Kök hücre Mobilizasyonu

Kök Hücre Kaynakları, Seçimi,
Toplama, Saklama ve İşleme
Doç. Dr. Fevzi Altuntaş
Ankara Onkoloji Eğitim ve Araştırma Hastanesi
Kök Hücre Nakli ve Aferez Ünitesi
THD, Hematoloji Okulu,
Kök Hücre Nakli Kursu, 27 Haziran 2009, Mardin
1
Kök Hücre Nedir?
 Kendini yenileyebilen (Self-Renewal)
 Farklı hücrelere yönlenebilen
(Differentiation)
 Yamalanma yapabilen (Engrafment)
 Klonal hücreler
Kök hücre nasıl tespit edilir?
2
 Kök hücreler yüzeyinde belli
proteinler eksprese ederler:

CD34
 CD34+ hücreler akım
sitometri kullanılarak
ölçülebilir


En kısa zaman dilimi içinde kök
hücreyi tespit etmek için indirekt
bir teknik,
 Birkaç saat alır
CD34 eksprese eden tüm hücreler
kök hücre değildir.
3
Kök Hücre kaynakları nelerdir?
Kaynak
 Kemik
İliği
 Periferik
 Kord
Kan

Verici

Allojeneik
 Akraba
 Akraba dışı

Otolog

Singeneik
Kanı
Periferik Kök Hücre: AVANTAJLAR

Uygulama kolaylıkları

Genel anestezi gerektirmemesi

Hastaneye yatırılmadan, ayaktan yapılabilmesi

Daha az travmatik olması

Daha ağrısız olması

Aferez öncesi transfüzyon gereksiniminin daha az olması

Nakil sonrası engraftmanın daha hızlı gerçekleşmesi

Trombosit süspansiyonu gereksiniminin daha az olması

Hastanede kalış süresinin daha kısa olması

Morbidite ve mortalite oranının daha düşük olması
Altuntas F, et al. Peripheral Blood Progenitor Cell Collection. Transfus Apher Sci. 2007;36(2):159-167
Periferik Kök Hücre: DEZAVANTAJLAR
 Vasküler giriş yolu gerektirmesi
 Mobilizasyon protokolüne gereksinim duyulması
 Toplama işleminin birkaç gün (seans) sürebilmesi
 Sitokinlere veya aferez işlemine bağlı görülebilecek komplikasyonlar
 Dondurulmuş ürünün infüzyonu sırasında görülebilecek yan etkiler
 PKH içeriğinin Kİ’ne göre yaklaşık 10 kat daha fazla T-lenfosit
içermesi GVHH riskini arttırabilir

Akut GVHH gelişimine etkisi yok

Kronik GVHH insidansını arttırabilir
Altuntas F. et al. Transfusion Med & Hemother 2008
Kord kanı kök hücre

Kord kanı kök hücreden zengin bir kaynak

Miktar az (75-200 cc): toplam kök hücre sayısı/kg başına sınırlı


Kök hücreler PK veya Kİ’ne göre daha az


50 kg kadar bireyler (çocuk) için yeterli
Graft yetmezliği ve engraftman gecikmesi
Proliferasyon hızı yüksek

