KimyaKongreleri.org

BK
XVIII. Ulusal Kimya Kongresi, Kars, 2004
KALIN BAĞIRSAKTAN SİTOZOLİK KARBONİK ANHİDRAZ ENZİMİNİN
SAFLAŞTIRILMASI VE KARAKTERİZASYONU
1
2
Fatma Coşkun , Yaşar Demir , Nazan Demir
1
1
Atatürk Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Bölümü, Erzurum
2
Atatürk Üniversitesi, Eğitim Fakültesi, Kimya Bölümü, Erzurum
+2
Karbonik anhidraz (CA), (E.C:4.2.1.1. karbonat hidroliyaz) Zn iyonu ihtiva eden
metalo enzimlerden ilk bulunanı olup, hücrelerde CO2 hidrasyonu veya HCO3 ’ın
dehidrasyonu reaksiyonunu katalizlemektedir. Sindirim sisteminde görev alan mide, ince
bağırsak ve kalın bağırsakta CA’nın varlığı ve dağılımı Hansson’un histokimyasal metodu ile
belirlenmiştir1. İmmunohistokimyasal yöntemlerle karbonik anhidrazın distal ince ve kalın
bağırsağın epitel plazma membranlarının apikal yüzeylerde yerleştiği bulunmuştur. Bağırsak
epitelinde CA-IV’ün bölgesel ve hücresel yerleşimi, sindirim sistemi CA’sı için önerilen
fizyolojik roller ile uyum göstermektedir. Aktif CA, kalın bağırsak ve ileum’da su ve iyon
transferine katılmaktadır. İnce bağırsağın duodenum ve jejunum mukozası daha az yoğunlukta
CA içeriyorken, ince bağırsağın cecum ve kalın bağırsağın kolon’undaki bezlerin üst
kısımlarında ve epitel hücre yüzeylerinde çok miktarda sitoplazmik karbonik anhidraz
bulunmuştur1,2.
Bu çalışmada sığır kalın bağırsağından sitozolik CA enziminin saflaştırılması ve
karakterizasyonu amaçlanmıştır. Bu amaçla fizyolojik serum içerisine alınmış olan kalın
bağırsaklar izotonik çözelti ile iyice yıkandı. Yıkanmış ve eritrositlerden tamamen
arındırılmış olan kalın bağırsak dokusu bıçakla küçük parçalara ayrıldıktan sonra, 1 M KCl
çözeltisi içerisine alınıp, vortex’te karıştırıldı. Ardından soğutmalı santrifüjde santrifüj edildi.
Süzgeç kağıdından süzülerek süpernatant ile çökelek ayrıldı. Buradan elde edilen çökelek
0.05 M Tris-SO4 (pH:7.4) tamponu içerisine alındı ve ultrasonik dismembratörde ultrasonik
ses dalgalarına maruz bırakıldı. Santrifüj edildikten sonra süzülerek süpernatant ve çökelek
ayrıldı. Sitozolik karbonik anhidraz eldesi için hazırlanan homojenat afinite kolonuna tatbik
edilerek enzim saflaştırıldı. Kalın bağırsağın doğal ortamında mevcut yağlar kromatoğrafi
öncesi CCl4 ile ekstrakte edildi. Enzimin saflığının kontrolü %3-10 SDS-PAGE ile yapıldı.
Enzimin aktif olduğu pH aralığı ve optimum pH’sı belirlendi. Ayrıca enzimin aktivite
o
gösterdiği sıcaklık aralığı 5-65 C olarak ölçüldü ve maksimum aktivite gösterdiği sıcaklıkta
belirlendi. Enzimin Vmax ve KM değerleri, molekül ağırlığı belirlendi ve karbonik anhidrazın
bilinen inhibitörlerine karşı davranışları araştırıldı.
Sonuç olarak sığır kalın bağırsağından sitozolik karbonik anhidraz enzimi saflaştırılıp
karakterize edildi. Elde edilen sonuçlar diğer CA izoenzimleriyle karşılaştırılarak tartışıldı.
Kaynaklar
1. Hansson, H.P.J. (1967), Histochemie. 11, 112-128.
2. Sugai, N., Ito, S. (1980), J. Histochem. Cytochem. 28:511-525.
458
KimyaKongreleri.org