EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
advertisement
EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (YÜKSEK LİSANS TEZİ) TRİPSİN İMMOBİLİZASYONU VE KARAKTERİZASYONU Ömer HABİB Biyokimya Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu: 405.05.01 Sunuş Tarihi: 22/08/2007 Tez Danışmanı : Prof. Dr. Figen ZİHNİOĞLU Bornova-İZMİR 1 1 GİRİŞ 1.1 Tripsin Tripsin (3.4.21.4), serin proteaz sınıfından hidrolitik bir enzimdir. Serin proteazlar aktif merkezlerinde esansiyel serin dizisinin varlığıyla karakterize edilirler. Yapısal benzerliklerine göre birçok alt aileye ayrılırlar. Bu gurup enzimler metabolizmada hormon aktivasyonu, kan pıhtılaşması, sindirim, immün sistem aktivasyonu gibi çok çeşitli proseslerde görev alırlar (Çizelge 1.1). Çizelge 1.1 Bazı serin proteazlar ve metabolizmadaki görevleri. Enzim Kesim Yeri Görevi Trombin Arg-Gly Kan pıhtılaşması Elastaz Val-X Bağ liflerinin yıkımı Tripsin Arg-X, Lys-X Zimojen aktivasyonları ve protein yıkımı Enteropeptidaz 6-Lys-|-Ile-7 Tripsinojen aktivasyonu Asetil kolin esteraz Sinir uyarılarının sinaptik bölgelerden geçişi Molekül ağırlığı 23722 Da olan tripsin, tripsinojen (Ma = 24409) olarak adlandırılan uzun, inaktif öncü protein şeklinde pankreastan salgılanır. Tripsinojen onikiparmak bağırsağına geldiğinde modifiye edilir. Burada ikinci bir enzim “enterokinaz” mukozal membrandan salgılanır ve aktif tripsin formunun açığa çıkmasını sağlar. Oluşan 2 trpisin daha sonra tripsinojenin aktivasyonunu gerçekleştirir. Yani aktivasyon prosesi buradan sonra oto-katalitik olarak yürür (Şekil 1.1). Şekil 1.1 Tripsinojen aktivayonu Tripsin amino asit analizleri, proteinlerin sekanslama, haritalama ve yapısal çalışmaları, doku kültür camlarından yapışmış hücrelerin çıkarılması ve soya tripsin inhibitörlerinin saflaştırılması gibi geniş bir uygulama alanına sahiptir. Tripsin, peptid bağlarını çok spesifik olarak hidrolizlemesinden dolayı özellikle sekans çalışmalarında önemli bir araç haline gelmiştir. İmmobilize tripsin otolizi elimine etmesi, örneklerin proteaz tarafından kirletilmemesi, uzaklaştırılabilirliği ile kontrollü parçalamaya olanak sağlaması gibi avantajlarından dolayı uygulama alanlarında serbest tripsine göre daha tercih edilir bir konuma gelmiştir ve günümüzde ticari immobilize tripsin çeşitli firmalardan (Clontech, Princeton Separation) temin edilebilmektedir. 3 Ayrıca son zamanlarda immobilize tripsin temelli kromatografik kolonların sürekli akış sistemlerinde on-line proteoliz için immobilize enzim reaktörleri olarak kullanımına yönelik çalışmalar ön plana çıkmaya başlamıştır. çalışmalarında Tripsin parçalanan reaktörlerinin peptidlerin protein ayrılması haritalama ve protein identifikasyonunda ESI/MS/MS gibi sistemlerle birleştirilebilmesi önemi arttırmaktadır. Bu alana yönelik çalışmalarda seçimlilik, duyarlılık, düşük geri basınç ve substratın aktif merkeze diğer taşıyıcılara göre daha yüksek oranda ulaşabilirliği nedeniyle silika tabanlı taşıyıcılar tercih edilmektedir. Bu tez kapsamında daha sonraki on-line proteoliz çalışmalarında HPLC kolon dolgu maddesi olarak kullanılmak üzere silika tabanlı taşıyıcılar üzerine tripsin immobilizasyonu gerçekleştirildi. 1.1.1 Substrat spesifikliği Tripsin polipeptidleri spesifik dizilerin karboksil ucundan keser. Bu aminoasit kalıntıları rasgele değildir; arginin ya da lizin gibi pozitif yüklü aminoasit artıklarından sonra keser. Serin proteazlar, substrat spesifikliğini oldukça etkileyen serin aktif bölgesine yakın “spesifik cep” olarak adlandırılan bir susbstrat bağlama bölgesine sahiptir. Tripsinde stratejik olarak alt kısmında karboksilat yan grubu bulunan cep bağıl olarak daha uzun ve dardır. Kimotripsinde ise bu cep daha geniş ve yüksüzdür fakat birçok hidrofobik grup içerir. Elastaz, tam tersine, valin ve treonin yan zincirlerinden oluşmuş, daha sığ bir cebe sahiptir. Şekil 1.2’de görüldüğü gibi bağlanma bölgesindeki değişimler 4 substrat spesifikliklerindeki değişimleri de açıklamaktadır (Whitford, 2005) Şekil 1.2 Kimoptripsin, tripsin ve elastazın spesifik cepleri 1.1.2 Mekanizması Serin proteazlar aktif merkezlerinde birbirine çok yakın bulunan ve değişmeyen üç dizi ile yapısal benzerlik gösterirler. Bu aminoasitler His57, Asp102 ve Ser195’tir ve hepsi birlikte hidrojen bağlarıyla bağlanarak katalitik üçlüyü oluşturur. Primer dizide farklı yerlerde bulunmalarına rağmen (Çizelge 1.2) aktif bölgede His57 ve Ser195 in Asp102 yakın konumda bulunurlar (Şekil 1.3). 5 Çizelge 1.2 Bazı serin proteazlarda katalitik üçlünün primer dizideki yerleri. Enzim EC No Ser His Asp/Glu Kimotripsin 3.4.21.1 195 57 Asp 102 Tripsin 3.4.21.4 195 57 Asp 189 Subtilisin 3.4.21.62 221 64 Asp 32 Asetilkolin esteraz 3.1.1.7 200 440 Glu 327 Şekil 1.3 Katalitik üçlü Peptit bağının hidrolizi zor bir kimyasal prosestir. Katalizlenmeyen reaksiyonda su amid bağının karbonuna atak yapar. Bu bağın polaritesinden dolayı C atomu elektronca fakirdir ve bu 6 nedenle elektronca zengin bir nükleofilin saldırısına karşı hassastır. Su zayıf bir nükleofildir. Bu problemi çözmek için mümkün iki strateji vardır: su daha iyi bir nükleofil olabilmesi için aktive edilir ve/veya amid grubu nükleofilik atağa karşı daha hassas hale getirilir. Hidroliz ile peptit yıkımını katalizleyen serin proteazlar tüm prosesi iki basamağa bölerek bu sorunun üstesinden gelir; hem atak yapan nükleofili ( Ser- OH ) hem de reaksiyondaki amid grubunu aktive eder. Aktif merkeze giren substrat polipeptidinin spesifik cebe sterik olarak uygun olan aminoasit kalıntısı cebe yerleşir. Spesifik bağlama Ser195 ile parçalanacak bağın karbonil grubunun yaklaşmasına neden olur. Normal koşullarda serinin –OH grubunun pK a ’sı çok büyüktür (>10) fakat kimotripsinde His57’nin yakınlığı proton transferine ve yüklü bir imidazol halkasının oluşmasına yol açar. Daha sonra, His57’nin protonlanması hidrofobik bölgede bulunan Asp102’nin negatif yükü (katalitik üçlünün son üyesi) tarafından stabilize edilir. Peptid bağı parçalanmasının ilk adımı olarak, aktif serinde oluşan güçlü bir nükleofil, karbonil grubuna saldırır. Nükleofil oluşumu, Asp102 ve His57’nin hidrojen bağlanmasının yol bağı açtığı oluşturmasına küçük neden konformasyonel olan substrat değişiklikler tarafından tetiklenir. Bu hidrojen bağının etkisiyle imidazol yan zincirinin pKa’sı 7’den 11’e çıkararak bazlığı artar. İkinci bir azot atomuna doğru yönlenen elektronlar daha güçlü bir baz oluşmasına yol açıp, normalde reaktif olmayan Ser195 yan zincirinden proton çekilerek kuvvetli bir nükleofil meydana gelmesini sağlar (Şekil 1.4). 7 Şekil 1.4 Serin proteazların katalitik mekanizması Nükleofilik atak tetrahedral geçiş halinin oluşumuyla sonuçlanır ve bunu da peptit bağının yarılması takip eder. Geçiş durumunda karbonil oksijeni tek bağlı duruma gelir ve negatif yüklü duruma geçer. Protein bu negatif yükü iki hidrojen bağıyla stabilize edecek şekilde yapılandırılmıştır. Bu bölgeye oksianyon boşluk adı verilir (Şekil 1.5). Peptid substratının N-terminal kısmı, enzime kovalent bağlı kalır ve 8 açil- enzim ara ürünü oluşur. His üzerinde yer alan Serin protonu, yeni bir terminal oluşturmak üzere, bu bölgede enzime sıkı bağlanmayan peptidin C-terminali tarafından alınır. Şekil 1.5 Oksianyon boşluk Tripsinde su açil-enzim ara ürününü hidrolizler. Su molekülü, imidazol yan zincirine proton vererek açil ara ürünüyle ikinci bir tetrahedral geçiş ara ürününü oluşturur. Bu ara ürün His57’den Ser195’e proton transferinin bir sonucu olarak hidrolizlenir ki böylece N-terminel peptidin ayrılmasıyla aktif merkez restore edilmiş olur. Serin proteazlar, ping pong mekanizmasını izler; ilk önce substrat enzime bağlanır, C-terminal ayrılmasını su molekülünün bağlanması ve açil-enzim ara ürünü oluşumu izler. Açil enzim ara ürününün hidrolizlenmesi sonucu N-terminalin ayrılması ile tamamlanır (Şekil 1.6) (Whitford, 2005). 9 Şekil 1.6 Serin proteazlar için ping pong mekanizması. 1.2 Enzim İmmobilizasyonu İmmobilize enzimlerin kullanımı için birçok neden vardır. En önemli ikisi: a) Enzimin üründen kolaylıkla ayrılması, b) Enzimin tekrar kullanımıdır. Enzimin üründen kolaylıkla uzaklaştırılması enzim uygulamalarını basitleştirir ve etkili reaksiyon teknolojilerine olanak sağlar. Ayrıca enzimin tekrar kullanımı fiyat avantajı açısından da önemlidir. İmmobilize enzim preparatlarının özellikleri hem enzim hem de taşıyıcı materyalin özellikleri tarafından belirlenir (Şekil 1.7). 10 Şekil 1.7 İmmobilize enzimlerin karakteristikleri Geçen yüzyılın ikinci yarısından itibaren değişik uygulamalar için çözünür olmayan immobilize enzimlerin geliştirilmesine yönelik birçok çalışma yapılmıştır. Şekil 1.8’de immobilize enzimlerin bazı uygulama alanları gösterilmiştir (Tischer, 1999). Şekil 1.8 İmmobilize enzimlerin uygulama alanları 11 Doğası ne olursa olsun, nasıl hazırlandığına bağlı olmaksızın, herhangi bir immobilize enzim, esansiyel olan katalitik ve katalitik olmayan fonksiyonlar üstelenen grupları içermelidir. Taşıyıcı ayırmaya yardımcı olacak, enzimin tekrar kullanımına ve prosesin kontrolüne olanak sağlayacak şekilde; enzim ise istenilen aktivite, verimlilik, seçimlilik ve substrat spesifikliğine göre seçilir (Şekil 1.9). Şekil 1.9 İmmobilize enzimin katalitik ve katalitik olmayan fonksiyonları arasındaki ilişki Katalitik olmayan parametreler, taşıyıcının özellikle şekil, büyüklük ve uzunluk gibi fiziksel ve kimyasal doğasıyla ilişkiliyken katalitik parametreler ise aktivite, seçimlilik, kararlılık, pH ve sıcaklık 12 profilleri gibi katalitik fonksiyonlara bağlıdır. İmmobilize enzimler için bu iki özelliğin seçimindeki genel kriterler çizelge 1.3’de verildi.