Düşük miktarda kök hücre tolere edilebilir

2 x106 CD34+ hücre/kg

2 x107 NC/kg

Graft rejeksiyon ve GVHH gelişme riski daha düşüktür

Kısmi HLA match (4/6) durumu tolere edilebilir

Verici bulmayı ve verici havuzu oluşturmayı kolaylaştırmakta
Kök Hücre Kaynakları
Kordon Kanı
Kİ/PK
Yok
Var
≤1
3-6
Hücre sayısı
HLA uygunluğu
Graft yerleşmemesi
Gecikmiş immün düzelme
GvHH
en az 4/6
9/10
Az
Yüksek
YOK
Olası
KHT sonrası infeksiyon
Daha yüksek
Yüksek
İmmünoterapi olasılığı
Yok
Var
Donör için risk
Arama süresi (ay)
Graft yerleşimini sınırlayan faktör
Sonucu etkileyen ana faktör
Uygunluk
GvHH riski
DLİ
4
Kök Hücreler nasıl
toplanır?
Kemik İliği
Kaynaklı
Kök Hücre
Toplama
(KI >MNH %1-4)
Alıcının kilogramı başına ~10-20 ml ilik materyali alınır.
KEMİK İLİĞİ ASPİRASYON SETİ (Thomas İğneleri)
VERİCİDEN AMELİYATHANEDE KEMİK İLİĞİ
TOPLANMASI
Kemik İliği Kaynaklı Kök Hücre Toplama
Amaç:
2-3 x 108 çekirdekli hücre/kg
>2 x 106 CD34+ hücre/kg
Kemik
İliği harvest
10 ml x 100-200 aspirasyon
Periferik
Kök Hücre
Toplama
Çekirdekli hücrelerin
%0.05
5


Mobilizasyon Nedir? ve Rasyoneli Nedir?
Periferal kan kök hücre içeriği kemik iliği kavitesindekinden daha azdır:

Kİ = hücrelerin %3-5’i CD34 eksprese eder

PK = hücrelerin %0.03-% 0.05 CD34 eksprese eder
Tanım:


Mobilizasyon periferal kandaki kök hücre içeriğini artırmak için kullanılan metot
İyi bir mobilizasyon metodu:

Hematopoetik yeniden yapılanmanın desteklenmesi ve

Transplant sonrası iyileşmenin hızlı olması için

Az sayıda aferez işlemi ile

Yeterli kök hücre toplanmasına imkân sağlamalıdır
6

Kök Hücre Mobilizasyon metotları nelerdir?
Mobilizasyon protokolleri:

Kemoterapi:

Periferik kanda kök hücre
konsantrasyonunu 20-25 kat arttırır



Siklofosfamit

Etoposit

Siklofosfamit + Etoposit
Sitokin (G-CSF)
160
140
120
100
80

Filgrastim
60

Lenograstim
40
Kombinasyon (Kemoterapi + sitokin):

Periferik kanda kök hücre
konsantrasyonunu 100-160 kat arttırır
20
0
Normal
KT
Lemoli RM, et al. Haematologica. 2008 Mar;93(3):321-4, Narayanasami U et al. Blood 2001; 98: 2059-2064
Sitokin KT + Sitokin
G-CSF: mobilizasyonda rolü nedir?

Proteazlar kök hücre mobilizasyonunda
rol oynamakta

G-CSF kemik iliğinde osteoblast
aktivitesini suprese eder ve

Sekonder olarak da mRNA düzeyinde
SDF-1↓ de düşüşe yol açar ve

Kritik basamak olan SDF-1/CXCR4
sinyalizasyonu keser

Böylece HKH mobilizasyonunu
sağlar…
Pruijt, Fibbe et al. 1999; Heissig, Hattori et al. 2002
Kök hücre aferezine ne zaman başlanır?
C D 3 4 + H üc re
G-CSF ve KT+G-CSF takiben
periferal CD 34+ kök hücre değişimi
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Günler

Narayanasami U, et al. Randomized trial of filgrastim versus chemotherapy and filgrastim mobilization of
HSC. Blood 2001; 98: 2059-2064
7
Periferik kan CD 34 sayısı önemli midir?
Mobilizasyon ürün belirleyicisi: aferez öncesi PK CD34 sayısı
İlk mobilizasyonda 1. aferez günü toplanan CD34 ürünü ile periferal
CD34 sayısı korelasyon göstermektedir
CD34 + ürün (hücre / kg )
1,20E+07
y = 72,633x + 531225
2
R = 0,5961
1,00E+07
8,00E+06
6,00E+06
4,00E+06
2,00E+06
0,00E+00
0,00E+00
2,00E+04
4,00E+04
6,00E+04
8,00E+04
Periferal kanda dolaşan CD34 sayısı (hücre/ml kan)
Altuntas F et al. Transfus Apher Sci 2007;36(2):159-167.
1,00E+05
1,20E+05
8
Kök hücre aferezi:
pratik bilgiler
Allojeneik Transplant:
Alıcı Yaşı Eğilimi 1987-2004
Transplant, %
100
80
60
20 yrs
21-40 yrs
41-50 yrs
51-60 yrs
60 yrs
40
20
0
1987-1992
1993-1998
1999-2004
NATIONAL MARROW DONOR PROGRAM® ©2005
Aferez- YAŞ
sınırı var mı? Yaş önemli mi?
 Yaş:

Sağlıklı vericilerde yaş sınırı= 4-79

Akraba nakillerinde yaş sınırı yok

Akraba dışı nakillerde yaş sınırı belirlenmemiş

Yaş artıkça PK mobilizasyon başarısızlığı artabilir

Yaş arttıkça GVHH riski artmakta
McCarty J. IBMTR 2007 Meeting Education Book
Kavukcu S, Altuntas F. et al Transfusion Med & Hemother 2008
Aferez- Febril nötropeni var. Tamam mı?
Devam mı? Ne yapayım?

İnfeksiyon:

Vericiler:


İlk 30 gün içerisinde bulaşıcı hastalık yönünden taraması
yapılmış ve normal olmalıdır.
Hastalar=

FEN ve infeksiyonu kontrol altında olan hastada aferez
sürdürülürken infeksiyon bulaşına yönelik önlemler alınmalıdır;

Aferez ürünün dondurulması sırasında otolog plazma kullanılmamalı

Aferez ürünü eritilip geri infüze edilirken yıkanmalı

Pnömonili hastalarda aferez ertelenmelidir

Viral infeksiyon durumunda hastaya göre karar vermek gerekir

Kültür örnekleri alınmalıdır
Smith AM, J Hemathother 1994;3:331-348
Aferez- Trombositopeni var. Ne yapayım?
TAM KAN SAYIMI:
 Vericiler:

PLT (x109/L)
Hb (g/dL)

İşlem Öncesi
>150
>12.5

1. Aferez Sonrası
>120
>10

2. Aferez Sonrası
>70
>10
Hastalar:

Trombosit: >20 x109/L olmalıdır
• Aferez ile kan hacminin 2 katı işlenmesi sonrası PLT sayısı %5-30 azalır
• G-CSF kullanımı da PLT sayısında azalmaya yol açar (dilusyonel)
Altuntas F. et al Transfusion Med & Hemother 2008
Allogeneik Transplant: 20yaş,
CIBMTR 1989-2004
- Verici Tipi ve Kök Hücre Kaynağı Eğilimi-
4.500
4.000
Akraba
Akraba dışı – Kİ veya PK
Akraba dışı – Kord kanı
Transplant
3.500
3.000
2.500
2.000
1.500
1.000
500
0
1989-90
1991-92
1993-94
1995-96 1997-98
1999-00
2001-02
2003-04
NATIONAL MARROW DONOR PROGRAM® ©2005
Kordon Kanı
Kök Hücre
Toplama
Çekirdekli hücrelerin
%0.3
9
Kordon kanı nasıl toplanır?
 KK toplama ağrısız, kolay ve riski minimal bir
işlemdir.
 Bebek doğduktan ve kordon klemplendikten
sonra plasenta ve umblikal kordda kalan 40-100
ml kan, umblikal kordun antiseptik solüsyonla
temizlenmesini takiben enjektör yardımıyla kan
torbasına toplanır.
 Toplama işlemi 2-4 dakika sürmektedir.
Kordon Kanının İşlenmesi

Toplanan üründen kültür alınır

İnfeksiyöz tarama: Sifilis, HIV, HBV, HCV ve CMV taraması yapılır

Hacim: Toplanan kord kanın hacmi kayıt edilir (ortalama 120 cc)

Hücre sayısı: MNH (>2x107 /kg) ve CD34+ hücre (>2x106 /kg) sayılır

HLA tiplemesi yapılır

Class I serolojik, Class II ise DNA (PCR-SSO veya PCR-SSP)
10



Kordon Kanı Nerde,
Ne kadar Süre Saklanabilir?
Bilgisayarlı kademeli dondurucuda dondurulup -196°C de sıvı
azot tankına aktarılır
Kordon kanındaki hücre canlılığı 10 yıllık sürede yeterli
düzeyde korunabilmekte
En uzun 10 yıllık kord kanı başarılı bir şekilde nakilde
kullanılmış
11
CD34+ hücre miktarı önemli midir?

