2.6.1.1. Primer hücre kültürü - Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesi
advertisement
1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ HÜCRE KÜLTÜRÜ UYGULAMALARINDA TEMEL PRENSİPLER Hazırlayan Mehmet Kaan TİRYAKİ Danışman Yrd. Doç. Dr. Esma KAYA Eczacılık Fakültesi Bitirme Ödevi Haziran 2010 KAYSERİ 2 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ HÜCRE KÜLTÜRÜ UYGULAMALARINDA TEMEL PRENSİPLER Hazırlayan Mehmet Kaan TİRYAKİ Danışman Yrd. Doç. Dr. Esma KAYA Eczacılık Fakültesi Bitirme Ödevi Haziran 2010 KAYSERİ I Yrd. Doç. Dr. Esma Kaya danışmanlığında Mehmet Kaan Tiryaki tarafından hazırlanan “Hücre kültürü uygulamalarında temel prensipler” konulu bu çalışma, jürimiz tarafından Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesinde Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir. …./…./2010 JÜRİ İMZA Üye: Yrd. Doç. Dr. Esma Kaya (Danışman) Üye: Doç. Dr. Hatice Özbilge Üye: Yrd. Doç. Dr. Nalan İmamoğlu ONAY: Bu bitirme ödevinin kabulu Fakülte Yönetim Kurulunun ….…………… tarih ve ..……………….. sayılı kararı ile onaylanmıştır. …./…./……. Fakülte Dekanı Prof. Dr. Müberra Koşar II TEŞEKKÜR Bu tezin hazırlanmasında bana destek olan ve hiçbir zaman yardımlarını esirgemeyen danışmanım Yrd. Doç. Dr. Esma Kaya’ya ve saygıdeğer hocalarım Doç. Dr. Hatice Özbilge ve Yrd. Doç. Dr. Nalan İmamoğlu’ na teşekkür ederim. Katkı ve desteğinden dolayı Araş. Gör. Çiğdem Yücel’ e teşekkür ederim. Tezi yazmam sırasında bana yardımcı olan arkadaşlarım Fatih Uluşen’e, Mehmet Türkmen’e, Gülşah Danğır’ a ve Gökçe Melis Dayıoğlu’na teşekkür ederim. Ayrıca her zaman yanımda olan, maddi ve manevi katkılarını hiç bir zaman esirgemeyen, beni anlayışla karşılayan aileme teşekkürü bir borç bilirim. III HÜCRE KÜLTÜRÜ UYGULAMALARINDA TEMEL PRENSİPLER ÖZET Hücre kültürü, hücrelerin belirli bir besi ortamında çoğaltılmasıdır. Hücre kültürü bugün birçok alanda uygulanabilirliğinden ve deney hayvanı kullanımını azaltması açısından büyük öneme sahiptir. Hücre ve doku kültürü çalışmaları günümüzde, aşı, monoklonal antikor, çeşitli enzimler ve hormonların üretimi, hücre içi aktivite ölçümü, DNA ve RNA replikasyonunun araştırılması, protein sentezi, enerji metabolizmasının araştırılması, çeşitli ilaçların hücre siklusuna etkisi, hormonal reseptör komplekslerinin davranışları, sinyal iletim mekanizması ve hücre haberleşmesi, hücrenin beslenme özellikleri, enfeksiyon ve kanser araştırmaları, viral transformasyon, kimyasal transformasyon, özel ürünlerin sentezlenip salgılatılması, embriyonik araştırmalar, hücre popülasyon kinetiği, adezyon, sitogenetik analiz, sitotoksisite çalışmaları, genetik manipülasyon ve immortalizasyon gibi çeşitli amaçlarla yapılmaktadır. Ayrıca somatik gen tedavisi, tümör aşıları, canlı aşıların greft amaçlı kullanılması, üç boyutlu dokuların oluşturulması konularında da gelecek vadetmektedir. Bu çalışma ile insan makrofaj hücreleri kullanılarak hücrelerin çoğaltılması, pasajlanması, dondurularak saklanması, canlılık kontrolü gibi hücre kültürünün temel aşamaları ile hücre kültür laboratuarının genel kuralları öğrenilmiştir. Anahtar Kelimeler: Hücre kültürü, makrofaj, hemositometre, trypan blue IV BASIC PRINCIPALS IN CELL CULTURE APPLICATIONS ABSTRACT Cell culture is the proliferation of cells in a certain nutritient middle. Cell culture is highly fundamental because it can be used in many fields and it helps reduce the usage of test animals. Cell culture is now used for: production of vaccines, monoclonal antibodies, different enzymes and hormones, measurement of intracellular activity, DNA and RNA replication, protein synthesis and energy metabolism researches, drug effects on cell cycle, acts of hormone receptor complexes, signal transmission mechanism and communication between cells, cell nutrition features, infection and cancer researches, virus transformation, chemical transformation, synthesis and secretion of special products, embryonic researches, cell population kinetic, adhesion, cytogenetic analysis, cytotoxicity studies, genetic manipulation and immortalization. Moreover it promises future in somatic gene therapies, tumor vaccines, usage of live vaccines as tissue grafts and development of 3D tissues. With this study the basic steps of cell culture and general convention of cell culture laboratories such as proliferation of cells using human macrophages, passaging and vitality control of the cells and preserving the cells by freezing Key words: Cell culture, macrofage, hemocytometer, trypan blue. V İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR ................................................................................................................... II ÖZET............................................................................................................................. III ABSTRACT .................................................................................................................. IV İÇİNDEKİLER .............................................................................................................. V KISALTMALAR ........................................................................................................ VII TABLO VE ŞEKİL LİSTESİ ..................................................................................... IX 1. GİRİŞ VE AMAÇ ....................................................................................................... 1 2. GENEL BİLGİLER .................................................................................................... 3 2.1. HÜCRE KÜLTÜRÜNÜN TANIMI VE GENEL BİLGİLER ............................... 3 2.2. HÜCRE KÜLTÜRÜNÜN TARİHÇESİ ................................................................ 4 2.3. HÜCRE KÜLTÜRÜNÜN AMAÇLARI ............................................................... 