( Cao, 2005). Çizelge 1.3 İmmobilize enzimler için kriterler. Parametreler Gereksinimler Katalitik olmayan Uygun partikül boyutu ve şekli fonksiyon Katalitik fonksiyon İmmobilize enzim Yararlar Kolay ayırma ve reaksiyon kontrolü Yüksek aktivite Yüksek verimlilik Organik çözgenlere karşı yüksek kararlılık Gözenek çaplarında sabitlik Yüksek kararlılık Yüksek verimlilik Geri kazanım Biyokatalizör için düşük maliyet Geniş substrat spesifikliği Substrattaki yapısal değişimlere tolerans Organik çözgenlerde kararlılık Organik çözgen kullanımı ile reaksiyon dengesinde kayma Termal kararlılık Sıcaklık yükselmesiyle kısa reaksiyon zamanı Operasyonel kararlılık Düşük maliyet Konformasyonel kararlılık Enzim özelliklerinin düzenlenmesi Geri kazanım Katalist için düşük maliyet Geniş uygulama alanı Proses değişimlerine tolerans Tekrar üretilebilirlik Kaliteli ürün garantisi 13 1.3 Enzim İmmobilizasyon Yöntemleri İmmobilize enzimlerin kullanılır (Şekil 1.10). hazırlanmasında çeşitli Şekil 1.10 Enzim immobilizasyon yöntemleri yöntemler 14 1.3.1 Taşıyıcıya bağlama yöntemleri Enzim immobilizasyon yöntemi, enzim aktif konformasyonu ve gerekli katalitik esnekliğini sürdürmesine/korumasına izin verecek şekilde seçilmelidir. Enzimin yapısal karakteristikleri hakkında bilgi, yüksek performansta biyokatalizör elde etmek için yardımcıdır. Temelde, enzimleri yüzeye immobilize etmek için dört yol vardır: a) Enzim aktivasyonu ve taşıyıcıya bağlama. Bu yaklaşım genelde aktivitede önemli bir kayba neden olur; çünkü proteinlerin, yüksek reaktivitedeki kimyasal bileşiklerle modifikasyonu katalitik veya yapısal açıdan esansiyel dizileri değiştirebilir. Ayrıca molekül içi ya da moleküller arası çapraz bağlanmalar da göz önünde tutulmalıdır. b) Destek materyalinin modifikasyonu ve aktivasyonu. Doğal enzim, bir sonraki adımda bağlanır. Enzimlerin taşıyıcı yüzeye kovalent bağlanmasında en önde gelen tekniktir. c) Enzim üzerindeki fonksiyonel grup ve taşıyıcının bi- veya multifonksiyonel ajanlarla bağlanması. Aynı zamanda molekül içi ve moleküller arası çapraz bağlanmalara neden olur. d) Biyospesifik grup içeren bir protein üretmek için enzimin rekombinant DNA teknikleriyle modifikasyonu. Böylece biyoafinite bağlama kullanılarak özel taşıyıcılara adsorplama gerçekleştirilebilir. 15 Taşıyıcı; elde edilen immobilize biyokatalizörün katalitik olmayan özelliklerinin kolay kontrol edilebilmesini sağlar. Seçilen taşıyıcı sadece enzim bağlanabilen fonksiyonel grubu için yapı iskelesi görevini üstlenmekle kalmaz; bunun yanında fiziksel ve kimyasal yapısı (gözenek boyutu, hidrofilik/hidrofobik dengesi, yüzey kimyası vb.) enzimin katalitik özeliklerini önemli ölçüde etkiler. Bu bağlamda taşıyıcı enzim modifikasyonunda kullanılıyor gibi düşünülebilir. Enzim immobilizasyonunda doğal veya sentetik birçok organik ve inorganik materyal kullanılmaktadır. Taşıyıcı, suda çözünmeyen katı veya polimer olabilir. Enzim immobilizasyonunda en yaygın kullanılan taşıyıcılar çizelge 1.4’te verilmiştir (Telefoncu, 1997). Çizelge 1.4 Enzim immobilizasyonunda kullanılan taşıyıcılar. Anorganik Kil, cam Silika jel Bentonit Aktif karbon Metaller Metaloksitler Doğal polimerler Selüloz Nişasta Dekstran Albumin Kitin/kitosan Agar/agaroz Sentetik polimerler Polistiren türevleri Poliakrilamid Naylon Oksiranlar Metakrilat 16 1.3.1.1 Kovalent bağlama ile immobilizasyon Taşıyıcıya kovalent bağlama enzim zincirindeki aminoasitlerin taşıdığı fonksiyonel gruplar üzerinden gerçekleşir (Çizelge 1.5). Çizelge 1.5 Kovalent bağlamada hedef amino asitler. Kovalent immobilize enzim; taşıyıcı, ara kol ve enzim bileşenlerinden oluşan bir kompozit olarak düşünülebilir (Şekil 1.11). Taşıyıcıya kovalent olarak bağlanmış enzimin performansını etkileyen özellikler şunlardır: 17 - Taşıyıcının fiziksel ve kimyasal doğası. - Bağlanma kimyası. - İmmobilizasyon konformasyonu. - Enzimin yönlenmesi. - Ara kolun uzunluğu ve doğası. - Enzimi bağlamak için kullanılan ortamın özellikleri. - Enzim ve taşıyıcı arasında oluşan bağ sayısı. - Taşıyıcı üzerinde veya içinde enzimin bozulması. sırasında ve sonrasındaki enzim Şekil 1.11 Enzimin taşıyıcıya kovalent bağlanması: A; aktif amino asit dizisi, B; taşıyıcının fonksiyonel grubu, C; taşıyıcı, D; ara kol. 18 Çizelge 1.6’da kovalent bağlama yöntemlerinin yarar ve sakıncaları verilmiştir (Telefoncu, 1997). Çizelge 1.6 Kovalent bağlama yöntemlerinin yarar ve sakıncaları Kovalent bağlama yöntemlerinin yarar ve sakıncaları Yararları Reaktif taşıyıcıya enzim bağlanması kolaydır ve bağlı olmayan enzim yıkama ile uzaklaştırılabilir. Katı taşıyıcıya bağlı katalizatör kullanışlıdır (süzme veya santrifüjleme ile ayrılır). Reaksiyon ortamından istenilen anda uzaklaştırılabilir. Ürünleri kirletmez. Taşıyıcının yapısına bağımlı olarak yeni spesifiklikler kazanabilir. Sürekli sistemlere uygundur. Değişik fiziksel formlarda (tabaka, partikül, fiber vb.) üretilebilirler. Sakıncaları Enzim immobilizasyon koşullarından etkilenebilir. Bağlanma aktivite için zorunlu aminoasit artıkları üzerinden gerçekleşebilir. Enzimin taşıyıcıya bağlanması özel ve masraflı preparasyonları gerekli kılabilir. Polimer taşıyıcının sebep olduğu sterik engellemeler nedeniyle aktivite azalabilir. 19 1.3.1.2 Adsorpsiyon ile immobilizasyon Enzim immobilizasyonunda kullanılan en eski ve en basit yöntemdir (Şekil 1.12). Yöntem; yüzey aktif, suda çözünmeyen bir adsorbanın enzim çözeltisi ile karıştırılması ve enzimin aşırısının iyice yıkanarak uzaklaştırılması temeline dayanır. Şekil 1.12 Adsorpsiyon temelli immobilizasyon yöntemleri Enzimlerin taşıyıcıya kovalent olmayan bağlanması şekil 1.13’de gösterildiği gibi sınıflandırılabilir. Spesifik olmayan fiziksel adsorpsiyon; enzimin bağlanması van der Walls kuvvetleri, hidrojen bağları ve hidrofilik etkileşimler gibi spesifik olmayan kuvvetlerle gerçekleştirilir. - Biyo-spesifik adsorpsiyon; immobilize ligandlar kullanılır. enzimin bağlanmasında 20 - Afinite adsorpsiyon; ya immobilize boyalar ile ya da immobilize metaller ile bağlanma gerçekleştirilir. - Elektrostatik etkileşim; taşıyıcı ve enzim arasındaki yük etkileşimine dayanır. İyonik bağlama çok yumuşak koşullarda gerçekleştiğinden enzimin konformasyonunda ve aktif merkezde değişikliğe neden olmaz. Ancak enzim ile taşıyıcı arasındaki bağ kovalent bağ kadar güçlü olmadığından enzim kaçışı söz konusudur. - Hidrofobik etkileşim; enzim ve taşıyıcı üzerindeki hidrofobik bölgelerin etkileşimine dayanır. Şekil 1.13 Enzimlerin yüzeye adsorpsiyonu A; Spesifik olmayan adsorpsiyon, B; Biyospesifik adsorpsiyon, C; Hidrofobik veya iyonik adsorpsiyon. Adsorpsiyon yönteminin yararları; enzim immobilizasyon yönteminin basit oluşu, değişik biçim ve yükteki taşıyıcıları seçme olanağı vermesi, bir yandan immobilizasyon gerçekleştirilirken diğer yandan enzim saflaştırılmasına olanak sağlamasıdır. İşlem çok kolay 21 olduğu gibi çok yumuşak koşullarda gerçekleşmekte ve önemli ölçüde enzim inaktivasyonuna neden olmamaktadır. Yöntemin sakıncaları ise; her ne kadar immobilizasyon işlemi kolaysa da optimal koşulların saptanması çok güçtür. Eğer enzim ile taşıyıcı arasında kuvvetli bir bağlanma yoksa bu durumda desorpsiyon sonucu enzim serbest halde reaksiyon ortamına geçmekte ve ürünlerin kirlenmesine neden olmaktadır. Enzim desorpsiyonu özellikle subsrat konsantrasyonunun yüksek olduğu durumlarda hiç istenmeyen bir durumdur. 1.3.2 Çapraz bağlama yöntemleri Küçük moleküllü bi- veya multi- fonksiyonel reaktifler enzim molekülleri arasında bağlar yaparak sonuçta suda çözünmeyen komplekslerin oluşmasını sağlarlar. Çapraz bağlama derecesi ve immobilizasyon, protein ve reaktif konsantrasyonuna, pH’ya ve immobilize edilecek enzime çok bağımlıdır. Moleküller arası bağlanmalar yanında molekül içi bağlanmalar da söz konusudur. Bu yöntem ile enzim immobilizasyonu genel olarak çözünmüş (a), kristal (b), püskürtülerek kurutulmuş (c) ya da fiziksel olarak agregatlaştırılmış (d) enzimlerin direkt olarak çapraz bağlanmasıyla gerçekleştirilir (Şekil 1.14). 22 Şekil 1.14 Çapraz bağlama yöntemleri 1.3.3 Tutuklama yöntemleri Prensip olarak tutuklama enzim molekülünü belli bir ortamda durmaya zorlamaktır. Enzim bulunduğu çevreden dışarı çıkamaz. Bu işlem polimer matriks içindeki kafeslerde gerçekleştirilebileceği gibi yarı geçirgen membranlar içinde mikrokapsülleme ve miseller ile de gerçekleştirilebilir. Bu yöntemi, kovalent bağlama ve çapraz bağlama ile immobilizasyondan ayıran en önemli özellik enzim molekülünün fiziksel veya kimyasal olarak herhangi bir taşıyıcıya bağlanmamış olmasıdır Polimer Matrikste Tutuklama Yöntem, yüksek derecede çapraz bağlı bir polimerin enzim çözeltisi içinde oluşturulması temeline dayanır. Polimerleşme sonucu 23 enzim molekülleri çapraz bağ ağları arasında tutuklanmakta ve böylece ana çözeltiye geçmeleri engellenmektedir (Şekil 1.15). Şekil 1.15 Matrikste tutuklama Mikrokapsülleme Bu yöntem enzim moleküllerinin yarı geçirgen bir membran içinde tutuklanmasından ibarettir (Şekil. 1.16). Enzimler daha çok kimyasal mikrokapsülleme ile immobilize edilmektedirler. Bu yöntem ile enzim immobilizasyonu; sürekli ve sürekli olmayan yarı geçirgen membran mikrokapsüllerde tutuklama olmak üzere iki grupta incelenebilir. Sürekli mikrokapsüllerde çerçeve membran katı, süreksiz mikrokapsüllerde (lipozomlar), ise bir sıvı tabakadır. İmmobilizasyonda kullanılan (membran) yarı geçirgen olması zorunludur. çerçeve maddesinin 24 Şekil 1.16 Mikrokapsülleme 1.3.4 Suda çözünen enzim immobilizasyonu Suda çözünmeyen formda hazırlanan immobilize enzimlerin aktivite ve spesifikliklerinde değişme olabilmektedir. Çünkü bu enzimler, modifikasyona uğrayabildikleri gibi mikroçevreleri de değişmektedir. Enzim çözeltisi bir membran ile ürün ve substrattan ayrılırsa doğal durumda kalması sağlanmış olur. Bu amaçla ultrafiltrasyon ve mikrofiltrasyon membranlarından yararlanılır. Kofaktöre gereksinim duyan enzimlerin immobilizasyonu söz konusu ise küçük molekülü olan kofaktörlerin yarı geçirgen membrandan çıkmamaları için polietilen glikol (PEG) gibi suda çözünen polimerlere kovalent bağlanması gerekir. 