlendirmiştir. Sonuçta; yaş, cinsiyet ve ağırlığın mobilizasyona minimal etki yaptığını savunmuştur. Çalışmamızda; filgrastim veya lenograstim almasına bakılmaksızın, kadın-erkek ve pediatrik-erişkin (yaş sınırı 18 alındı) olarak gruplandırılan donörlerin sonuçları tartışıldı. Kadın ve erkeklerde periferik kan sonuçlarına bakıldığında; BK (34.1±3.1 , 30.9±3.9 , p>0.05) ve CD34+ hücre sayısının (83.3±15.0 , 62.8±25.6 , p>0.05) eşit olduğu görülmüştür. Filgrastim grubunda bulunan, 60Kg ağırlığa sahip, biri kadın biri erkek iki donörün periferik kan sonuçları hesaplandığında, CD34+ hücre sayısının erkekte önemli derecede 38 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Ayşe KÜSTÜ üstünlük gösterdiği saptanmış fakat, tek örnek olduğu için istatistiksel olarak değerlendirmeye alınmamıştır. Pediatrik ve erişkin grupları karşılaştırıldığında ise, periferik kan BK sayısının (31.9±3.4 , 34.0±3.6 , p>0.05) eşit olduğu, CD34+ hücre yüzdesinin (1.2 ±0.4 , 1.3±0.5 , p>0,05) ve CD34+ hücre sayısının (56.0±18.3 , 120.0±38.0 , p>0.05) önemsiz farklılıklar gösterdiği bulunmuştur. Martino ve ark. (2005), lenograstim ve filgrastim alan her iki grupta da trombosit sayısında düşüş olduğunu, fakat, bunun donör açısından risk taşımadığını belirtmiştir. Bu çalışmada; lenograstim ve filgrastim gruplarında, hem Hct hem de trombosit sayıları kontrol edilmiştir. Sonuç olarak, her iki grupta da hiçbir donörün sağlığı açısından risk taşımayan benzer sonuçlar (p>0.05) alınmıştır. Hoglund ve ark. (1997), yaş ortalaması 27 (19-44) olan, 32 sağlıklı, erkek vericinin sonuçlarını değerlendirdikleri çalışmada, 5 gün boyunca 10 µg/Kg/gün, filgrastim ve lenograstim kullanımında karşılaşılan yan etkilerde önemli bir farklılık olmadığını kaydetmiştir. Martino ve ark. (2005), düşük doz alınan G-CSF’in iyi tolere edildiğini, doz artışına bağlı olarak, en sık karşılaşılan yan etkinin; kemik ağrısı, sonrasında ise, baş ağrısı, mide bulantısı, ateş ve splenomegali olduğunu belirtmiştir. Bu yan etkilerin, sürekli ilaç kullanımı gerektirmediğini vurgulamıştır. Sonuçlarımıza bakıldığında, benzer şekilde, karşılaşılan komplikasyonlar; iskelet ağrısı, baş ağrısı, mide ağrısı, bulantı ve halsizlik olarak kaydedilmiştir. Yan etkiler, lenograstim grubunda daha sık oranda karşılaşılmasına rağmen, fark, şiddetler göz önüne alındığında önemsiz olarak kabul edilmişti (p>0.05). Hiçbir donörde ciddi yan etkilerle karşılaşılmamıştır. 39 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Ayşe KÜSTÜ 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Bu çalışmada allojeneik periferik kök hücre transplantasyonunda mobilizasyon amacı ile donöre eşit dozda uygulanan iki farklı G-CSF türü değerlendirildi. Değerlendirmede, periferik kan ve toplanan kök hücre ürününde bulunan MNH ve CD34+ kök hücre miktarı, aferez işlem sayısı, maliyet, karşılaşılan yan etkiler ve mobilizasyona etkili diğer faktörler (yaş, cinsiyet vb.) karşılaştırıldı. Sonuçta lenograstim ile filgrastimin; allojeneik perferik kök hücre transplantasyonu amacıyla, mobilizan ajan olarak kullanıldığında, MNH ve kök hücre sayısı üzerinde eşit etki oluşturacağı saptandı. Yaş, cinsiyet ve kilonun mobilizasyona minimum etki yaptığı, her iki G-CSF’inde yan etkiler ve maliyet açısından önemsiz derecede farklı olduğu sonucuna varıldı. Yine de, bilimsel olarak daha net bir sonuç alabilmek için, böyle bir çalışmanın prospektif olarak düzenlenerek ve daha fazla örnek sayısı oluşturularak yapılması önerilmektedir. 