5 2.4. HÜCRE KÜLTÜRÜNÜN AVANTAJLARI ......................................................... 7 2.5. HÜCRE KÜLTÜRÜNÜN DEZAVANTAJLARI ................................................. 8 2.6. HÜCRE KÜLTÜRÜNÜN SINIFLANDIRILMASI ............................................ 10 2.6.1. Kaynaklarına Göre Kültürler ......................................................................... 10 2.6.1.1. Primer hücre kültürü ............................................................................... 10 2.6.1.2. Sekonder hücre kültürü ........................................................................... 12 2.6.1.3. Sürekli hücre kültürü ............................................................................... 12 2.6.2. Büyüme Biçimlerine Göre Kültürler ............................................................. 15 2.6.2.1. Süspansiyon kültürler .............................................................................. 15 2.6.2.2. Tutunarak büyüyen (monolayer) hücreler ............................................... 15 2.7. HÜCRE KÜLTÜR YÖNTEMLERİ .................................................................... 16 2.7.1. Standart Tüp Kültürü ..................................................................................... 16 2.7.2. “Shell Vial” Hücre Kültürü Yöntemi............................................................. 16 2.7.3. Kokültivasyon Yöntemi ................................................................................. 17 2.8. HÜCRE KÜLTÜRÜ LABORATUARLARI VE TEMEL CİHAZLARI ........... 17 2.9. HÜCRE KÜLTÜRÜNDE KULLANILAN TEMEL BESİYERİ VE SOLÜSYONLAR ........................................................................................................ 21 2.10. HÜCRE KÜLTÜRÜ ÇALIŞMALARINDA YAPILAN İŞLEMLER .............. 24 2.10.1. Hücrelerin Beslenmesi ................................................................................. 24 2.10.2. Hücrelerin Pasajlanması .............................................................................. 26 2.10.3. Hücrelerin Dondurularak Saklanması .......................................................... 26 VI 2.10.4. Hücreleri Çözme ..................................................................................... 27 2.10.5. Hücre Canlılığı ve Sitotoksite ................................................................. 27 2.10.5.1. Hemositometre ile hücre sayımı ..................................................... 28 2.10.5.2. Trypan blue canlılık testi................................................................. 28 2.10.5.3. Neutral red boyası ile canlılık testi.................................................. 28 2.10.5.4. Floresan boya tutucularla canlılık sayımı ....................................... 29 2.10.5.5. MTT testi......................................................................................... 29 2.10.6. Hücre Kültüründe Kontaminasyon ......................................................... 30 3. ECZACILIK FAKÜLTESİ ARAŞTIRMA LABORATUARINDA U937 MAKROFAJ HÜCRELERİNİN KÜLTÜRÜ ............................................................ 32 3.1. ÇALIŞMADA KULLANILAN TAMPON, SOLÜSYON VE BESİYERLERİ . 32 3.2. U-937 HÜCRESİNİN TEMİN EDİLMESİ VE ÜRETİLMESİ .......................... 34 3.2.1. Hücrelerin Çözdürülmesi ............................................................................... 34 3.2.2. Hücrelerin Pasajlanması ................................................................................ 34 3.2.3. Hücrelerin Canlılık Kontrolü ......................................................................... 35 3.2.4. Hücrelerin Dondurulması .............................................................................. 35 3.2.5. Hücrelerin Sayımı .......................................................................................... 36 4. HÜCRE KÜLTÜRÜ ÇALIŞMALARINA ÖRNEKLER ..................................... 39 5. SONUÇ ....................................................................................................................... 42 KAYNAKLAR .............................................................................................................. 43 ÖZGEÇMİŞ ................................................................................................................... 46 VII KISALTMALAR Kısaltmalar Açıklama Ca+2 : Kalsiyum CO2 : Karbondioksit DMEM : EMEM’e Dulbecco modifikasyonu DMEM/ F12 : Ham’s F12, DMEM ve F12 nin 1:1 karışımı DMSO : Dimetilsülfoksit DNA : Deoksiribonükleikasit Dulbecco’s PBS : Dulbecco’s Balanced Salt Solution Earle’s BSS : Earle’s Balanced Salt Solution EBSS : Earle’s Balanced Salt Solution ECV 304 : Transforme endotel hücre soyu EDTA : Etilendaimintetraasetik asit EM : Ekstasellüler matriks EMEM : Eagle’s Minimum Essential Medium FBS : Fetal bovine serum FCS : Fetal calf serum FITC : Fluorescein isothiocyanate GMK : Yeşil maymun böbreği Hank’s BSS : Hank’s Balanced Salt Solution HAM : İnsan amniyonu HBSS : Hank’s Balanced Salt Solution HCO3 : Bikarbonat HEK : İnsan embriyonu böbreği HeLa : İnsan serviks karsinomu HIV : Human Immunodeficiency Virus VIII HUVEC : Human Umbilical Vein Endothelial Cells LETS : Large, external, transformation sensitive MRC- 5 : İnsan embriyonik akciğer fibroblastı MTT : 3-[4,5-Dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue NaHCO3 : Sodyum bikarbonat PBS : Phosphate Buffered Saline RhMK : Rezüs maymun böbreği RK : Tavşan böbreği PMH : Periferik mononükleer hücreler RNA : Reoksiribonükleikasit UV : Ultra violet WI- 38 : İnsan diploit fibroblastları WST- 1 : 2-[4-iodophenyl]-3-[4-nitrophenyl]-5-[2,4-disulfophenyl]-2H tetrazolium monosodium salt XTT : 2,3-bis[2-Methoxy-4-nitro-5-sülfophenyl]-2H-tetrazolium -5carboxanilide iner salt mL : Mililitre mm : Milimetre μg : Mikrogram μL : Mikrolitre IX TABLO VE ŞEKİL LİSTESİ Tablo 2.1. Hücre ve doku kültürünün gelişimine katkı sağlayan önemli olaylar ............. 