25 1.4 Enzim İmmobilizasyon Yöntemi ve Taşıyıcı Seçimi İmmobilizasyon yönteminin seçiminde dört ana kriter göz önüne alınmalıdır: güvenilirlik, maliyet, aktivitenin korunması ve kararlılık (Çizelge 1.6). İmmobilizasyon esnasında veya immobilizasyondan sonra enzim aktif merkezinin zarar görmeyeceği bir yöntem seçilmelidir. Böyle bir seçimin sağlıklı olabilmesi için enzimin yapısının çok iyi bilinmesi gerekir. Enzim ile taşıyıcı arasında herhangi bir bağlanma söz konusu ise ya bu bağlanmanın aktif merkez üzerinden gerçekleşmeyeceği taşıyıcılar seçilmeli ya da immobilizasyon işlemi sırasında aktif merkez korunmalıdır. Çizelge 1.7 İmmobilizasyonda göz önünde bulundurulması gereken kriterler. Enzim Biyokimyasal Özellikler Moleküler kütle, prostetik gruplar, protein yüzeyindeki fonksiyonel gruplar, saflık Kinetik Parametreler Spesifik aktivite, pH ve sıcaklık profilleri, aktivite ve inhibisyon için kinetik sabitler, çözgenlere karşı kararlılık, kontaminantlar Taşıyıcı Kimyasal Karakteristikler Kimyasal temel ve komposizyon, fonksiyonel gruplar, kimyasal kararlılık, por büyüklüğü, şişme özellikleri Mekanik Özellikler Partikül çapı, sedimentasyon sabiti, aşınma İmmobilize enzimler İmmobilizasyon Metodu / Kütle Transfer Etkisi / Kararlılık Bağlı protein, aktif enzim verimi, gerçek kinetik parametreler, difüzyon, operasyonel kararlılık, verimlilik 26 Enzim immobilizasyonu için değişik yöntemler kullanılabilir. Bunların içinde aktivitenin en yüksek düzeyde korunduğu yöntemin seçilmesi önemlidir. Ayrıca üretim için biyokatalizör açısından optimal koşulların saptanmasında yalnız immobilizasyon yöntemi değil aynı zamanda taşıyıcı ve reaktör tipi de önemli rol oynamaktadır (Şekil 1.17) (Cao, 2005). Şekil 1.17 Enzim immobilizasyonu için genel prosedür 1.5 Silika Silika (silikon dioksit) tetrahedral veya oktahedral SiO4’lerin bağlanmasıyla oluşan inorganik bir polimerdir. Polimerin sonundaki silisyum atomları hidroksil gruplarına bağlıdır. Silika amorf ve kristal 27 yapıda olabilir. 35 farklı kristal yapı bilinmektedir. HPLC kolon dolgu maddesi olarak kullanılan silika amorf yapıdadır. Silika nemli havaya maruz kaldığında yaklaşık % 5-10 (w/w) su adsorblayan hidrofilik bir adsorbandır. Silika yüzeyi, Si atomlarıyla koordinasyonuna göre üç çeşide ayrılan hidroksil grupları taşır: izole, geminal ve yakın (hidrojen bağlarıyla bağlı). Bunlar IR spektroskopisi, Si CP MAS NMR spektroskopisi ve diğer fizikokimyasal metodlarla karakterize edilebilir. Tamamen hidroksillenmiş durumda, hidroksil gruplarının yüzey konsantrasyonu, αOH, yaklaşık 8-9 μmol/m dir. Genellikle adsorblanmış su vakumda 150 oC’ye maruz bırakılarak silika yüzeyinden ayrılır. Poröz silikanın çok yüksek sıcaklıkta su ya da su buharına maruz bırakılması silikanın gözenek yapısında değişikliklere neden olur. Bunun sonucunda, spesifik yüzey alanı azalır ve ortalama gözenek çapı artar; ancak spesifik gözenek hacmi sabit kalır. Etkinin büyüklüğü, ısıya ve hidrotermal işlemin süresine bağlıdır. Yüzey hidroksil grupları pKa’sı yaklaşık 7,0 olan zayıf Bronsted asitleridir. Ancak, tayin yöntemine göre pKa değerinin 2 ile 10 arasında değişebileceği rapor edilmiştir. pKa değerlerinin geniş aralıklarda değişmesinin nedeni silikadaki metal safsızlıklardır. Silikalar camdan ya da önemli ölçüde sodyum, alüminyum titanyum vb. içeren kolloidal silikadan üretilmiştir. Örnek olarak, alüminyum varlığında kuvvetli bir Bronsted asiti olan Si-OH-Al oluşur. 28 Silika partiküllerinin net yükünün sıfır olduğu pH, pHzc ile gösterilir ve pH 1,5 ile 3 arasında değişir. pHzc ’nin üzerindeki değerlerde silika zayıf katyon değiştirici gibi davranırken; bu değerin altında anyon değiştirici olarak davranır. Aşağıdaki iyon değişim işlemi Allen ve Matijevic tarafından önerilmiştir: Si-OH + M+ = Si-OM + H+ pH>8 Si-OH + OH = Si-O + H20 pH>8 Silika süspansiyonun pH’ı 3’ten 8’e çıktıkça yüzey giderek artan negatif yükle yüklenir. Yüzey hidroksil gruplarının deprotonlanması hızlı gerçekleşen bir prosesken, protonlama ise nispeten daha yavaştır. pH 8’in üstünde silika, silikatlar halinde çözünür. Çözünürlük, pH 10’un üzerine çıktıkça üstel olarak artar. Poröz silika, kullanımdan ve kimyasal modifikasyondan önce, yüzey heterojenliğini azaltmak ve inorganik safsızlıkları uzaklaştırmak için termal işlem ya da derişik asit çözeltisi (hidroflorik asit hariç) ile muameleden oluşan bir aktivasyon işlemine tabi tutulur (Unger, 2002). HPLC’de sıklıkla kullanılan silika matriksler sodyum silikatın asitle muamelesi sonucu elde edilir. Silika yüzeyindeki silanol grupları (Si-OH) onlara çok hidrofilik ve kolaylıkla modifiye edilebilen bir yapı kazandırır. Silika matriksler sıkıştırılamaz ve bu nedenle HPLC 29 çalışmalarında sıklıkla kullanılmaktadır. Ayrıca organik çözgenlerden etkilenmezler ve mekanik olarak kararlıdırlar. 30 2. Materyal ve Metod 2.1 Materyal Kullanılan kimyasal maddeler; silikon dioksit, 1-1’ karbonildiimidazol (CDI), 3aminopropil-silika jel, glutaraldehit, 2 (3,4 epoksisiklohekzil) etil-silika dimetilaminopropil)-N’-etil disiklohekzil karbodiimid jel, karbodiimid (DCC), süksinikanhidrit, hidroklorür N-hidroksisüksinimid N-(3(EDC), (NHS), Coomassie Brillant Blue G250, N-benzoil-L-arginin-p-nitro anilid (BAPNA), tripsin (1670 U/mg katı, 0,1 mg protein/mg katı) Sigma Chemical Co.(St.Louis, CA)’den temin edilmiştir. Kullanılan diğer kimyasallar analitik saflıktadır. 2.2 Tripsin Aktivite Tayini Tripsin aktivitesi, sentetik bir substrat olan N-benzoil-L-argininp-nitroanilid (BAPNA) kullanılarak tayin edildi. Aktivite tayin yöntemi Pritchett ve arkadaşları tarafından geliştirilen bir yöntemin (Pritchett et al., 1981) tarafımızdan modifiye edilmiş halidir. Prosedürün temeli, reaksiyon sonucu açığa çıkan p- nitro anilinin 410 nm’de spektofotometrik tayinidir. 31 Serbest tripsin aktivite ölçümünde reaksiyon karışımı 2,72 ml 50 mM, potasyum fosfat tamponu (pH 7,5), 0,4 ml, 7,8 mM BAPNA ve 20 μl uygun tripsin preparatı (300 U) içerir. İmmobilize enzimin aktivite ölçümünde ise reaksiyon karışımda; 20 μl serbest enzim yerine 10 mg immobilize tripsin preparatı kullanıldı. Reaksiyon karışımı, 37 o C’de su banyosunda çalkalanarak 15 dakika inkübe edildi. Reaksiyon 0,2 ml asetik asit (%99) ilave edilerek durduruldu. Açığa çıkan p-nitro anilinin 410 nm’de absorbans okunarak spektrofotometrik olarak belirlendi. Bir tripsin aktivite birimi, optimum koşullarda dakikada 1 μmol p- nitro anilinin açığa çıkaran enzim miktarı olarak ifade edilir (Unit ). 32 2.3 Protein Tayini (Bradford Metodu) Tripsin preparatlarının ve immobilizasyon sonrası yıkama sularının protein konsantrasyonlarının tayini Bradford (Bradford., 1976) metodu ile gerçekleştirildi. Boya bağlama temelli yöntemlerin en yaygını, Bradford tarafından geliştirilen ve Coomassie Brillant Blue G-250 boyasının kullanıldığı yöntemdir. Yöntem, organik boyaların asidik grupları ile proteinlerin bazik gruplarının (Lys, Arg) etkileşerek renk oluşturmasını esas almaktadır. Sığır serum albümininin (BSA), distile suda hazırlanmış 1 mg/ml’lik stok standart çözeltisinden 0,02-0,2 mg/ml konsantrasyon aralığı ile hazırlanan standart grafiği kullanılarak örnek protein konsantrasyonları hesaplandı (Çizelge 2.1). Bradford reaktifi: 40 mg Coomassie Brillant Blue G250, %95’lik 50ml etanolde çözülür, üzerine 55 ml % 88’lik fosforik asit ilave edilerek distile su ile 1 lt’ye tamamlanıp filtre edilir. 33 Çizelge 2.1 Protein Tayini (Bradford Metodu). Standart Kör 0,1 ml Örnek Distile su Standart çöz. 0,1 ml Örnek 0,1 ml Reaktif 2 ml 2 ml 2 ml Tüpler karıştırılıp oda sıcaklığında 10 dk bekletilir. 595 nm’de absorbans okunur. 2.4 Tripsin İmmobilizasyonu Ticari olarak temin edilen tripsin silika tabanlı taşıyıcılar üzerine kovalent bağlama yöntemi kullanılarak immobilize edildi. Taşıyıcı olarak seçilen silikon dioksit, 3aminopropil-silika jel ve 2 (3,4 epoksisiklohekzil) etil-silika jel, EDC, DCC, NHS ve glutaraldehit gibi aktivasyon ajanları kullanılarak aktive edildi ve aşağıda verilen çeşitli metodlar kullanılarak tripsin immobilizasyonu gerçekleştirildi. 34 2.4.1 Silikon dioksit (Si) üzerine tripsin immobilizasyonu 1.yöntem (Si-CDI) I. adım ( 1. ve 2. Yöntemler için ortak adım) 100 mg silikon dioksit + 300 mg CDI / 5 ml DMSO (susuz) 25 oC’de karıştırılarak 2 saat İnkübasyon Santrifüj sonrası çökelek (Si-CDI) DMSO ile yıkandı. II. adım Si-CDI + 4 ml 50 mM pH 8,0 fosfat tamponu + 1 ml tripsin çözeltisi (1 mg protein/ml) 25 oC’de gece boyu inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek 50 mM pH 8,0 fosfat tamponu ile üst fazda protein gözlenmeyinceye kadar yıkandı. Şekil 2.1 CDI ile aktiflenmiş silikon dioksitte tripsin immobilizasyonu 35 2.yöntem (Si-CDI-KaproikasitDCC/NHS) II. adım Si-CDI + 0,05 mmol ε amino nkaproikasit / 5 ml 0,1 M pH 8,0 fosfat tamponu 4 oC’de 12 saat inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek (Si – kaproik COOH ) aynı tamponla yıkandı III. adım Si –kaproik COOH + DCC (0,5 mmol) / NHS (0,75 mmol) / 5 ml DMF 6 saat oda sıcaklığında inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek (Si – COO-NHS) DMF ile yıkandı IV. adım Si – COO-NHS + 4 ml 0,1 M pH 7,0 MeIm7 tamponu + 1 ml tripsin çözeltisi ( 1 mgprotein/ml ) 4 oC’de 12 saat inkübasyon Santrifüj ardından çökelek aynı tampon ile üst fazda protein gözlenmeyinceye kadar yıkandı. 36 Şekil 2.2 Si-CDI-Kaproikasit-DCC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu 37 3.yöntem (Si-Süksinik anhidrit-EDC/NHS) I. adım (3. ve 4. yöntemler için ortak) 100 mg silikon dioksit + 10 mg süksinik anhidrit / 5 ml DMF 2 saat oda sıcaklığında inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek (Si – COOH) DMF ile yıkandı II. adım Si – COOH + EDC (1 mg/ml) / NHS (0,1 mg/ml) / 5 ml MeIm7 tamponu 6 saat oda sıcaklığında inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek (Si – COO-NHS) bidistile H2O ile yıkandı. III. adım Si – COO-NHS + 4 ml 0,1 M MeIm7 tamponu + 1 ml tripsin çözeltisi ( 1 mg-protein/ml ) 4 oC’de gece boyu inkübe edildi Santrifüj sonrası çökelek 50 mM pH 8,0 fosfat tamponu ile üst fazda protein gözlenmeyinceye kadar yıkandı. 