40 KAYNAKLAR ADACHI, S., KUBOTA, M., LIN, Y.W., OKUDA, A., MATSUBARA, K., WAKAZONO, Y. and HİROTA, H., 1994. In vivo administration of granulocyte-colony stimulating factor promotes neutrophil survival in vitro. European Journal of Haematology, 53 ,129-134. ANDERLINI, P., PRZEPIORKA, D., SEONG, D., O’BRIEN, S., GIRALT, S., IPPOLITI, C. and KORBLING, D., 1996. Clinical toxicity and laboratory effects of granulocyte colony stimulating factor mobilization and blood stem cell apheresis from normal donors , and analysis of charges forth procedure. Transfusion, 36 ,590-595 APPELBAUM, F.R., 2000. Is there a best transplant conditioning regimen for acute myeloid leukemia ?. Leukemia, 14 , 497-500. ARPACI, F., 2006. Türkiye Kök Hücre Nakli Verileri ve Türkiye’de Kök Hücre Transplantasyonu’nun Tarihçesi. 2. Ulusal Kök Hücre Kongresi-Trabzon / Türkiye. ASANO, S., 1991. Human granulocyte colony-stimulating factor. Its basic aspects and clinical applications. American Journal of Pediatric HaematologyOncology, 13 , 400-413. BENICHOU, G., TOM, R.C., SOARES, L.R. and FEDOSEYEVA, E.V., 1997. Indırect T-Cell allorecognition: perspectives for peptide-based therapy in transplantation. Immunology Today, 18 , 67-71. CHAISIRIPOOMKERE, W., JOOTAR, S. and UNGKANONT, A., 2001. Effect of G-CSF on peripheral blood progenitor cell mobilization and collection from healthy donors. Asian Pac Journal of Allergy Immunology, 19(3) , 183-190. DE ARRIBA, F., LOZANO, M.L., ORTUNO, F., HERAS, I., MORALEDA, J.M. and VICENTE, V., 1997. Prospective randomized study comparing the efficacy of bioequivalent doses of glycosylated and non-glycosylated rG-CSF for mobilizing peripheral blood progenitor cells. British Journal of Haematology, 96 , 418-420. 41 DE LA RUBIA, J., DIAZ, M.A., VERDEGUER, A., PASCUAL, M.J. and AR-SEVILLA, C., 2001. Donor age related differences in PBPC mobilization with rHuG-CSF. Transfusion, 41 , 201-205 DEMETRI, G.D. and GRIFFIN, J.D., 1991. Granulocyte colony-stimulating factor and its receptor. Blood, 78 , 2791-2808. DUNCOMBE, A.,1997. ABC of clinical haematology: bone marrow and stem cell transplantation. British Medical Journal, 314 , 1179-1182. EBMT (The Europan Group for Blood and Marrow Transplantation), 2000. Endication Categories of Stem Cell Transplantation. FILSHIE, R., 2002. Cytokines in haematopoietic progenitor mobilization for peripheral blood stem cell transplantation. Current Pharmacology Design; 8 , 379-394. FISCHER, J.C., FRICK, M., WASSMUTH, R., PLATZ, A., PUNZEL, M. and WERNET, P., 2005. Superior mobilisation of haematopoietic progenitor cells with glycosylated G-CSF in male but not female unrelated stem cell donors. British Journal of Haematology, 130 , 740-746. GILCHER, R.O., 1996. Apheresis: Principles and Practices. Principles of Transfusion Medicine, 2nd Edition. .Ed. Rossi EC, Simon TL, Moss GS, Gould SA. Baltimore, MD: Williams and Wilkins. 537-545 GROOPMAN, J.E., MOLINA, J.M. and SCADDEN, D.T., 1989. Haematopoietic growth factors: biology and clinical applications. New England Journal of Medicine, 321 , 1449-1459 HAEN, P.J., 1995. Principles of Haematology, Ed. Linda Haris Young. Wm.C. Brown Publishers, USA, pp 26-36. HAMPSON, L., DEXTER, T.M. and HAMPSON, I.N., 1996. The biology of hematopoiesis. Education programme 26th Congress of the International Society of Haematology. Singapore. HERZOG, E.L., CHAİ, L. and KRAUSE, D.S., 2003. Plasticity of bone marrow derived stem cells. Blood, 102(10) , 3483-3493. HOGLUND, M., SMEDMYR, B., BENGTSSON, M., TOTTERMAN, T.H., COUR-CHABERNAUD, V., YVER, A. and SMINSSON, B., 1997. 