5 Tablo 2.2. Hücre kültürünün avantajları........................................................................... 8 Tablo 2.3. Hücre kültürünün dezavantajları .................................................................... 9 Tablo 2.4. Yaygın olarak kullanılan hücre serileri ......................................................... 14 Şekil 2.1.a. Laminar akım kabini .................................................................................... 19 Şekil 2.1.b. CO2 inkübatörü ............................................................................................ 19 Şekil 2.2.a. İnvert mikroskop.......................................................................................... 20 Şekil 2.2.b. Su banyosu .................................................................................................. 20 Şekil 2.3.a. Santrifüj cihazı ............................................................................................. 21 Şekil 2.3.b. Buzdolabı..................................................................................................... 21 Şekil 2.3.c. Sıvı azot tankı .............................................................................................. 21 Şekil 3.1. Thoma lamı yandan görünüş .......................................................................... 36 Şekil 3.2. Thoma lamı üstten görünüş ............................................................................ 37 Şekil 3.3. U937 hücrelerinin ışık mikroskobunda görüntüsü ......................................... 37 Şekil 4.2. Trypan blue canlılık testi ................................................................................ 37 Şekil 4.3. Thoma lamı ile hücrelerin sayımı .................................................................. 38 1 1. GİRİŞ VE AMAÇ Hücre kültürü, hücrelerin belirli bir besi ortamında çoğaltılmasıdır. Hücre kültürü çalışmalarının günümüzde önemli bir yeri vardır. Çeşitli patolojik durumlarda bir maddenin etkilerini, bir hücre ya da dokuda üretilen bir maddenin işlevlerini belirlemek amacıyla, belirli bir hücre serisinden çoğaltılan hücrelerde çalışmalar yapılarak in vitro sonuçlar elde edilebilmektedir. Hücre ve doku kültürü çalışmaları; aşı, monoklonal antikor, çeşitli enzimler ve hormonların üretimi, hücre içi aktivite ölçümü, DNA ve RNA replikasyonunun araştırılması, protein sentezi, enerji metabolizmasının araştırılması, çeşitli ilaçların hücre siklusuna etkisi, hormonal reseptör komplekslerinin davranışları, sinyal iletim mekanizması ve hücre haberleşmesi, hücrenin beslenme özellikleri, enfeksiyon araştırmaları, viral transformasyon, kimyasal transformasyon, özel ürünlerin sentezlenip salgılatılması, embriyonik araştırmalar, hücre popülasyon kinetiği, adezyon, sitogenetik analiz, genetik manipülasyon ve immortalizasyon gibi çeşitli amaçlarla yapılmaktadır. Kültürdeki hücreler kullanılarak uygun şekilde düzenlenmiş deneylerle, rekombinant ve mutantları belirleyerek genetik analiz yapılmaktadır. Hücre kültürünün kullanılması, gen haritalamasındaki gelişmelere de büyük ölçüde destek sağlamaktadır. Hücre kültürü için çeşitli doku kaynakları kullanılır. Doğum öncesi tanı için amniyotik hücreler, çeşitli araştırmalar için epitel ve fibroblast hücreleri, noninvaziv ve çoğalma kabiliyetlerinden dolayı kemik iliği, periferal kan, ayrıca tüm doku hücrelerinin yanı sıra hücre serileri oluşturmada kullanılan çeşitli tümör hücreleri günümüzde kullanılmaktadır. 2 Hazırlanması zor, son derece titizlik gerektiren ve hassas çalışmalar içeren hücre kültür teknolojisi, bugün birçok alanda uygulanabilirliğinden dolayı büyük öneme sahiptir. Bu çalışmada U937 makrofaj hücrelerinin çoğaltılması, pasajlanması, dondurularak saklanması, hücre sayımı, canlılık testi gibi işlemler gerçekleştirilerek hücre kültür çalışmalarının temel aşamalarının öğrenilmesi amaçlanmıştır. 3 2. GENEL BİLGİLER 2.1. HÜCRE KÜLTÜRÜNÜN TANIMI VE GENEL BİLGİLER Hücre kültürü; canlı bir doku veya organdan alınan küçük bir parçanın in vitro ortamda büyütülmesi ve çoğaltılması işlemine verilen isimdir. Hücre kültürü, deney hayvanı kullanımının azaltılması için tercih edilebilecek önemli bir yöntemdir. Deney hayvanlarıyla yapılan birçok çalışmadan çok daha kolaylıkla yapılabilir. Dikkat edilmesi gereken en önemli konu titizlik ve sterilizasyon koşullarına uyumdur (1). Hücre kültürleri primer doku eksplantları veya hücre süspansiyonlarından meydana gelir. Hücre kültürleri genel olarak süspansiyon kültür ve monolayer kültür olmak üzere ikiye ayrılır. Süspansiyon kültürler; genellikle kan, kemik iliği ve bazı tümör hücrelerinden yapılan, kültür kabına yapışmayan kültürlerdir. Monolayer kültürler ise amniyon hücreleri ve fibroblast hücreleri gibi yapışma ihtiyacı hisseden hücre kültürleridir (2). Teorik olarak çekirdeği olan her hücre çoğalma kabiliyetinde ise de vücudumuzdaki hücreler çoğalma özelliklerinden dolayı üç ana gruba ayrılırlar. Birincisi kök hücreler, kemik iliği ve gastrointestinal sistemin epitel hücreleri gibi daima çoğalan hücreler, ikincisi karaciğer, periferal lenfosit ve makrofajlar gibi uyarıldığı zaman çoğalan hücreler, son grup ise sinir sistemi ve gözün bazı hücreleri gibi yaşam boyu bir kez çoğalan hücrelerdir. Bunlar haricinde normal olmayan bir grup daha vardır ki bu hücreler, doğal olarak apoptozise uğramayan, ölümsüz olduğu kabul edilen ve sürekli çoğalan tümör hücreleridir (3). Tek bir hücre tipi hakkında en iyi bilgiyi elde edebilmek için hücrenin bulunduğu dokudan ve diğer hücre tiplerinden ayrılarak izole edilmesi gerekir. Bu izolasyon 4 sonucunda oluşan homojen hücre popülasyonu doğrudan ya da kültür ortamında çoğaltıldıktan sonra analiz edilebilir. Farklı