38 Şekil 2.3 Si-Süksinik anhidrit-EDC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu 39 4. yöntem (Si-Süksinik anhidrit-DCC/NHS) II. adım Si – COOH + DCC (0,5 mmol) / NHS (0,75 mmol) / 5 ml DMF’de 6 saat oda sıcaklığında inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek (Si – COO-NHS) DMF ile yıkandı. III. adım Si – COO-NHS + 4 ml 0,1 M MeIm7 tamponu + 1 ml tripsin çözeltisi ( 1 mg-protein/ml ) 4 oC’de gece boyu inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek 50 mM pH 8,0 fosfat tamponu ile üst fazda protein gözlenmeyinceye kadar yıkandı. 40 Şekil 2.4 Si-Süksinik anhidrit-DCC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu 41 2.4.2 3 aminopropil-silika (Si APTES) üzerine tripsin immobilizasyonu 5. yöntem (Si APTES – Glutaraldehit) I. adım 100 mg Si APTES + 4,9 ml pH 8,0 fosfat tamponu + 0,1 ml %25 glutaraldehit 25 oC’de 15 dk İnkübasyon Santrifüj sonrası çökelek bidistile H2O ile yıkandı. II. adım Si APTES – Glutaraldehit + 4 ml pH 8,0 fosfat tamponu + 1 ml tripsin çözeltisi (1mg-protein/ml ) 4 oC’de gece boyu inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek 50 mM pH 8,0 fosfat tamponu ile üst fazda protein gözlenmeyinceye kadar yıkandı. 42 Şekil 2.5 Si APTES – Glutaraldehit üzerine tripsinin immobilizasyonu 43 6. yöntem (Si APTES –Süksinik anhidrit-DCC/NHS) I. adım (6, 7 ve 8. yöntemler için ortak) 100 mg Si APTES + 10 mg süksinik anhidrit / 5 ml DMF 2 saat oda sıcaklığında inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek (Si – COOH) DMF ile yıkandı. II. adım Si – COOH + DCC (0,5 mmol) / NHS (0,75 mmol) / 5 ml DMF 6 saat oda sıcaklığında inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek (Si – COO-NHS) DMF ile yıkandı III. adım Si – COO-NHS + 4 ml 0,1 M MeIm7 tamponu + 1 ml tripsin çözeltisi. (1 mg-protein /ml) 4 oC’de 12 saat Santrifüj sonrası çökelek aynı tampon ile üst fazda protein gözlenmeyinceye kadar yıkandı. 44 Şekil 2.6 Si APTES –Süksinik anhidrit-DCC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu 45 7. ve 8. yöntem II. adım Si – COOH + 4 ml 50 mM pH 7,2 HEPES tamponu + 1 ml tripsin çözeltisi ( 1 mg protein /ml ) 4 oC’de 2 saat inkübasyon 7.yöntem (Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC/NHS) + 20 mg EDC / 20 mg NHS Oda sıcaklığında 2 saat inkübasyonun ardından gece boyu 4 oC’de karıştırıldı Santrifüj sonrası çökelek aynı tampon ile üst fazda protein gözlenmeyinceye kadar yıkandı. 8.yöntem ((Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC) + 20 mg EDC Oda sıcaklığında 2 saat inkübasyonun ardından gece boyu 4 oC’de karıştırıldı Santrifüj sonrası çökelek aynı tampon ile üst fazda protein gözlenmeyinceye kadar yıkandı. 46 Şekil 2.7 Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu 47 Şekil 2.8 Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC üzerine tripsinin immobilizasyonu 48 9. yöntem (Si APTES-PEGSüksinik anhidrit-DCC/NHS) I. adım 1 g PEG 6000 + 150 mg CDI / 5 ml DMSO 25 oC’de 2 saat inkübasyon Yıkama yapılmadan 150 mg Si APTES üzerine ilave edildi. 4 oC’de 12 saat inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek (silikaPEG) saf su ile yıkandı II. adım 100 mg silika-PEG + 10 mg süksinik anhidrit / 5 ml DMF 2 saat oda sıcaklığında inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek (Si – PEG-COOH) DMF ile yıkandı. III. adım Si APTES –PEG-COOH + DCC (0,5 mmol) / NHS (0,75 mmol) / 5 ml DMF 6 saat oda sıcaklığında inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek (Si APTES –PEG-COONHS) DMF ile yıkandı IV. adım Si APTES –PEG-COONHS + 4 ml 0,1 M MeIm7 tamponu + 1 ml tripsin çözeltisi. ( 1 mgprotein/ml ) 4 oC’de gece boyu İnkübasyon Santrifüj sonrası çökelek aynı tampon ile üst fazda protein gözlenmeyinceye kadar yıkandı. 49 Şekil 2.9 Si APTES-PEG-Süksinik anhidrit-DCC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu 50 2.4.3 2(3,4 epoksisiklohekzil) etil-silika jel (Silika tripsin immobilizasyonu epoksi) üzerine 10.yöntem (Si epoksi) 100 mg Silika epoksi + 4 ml 0,1 M pH 8,0 fosfat tamponu + 1 ml tripsin çözeltisi ( 1 mg-protein/ml ) 4 oC’de gece boyu inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek aynı tampon ile üst fazda protein gözlenmeyinceye kadar yıkandı. Şekil 2.10 Si epoksi üzerine tripsinin immobilizasyonu 51 11. yöntem (Si epoksi-Kaproik asit-DCC/NHS) I. adım 100 mg Silika epoksi + 5 ml 0,1 M pH 8,0 fosfat tamponu + 0,05 mmol ε amino n- kaproikasit 4 oC’de 12 saat inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek (Silika epoksi –kaproik COOH) 50 mM pH 8,0 fosfat tamponu ile yıkandı. II. adım Silika epoksi –kaproik COOH + DCC (0,5 mmol) / NHS (0,75 mmol) / 5 ml DMF 6 saat oda sıcaklığında inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek (Silika epoksi –kaproik COO NHS) DMF ile yıkandı. III. adım Silika epoksi –kaproik COO NHS + 4 ml 0,1 M MeIm7 tamponu + 1 ml tripsin çözeltisi ( 1 mg protein/ml ) 4 oC’de 12 saat inkübasyon Santrifüj sonrası çökelek üst fazda protein gözlenmeyinceye kadar yıkandı. 52 Şekil 2.11 Si epoksi-Kaproik asit-DCC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu 53 2.5 Silika Üzerine İmmobilize Edilmiş Tripsinin Karakterizasyonu Taşıyıcıya bağlama sonucu enzim molekülünün fiziksel ve kimyasal özelliklerinin değişmesi doğaldır. Enzim molekülünün hareket yeteneği sınırlanır, konformasyonu değişir, Kovalent bağlama durumunda yükü ve kimyasal yapısı değişir. Teorik olarak immobilizasyondan sonra enzimin spesifik aktivitesinde düşme beklenir. Fakat hiç değişmediği veya arttığı durumlarda söz konusudur. İmmobilize ve serbest enzimlerin aktivitelerinin kıyaslanabilmesi için taşıyıcıya bağlanan enzim miktarının bilinmesi gerekir. Bu amaçla immobilizasyon öncesi ve sonrası enzim (serbest ve immobilize) aktiviteleri belirlendi. Benzer şekilde serbest enzim ve immobilizasyon sonrası yıkama sularında protein tayinleri Bradford yöntemine göre gerçekleştirildi. İmmobilizasyon verimleri gerek aktivite gerekse protein miktarı cinsinden başlangıç ve yıkama sularındaki bağlanmayan enzim miktarı arasındaki farktan hesaplanarak belirlendi. Test edilen 11 farklı immobilizasyon yöntem sonuçları kıyaslanarak tripsin immobilizasyonu için uygun metod olarak belirlendi ve bu metodla gerçekleştirilen immobilize tripsin preparatlarında optimizasyon ve karakterizasyon çalışmaları serbest enzimle kıyaslamalı olarak yapıldı. 54 2.5.1 İmmobilizasyon verimine protein miktarının etkisi Enzimatik olarak yürüyen bir reaksiyonun hızı, reaksiyon koşullarına bağlıdır. Bunlardan en önemlisi enzim konsantrasyonu olup, diğerleri substrat konsantrasyonu, ortamın pH’sı ve sıcaklığı, aktivatör ve inhibitörlerin varlığı olarak sıralanabilir. İmmobilizasyon etkinliğine protein miktarının etkisini incelemek amacıyla immobilizasyon için seçilen Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC yönteminde enzimin farklı protein miktarları (2-20mg / g taşıyıcı) kullanılarak immobilizasyon gerçekleştirildi ve immobilizasyon için en uygun protein miktarı belirlendi. 2.5.2 Sıcaklık Tüm kimyasal reaksiyonlar gibi enzim katalizli reaksiyonlar da sıcaklığa bağımlıdır ve reaksiyon hızı sıcaklıkla artar. Fakat bu artış sürekli olmayıp belli bir derecenin üzerinde, inkübasyon zamanına bağımlı olarak önce duraklama daha sonra da gerileme şeklinde kendini göstermektedir. Serbest ve immobilize enzim aktivitesine sıcaklığın etkisi genellikle optimum eğrileri çizilerek belirlenir. Bu grafik bağıl aktivitenin sıcaklık ile değişimini gösterir. Genellikle inkübasyon süresi arttıkça termal denatürasyon nedeniyle optimum sıcaklık düşer. İmmobilizasyon sonrası da enzimin optimum sıcaklığı genellikle değişir. 55 Serbest ve immobilize tripsin aktivitelerinin sıcaklığa bağımlılığını belirlemek amacı ile 4-70oC sıcaklık aralığında (4, 10, 20, 30, 37, 50, 60, 70 oC) çalışıldı ve her iki formun optimum sıcaklık değerleri belirlendi. 2.5.3 pH Enzimler protein yapısındaki moleküller olduklarından katalitik aktiviteleri çevre koşullarından oldukça etkilenmektedir. Bunlardan biriside ortamın pH’ıdır. İnkübasyon ortamının pH’sı protein molekülünün tamamının yük ve dissosiasyon durumu yanında aktif merkezini de etkilemektedir. Bu nedenle pH-aktivite ilişkisinin incelenmesi, enzim proteinlerinin yapı fonksiyon ilişkilerinin anlaşılması açısından faydalıdır. pH’ın serbest ve immobilize enzim aktivitelerine etkisini incelemek için inkübasyon tamponunun pH’ı 4-12 arasında değiştirilerek standart koşullarda aktiviteleri ölçüldü. İnkübasyon karışımlarının içerdiği tampon türü ve pH değerleri; asetat (pH 4 - 5), sitrat (pH5 – 6), fosfat (pH 6 -7 -8 - 11 - 12), borat (pH 8 - 9 - 10). Her bir pH değeri için iki örnek ve bir kör deneme yapıldı. 2.5.4 Substrat Konsantrasyonu Serbest ve immobilize tripsin aktivitelerinin substrat konsantrasyonuna bağımlı değişimleri substrat olarak BAPNA kullanılarak belirlendi. Bu amaçla hazırlanan denemede farklı 56 konsantrasyonlarda (0,3–3 mM) BAPNA kullanılarak standart koşullarda aktivite tayini yapıldı. 2.6 Kararlılık Testleri İmmobilize enzim preparatları özellikle endüstriyel proseslerde kullanılacaklarsa en önemli kriterlerden birisi bu preparatların kararlılığıdır. İmmobilize enzimin kararlılığından anlaşılan belirli çalışma koşullarında enzim aktivitesinin zaman bağımlı olarak korunmasıdır. Bu sıradaki enzim aktivite kaybı çeşitli nedenlere dayanır. Bunlar, mikrobiyal yıkım, termal, pH veya kimyasal inaktivasyon olarak sıralanabilir. Bunun dışında taşıyıcının parçalanması veya başka sebepler ile enzim kaçışı da aktivite kaybına neden olur. İmmobilize enzimin depo ve operasyonel kararlılıkları da önemli parametrelerdir. Genellikle immobilize enzimlerin depo kararlılıkları serbest enziminkinden daha iyidir. Ancak tersi durumlarla da karşılaşılmaktadır. Depo kararlılığı uzun süre saklama durumunda enzimin aktivite kaybının bir ölçüsüdür. Bu süre içinde enzimin katalitik potansiyelinden yararlanılmaz yani enzim iş yapmaz. Halbuki operasyonel kararlılık enzimin iş yapma süresince aktivitesindeki değişmeyi gösteren bir parametredir. Operasyonel kararlılık ne kadar yüksek ise enzimin katalitik potansiyelinden o ölçüde yararlanılabilir. Operasyonel kararlılığın ölçüsü ise enzimin reaktördeki yarı ömrüdür (t1/2). Yani enzim aktivitesinin yarısının kaybolması için geçen süredir. 