42 Mobilization of CD34+ cells by glycosylated and nonglycosylated G-CSF in healthy volunteers. Europan Journal of Haematology, 59(3) , 177-183. HÜTTMANN, A., SCHIRSAFI, K., SEEBER, S. and BOJKO, B., 2005. Comparison of lenograstim and filgrastim: effects on blood cell recovery after hıgh dose chemotherapy and autologous peripheral blood stem cell transplantation. Journal Cancer Res Clinical Oncology, 131 , 152-156. INGS, S.J., BALSA, C., LEVERETT, D., MACKINNON, S., LINCH, D.C. and WATTS, M.J., 2006. Peripheral stem cell yield in 400 normal donors mobilised with granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF): Impact of age, sex, donor weight and type of G-CSF used. British Journal of Haematology, 134 , 517-525. JANSEN, J., THOMPSON, J.M., DUGAN, M.J., NOLAN, P., WIEMANN, M.C., BIRHIRAY, R., HENSLEE-DOWNEY, P.J. and AKARD, L.P., 2002. Peripheral blood cell progenitor cell transplantation. Therapeutic Apheresis, 6 , 5-14. KESSINGER, A. and ARMITAGE, J.O., 1987. Harvesting marrow for autologous bone marrow transplantation from patients with malignancies. Bone Marrow Transplantation, 2 , 15. KRÖGER, N., RENGES, H., KRÜGER, W. and GUTENSOHN, K., 2000. A randomized comparison of once versus twice daily recombinant human granulocyte colony stimulating factor for stem cell mobilization in healthy donors for allogeneic transplatation. British Journal of Haematology, 111 , 761-765. KUBOTA, N., ORITA, T., HATTORI, K., OH-EDA, M., OCHI, N. and YAMAZAKI, T., 1990. Structural characterization of natural and recombinant human granulocyte colony-stimulating factors. Journal of Biochemistry (Tokyo), 107 , 486-492. LAKSHMIPATHY, U. and VERFAILLIE, C., 2005. Stem Cell Plasticity. Blood Review, 19(1) , 29-38. LANIER, L.L., CORLISS, B. and PHILIPS, J.H., 1997. Arousal and inhibition of human NK cells. Immunology Review, 155 , 145-154. 43 LIESCHKE, G.J. and BURGESS, A.W., 1992. Granulocyte colony-stimulating factor and granulocyte macrophage colony-stimulating factor. New England Journal of Medicine, 327 , 28-35. LIFFICK, S.M., 1997. Fundamentals of Clinical Hematology, 1st Edition. W.B Saunders Company, Pennsylvania. pp 35-48. MARTINO, M., CONSOLE, G., IRRERA, G., CALLEA, I., CONDEMI, A., DATTOLA, A., MESSINA, G., PONTARI, A., PUCCI, G., FURLO, G., BRESOLIN, G., LACOPINO, P. and MORABITO, F., 2005. Harvesting peripheral blood progenitor cells from healthy donors: retrospective comparison of filgrastim and lenograstim. Journal of Clinical Apheresis, 20(3) , 129-136. METCALF, D., 1996. The molecular control of granulocytes and macrophages. Education program 26th Congress of the International Society of Haematology. Singapore. NISSEN, C., DALLE-CARBONARE, Y. and MOSER, Y., 1994. In-vitro comparison of the biological potency of glycosylated versus non-glycosylated rG-CSF. Drug Investigation, 7 , 346-352 OGAWA, M., 1993. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood, 81 , 2844-2853. QUESENBERRY, P.J. and COLVİN, G.A., 2001. Hematopoetic stem cells, progenitor cells and cytokines. In Williams Hematology 6th Edition. Ed. Beutler E., Lichtman MA., Coller BS. McGraw-Hill New York. pp 153-174. PEDRAZZOLI, P., GIBELLI, N., PAVESI, L., PRETI, P., PIOLINI, M. and BERTOLİNİ, F., 1996. Effects of glycosylated and non-glycosylated GCSFs, alona and in combination with other cytokines, on the growth of human progenitor cells. Anticancer Res, 16 , 1781-1785 RAMAKRISHNA, L.R., 2005. Mobilization and collection of peripheral blood progenitor cells for transplantation. Transfusion and Apheresis Science, 32 , 63-72. 