hücre türleri doku süspansiyonundan değişik yöntemlerle izole edilerek tipleri belirlenebilir. Değişik hücre türlerinden oluşan bir dokudan tek tip hücre elde edebilmek için yapılması gereken ilk işlem, hücreleri bir arada tutan ekstrasellüler matriksi ayırmaktır. Bunun için doku örneği, proteinleri parçalayan tripsin ve kollajenaz gibi proteolitik enzimler ve hücre adezyonunda rol oynayan Ca+2 bağlayan EDTA gibi ajanlarla muamele edilmelidir (4). Hücre süspansiyonundan farklı hücre türlerini ayırmak için değişik yöntemler uygulanabilir. Öncelikle hücreler fiziksel özelliklerine göre ayrılabilir. Örneğin büyük olanlar küçük olanlardan, ağır olanlar hafif olanlardan santrifüj edilerek ayrılabilir. Bir başka yöntem ise, bazı hücre türlerinin cam ya da plastikten yapılmış yüzeye daha sıkı yapışması prensibine dayanır. Bu yöntemde antikorlar kullanılarak istenen hücre türünün yüzeye yapışması sağlanır, daha sonra da uygun işlemlerle o hücrelerin elde edilmesi sağlanabilir (4). 2.2. HÜCRE KÜLTÜRÜNÜN TARİHÇESİ Doku kültürü, ilk kez yirminci yüzyılın başında, hayvan hücrelerinin özelliklerinin sistemik değişikliklerden etkilenmeksizin çalışılmasında kullanılabilecek bir yöntem olarak düşünülmüştür (5). 1950’lerde ilk hücre dizisi ‘HeLa’, insan servikal kanserinden başarıyla kültüre edildiği zaman memeli hücre kültürü değerli bir araştırma aracı olarak ortaya çıkmıştır (6). 1950’lerde önemli gelişmeler olmasına rağmen ancak 1980’lerde tekrarlanabilir ve geniş ölçekli memeli hücre kültürleri gerçekleştirilebilmiştir (6). 20. yüzyılın ikinci yarısında hücre kültürü çalışmaları oldukça yaygın olmasına rağmen, 50 yıldan daha fazla doku eksplantları kullanıldığından doku kültürü ismi halen hücre kültürü için de kullanılmaktadır. Böylece doku kültürü terimi hem organ kültürünü (ayrıştırılmamış dokuların 3 boyutlu kültürü) hem de hücre kültürünü (primer veya hücre dizilerinden elde edilmiş hücrelerin kültürü) kapsar (6). Hücre ve doku kültürünün gelişimine katkı sağlayan önemli olaylar Tablo 2.1. de özetlenmiştir (6). 5 Tablo 2.1. Hücre ve doku kültürünün gelişimine katkı sağlayan önemli olaylar TARİH OLAY REFERANS 1907 İn vitro kurbağa embriyonu sinir lifi üretimi Harrison, 1907 1912 Tavuk bağ dokusunun explantları Carrel, 1912 1920/30 Fibroblastik hücre soylarının subkültürü Carrel & Ebeling, 1923 1940 Doku kültüründe antibiyotik kullanımı Keilova, 1948 1943 İlk devamlı hücre soyları Earle ve ark.,1943 1949 Hücre kültüründe virüsün üretilmesi Enders ve ark., 1949 1952 Subkültürde tripsin kullanımı Dulbecco, 1952 1952- 1955 Servikal karsinomadan ilk insan hücre soyu, HeLa Gey ve ark., 1952 1955 HeLa’ nın klonlanması Puck & Marcus, 1955 Medyanın geliştirilmesi Eagle, 1955, 1959 1965 Çin hamster hücrelerinin serumsuz klonlanması Ham, 1965 1970 Laminer akım kabinlerinin geliştirilmesi Kruse ve ark., 1991 1980- 1987 Özel hücre soylarının geliştirilmesi Peehl & Ham, 1980 1991 Yetişkin insan mezenkimal kök hücresinin kültürü Caplan, 1991 1998 İnsan embriyonik kök hücre kültürü Thomson ve ark., 1998 2000 + İnsan genom projesi: genomiks, proteomiks Dennis ve ark., 2001 2.3. HÜCRE KÜLTÜRÜNÜN AMAÇLARI Hücre ve doku kültürü; aşı, monoklonal antikor, çeşitli enzimler ve hormonların üretimi, hücre içi aktivite ölçümü, DNA ve RNA replikasyonu araştırması, protein sentezi, enerji metabolizmasının araştırılması, çeşitli ilaçların hücre siklusuna etkisi, hormonal reseptör komplekslerinin davranışları, sinyal iletim mekanizması ve hücre haberleşmesi, hücrenin beslenme özellikleri, enfeksiyon araştırmaları, viral transformasyon, kimyasal transformasyon, özel ürünlerin sentezlenip salgılatılması, embriyonik araştırmalar, hücre popülasyon kinetiği, adezyon, sitogenetik analiz, genetik manipülasyon ve immortalizasyon gibi çeşitli amaçlarla yapılmaktadır (2). 6 Hücre kültürünün amacı, bir grup hücreyi yaşatmak, ileri çalışmalar için çoğaltmak, gerektiğinde kullanmak için dondurarak saklamaktır. Hücrelerin çoğaltılması, yapılabilecek deneylerin sayısını arttırmayı; deney yapılan pasajdaki hücrelerin dondurulması ise ileride deneyin aynı pasajdaki hücrelerle tekrarlanabilmesini sağlar. Her aşamada üzerinde dikkatle durulan, hücrelerin canlılığıdır. Hücre kültüründe başarı, steril çalışma koşullarının sağlanabilmesine bağlıdır (1). Hücre kültürlerinin çok yaygın kullanım alanları vardır. Hemen her alanda bu tür çalışmalara rastlamak mümkündür. Bunlar şu şekilde özetlenebilir; Viral aşılar ve viral tanı Monoklonal antikorlar ile antikor üretimi İnterferon üretimi Enzim üretimi İnsektisit ve insekt aşı üretimi İnterlökin gibi immünoregülatörlerin üretimi Hormon üretimi Büyüme faktörlerinin üretimi Hücre kültürlerinin son yıllardaki gelecek vadeden kullanım alanları ise şöyledir: Somatik gen tedavisi Tümör aşıları Canlı hücrelerin greft amaçlı olarak çeşitli şekillerde kullanılması - Eritrositlerin organizma dışında transfüzyon amacıyla kullanılması - Kanser tedavisinde kemik iliğinin kullanılması - Parkinson hastalığının tedavisinde beyin hücrelerinin kullanılması - Organizma dışında hücre modifikasyonu Kompleks üç boyutlu dokuların oluşturulması - Yapay deri - Yapay kıkırdak - Yapay karaciğer - Yapay pankreas (7). 