57 2.6.1 Termal kararlılık Enzimler protein yapıda oldukları ve ısıya karşı kararlı olmadıklarından, sıcaklık yükseldikçe inkübasyon süresine bağımlı olarak aktivite kaybı hızlanır. Sıcaklık sabit tutulsa bile yalnız inkübasyon süresinin uzaması bile denatürasyon sonucu aktivite kaybına neden olur. Eğer bir enzimin termal kararlılığı immobilizasyon ile değişiyorsa böyle enzimlerin kullanımı pek çok alanda yaygın olacaktır. Termal kararlılığın belirlenmesi amacıyla, ayni miktar protein içeren serbest ve immobilize enzimler 30 dakika boyunca farklı sıcaklıklarda (4, 20, 10, 30, 40, 50, 60, 70 oC) inkübe edildi ve optimum koşullarda aktiviteleri ölçüldü. 2.6.2 pH kararlılığı Enzim aktivitesi üzerine pH kararlılığının etkisini incelemek amacıyla farklı pH’lardaki (7, 8, 9, 10, 11, 12) tamponlarda serbest ve immobilize enzim preparatları 30 dakika oda sıcaklığında bekletildi ve optimum koşullarda aktiviteleri ölçüldü. 58 2.6.3 Depo kararlılığı Depo kararlılığı, immobilize enzim uygulamalarını ilgilendiren önemli bir parametre olup uzun süre saklama durumunda enzimin aktivite kaybının bir ölçüsüdür. Depo kararlılığını belirlemek için 4 oC’de aynı koşullarda saklanan serbest ve immobilize enzimlerden belirli zaman aralıklarıyla örnekler alınarak aktiviteleri optimum koşullarda tayin edildi. 2.6.4 Operasyonel kararlılık Enzimlerin operasyonel kararlılığı, immobilize enzimlerin endüstriyel uygulamalarında önemli bir parametredir. İmmobilize enzimin operasyonel kararlılığı için, farklı tüplerde değişen inkübasyon süreleriyle aktivite tayini yapıldı. Operasyon zamanı ile enzim aktivitesindeki azalma arasındaki ilişki belirlenerek biyokatalizörün yarı ömrü (t1/2) hesaplandı. 59 3. Sonuçlar ve Tartışma 3.1 Tripsinin Silika Tabanlı Taşıyıcılar Üzerine Kovalent Bağlama ile İmmobilizasyonu İmmobilize tripsin başlıca; peptit sentezi ve özellikle proteom analizlerinin kilit adımı olan peptit haritalamada kullanılır ki; bu da hastalık teşhisi, ilaç etkileşimleri için potansiyel hedefin görüntülenmesi, rekombinant DNA teknolojisiyle üretilen proteinlerin kalite kontrolü gibi alanlardaki çalışmalar için en önemli adımlardan birisidir. Tripsin ile yapılan immobilizasyon çalışmaları oldukça fazladır (Unen et al., 2001; Wu et al., 2004; Malmsten et al., 2000; Bisswanger et al., 2001; Wu et al., 2005; Xi et al., 2004). Bu çalışmada silika tabanlı taşıyıcıların yüzey kimyası değiştirilerek tripsin immobilizasyonu için uygun şartlar belirlendi. Taşıyıcıya kovalent bağlama ile enzim immobilizasyonunda ilk adım taşıyıcının aktivasyonudur. Çalışmamızda silika tabanlı taşıyıcıların aktivasyonu için CDI, EDC, DCC ve glutaraldehit gibi aktifleyici ajanlar kullanılarak tripsin immobilizasyonu gerçekleştirildi. Her bir immobilizasyon yöntemi için aktivite ve protein cinsinden % immobilizasyon verimleri hesaplandı. Elde edilen sonuçlar kıyaslanarak tripsin için uygun taşıyıcı ve immobilizasyon metodu belirlendi. İmmobilize enzim ve serbest enzim için karakterizasyon çalışmaları yapıldı. Bunun için optimum sıcaklık, optimum pH, termal kararlılık, pH kararlılık, depo kararlılığı ve kinetik sabitleri belirlendi. 60 Tripsinin silika tabanlı taşıyıcılarda immobilizasyonuna ait sonuçlar çizelge 3.1’de verildi. Çizelgeden görüldüğü gibi en yüksek aktivite verimi Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC (yöntem 8) ile elde edildi. Bu nedenle bu yöntemle hazırlanan enzim preparatının karakterizasyonu gerçekleştirildi. Çizelge 3.1 Silika tabanlı taşıyıcılara tripsin immobilizasyonu için kullanılan yöntemler. Yöntem % İmmobilizasyon Verimi Protein Aktivite 1 Si-CDI 44 2 2 Si-CDI-Kaproikasit-DCC/NHS 34 2 3 Si-Süksinik anhidrit-EDC/NHS 39 2 4 Si-Süksinik anhidrit-DCC/NHS 33 1 5 Si APTES – Glutaraldehit 17 3 6 Si APTES –Süksinik anhidrit-DCC/NHS 37 4 7 Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC/NHS 100 6 8 Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC 89 12 9 Si APTES-PEG-Süksinik anhidrit-DCC/NHS 32 3 10 Si epoksi 15 3 11 Si epoksi-Kaproik asit-DCC/NHS 27 3 61 3.1.1 Taşıyıcının aktivasyonuna EDC miktarının etkisi 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid (EDC), polipeptid sentezinde en yaygın kullanılan bağlama ajanlarından biridir. Karbodiimidler, karboksilatları bir O-açilüre oluşturmak için aktive ederek, karboksilik asitler ve aminler arasında amid bağlarının oluşumunu katalizler (Pascual et al., 2003). Yöntem Hoare ve Koshland (Hoare and Koshland, 1967) tarafından geliştirilmiştir. Reaksiyon basittir ve sulu çözeltide oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, karbodiimidler oldukça kararsız moleküllerdir; diğer fonksiyonel gruplarla örneğin sülfidril (Carraway and Triplett, 1970) veya amino grupları (Kurzer et al., 1967), tirozin (Carraway et al., 1968), su ve diğer bileşenlerle kolayca reaksiyon verebilirler. Taşıyıcı (Si APTES –Süksinik anhidrit) aktivasyonu için kullanılacak olan uygun EDC miktarını belirlemek için gram taşıyıcı başına değişen miktarlarda (0,25-2 mmol) EDC kullanılarak aktivasyon gerçekleştirildi. Farklı miktarlarda EDC ile aktive edilmiş taşıyıcılara 100 mg tripsin preparatı (10 mg protein/g katı) kullanılarak immobilizasyon yapıldı ve % immobilizasyon verimleri hesaplandı (Çizelge 3.2). Gram taşıyıcı başına 0,25 mmol EDC oranında en yüksek aktivite verimi elde edildi. 62 Çizelge 3.2 Farklı EDC/g taşıyıcı oranlarında immobilizasyon verimi. EDC miktarı (mmol/g % İmmobilizasyon Verimi taşıyıcı) Protein Aktivite 0,25 88 15 0,5 88 12,2 1 89 11,8 1,5 88 11 2 91 10,8 Genellikle daha fazla aktivasyon ajanı kullanımı ile (aktiflenmiş karboksil gruplarının sayısında artış), immobilizasyon veriminde ve dolayısıyla enzim aktivitesinde artışı beklenir. EDC’nin fazlasının kullanılmasıyla aktivite cinsinden % immobilizasyon veriminde görülen düşme; sadece tripsin ve taşıyıcı arasında değil aynı zamanda EDC’nin tamamen hidrolizinden önce tripsinler arasında da amid bağlarının oluşabilmesiyle açıklanabilir. Enzimin bir miktarının kendi içinde çapraz bağlanması moleküllerin konformasyonel hareketlerini sınırlayarak enzim aktivitesinde düşüşe neden olur. Literatürde benzer örnekler vardır (Kan et al., 2005, Ferreira et al., 2003, Park et al., 2002, Yang et al., 2004). 63 3.1.2 Tripsin immobilizasyonu için uygun protein miktarının belirlenmesi Aktivasyon oranı belirlendikten sonra bağlanan proteinin optimizasyonu için; taşıyıcı ve aktifleyici ajan miktarı sabit tutularak farklı protein konsantrasyonlarında tripsin preparatları kullanılarak aynı koşullarda immobilizasyon gerçekleştirildi. Çizelge 3.3 Tripsin immobilizasyonu için uygun protein miktarının belirlenmesi. Tripsin Bağlanan (mg protein / g protein (mg/ taşıyıcı) g taşıyıcı 2 % İmmobilizasyon Verimi Protein Aktivite 2 100 29,7 5 5 100 21,2 10 9,6 96 15,7 15 14,25 95 12,5 20 18,6 93 10,7 Enzim miktarı 2 mg’dan fazla olduğunda % immobilizasyon veriminde düşme gözlendi. Aktivite cinsinden % immobilizasyon verimindeki düşmeye rağmen taşıyıcıya bağlanan tripsin miktarı açık bir şekilde artmaktadır (Çizelge 3.3). Bağlanan tripsin fazla olduğunda enzimlerin sıklıkla bağlanması nedeni ile gerçekleşen yapısal 64 değişiklikler enzim ve substrat arasındaki etkileşimi engelleyebilir. Sonuç olarak da; enzim aktivitesi düşebilir (Kan et al., 2005). Bundan sonraki çalışmalara gram taşıyıcı başına 2 mg protein içeren tripsin preparatı kullanılarak devam edildi. 3.2 İmmobilize Tripsinin Karakterizasyonu 3.2.1 Sıcaklık etkisi Enzimlerin katalitik aktivitesi sıcaklığa bağımlıdır. Serbest ve immobilize enzimlerin aktivitelerine sıcaklığın etkisi genellikle optimum eğrileri çizilerek izlenmektedir. Bağıl aktivitenin sıcaklıkla değişimini gösteren bu grafikten enzim için optimum sıcaklık değeri belirlenir. Sıcaklığın serbest ve immobilize tripsin aktivitesine etkisi bölüm 2.5.2’de açıklandığı gibi ayni miktar protein içeren serbest ve immobilize enzimin aktivitelerinin farklı sıcaklıklarda standart koşullarda ölçülmesiyle belirlenmiş ve bu ilişki Şekil 3.1’de verilmiştir. 65 Şekil 3.1 Serbest ve immobilize tripsin aktivitesinin sıcaklığa bağımlı değişimi Genellikle hayvansal kaynaklı tripsinlerin optimum sıcakılık değerleri 40-65 oC arasında değişmektedir (Guyonnet et al., 1999, Ahsan , 2001, Venkatesh et al., 1998, Kishimura et al., 2002). Şekil 3.1’den görüldüğü gibi serbest ve immobilize enzim için optimum sıcaklık değeri 50 oC olarak bulundu. Bu da immobilizasyon işleminin tripsinin optimum sıcaklığında bir etkisi olmadığını göstermektedir. Enzimler protein yapıdaki büyük ve oldukça komplike moleküllerdir. Aktivitesinin korunması için üç boyutlu yapısı korunmalıdır. Aktiviteye etki eden önemli parametrelerden biri de sıcaklıktır. Reaksiyon hızı sıcaklık arttıkça artar. Fakat belirli sıcaklıktan sonra enzim proteinin denaturasyonundan dolayı aktivitede düşme olur. Enzimin maksimum aktivite gösterdiği sıcaklık (optimum sıcaklık) özellikle operasyonel bir parametre olması açısından önemlidir. Literatürlerde çeşitli taşıyıcılarda immobilize edilmiş glukoz izomeraz, 66 lösin aminopeptidaz, kimotripsin, tripsin ve asparaginaz gibi bazı enzimlerin optimum sıcaklıklarının immobilizasyon sonrasında değişmediği örnekler mevcuttur (Önal, 2000). İmmobilizasyondan sonra yapılan sıcaklık etkisi ile ilgili çalışmalarda genellikle daha iyi bir yorum yapabilmek için Arrhenius diyagramları oluşturulur. Bağıl aktivitelerin logaritması ile 1/T arasında çizilen bu grafikten aktivasyon enerjileri (Ea) hesaplanır. Ea, bu grafiğin eğimi ve genel gaz sabiti (R) ile doğru orantılıdır ve reaktant molekülün ürüne çevrilebilmesi için sahip olması gereken minimum enerji miktarıdır. Aktivasyon enerjisi immobilizasyon sonucu artar veya azalabilir (Önal, 2000). Çizilen Arrhenius diyagramlarından aktivasyon enerjisi (Ea), Ea = eğim x R (R=8,314 J.K-1.mol-1) formülü kullanılarak hesaplanır. Serbest ve immobilize tripsin için çizilen Arrhenius diyagramlarından (Şekil 3.2) aktivasyon enerjisi serbest enzim için 23,4 kjmol-1 ve immobilize enzim için ise 57,3 kjmol-1 olarak hesaplandı. İmmobilize enzim için aktivasyon enerjisinin yüksek olması genellikle kullanılan enzim immobilizasyon yönteminin özellikle kovalent bağlama yöntemlerinde enzim moleküllerinin yapısında bazı değişiklikler yarattığı ve bu nedenle enzim katalizli reaksiyonun engellendiği şeklinde açıklanmaktadır (Rashid and Siddiqui, 1998; Krajewska et al., 1990). 