44 REYES, M., DUDEK, A., JAHAGIRDAR, B., KOODIE, L., MARKER, P.H. and VERFAILLIE, C.M., 2002. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. Journal Clinical Investigation, 418 , 41-49. SCHMITZ, N., GRATWOHL, A. and GOLDMAN, J., 1996. Allogeneic and autologous transplantation in haematological diseases, solid tumors and immune disorders: current practice in Europe in 1996 and proposals for an operational classification. Accreditation Sub-committee of EBMT. Bone Marrow Transplantation, 17 , 471-477. SHIMIZU, N., ASAI, T., HASHIMOTO, S., NORITA, M. and KOBAYASHI, M., 2002. Mobilization factors of peripheral blood stem cells in healthy donors. Therapeutic Apheresis, 6(6) , 413-418. SROUR, E.F., JETMORE, A., WOLBERE, F.M., PLETT, P.A., ABONOUR, R., YODER, M.C. and ORSCHELL, T.C.M., 2001. Homing cell cycle kinetics and fate of transplanted hematopoietic stem cells. Leukemia, 15(11) , 16811684. TANIGUCHI, T., 1995. Cytokine signaling through non-receptor protein tyrosine kinases. Science, 268 , 251-255. TESETA, N.G. and DEXTER, T.M., 1999. The regulation of haematopoietic cell production. In postgraduate Haematology 4th Edition. Ed. Hoffbrand AV., Lewis ST., Tuddenham EGD. Butterworth Heinemann Oxford. pp 1-12. TO, L.B., HAYLOCK, D.N., SIMMONS, P.J. and JUTTNER, C.A., 1997. The biology and clinical uses of blood stem cells. Blood, 89 , 2233-2258. WATT, S.M., 2003. Stem cell plastıcıty. Brıtısh Journal of Haematology, 122 , 877891. WATTS, M.J., ADDISON, I. and LONG, S.G., 1997. Crossover study of the haematological effects and non-glycosylated G-CSF in healthy volunteers. Brıtısh Journal of Haematology, 98 , 474-479 WILLIAMS, D.A., 2000. Stem cell model of hematopoiesis. In Hematology Basıc Principles and Practice 3rd Edition, Ed. Hoffman R., Benz Jr EB., Shattil SJ., Furie B., Cohen HJ., Silberstein LE., McGlave P Churchill Livingston New York. pp 126-138. 45 LENOGRASTIM PRODUCT MONOGRAPH FILGRASTIM PRODUCT MONOGRAPH 46 ÖZGEÇMİŞ AYŞE KÜSTÜ Doğum Tarihi : 01.10.1981 Doğum Yeri : Karaisalı Uyruğu : T.C. Yabancı Dil : İngilizce EĞİTİM 09 / 2005 : Çukurova Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü Master Programı, 09/2004 – 06/2005 :YADEM Yabancı Dil Eğitim Merkezi, İngilizce Hazırlık Programı 09/2000 – 06/2004 : Ankara Üniversitesi, Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü İŞ DENEYİMİ 05 / 2005 - : Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi Terapötik Aferez, Kök Hücre ve Kriyoprezervasyon Ünitesi. Ünvanı : Biyolog KONGRE 1 – 4 / 11 / 2007 : 3. Ulusal Hemaferez Kongresi 16-19 / 10 / 2007 : 33. Ulusal Hematoloji Kongresi • ‘’Kaskad Filtrasyon Plazmaferezi: Ç.Ü.T.F Terapötik Aferez Ünitesi Deneyimi’’ başlıklı poster çalışması yapıldı. • ‘’Kaskad Filtrasyon Plazmaferezi: Ç.Ü.T.F Terapötik Aferez Ünitesi Deneyimi’’ adlı sözlü sunum yapıldı. • ‘’33. Ulusal Hematoloji Kongresi Genç Katılımcı Ödülü’’ alındı. • ‘’Lipid Aferezi: Ç.Ü.T.F Terapötik Aferez Ünitesi Deneyimi’’ başlıklı poster çalışması yapıldı. 8 -12 / 11 / 2006 : 32. Ulusal Hematoloji Kongresi 15-17 / 11 / 2006 : 5. Ankara Biyoteknoloji Günleri; Laboratuardan Kliniğe Kök Hücre Uygulamaları 47