7 2.4. HÜCRE KÜLTÜRÜNÜN AVANTAJLARI Çevrenin kontrolü: Hücre kültürünün temel avantajı fizyolojik ve kimyasal çevrenin kontrol edilebilmesidir. Hücre kültürü ortamında fizikokimyasal çevre ve buna bağlı olarak fizyolojik koşullar daha iyi kontrol edilebilir. Sıcaklık, pH, ozmotik basınç, O2 ve CO2 kısmi basınçları gibi fizikokimyasal koşullar hücre kültüründe daha kolay sağlanırken, canlı vücudunda sabit bir çevreyi oluşturarak bir takım testleri yapmak daha zordur (5). Örneğin homojenitesi ve karakterizasyonu: Doku örnekleri çoğunlukla heterojendir. Ancak, bir iki pasaj sonra kültüre edilmiş hücreler, homojen hale gelirler. Dolayısıyla, her subkültürde yenilenmiş örnekler diğerine benzerdir ve hücre dizisinin karakteristiği devam eden jenerasyonlarda korunabilir. Hatta hücre dizisi sıvı nitrojende depolandıysa sonsuz bile olabilir (5). Hücrelerin homojenitesi, elde edilen ürünlerin homojenitesi açısından son derece önemlidir. Bunun sağlanmasının bir diğer yolu da, kuşkusuz çalışan kişilerin homojenitesi ve çalışmaların aynı koşullarda yapılmasıdır (7). Ekonomi: Hücre kültürleri ekonomiktir. İn vivo sistemlerde test için organizmaya verilen maddenin bir kısmı çeşitli yollarla dışarıya atılmakta, bir kısmı da organizmanın bağışıklık sistemi tarafından ortadan kaldırılmaktadır. Bu koşullarda canlı bir organizmada, verilen maddenin ancak % 10’una bir cevap alınabilirken, hücre kültürlerinde bu oran % 90’lara kadar çıkabilmektedir (5). İn vivo durumların in vitro modellenmesi: Hücre kültürlerinin bir diğer avantajı da ürün eldesinde endüstriyel amaçlı olarak kullanılabilmesidir. Son yıllarda geliştirilen teknikler (histotipik ve organotipik modellerdeki gelişme) ile bu, çok daha kolay başarılabilmektedir (5). Hücre kültürünün temel avantajları Tablo 2.2. de gösterilmiştir (5). 8 Tablo 2.2. Hücre kültürünün avantajları KATEGORİ AVANTAJLAR Fizyo-kimyasal çevre pH, ısı, osmolalite ve çözünmemiş gazların kontrolü Fizyolojik şartlar Hormonlar ve solüsyonların kontrolü Mikroçevre Matriksin düzenlenmesi, hücre- hücre etkileşimi ve gazların difüzyonu Koruma Sıvı nitrojen içerisinde depolanabilir Validasyon Doğruluğu kanıtlanır ve kaydedilir Kopyalanma ve Niceliksel, kolaydır değişkenlik C ×T nin kontrolü Dozu belirleme yeteneği (Konsantrasyon-Zaman) Hayvan kullanımının Sitotoksik farmasötiklerin hayvanlar üzerinde azaltılması denenmemesi 2.5. HÜCRE KÜLTÜRÜNÜN DEZAVANTAJLARI Uzmanlık: Kültür çalışmaları aseptik koşullarda yapılmalıdır çünkü hayvan hücreleri bakteri, maya veya küf gibi bir organizma ile kontamine olursa çok yavaş gelişir ve bu durum deney sonuçlarını olumsuz etkiler. Ayrıca multisellüler hayvanların hücreleri genelde izole olarak bulunmazlar. Bu yüzden bu hücreler; kan plazması veya interstisiyel sıvının benzeri bir kompleks çevre sağlanmadan bağımsız bir şekilde yaşamlarını sürdüremezler. Bu şartlar, hücre kültürünün yapılması ve kültürün oluşması sırasında meydana gelebilecek bir hatanın çözülebilmesi için bir uzmana ihtiyaç duyulduğu anlamına gelir (5, 7). Miktar: Küçük laboratuarlarda hücrelerin 1- 10 gramı ile çalışılabilir, geniş laboratuarlarda ise 10- 100 gram hücre ile çalışmak mümkündür. 100 gramın üstü hücre ile çalışılacaksa endüstriyel ortam gereklidir (5). 9 Farklılaşma ve seleksiyon: 1950’ lerde ilk hücre soyu çoğaltıldığında, izole edilen hücrelerin karakteristik özelliklerinin kaybolduğu gözlemlenmiştir. Bu olay farklılaşma olarak adlandırılmış fakat daha sonra bunun sebebinin aynı veya farklı soyun hücrelerinin aşırı büyümesinden kaynaklandığı anlaşılmıştır. Hücrelerin farklılaşması nedeniyle besiyerleri yeniden düzenlenmiştir. Bu tarihsel gelişimden de anlaşıldığı gibi primer kültürün birbirini izleyen pasajlarında hücreler farklılaşır ve bir miktarı ölür. Yani her zaman istenilen saflıkta ve miktarda hücre elde edilemeyebilir (5, 7). Anstabil anöploid kromozomal bileşimden kaynaklanan stabilite sorunu sürekli hücre soylarının esas problemlerinden biridir. Hücreler farklı oranlarda büyüdüğü ve geliştiği için heterojenite problemi ortaya çıkar. Popülasyondaki bu farklılıktan dolayı bir pasajdan diğer pasaja çeşitlilikler oluşur (5). Hücre kültürünün dezavantajları Tablo 2.3. te gösterilmiştir. Tablo 2.3. Hücre kültürünün dezavantajları (5). KATEGORİ ÖRNEK Uzman gerekliliği Kimyasal kontaminasyon Mikrobiyal kontaminasyon Çapraz kontaminasyon Çevresel kontrol Çalışma alanı Biyolojik açıdan tehlikeli maddeler Miktar ve masraf Çalışılan malzemeler çok pahalı Medyum ve serum pahalı Kullanılıp atılan plastik malzemeler Genetik instabilite Heterojenite, çeşitlilik Fenotipik instabilite Hücrelerin farklı adaptasyonları Selektif fazla büyüme Hücre tiplerinin teşhisi İşaretleyiciler daima göstermez Geometri ve sitolojisi değişik 10 2.6. HÜCRE KÜLTÜRÜNÜN SINIFLANDIRILMASI Hücre kültürü hazırlamak için alınan küçük doku veya organ parçasına eksplant denir. Çalışmalarda daha çok diploid hücreler kullanılır. Eksplantın doku veya organdan alınıp ilk ekiminin yapıldığı kültüre primer kültür, burada oluşan yeni hücrelerin bir başka besiyerine ekimiyle oluşan kültüre ise pasaj veya subkültür denir. Primer hücre kültürlerinin kültürde belirli süre ömürleri vardır. Sürekli hücre kültürleri; anormal, transforme olmuş ve ölümsüz hücrelerdir (8). Kültür ortamında yetiştirilen hücrelerin belli zaman aralıklarında çoğalarak hücre sayılarının iki katına çıkma zamanına da katlanma zamanı denir. Hücre kültürü için çeşitli doku kaynakları kullanılır. Doğum öncesi tanı için amniyotik hücreler, çeşitli araştırmalar için epitel ve fibroblast hücreleri, noninvaziv ve çoğalma kabiliyetlerinden dolayı kemik iliği, periferal kan ve çeşitli tümör hücreleri günümüzde kullanılmaktadır (2). Hücre kültürleri kaynaklarına ve büyüme biçimlerine göre sınıflandırılabilir. 2.6.1. Kaynaklarına Göre Kültürler Çok çeşitli kaynaklardan ve dokulardan elde edilen hücre kültürleri üç bölümde incelenir. 1) Primer (birincil) hücre kültürleri 2) Sekonder veya diploid hücre kültürleri 3) Sürekli hücre kültürleri veya hücre soyları (cell line) 2.6.1.1. Primer hücre kültürü Dokulardan tripsin ile ayrıştırılarak elde edilen hücrelerin in vitro üretilmeleri ile elde edilen kültürlere denir. İn vitro koşullarda pasajları kısıtlı olup, bir kaç pasajdan sonra üreyebilme yeteneklerini kaybederler. Primer hücrelerin en önemli avantajları, kültür edildikleri ortamlarda in vivo genotipik ve fenotipik özelliklerini büyük ölçüde korumalarıdır (9). Örneğin: İnsan embriyonu böbreği (HEK), insan amniyonu (HAM), Rhesus maymun böbreği (RhMK), yeşil maymun böbreği (GMK), tavşan böbreği (RK) (10). 