67 (a) Şekil 3.2 İmmobilize (a) ve serbest (b) enzime ait Arrhenius diyagramları 68 3.2.2 pH etkisi Enzim aktivitesini etkileyen faktörlerden en önemlisi pH etkisidir. Bir enzimin pH optimumu; reaksiyon süresi, sıcaklık, substrat yapısı ve konsantrasyonu, kullanılan tamponun türü ve konsantrasyonu, ortamın iyonik şiddeti, enzimin saflığı gibi bir seri deneysel parametreye bağımlı bir değişkendir. Biyokimyasal reaksiyonlar in vivo koşularda sulu ortamda gerçekleştiğinden pH enzimin yük durumunu dolayısıyla aktivitesini çok etkiler. Hayvansal kaynaklı tripsinlerin optimum pH değerleri genellikle 7,0-9,5 arasında değişmektedir (Asgeirsson et al., 1989, Kishimura et al., 2002, Fengna et al., 2004) Serbest ve immobilize tripsin aktivitesine pH etkisi ve optimum pH bölüm 2.5.3’te açıklandığı gibi belirlenerek Şekil 3.3’de verilmiştir. Serbest ve immobilize enzim için optimum pH sırasıyla 8,0 ve 9,0 olarak belirlendi. 69 (a) (b) Şekil 3.3 İmmobilize (a) ve serbest (b) tripsin aktivitesinin pH’ya bağımlı değişimi. 70 Enzimin immobilizasyonundan sonra pH değişimi üç faktör ile açıklanabilir: 1.Destek materyalinin polianyonik veya polikatyonik karakteri 2.Enzim molekülünün immobilizasyon sırasında modifikasyonu 3.Enzimatik reaksiyon sonrası ürünlerin asidik ya da bazik olmasıdır (Zihnioğlu, 1992). İmmobilize enzimin optimum pH değerinin bazik bölgeye kayması, Şekil 2.8’de görülen mekanizma ile taşıyıcıya amino gruplarından bağlanan enzimin sahip olduğu pozitif yüklü grup sayısında immobilizasyon sonrasında meydana gelen azalma nedeniyle, enzimin daha polianyonik karakter kazanmasından kaynaklanmaktadır (Fengna et al., 2004, Kilinc et al., 2002). 3.2.3 Substrat konsantrasyonun etkisi İmmobilizasyon sırasında enzim proteinindeki konformasyonel değişiklikler, sterik etkiler, mikroçevre etkileri ve difüzyon etkileri, immobilize enzimlerin serbest enzimden farklı kinetik davranışlar göstermesine neden olurlar. O nedenle immobilize enzimlerin kinetik davranışlarının incelenmesi, kinetik sabitlerinin tayini ve serbest enzimle kıyaslanması oldukça önemlidir. Serbest ve immobilize tripsin aktivitelerinin substrat konsantrasyonuna bağlı değişimleri 0,3-3 mM aralığındaki konsantrasyonlarda BAPNA kullanılarak belirlendi. BAPNA konsantrasyonunun aktivite üzerine etkisi Şekil 3.4’te verildi. 71 (a) (b) Şekil 3.4 Serbest (a) ve immobilize (b) tripsin aktivitelerinin BAPNA konsantrasyonununa bağımlı değişimleri. 72 Serbest ve immobilize tripsin aktivitelerinin substrat konsantrasyonuna bağlı değişimleri belirlendikten sonra kinetik parametrelerin tayini için Lineweaver-Burk diyagramları çizildi (Şekil 3.5). (a) (b) Şekil 3.5 Serbest (a) ve immobilize (b) tripsin Lineweaver-Burk diyagramı 73 Bilindiği gibi Km (Michaelis sabiti) bir enzimatik reaksiyonda, reaksiyon hızının maksimum hızın yarısına ulaştığı andaki substrat konsantrasyonunu ifade eder ve substratın enzime olan ilgisinin ölçüsüdür. Yüksek bir Michaelis sabiti, yarı doygunluğa ulaşabilmek için yüksek bir substrat konsantrasyonu gerektiğini ve enzimin adı geçen substrata ilgisinin yüksek olmadığını gösterir. Çizelge 3.4’te immobilize ve serbest enzimlerin kinetik parametreleri verildi. Çizelge 3.4 Serbest ve immobilize enzimin kinetik sabitleri. Serbest Enzim Substrat BAPNA Km İmmobilize Enzim Km V max V max (mM) (μmol/dak/mg) (mM) (μmol/dak/mg) 0,56 9 0,6 2,1 Serbest tripsin için Km değerinin hayvansal kaynaklı tripsinler (Guyonnet et al., 1999, Ahsan , 2001) ile benzer olduğu gözlendi. Çizelge 3.4’te görüldüğü gibi serbest ve immobilize enzimlerin Km değerleri arasında mertebe açısından önemli bir değişiklik yoktur. İmmobilizasyon sonrasında enzimin Km değerinde bir değişim olmaması enzimin katalitik bölgesinin immobilizasyondan etkilenmediğini göstermektedir (Önal, 2000). 3.3 Kararlılık Testleri İmmobilize enzimin stabilitesinden anlaşılan, belirli çalışma koşullarında enzim aktivitesinin zamana bağımlı olarak korunmasıdır. Enzimlerin kararlılığı denince proteinin konformasyonel kararlılığından 74 söz edilir. Enzimin termal, pH ve depo kararlılıkları büyük ölçüde konformasyonel kararlılığı ile belirlenir ve denaturasyon sonucu da inaktivasyon gerçekleşir. Enzim aktivite kaybı değişik nedenlere (pH veya kimyasal inaktivasyon vb.) dayanır (Telefoncu,1997). 3.3.1 Termal kararlılık Enzimlerin kararlılığına etki eden parametrelerden birisi sıcaklıktır. Genellikle enzimler düşük sıcaklıklarda daha kararlı olurken, yüksek sıcaklıklarda hızla termal denatürasyon gerçekleşir. Serbest ve immobilize tripsinin termal kararlılıkları bölüm 2.6.1’de açıklandığı gibi belirlendi. Şekil 3.6 Serbest ve immobilize tripsinin termal kararlılığı 75 Termal kararlılık denemeleri sonucunda immobilize enzimin yüksek sıcaklıklarda bile aktivite göstermeye devam ettiği, serbest tripsinin 70 °C sıcaklıkta aktivitesinin % 74’ünü kaybederken, immobilize tripsinin ise % 23 oranında aktivitesini kaybettiği görüldü (Şekil 3.6). Benzer olarak sığır pankreatik tripsini için yapılan denemelerde enzimin 50 °C’ ye dek aktivitesini büyük ölçüde koruduğu ve bu sıcakılığın üzerindeki sıcaklıklarda aktivitesini hızla kaybettiği belirtilmiştir (Fernandez et al., 2005). Çeşitli immobilize tripsin preparatlarının da 70-80 °C’ ye dek kararlı olduğu belirtilmiştir (Montero et al., 2007, Fernandez et al., 2005). İmmobilizasyon sonrasında enzimin termal kararlılığı artabilir, azalabilir ya da hiç değişmez. Fakat genellikle immobilizasyon işlemi enzimin termal kararlılığını arttırmaktadır (Telefoncu, 1997; Mitsutomi et al., 1985; Hayashi et al., 1993). 3.3.2 pH kararlılığı Enzimler protein olduklarından, kararlılıklarına etki eden her faktör, proteinin sekonder, tersiyer ve/veya kuarter yapılarını etkiler. Çoğu enzim, aşırı asidik ya da bazik koşullarda tersinmez denatürasyona uğrar. Bir enzimin pH kararlılığı inkübasyon koşulları, inkübasyon süresi, sıcaklık, tampon türü ve konsantrasyonu, substrat konsantrasyonu ve iyonik şiddet gibi birçok faktör ile modifiye edilebilir. Serbest ve immobilize tripsinin pH kararlılığı, bölüm 2.6.2’de açıklandığı gibi belirlendi. 76 Şekil 3.7 Serbest ve immobilize tripsinin pH kararlılığı İmmobilize enzimin özellikle bazik bölgede (pH 8-12) serbest enzime göre daha kararlı bir yapıya sahip olduğu görüldü. Hayvansal kaynaklı tripsin genelde pH 6-9 arasında kararlıdır (Kishimura et al., 2002, Fengna et al., 2004). Silika jel ile desteklenmiş kitosan buncuklara immobilize tripsinin serbest enzime kıyasla bazik bölgede daha yüksek bir kararlılık gösterdiği belirtilmiştir (Fengna et al., 2004). 3.3.3 Depo kararlılığı Depo kararlılığı, özellikle immobilize enzimlerin uygulama alanı ile ilgili önemli bir faktördür. Depo kararlılığı, enzimin saklama koşullarına bağlı bir parametredir. Genellikle, suda çözünmez enzim preparatları ya liyofilize edilerek ya da süspansiyon şeklinde 4-5 °C’de saklanabilirler. 77 Serbest ve immobilize tripsinin depo kararlılıkları bölüm 2.6.3’de anlatıldığı gibi belirlendi. Grafikten de görüldüğü gibi immobilize tripsin, 40 gün sonunda aktivitesini hâlâ büyük oranda (~ %95) korurken serbest enzim % 61 oranında korumuştur. Monolitik silika üzerine immobilize edilmiş sığır pankreatik tripsinin 6 ay sonunda aktivitesini ~ %90 oranında koruduğu belirtilmiştir (Ota et al., 2006). Şekil 3.8 Serbest ve immobilize tripsinin depo kararlılığı 78 3.3.4 Operasyonel kararlılık Operasyonel kararlılık, enzimin iş yapma süresince aktivitesindeki değişmeyi gösteren bir parametredir ve operasyon süresi ve operasyon sıcaklığına bağlı olarak değişir. Ayrıca bir enzimin katalitik potansiyeli operasyonel kararlılığı ile orantılıdır. Operasyonel kararlılığın ölçüsü, enzimin reaktördeki yarı ömrüdür ve t1/2 ile ifade edilir. Daha doğru bir tanımlama ile, enzim aktivitesinin yarısının yitirilmesi için geçen zamandır ve şu eşitlikle hesaplanır: Ar = A0 exp (-kD t) t1/2 = 0,693 / kD t operasyon süresini, kD bozunma katsayısını, A0 ve Ar ise sırasıyla başlangıç ve t anındaki enzimatik aktiviteyi göstermektedir (Calsavara, 2000). Yapılan hesaplama sonucunda enzimin yarı ömrü (t1/2) yukarıdaki formülden yaklaşık 43 dakika olarak hesaplandı. Literatürde benzer bir çalışmaya rastlanmadığı için kıyaslama yapılamadı. 79 Şekil 3.9 İmmobilize tripsinin operasyonel kararlılığı 80 4. SONUÇ Bu çalışmada tripsinin çeşitli silika tabanlı taşıyıcılarda immobilizasyonu amaçlandı. Ticari olarak temin edilen tripsinin immobilizasyonu kovalent bağlama yöntemi kullanılarak 11 farklı immobilizasyon metodu kullanılarak gerçekleştirildi. Kullanılan metodlar arasında Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC immobilizasyon verimleri çok daha iyi olduğundan bu yöntemle çalışılmasına karar verildi. İmmobilizasyonda kullanılacak enzim miktarı 2 mg olarak tespit edildi. Karakterizasyon işlemlerinde BAPNA substrat olarak kullanıldı. Serbest ve immobilize enzim için optimum pH sırasıyla 8,0 ve 9,0 olarak belirlendi. Optimum sıcaklık ise hem serbest enzim hem de immobilize enzimde 50 °C olarak hesaplandı. Serbest ve immobilize enzim için kinetik parametreler (Km ve Vmax) Lineweaver-Burk diyagramı yardımıyla hesaplandı. İmmobilize enzimin termal ve depo kararlılığının serbest enzime kıyasla daha iyi olduğu bulundu. Operasyonel kararlılık testleri sonucu yarılanma ömrü 43 dakika olarak tespit edildi. Sonuç olarak bu tez kapsamında ticari tripsin ile hazırlanan immobilize enzimin serbest enzime göre daha iyi özellik ve kararlılıklara sahip olduğu görüldü. İmmobilize tripsinin kullanılmasının hedeflendiği on-line proteoliz çalışmalarına geçmeden enzimin doğal substratlara karşı davranışı ve organik çözgen kararlılığı incelenmelidir. 