Kök hücre dozu KHT’nın başarısını etkiler

TRM, Relaps riski, post-KHT MDS/AML ve LOS

Yeterli hücre miktarı:

Sitopeniler ile ilişkili maliyet ve yan etkileri sınırlamak için çok
hızlı (8-14 gün) nötrofil (>500) ve trombosit engraftmanı
(>20,000) sağlayan dozdur:

Azalmış transfüzyon gereksinimi

Daha az sepsis atağı

Daha az antibiyotik kullanımı

Hastanede kalış süresinde kısalma
McCarty J. IBMTR 2007 Meeting Education Book
CD34 Dozu Ne olmalı?
 Otolog KHT

> 2 x106 CD34+
hücre/kg
 Allojeneik KHT

> 5 X106 CD34+
hücre/kg
 Kord Kanı KHT
>
2 x106 CD34+
hücre/kg
Hematopoetik yapılanma
12
Mobilizasyon başarısızlığı? nedenleri nelerdir?
<2 x106 CD34+ hücre/kg = %10-20
 Yaş: Yaşlı hastalar
 Primer hastalık: Lenfoma hastaları (%35)
 Önceki KemoTerapiler:

Sayısı: Arttıkça risk artmakta

Alkilleyici ajanlar

Mobilizasyondan 2 ay önce fludarabin tedavisi
 Kemik iliği alanlarına RT alması
 Trombositopeni (düşük ürün belirteci)
 Mobilizasyon öncesi PK CD34+ hücre sayısı düşüklüğü
 Kemo-mobilizasyon sonrası nötrofil recovery’de geçikme
McCarty J. IBMTR 2007 Meeting Education Book
Mobilizasyon başarısızlığı var: NE yapabilirim?

Mobilizasyonu tekrarla






Yüksek volüm aferez
 Maliyet artış ve Morbidite artış
Alternatif ve/veya Yüksek doz sitokin
 Yüksek doz G-CSF
 SCF, GM-CSF, IL-3
Kemo-mobilizasyon
 Toksisite, FEN, maliyet artışı
AMD3100= Plerixifar (Mobozil); SDF-1 alfa inhibitörü
Büyüme hormonu (GH)
Kemik iliği harvest


Maliyet artışı
Engraftman yavaş
McCarty J. IBMTR 2007 Meeting Education Book
KÖK HÜCRELERİN DONDURULMASI VE
SAKLANMASI
Kök hücre dondurmadan
ne kadar süre saklayabilirim?
13

Isı -79C’nin altına inmedikçe metabolik saatin durdurulması
imkansız

0-20C ‘de Na-K pompası bozulmakta ve hücreler şişmeye
başlamakta

Enzim aktiveleri bozulmakta

pH değişiklikleri oluşmakta


Sonuçta hücre viabilitesi bozulmakta
Donma ısısının üzerinde vericiden alıcıya kök hücre
transferi 72-96 saat içinde gerçekleştirilmelidir
Stockschlaeder M, et al. Long term follow up of leukemic patients after related cryopreserved bone marrow transplantation. Br J Haematol 1997; 96: 382–386
14
KRİYOPROTEKTAN AJANLAR
NELERDİR?
Kriyoprotektif ajanlar iki tiptir
1- İntrasellüler ajanlar

Gliserol

Dimetilsulfoksid (DMSO)
2- Ekstrasellüler ajan

HES (Hidroksietil starch)
Gorlin J. Stem cell cryopreservation. J Infusional Chemother 1996; 6: 23-27
Kök hücre dondurma
Amaç:

Kök hücreleri maksimum canlılık oranı ve fonksiyonel kapasite ile
tekrar resüsite edebilecek şekilde dondurarak saklamaktır.
 DMSO= Tek başına kullanıldığında en ideal kriyoprotektan ajan