11 Mekanik veya enzimatik yollarla bir dokudan ayrıştırılan primer hücreler dört farklı gelişim gösterirler. Bu gelişimler; 1. İn vitro ortama hücrelerin alıştığı dönem 2. Hücrelerin logaritmik olarak çoğaldığı dönem 3. Hücrelerin çoğalma hızının giderek yavaşladığı dönem 4. Hücrelerin yaşlandığı, bölünmelerinin zorlaştığı ve hücre ölümlerinin başladığı dönemdir (1). Hücre kültürü çalışmalarında deneyler, hücrelerin logaritmik olarak çoğaldığı dönemde planlanmalı ve bu hücrelerin bir kısmı ilerideki çalışmalar için dondurularak saklanmalıdır (1). Primer hücre kültürleri, küçük doku parçalarının petri yüzeylerine ekilmesiyle eksplant kültürler halinde ya da enzim uygulanmasıyla tek hücre süspansiyonu halinde yapılabilir (11). Primer kültürler kontaminasyon riski olan kültürlerdir, bu yüzden manipülasyonlarda steriliteye özen gösterilmelidir. Kullanılan cerrahi malzemeler otoklavlanmış olmalıdır. Tüm manipülasyonlar laminar kabin içinde yapılmalıdır (11). Primer hücre kültürünün bir uygulama örneği aşağıda verilmiştir. Primer mezanşimal (kıkırdak, fibroblast) hücre kültürü: Kulak %70 alkol ile temizlenmeli ve alkol ile iyice temizlenmiş kulak pensi ile doku alınmalıdır. Hayvandan alınan dokular, + 4 derecede %5 antibiyotik içeren PBS solüsyonunda işleneceği laboratuara gelene kadar saklanır. Dokuların alınması sırasında steriliteye özen gösterilmelidir. Bu şekilde muhafaza edilen doku örnekleri 3- 4 gün canlılığını muhafaza edebilir. Laboratuara ulaşan doku örnekleri laminar kabin içinde %5 antibiyotikli PBS’den %2 antibiyotikli PBS içerisine aktarılırlar. Kulak doku parçalarının üzerindeki kıllı deri bisturi ucu yardımı ile temizlenir, kıkırdak ve bağ dokusu temiz bir petriye aktarılır ve kurumaması için üzerine az miktarda PBS damlatılır. 12 Steril bistüri ve pensler ile dokular iğne başı kadar küçük parçalara ayrılır. Bu parçalar 35 mm’lik hücre kültür petrilerine aktarılır. Dokuların kültür petrisine yapışması için bir süre (2- 3 dakika) beklenir. Hücre kültür medyumu petrinin kenarından yavaş bir şekilde dokuların üzerini kaplayacak şekilde uygulanır. Ekim yapılan kültür petrileri inkübatöre yavaşca kaldırılır. Petriyi sarsmamaya özen gösterilmelidir aksi takdirde ekilen dokuların yerlerinden kalkma olasılığı vardır. Petriler her gün dışarıdan kontrol edilir. Besiyerinin rengi sarıya dönmüşse, bulanıklaşmışsa veya bir tortu oluşmuşsa kültür kontamine olmuştur. Eğer petrilerde kontaminasyon tespit edilirse, kontamine petri % 70 alkolle kaplanır ve tıbbi atık olarak bertaraf edilir. Ekimi takiben 7 gün boyunca petriler yerlerinden oynatılmadan kültüre edilmelidirler. 7. günde petriler invert mikroskop altında kontrol edilir ve hücre üremesi olanlar tespit edilir. İlk olarak primer kültür petrilerinin medyumu 7. günde tazelenir ve 2 gün ara ile medyum değişimleri tekrarlanmalıdır. Hücrelerin petriyi kaplamasının ardından; doku parçaları pastör pipeti ile toplanır ve petrilere tripsin uygulanır ve hücreler pasajlanır. Eğer hücreler hemen kullanılmayacaksa dondurma işlemi gerçekleştirilir (11). 2.6.1.2. Sekonder hücre kültürü Normal kromozom sayısına sahip diploid hücrelerden elde edilen ve en fazla 50 kez pasajları yapılabilen kültürlere denir. Örneğin: WI-38, MRC-5 vb (10). 2.6.1.3. Sürekli hücre kültürü Teorik olarak sonsuz pasajları yapılabilen genellikle habis tümörlerden elde edilen kültürlerdir. Laboratuar koşullarında değişime uğrarlar ve kromozom sayıları sabit değildir (10). Primer kültürlerden spontan mutasyonlar sonucunda kendiliğinden ya da virüsler eklenerek insan eliyle oluşturulabildikleri gibi, tümör dokusundan alınan hücrelerden de elde edilebilirler. Örneğin: İnsan larenks epidermoit karsinomu (Hep-2), insan 13 nazofarenks karsinomu (KB), insan serviks karsinomu (HeLa), yeşil maymun böbreği (Vero) (1). Hücre soylarının primer kültürlerden farkları; Kültürde yüksek yoğunluğa ulaşabilmeleri Serum ve büyüme faktörüne daha az ihtiyaç duymaları Çoğalmak için bir zemine tutunma gereksinimlerinin daha az olması Çoğalma yeteneklerinin sonsuz olması olarak sıralanabilir. Yapılması planlanan araştırmaya göre, araştırmada kullanılacak olan hücreler seçilmelidir. Fizyolojik veya farmakolojik araştırmalarda primer hücrelerin kullanılması daha olasıdır. Örneğin; ECV 304, transforme endotel hücre soyudur. ECV 304 hücrelerinin gen ekspresyon profilinin ve uyarılara verdiği moleküler yanıtların, HUVEC’ ten farklı olduğu rapor edilmiştir (12). Geliştirilmek için tıbbi açıdan en umut verici olan hücre kültürü, insan embriyonik kök hücre kültürleri gibi görünmektedir. Bu hücreler erken embriyonun iç hücre kitlesinden elde edilirler ve sınırsız çoğalma özelliğiyle birlikte herhangi bir hücreye dönüşme yeteneğine de sahiptirler. Tablo 2.4. te sıralanan hücre kültürlerinin çoğu tümörlerden türetilmiştir. Hepsi, kültürde sınırsız kopyalanma yeteneğine sahiptir ve kökenleri olan hücrenin özelliklerinden en azından bir kaçını gösterir (3). 14 Tablo 2.4. Yaygın olarak kullanılan hücre serileri Hücre kültürü Hücre tipi ve kökeni K562 KML transforme eritrolösemi hücre dizisi RPMI-8226 Hafif zincir sekrete eden plazmasitoma hücre dizisi MCF-7 Meme adenokarsinomu hücre dizisi A2780 Yumurtalık kanser hücre dizisi HCT-116 Kolon karsinoma hücre dizisi (insan) A-549 Akciğer kanseri epitel hücre dizisi (insan) 3T3 Fibroblast (fare) BHK21 Fibroblast (hamster) PtK1 Epitel hücresi (rat) L6 Miyoblast (rat) PC12 Kromaffin hücresi (rat) SP2 Plazma hücresi (fare) COS Böbrek (maymun) CHO Over (hamster) DT40 Lenfoma hücresi (civciv) R1 Embryonik kök hücreler (fare) T24 Mesane epitel hücresi (insan) HepG2 Karaciğer epitel hücresi (insan) HEK293 Böbrek epitel hücresi (insan) HL60 Lösemi hücresi (insan) SH-SY5Y Nöroblastoma hücresi (insan) H1, H9 Embryonik kök hücreler (insan) S2 Makrofaj benzeri hücreler (Drosofila) 15 2.6.2. Büyüme Biçimlerine Göre Kültürler 2.6.2.1. Süspansiyon kültürler Üreyebilmeleri için bir zemine tutunma gereksinimleri olmayan, gaz alışverişinin ve besin transferinin yeteri kadar sağlanabildiği bir vasat içinde üreyebilen kültürlere denir. Süspanse hücrelerin üremelerini kontrol etmek mümkündür. Pasajlanmaları için basit bir dilüsyon yeterlidir. Bu kültürler hücrelerin bir defada ve büyük miktarlarda üretilmesinde kullanılmaktadır. Kan, dalak, kemik iliği kültürleri ve olgunlaşmamış hücreler bu şekilde kültüre edilir (1, 7). 