81 KAYNAKLAR DİZİNİ Ahsan, M.N., Watabe, S., 2001, Kinetic and structural properties of two isoforms of trypsin isolated from the viscera of Japanese anchovy, Engraulis japonicus, Journal of Protein Chemistry 20(1):49-58. Asgeirsson, B., Fox, J.W., Bjarnason, J.B., 1989, Purification and characterization of trypsin from the poikilotherm Gadus morhua, Europan Journal of Biochemistry, 180: 85-94. Bradford, M.M., 1976, Analytical Biochemistry, 72: 248-254. Bisswanger, H., Nouaimi, M., Klaus, M., Immobilization of trypsin on polyester fleece via different spacers, 2001, Enzyme and Microbial Technology, 29: 567-574. Calsavara, L.P.V., Moraes, F.F., and Zanin, G.M., 2000, Thermal stabılıty and anergy of deactıvatıon of free and immobılızed cellobıase, Brazilian Journal of Chemical Engineering, 17: 4-7. Cao, L., 2005, Carrier-bound Immobilized Enzymes Principles, Application and Design, 128 p. Cao, L., 2005, Immobilised enzymes: science or art?, Current Opinion in Chemical Biology, 9:217–226 Carraway, K.L., Koshland, D.E.J., 1968, Reaction of tyrosine residues in proteins with carbodiimide reagents, Biochimica et Biophysica Acta Elsevier, 200: 564-566. 82 KAYNAKLAR DİZİNİ (Devam) Carraway, K.L., Triplett, R.B., 1970, Reaction of tyrosine residues in proteins with carbodiimide reagents, Biochimica et Biophysica Acta Elsevie, 160. 272-274. Fengna, X., Jianmin, Wu., Zhishen, Jia., Xianfu, Lin., 2004, Preparation and characterization of trypsin immobilized on silica gel supported macroporous chitosan bead, Process Biochemistry, 40: 2833– 2840. Fernandez, L., Gomez, L., Ramırez, H.L., Villalonga, M.L., Villalonga, R., 2005, Thermal stabilization of trypsin with glycol chitosan, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 34: 14–17. Ferreira, L., Ramosb, M.A., Dordick, J.S., Gil, M.H., 2003, Influence of different silica derivatives in the immobilization and stabilization of a Bacillus licheniformis protease, Journal of Molecular Catalysis B, 21: 189-199. Guyonnet, V., Tłuscik, F., Long, P.L., Polanowski, A,, Travis, J., 1999, Purification and partial characterization of the pancreatic proteolytic enzymes trypsin, chymotrypsin, and elastase from the chicken, Journal of Chromatogr A, 852(1):217-25. Hayashi, T., Hyan, S., Cha, W. and Ikada, Y., 1993, Immobilization of thiol proteases onto porous poly(vinyl alcohol) beads, Polymer Journal, 25(5): 489-497. 83 KAYNAKLAR DİZİNİ (Devam) Hoare, D.G., Koshland, D.E.J., 1967, A method for quantitative modification and estimation of carboxylic acid groups in proteins, Journal of Biological Chemistry, 242: 2447-2453. Kan, C., Kang, K., Yeung, A., Liu, D., 2005, The immobilization of trypsin on soap-free P(MMA-EA-AA) latex particle, Materials Science and Engineering, 26: 664-669. Kilinc, A., Onal, S., Telefoncu, A., 2002, Chemical attachment of porcine pancreatic lipase to crosslinked poly(vinyl alcohol) by means of adipoyldichloride, Process Biochemistry, 38: 641-647. Kishimura, H., Hayashi, K., 2002, Isolation and characteristics of trypsin from pyloric ceca of the starfish Asterina pectinifera, Comparative Biochemistry and Physiology, 132: 485-490. Krajevska, B., Leszko, M., Zaborska, W., 1990, Urease immobilized on chitosan membrane: preparation and properties, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 23: 661-667. Kurzer, F., Dauraghi-Zadeh, K., 1967, Advanced in the chemistry of carbodiimides, Chemistry Reviews, 67: 107-152. Malmsten, M., Larsson, A., 2000, Immobilization of trypsin on porous glycidyl methacrylate beads: effects of polymer hydrophilization, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 18: 277-284. 84 KAYNAKLAR DİZİNİ (Devam) Mitsutomi, M and Ohtakara, A., 1998, Immobilization of thermostable α-galactosidase from Pycnoporus cinnabarinus on chitin and some properties of the immobilized enzyme, Journal of Fermantation Technology, 63(4): 325-329. Montero, F.M.F., Silva, G.M.M., Silva, J.B.R., 2007, Immobilization of trypsin on polysaccharide film from Anacardium occidentale L. and its application as cutaneous dressing, Process Biochemistry, 42: 884–888. Ota, S., Miyazaki, S., Matsuoka, H., Morisato, K., Shintani, Y., Nakanishi, K., 2006, High-throughput protein digestion by trypsinimmobilized monolithic silica with pipette-tip formula, Journal of Biochemical and Biophysical Methods,(in press). Önal, S., 2000, Karpuz (Citrullus vulgaris) α-galaktozidazının doğal ve sentetik polimerlerde immobilizasyonu, Doktora Tezi, Ege Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, 190 s Park, S.W., Kim, Y.I., Chung, K.H., Hong, S.I., 2002, Covalent immobilization of GL-7-ACA acylase on silica gel through silanization, Reactive and Functional Polymers, 51:79-92. Pascual, S., Haddleton, D.M., Heywood, D.M., Khoshdel, E., 2003, Investigation of the effect of various Parameters on the synthesis of oligopeptides in aqueous solution, European Polymer Journal, 39(8): 1559-1565. 85 KAYNAKLAR DİZİNİ (Devam) Pritchett, D.W., Young, S.Y., and Geren, C.R., 1981, Proteolytic activity in the digestive fluid in larvae of Trichoplusia ni, Insect Biochemistry, 11: 523-526. Rashid, M.H and Siddiqui, K.S., 1998, Carboxy-group modification: high temparature activation of charge-nuutralized and charge-reversed βglucosidase from Asperligus niger, Biotechnology and Applied Biochemistry, 27: 231-237. Telefoncu, A., 1997, İmmobilize Enzimler, Enzimoloji (Yaz Okulu), Editör: A. Telefoncu, 193 s. Tischer, W., Wedekind, F., 1999, Immobilized Enzymes: Methods and Applications, 200: 96-136 Unen, D.J., Johan, F. J., David N. R., 2001, Sol-Gel immobilization of serine proteases for application in organic solvents, Biotechnology and Bioengineering,75: 154-158. Unger, K.K., 2002, HPLC of Biological Macromolecules (2nd Edition), 15 p. Venkatesh, R., Sundaram, P.V., 1998, Modulation of stability properties of bovine trypsin after in vitro structural changes with a variety of chemical, Protein Engineering, 11: 691-699. Whitford, D., 2005, Protein structure and function, 212 p. 86 KAYNAKLAR DİZİNİ (Devam) Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xuc, Y., Wangc, H., 2004, Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance, Miniaturisation for Chemistry, Biology and Bioengineering, 4: 588 – 597. Wu, J., Xi, F., Jia, Z., Lin, X., 2005, Preparation and characterization of trypsin immobilized on silica gel supported macroporous chitosan bead, Process Biochemistry, 40: 2833-2840. Xi, F., Wu, J., 2004, Macroporous chitosan layer coated on non-porous silica gel as a support for metal chelate affinity chromatographic adsorbent, Journal of Chromatography A,1057: 41-47. Yang, Y.M., Wang, J.W., Tan, R.X., 2004, Immobilization of glucose oxidase on chitosan–SiO2 gel, Enzyme and Microbial Technology, 34:126-131. Zihnioğlu, F., 1992, Isolation, purification and immobilization of UDPglucuronyl transferase, PhD Thesis, Ege Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, 169 s. 87 ÖZGEÇMİŞ Adı, Soyadı : Ömer HABİB Doğum Tarihi : 19/ 06/ 1981 Doğum Yeri : GAZİANTEP Medeni Hali : Bekar Uyruğu : T.C. İş Adresi : Ege Üniversitesi Fen Fakültesi, Biyokimya Bölümü 35100 Bornova/ İZMİR E-mail : [email protected] Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu : Okul Altıparmak İlköğretim Okulu, Bursa A. Vefik Paşa Lisesi, Bursa Fırat Üniversitesi, Elazığ Ege Üniversitesi, İzmir Derece Yıl Diploma 1987-1995 Diploma 1995-1998 B.Sc. (Kimya) 1998-2002 M.Sc. (Biyokimya) 2004- 88 BİLİMSEL TOPLANTILARDA SUNULAN BİLDİRİLERİN LİSTESİ 1. “Proteolitik Aktivite Tayini için Coomassie-violet Boyalı Jelatin Hazırlanması.” Önal, S., Habib, Ö., Zihnioğlu, F., 18. Ulusal Biyokimya Kongresi, 1519 Mayıs 2004, Trabzon 2. “Toplam Protein Konsantrasyonu Tayininde Beş Farklı Metodun Karşılaştırılması.” Okutucu, B., Dinçer, A., Habib, Ö., Zihnioğlu, F., 19.Ulusal Biyokimya Kongresi, 22-25 Nisan 2005, Antalya 3. “Selüloz Asetat-GOD Karakterizasyonu.” Kompozit Membran Hazırlanması ve Habib, Ö., Telefoncu, A., 20. Ulusal Kimya Kongresi, 4-8 Eylül 2006, Kayseri MAKALELER 1. Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, Ö., Zıhnıoglu, F., 2007, Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 70: 709–711 ARAŞTIRMA PROJELERİ “Tripsin İmmobilizasyonu ve Karakterizasyonu” Ömer HABİB, Ege Üniversitesi Araştırma Fonu, (2005 Fen 049) “Plasma Proteome; Determination of Specific Proteins in the Development of Type 2 Diabetes by Two Dimensional Gel Electrophoresis and Structure Analysis.” Figen Zihnioğlu, Seçil Önal, Suna Timur, Ömer Habib, Erdal Duman, TÜBİTAK, 104T410 II III Sayın Ömer HABİB tarafından Yüksek Lisans Tezi olarak sunulan “Tripsin İmmobilizasyonu ve Karakterizasyonu” başlıklı bu çalışma E.