%5-10 DMSO etkin koruma sağlayabildiği gösterilmiştir

Suda yüksek derecede çözünürlük gösterebildiği ve hücre
membranlarını geçebildiği için, hem hücre içi hem de hücre dışında
osmolaliteyi yükselterek membran boyunca yerleşen tuz gradientini
dengeye getirir.
Gorlin J. Stem cell cryopreservation. J Infusional Chemother 1996; 6: 23-27
Programlı dondurma
• Ürün ısısı -20C’ye ulaşana kadar 15-20
C/dk’da hızlı bir soğutma işlemine tabi
tutulur.
• Geçiş fazı sonrası ideal soğutma hızı 13C/dk’dır.
• -80C’ye ulaşıldıktan sonra ürün daha
düşük ısılara, örneğin sıvı azot veya azot
buharı içine direkt olarak kaldırılabilir
Kök hücreleri saklamak için en uygun ısı nedir?
15
Hangi koşullarda ne kadar süre saklanabilir

Kök hücreleri için en uygun ısı nedir?


-80 °C ile - 196 °C arasıdır.
Hangi koşullarda ne kadar süre saklanabilir?

-80 °C’nin üzerinde (deep freeze) = 5 yıl

-150 °C’nin üzerinde (azot buhar fazı) = 10-15 yıl

-196 °C ‘de (sıvı nitrojen) = sonsuza dek saklanabilir
Valeri CR, Pivacek LE: Transfusion 36:303-308:1996 ve Galme A et al; Transfusion 36:794-797:1996.
Kök Hücre Transferini Nasıl Yapabilirim?

Dondurulmuş hücreler nakil yapılacak merkeze özel
taşıma tankları ile transfer edilmeli:

Ürünlerin saklandığı tankların ısısıyla aynı olmalı

Ürünler taşınırken ısı farkına maruz kalmamalı

Şehirlerarası ve uluslar arası taşımalarda, dökülme, sızıntı v.b
risklere karşı ürünler sıvı azot içerisinde değil buhar fazında
taşınmalı

Taşıma tankı üzerinde ortamın ısısını belirten bir gösterge olmalı
16
Kök hücre eritme ve
infüzyon
Kök Hücre Eritme işlemi nerde yapılır?
İçi %90 etil alkol ile yıkanmış su banyosuna steril su
konduktan sonra 37-40C kadar su ısıtılır
 Kök hücre ürünü hızlıca 37-40°C’de çözülür


Bir miktar azot içeren kaplar ile transfer edilen ürün
torbaları su banyosu içinde yumuşak masaj hareketleri ile
tamamen eritilir.

Ürün torbasının koruyucu kılıfı yoksa ağız kısmının su
içine daldırılmamalıdır.
Kök Hücre infüzyonunda nelere dikkat etmeliyim?
 Banyodan çıkan torbalar steril bezlerle silindikten
sonra koruyucu kılıfından çıkarılarak 200m’lik
filtre içeren setlerle infüze edilir.
 Çözünme ile infüzyon arasındaki süre 1 saati
geçmemelidir

İnfüzyon süresi 10-15 dakikayı geçmemelidir
17
Viyabilite Nedir? Nasıl bakılır?
 Viyabilite= Hücre canlılığı

1) Flörasan mikroskobu

2) Akım sitometri yöntemi
 Tripan Mavisi, Akridin-Oranje ve
Propidyum İyodit
 Canlılık (%)= Canlı hücre / Total
hücre x100

Canlı
Hücre
En az % 75 ve üzeri olmalı
MNH
Canlı
Hücre
Kalite kontrolü için neler yapılmalı?
 1. Hücre Miktarı:

A. Çekirdekli hücre miktarı

B. Eritrosit miktarı

C. Trombosit miktarı
 2. Hücre morfolojisi (Yayma, formül)
 3. Hücre canlılığı (Viabilite)
 4. Sterilite (Kültür)
 5. Kök Hücre miktarı (Quantity):

A. CD34 hücre sayısı

B. Hematopoietik progenitor hücre kültür
 6. Tümör hücre kontaminasyonu