2.6.2.2. Tutunarak büyüyen (monolayer) hücreler Ektoderm ve endodermden oluşan hücreler (fibroblast ve epitel hücreleri), ekstasellüler matriks olarak adlandırılan ve kollajen, fibronektin, laminin proteoglikanlar gibi makromoleküllerin bir karışımı olan kompleks bir yapı üzerinde, bu yapıdaki moleküllerde membran reseptörleri aracılığı ile etkileşerek büyürler. Bu etkileşimi sağlayan membran proteinlerinin en önemlileri, integrin adlı heterodimerik proteinlerdir (Ör: İntegrin α1ß3, α2ß3 vs.). Tutunma gereksinimlerine göre kültürler iki şekilde sınıflandırılabilir (1). 1. Tutunma gereksinimi olan hücreler: LETS ( Large, external, transformation sensitive) adlı glikoproteinin varlığı, tutunabilme özelliğini göstermesini sağlamaktadır. 2. Tutunmadan büyüyebilen hücreler: Tutunmadan büyüyebilen hücreler; hematopoetik hücre soyları, fare ve sıçan asit tümörleri ve insan küçük hücreli akciğer kanseri gibi bazı kanser hücreleridir (1, 13). Hücrelerin kültürde büyütülmeleri, en çok polistiren bileşiminde tek kullanımlık plastik malzeme üzerinde gerçekleştirilir. Polistiren yüzeyler hidrofobiktir ve hücrelerin tutunmasına uygun değildir, bu nedenle, polistiren hücre kültür kapları özel yöntemler ile aktive edilir, üzerlerine yüklü moleküllerin yerleşmesi sağlanır, böylece hidrofilik hale getirilirler. Cam malzemenin yıkanma ve sterilizasyonu zahmetlidir ve kontaminasyon riski doğurur (1). 16 Tutunarak büyüyen hücreler belirli bir döngü içerisinde sürekli olarak ürerler. Bu hücrelerin pasajlanması için tripsinizasyon gereklidir çünkü yüzeye bağlı yoğunluk sınırlaması vardır. Bu durum kontakt inhibisyondan kaynaklanmaktadır. Tutunarak büyüyen hücreler için difüzyona bağlı olumsuz etkiler söz konusuyken, süspanse kültürlerde karıştırmaya, hücrenin kap çeperine veya hava kabarcıklarına çarpmasına bağlı hasarlar görülebilir. Tutunarak büyüyen hücreler genellikle sitolojik preparatların hazırlanmasında, immünfloresan tekniğinde ve histokimyasal tetkiklerde kullanılır (7). Hücre kültür malzemesinin yüzeyi, hücrelerin tutunma ve çoğalmalarını kolaylaştırmak amacıyla çeşitli makromoleküllerle kaplanabilir. Bunlar, hücrelerin yüzeylerinde eksprese olan integrin proteinleri ile etkileşerek dokuda var olan ekstrasellüler matrikse benzer etki gösterirler, hücrenin içine mitozun gerçekleşmesi yönünde, antiapopitotik sinyallerin iletimini ve bunun yanı sıra, hücrelerin diferansiyasyonunun –bir ölçüdedeğişmemesini sağlarlar. Epitelyum hücreleri, kas hücrelerinin tutunması ve hepatositlerin diferansiye kalabilmesi için kollajen jel tabakası; endotel hücreleri için fibronektin ya da jelatin, zemini kaplamada kullanılan maddelerdir (1). 2.7. HÜCRE KÜLTÜR YÖNTEMLERİ 2.7.1. Standart Tüp Kültürü Genel olarak tüm virüslerin üretilmesinde altın standart yöntemdir. Standart laboratuar tüpleri içine pasajlanan hücre dizilerinin belli aralıklarla döndürülmesi (genellikle, roller drum’da 10- 15 rph) ve ısı yardımıyla tüp yüzeyinin tek tabaka hücre dizisi ile kaplanması sağlanır. Tüplere örnek ekimi yapıldıktan sonra, her virüsün sitopatik etki oluşturma süresi farklı olmakla birlikte tüpler 14 gün boyunca inkübe edilir (10) . 2.7.2. “Shell Vial” Hücre Kültürü Yöntemi 4- 5 cm boyunda, 16- 18 mm çapında tüpler içine 12- 15 mm’lik yuvarlak lameller yerleştirilir. Hücre dizileri bu lameller üzerine pasajlanır. Yuvarlak lameller 96’lık U tabanlı serolojik plaklara da yerleştirilerek aynı yöntem kullanılabilir. Tek tabaka hücre dizisi oluştuktan sonra örnek ekimleri yapılırken süresi ve hızı izole edilecek örneğe göre değişen santrifüjleme işlemi yapılır. Burada amaç, örnekte bulunması olası etkenin 17 hücre dizileri içine girişini hızlandırmak ve süreci kısaltmaktır. Bu yöntemde standart tüp kültüründe olduğu gibi etkenin sitopatik etki yapması beklenmez. Lameller, yaklaşık 24- 48 saat sonra etkene özgül FITC (fluorescein isothiocyanate) ile işaretlenmiş monoklonal antikor ile boyanır (10). 2.7.3. Kokültivasyon Yöntemi Tanı amacı ile incelenen doku örneğinin, daha önceden üretilmiş hücreler ile birlikte kültürünün yapılmasıdır. Önceden üretilmiş hücre kültürü, incelenen örnekteki hücrelerin canlılık ve sürekliliğini sağlamaktadır. Bu yöntem HIV tanısında kullanılır. Hastadan alınan periferik mononükleer hücreler (PMH) ile, HIV-1 seronegatif vericiden alınmış ve fitohemaglütinin ile uyarılmış PMH’lerin birlikte kültürü yapılır. Bu işlemde PMH’lerin üretilmesi için içine interlökin-2 eklenmiş özel besiyeri kullanılır. Kültür inkübe edildiği sürece içine 3- 5 günde bir taze PMH eklenir. Sitopatik etki, EIA, RIA gibi yöntemlerle veya kültür üst sıvısından “reverse transkriptase” enzim aktivitesi veya p24 antijeni saptanması ile anlaşılır. Hücre kültürünün üst sıvısında, 10. günde p24 antijeninin saptanması % 90 olasılıkla tanı koydurur (10). 