Ü. Lisansüstü Eğitim ve Öğretim Yönetmeliği ile E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Eğitim ve Öğretim Yönergesi’nin ilgili hükümleri uyarınca tarafımızdan değerlendirilerek savunmaya değer bulunmuş ve / / tarihinde yapılan tez savunma sınavında aday oybirliği/oyçokluğu ile başarılı bulunmuştur. Jüri Üyeleri: Jüri Başkanı : ........................................... Raportör Üye: ........................................... Üye : ........................................... İmza ................................. ................................. ................................. IV V ÖZET TRİPSİN İMMOBİLİZASYONU VE KARAKTERİZASYONU HABİB, Ömer Yüksek Lisans Tezi, Biyokimya Anabilim Dalı Tez Danışmanı: Prof. Dr. Figen ZİHNİOĞLU Ağustos 2007, 88 sayfa Tripsin (3.4.21.4) peptidlerin lizin ve arginin artıklarının karbonil ucundan hidrolizini katalizleyen, serin proteaz ailesinden bir endopeptidazdır. Tripsin endüstriyel, biyomedikal ve biyoteknolojik araştırmalarda sıklıkla kullanılmaktadır. Doğal enzimlerin kararlılıklarını uzun süre koruyamamaları, operasyon ve depolama koşullarında aktivitelerini çabuk kaybetmeleri, organik çözgende denatüre olmaları nedeniyle kullanımları sınırlıdır. Bunun yanında enzimin tepkime ortamından uzaklaştırılmasının zorluğu bir başka problem olan ürün kirlenmesini de beraberinde getirir. Birçok araştırmacı immobilize enzimlerin doğal enzimlere kıyasla geliştirilmiş kararlılık ve enzimin kolayca uzaklaştırılabilirliği açısından büyük avantajlara sahip olduğunu göstermiştir. İmmobilize tripsin başlıca; peptit sentezi ve özellikle proteom analizlerinin kilit adımı olan peptit haritalamada kullanılır ki bu da hastalık teşhisi, ilaç etkileşimleri için potansiyel hedefin görüntülenmesi, rekombinant DNA teknolojisiyle üretilen proteinlerin kalite kontrolü gibi alanlardaki çalışmalar için en önemli adımlardan birisidir. VI Bu çalışmada silika tabanlı taşıyıcının yüzey kimyası değiştirilerek tripsin immobilizasyonu için uygun şartlar belirlendi. İmmobilize tripsinin optimum sıcaklık ve pH değerleri, termal, depo, operasyonel kararlılıkları, kinetik sabitlerinin belirlenmesiyle karakterizasyonu gerçekleştirildi. Anahtar sözcükler: Tripsin, immobilizasyon, silika VII ABSTRACT TRYPSIN IMMOBILIZATION AND CHARACTERIZATION HABİB, Ömer Master of Science Thesis, Biochemistry Department Supervisor: Prof. Dr. Figen ZİHNİOĞLU September 2007, 88 pages Tyripsin (3.4.21.4) is an endopeptidase from serine protease family which catalysis hydrolysis peptides at the carbonyl group of lysine and arginine residues. Tyripsin is commonly used in industrial, biomedical and biotechnological researches. Due to not being able to keep their stability for a long time, loosing the activity quickly in operation and storage conditions and denaturation in organic solvents, the usage of natural enzymes are limited. Furthermore, adversity of removing the enzyme from medium of reaction causes product pollution. Many researchers find out that immobilised enzymes have got great advantages from the point of improved stability and removability of enzyme easily compared to the natural enzymes. VIII İmmobilised tyripsin is mainly used in peptid synthesis and peptide mapping which is the basic step of proteom analysis that is one of the most important step for diagnostic, determination of the potential target of drug interactions, quality control of the proteins produced by recombinant DNA technology. In this work, the suitable conditions for tyripsin immobilisation were determined by changing the surface chemistry of silica based carrier. İmmobilised tyripsin was characterized by the determination of optimum temperature and pH, thermal, storage, operational stability and kinetic constants. IX Keywords: Trypsin, immobilization, silica. TEŞEKKÜR Yüksek lisans çalışmam boyunca görüş ve deneyimlerinden yararlandığım sayın hocam Prof. Dr. Figen ZİHNİOĞLU’na, beni bu günlere getiren aileme ve tüm desteklerinden dolayı Gizem YILMAZ’a teşekkürü bir borç bilirim. Bu çalışma Ege Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir (2005 FEN 049). X XI XII İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET………………………………………………………………….V ABSTRACT…………………………………………………………VII TEŞEKKÜR………………………………………………………….IX ŞEKİLLER DİZİNİ…………………………………………………XIII ÇİZELGELER DİZİNİ……………………………………………...XVI SİMGELER VE KISALTMALAR…………………………………XVII 1.GİRİŞ…………………………………………………………………..1 1.1 Tripsin……………………………………………………………...1 1.1.1 Substrat spesifikliği…………………………………………..3 1.1.2 Mekanizması………………………………………………....4 1.2 Enzim İmmobilizasyonu……………………………………………9 1.3 Enzim İmmobilizasyon Yöntemleri……………………………….13 1.3.1 Taşıyıcıya bağlama yöntemleri……………………………..14 1.3.2 Çapraz bağlama yöntemleri………………………………...21 1.3.3 Tutuklama yöntemleri………………………………………22 1.3.4 Suda çözünen enzim immobilizasyonu……………………..24 1.4 Enzim immobilizasyon yöntemi ve taşıyıcı seçimi………………..25 1.5 Silika………………………………………………………………26 2. MATERYAL VE METOD…………………………………………..30 2.1 Materyal…………………………………………………………..30 2.2 Tripsin Aktivite Tayini……………………………………………30 2.3 Protein Tayini (Bradford Metodu)………………………………..32 2.4 Tripsin İmmobilizasyonu…………………………………………33 2.4.1 Silikon dioksit (Si) üzerine tripsin immobilizasyonu…..….34 XIII İÇİNDEKİLER (Devam) 2.4.2 3 aminopropil-silika (Si APTES) üzerine tripsin immobilizasyonu………………………………………………....41 2.4.3 2(3,4 epoksisiklohekzil) etil-silika jel (Silika epoksi) üzerine tripsin immobilizasyonu…………………………………………..50 2.5 Silika Üzerine İmmobilize Edilmiş Tripsinin Karakterizasyonu…53 2.5.1 İmmobilizasyon verimine protein miktarının etkisi………..54 2.5.2 Sıcaklık……………………………………………………..54 2.5.3 pH…………………………………………………………..55 2.5.4 Substrat konsantrasyonu…………………………………...55 2.6 Kararlılık Testleri………………………………………………...56 2.6.1 Termal kararlılık…………………………………………..57 2.6.2 pH kararlılığı………………………………………………57 2.6.3 Depo kararlılığı……………………………………………58 2.6.4 Operasyonel kararlılık……………………………………..58 3. SONUÇLAR VE TARTIŞMA………………………………………59 3.1 Tripsinin silika tabanlı taşıyıcılar üzerine kovalent bağlama ile immobilizasyonu……………………………………………………..59 3.1.1 Taşıyıcının aktivasyonuna EDC miktarının etkisi………...61 3.1.2 Tripsin immobilizasyonu için uygun protein miktarının belirlenmesi……………………………………………………..63 3.2 İmmobilize Tripsinin Karakterizasyonu………………………...64 3.2.1 Sıcaklık etkisi……………………………………………...64 3.2.2 pH etkisi…………………………………………………...68 3.2.3 Substrat konsantrasyonun etkisi…………………………...70 XIV İÇİNDEKİLER (Devam) 3.3 Kararlılık Testleri…………………………………………………..73 3.3.1 Termal kararlılık…………………………………………..74 3.3.2 pH kararlılığı……………………………………………75 3.3.3 Depo kararlılığı…………………………………………76 3.3.4 Operasyonel kararlılık…………………………………..78 4. SONUÇ………………………………………………………………80 KAYNAKLAR DİZİNİ………………………………………………...81 ÖZGEÇMİŞ…………………………………………………….………87 XV ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil Sayfa 1.1 Tripsinojen aktivayonu ……………………………………………..2 1.2 Kimoptripsin, tripsin ve elastazın spesifik cepleri………….……….4 1.3 Katalitik üçlü……………………………………………….………..5 1.4 Serin proteazların katalitik mekanizması…………………….……...7 1.5 Oksianyon boşluk …………………………………………….……..8 1.6 Serin proteazlar için ping pong mekanizması………………….……9 1.7 İmmobilize enzimlerin karakteristikleri…………………………….10 1.8 İmmobilize enzimlerin uygulama alanları………………………….10 1.9 İmmobilize enzimin katalitik ve katalitik olmayan fonksiyonları arasındaki ilişki ………………………………………………….……..11 1.10 Enzim immobilizasyon yöntemleri ……….………………………13 1.11 Enzimin taşıyıcıya kovalent bağlanması …….……………………17 1.12 Adsorpsiyon temelli immobilizasyon yöntemleri …….…………..19 1.13 Enzimlerin yüzeye adsorpsiyonu……………………………….…20 1.14 Çapraz bağlama yöntemleri…………………...…………………..22 1.15 Matrikste tutuklama……………………………………...………..23 1.16 Mikrokapsülleme………………………...………………………..24 1.17 Enzim immobilizasyonu için genel prosedür……………………..26 2.1 CDI ile aktiflenmiş silikon dioksitte tripsin immobilizasyonu…….34 2.2 Si-CDI-Kaproikasit-DCC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu………………………………………………………..36 2.3 Si-Süksinik anhidrit-EDC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu………………………………………………………..38 XVI ŞEKİLLER DİZİNİ (Devam) 2.4 Si-Süksinik anhidrit-DCC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu………………………………………………………..40 2.5 Si APTES – Glutaraldehit üzerine tripsinin immobilizasyonu…….42 2.6 Si APTES –Süksinik anhidrit-DCC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu………………………………………………………..44 2.7 Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu…………………………………………………..……46 2.8 Si APTES –Süksinik anhidrit-EDC üzerine tripsinin immobilizasyonu………………………………………………..………47 2.9 Si APTES-PEG-Süksinik anhidrit-DCC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu………………………………………………………..49 2.10 Si epoksi üzerine tripsinin immobilizasyonu………………..…….50 2.11 Si epoksi-Kaproik asit-DCC/NHS üzerine tripsinin immobilizasyonu………………………………………………..………52 3.1 Serbest ve immobilize tripsin aktivitesinin sıcaklığa bağımlı değişimi……………………………………………………...………….65 3.2 İmmobilize (a) ve serbest (b) enzime ait Arrhenius diyagramları…………………………………………………………….67 3.3 İmmobilize (a) ve serbest (b) tripsin aktivitesinin pH’ya bağımlı değişimi………………………………………………………………....69 3.4 Serbest (a) ve immobilize (b) tripsin aktivitelerinin BAPNA konsantrasyonununa bağımlı değişimleri………………….……………71 3.5 Serbest (a) ve immobilize (b) tripsin Lineweaver-Burk diyagramı……………………………………………………………….72 XVII ŞEKİLLER DİZİNİ (Devam) 3.6 Serbest ve immobilize tripsinin termal kararlılığı………………….74 3.7 Serbest ve immobilize tripsinin pH kararlılığı……………………...76 3.8 Serbest ve immobilize tripsinin depo kararlılığı……………………77 3.9 İmmobilize tripsinin operasyonel kararlılığı………………………..79 XVIII ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge Sayfa 1.1 Bazı serin proteazlar ve metabolizmadaki görevleri………………....1 1.2 Bazı serin proteazlarda katalitik üçlünün primer dizideki yerleri……5 1.3 İmmobilize enzimler için kriterler………………………………….12 1.4 Enzim immobilizasyonunda kullanılan taşıyıcılar………………….15 1.5 Kovalent bağlamada hedef amino asitler…………………………...16 1.6 Kovalent bağlama yöntemlerinin yarar ve sakıncaları ……………..18 1.7 İmmobilizasyonda göz önünde bulundurulması gereken kriterler….25 2.1 Protein Tayini (Bradford Metodu)………………………………….33 3.1 Silika tabanlı taşıyıcılara tripsin immobilizasyonu için kullanılan yöntemler…………………………………………………………….…60 3.2 Farklı EDC/g taşıyıcı oranlarında immobilizasyon verimi………....62 3.3 Tripsin immobilizasyonu için uygun protein miktarının belirlenmesi…………………………………………………………63 3.4 Serbest ve immobilize enzimin kinetik sabitleri…………………....73 XIX SİMGELER VE KISALTMALAR Simge Açıklama . t1/2 Yarılanma ömrü Kısaltma Açıklama CDI 1-1’ karbonildiimidazol EDC N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etil . karbodiimid hidroklorür DCC Disiklohekzil karbodiimid NHS N-hidroksisüksinimid BAPNA N-benzoil-L-arginin-p-nitro anilid DMSO Dimetilsülfoksit DMF Dimetil formamid MeIm 1-metil imidazol