2.8. HÜCRE KÜLTÜRÜ LABORATUARLARI VE TEMEL CİHAZLARI Viroloji ve hücre kültürü laboratuarları, hava akımına sahip kabinlerin (Class 2 kabinpozitif basınçlı HEPA filtreli) bulunduğu ayrı odalardan oluşturulmalıdır. Bakteri ve mantar kontaminasyonundan korunmak için çalışma alanı, çalışılmadan önce ve sonra dezenfektan ve UV ile temizlenmeli, diğer durumlarda temiz ve tozsuz tutulmalıdır. Farklı hücre dizileri aynı anda işlenmemelidir. Hiçbir sıvı ağız ile pipetlenmemelidir. Flasklar kullanılmadan önce %70’lik alkol ile silinmelidir. Olası bir kontaminasyon durumunda erken farkına varmak için, hücre üretme besiyerleri örnek ekilmediği sürece antibiyotiksiz kullanılmalıdır (7, 10). Hücre kültürü çalışmaları için gerekli donanımdaki araç-gereçler: laminar akımlı kabin, karbondioksit (CO2) etüvü, faz kontrast mikroskop, hücreleri saklama ve koruma için sıvı azot tankı ve hücrelerin üremeleri için gerekli tutunma ve hareketlerine olanak sağlayacak toksik olmayan, biyolojik olarak inert ve optik olarak saydam, tek kullanımlık steril plastik kaplardır (7). 18 Laminar akımlı kabin (laminar flow hood): Horizontal ve vertikal olmak üzere iki tip laminar akım kabini vardır. Her iki tip laminar akım kabininde de havadaki partikülleri uzaklaştıran HEPA (high efficiency particible) filtre kullanılır. Horizontal kabinler ortamı steril ederken, vertikal kabinde steril edilen hava çalışılan ortamın önünden aşağıya doğru bir şelale gibi akar ve iç ortam ile dış ortamın karışmasını engeller. (Şekil 2.1.a) Sonuç olarak horizontal tipte, hava akımı çalışma alanına paralel, vertikal tipte ise yerden çalışma alanına doğrudur. Ortamda kısa dalga boylu UV ışığı da her zaman için steriliteye katkıda bulunur (7). Çalışmadan önce ve çalışmadan sonra UV ışığı 10–20 dakika açık bırakılır. Her kullanımdan sonra ortam %70’lik etanol ile temizlenir. Horizontal kabinler, ameliyathane gibi ortamların havasını steril etmek için kullanılırlar ve Class C olarak da bilinen bu kabinler doku kültürü laboratuarlarında daha çok ürün korumaya yönelik olarak kullanılan, kullanıcıyı korumayan kabinlerdir. Biyolojik güvenlik kabini olarak bilinen vertikal laminar akım kabinleri ise; zararlı organizmalarla çalışırken ve hücre kültürü yaparken steril bir ortam sağlarlar. Class B olarak bilinen vertikal kabinler hem ürünü hem de kullanıcıyı koruyan kabinler olup, hücre kültürü laboratuarlarında en çok kullanılan kabinlerdir. Class A olarak bilinen özel odalarda yer alan diğer tip kabinler, yüksek biyolojik kontaminasyon riski bulunan ürünler için planlanmış olup, Class B kabinlerinin özelliklerinin yanı sıra tamamen kapalı uzaktan kumanda ile işlemlerin yapıldığı kabinlerdir (14). CO2 inkübatörü: Hücreler %5–10 CO2’li ortamda çoğalırlar. Çünkü ortamın CO2 içeriği medyum NaHCO3 / H2CO3 dengesinde önemli rol oynar. Bu nedenle kültüre alınan kültür flasklarının kapakları gaz giriş çıkısına uygun olmalı, ya da gevşek olarak kapatılmalıdır. İnkübatörlerin kapısı uzun süreli açık kalmamalı, ısı kaybı ve kontaminasyon riski unutulmamalıdır. Ortamın nemi inkübatördeki su kabının daima temiz ve dolu olmasıyla sağlanır. (Şekil 2.1.b) Kültür ortamının optimal sıcaklığı kullanılan hücre tipine göre ayarlanmalıdır. Genellikle 36,5–37°C hücre kültürleri için uygun sıcaklıktır. 19 Şekil 2.1.a. Laminar akım kabini Şekil 2.1.b. CO2 inkübatörü Mikroskoplar: Hücre kültürü laboratuarında iki tip mikroskop kullanılır. Flasklarda hücrelerin tek tabaka olup olmadığı, shell-vial yüzeyinde yeterli hücre olup olmadığı ve ekimlerden sonra sitopatik etkinin izlenmesi için “inverted” mikroskop ve floresan antikor reaksiyonlarını izlemek için floresan mikroskobu kullanılır. (Şekil 2.2.a) İnverted faz kontrast mikroskobu hücre kültürü çalışmalarında çok önemlidir. Kültür devam ederken hücrelerin büyümesi, morfolojik özellikleri ve kontaminasyon olup olmadıgı invert mikroskopta takip edilir. Normal ışık mikroskobu kültür sonrası testler (canlılık, sitogenetik, hücre sayımı vb.) için gereklidir. Hücreleri gözlemek için de faz kontrast mikroskoplar kullanılır (14). Su banyosu: Düzenli olarak temizlenmeli ve hücrelerin kontamine olması önlenmelidir. Azot tankından çıkarılan hücre stoklarının hızlı eritilmesinde ve FCS’nin inaktive edilmesinde kullanılır. (Şekil 2.2.b) 20 Şekil 2.2.a. İnvert mikroskop Şekil 2.2.b. Su banyosu Santrifüj cihazı: Belli bir hızla dönen ve bu dönme sayesinde tüpler içerisinde yoğunluğa bağlı olarak çökme meydana getiren cihazlardır. Hücre kültürü işlemlerinde birçok basamakta kullanılır. (Şekil 2.3.a) Buzdolabı ve dondurucular: Hücre üretme sıvıları 2- 80°C’ lik soğutucularda, tripsin gibi enzimler, FCS, L- glutamin, antibiyotik solüsyonları vb. –20°C’ de, hasta örnekleri, sulandırılmış monoklonal antikorlar, hemen kullanılacak hücre stokları vb. –80°C’ de, hücre ve virüs stoklar ise –196°C’ de (azot tankı) saklanır. (Şekil 2.3.b) Hücre saklama kapları: Hücre saklama kapları, sıvı nitrojen içerisinde saklanılan plastik ya da metal alaşımlı kaplardır. Sıvı nitrojen sıvı fazında iken -196°C, gaz fazında iken -156°C’ dir. Doku kültürü hücrelerinin saklanması için kullanılır. (Şekil 2.3.c) Hücre kültür laboratuarında bu cihazların dışında genel olarak mikrobiyoloji laboratuarlarında olması gereken vakum hattı ya da pompası, malzemelerin sterilize edilebileceği bir otoklav, ve hücrelerin saklanabilmesi için bir sıvı azot tankı da bulunmalıdır. 21 Şekil 2.3.a. Santrifüj cihazı 2.9. HÜCRE KÜLTÜRÜNDE Şekil 2.3.b. Buzdolabı KULLANILAN Şekil 2.3.c. Sıvı azot tankı TEMEL BESİYERİ VE SOLÜSYONLAR Hücre kültürü besiyerleri, laboratuar ortamında hücrelerin normal metabolik aktivitelerini sürdürebilmeleri için gerekli olan mikroçevreyi sağlayan besleyici solüsyonlardır. Hücre kültürü besiyerleri içeriklerindeki aminoasit, karbonhidrat, vitamin ve iyonlarla hücrelerin gelişimini desteklerler. Laboratuar ortamında hücrelerin çoğaltılabilmesi için uygun pH sıcaklık ve nemin sağlanması çok önemlidir. Hücre kültürü besiyerleri içeriklerindeki iyonlarla gerekli ozmolarite ve pH’ı da sağlarlar. Besiyeri ihtiyacı, hücrelerin tipine, adaptasyon kabiliyetine ve hücre kaynağının türüne göre farklılık gösterir. Hücreler farklı besiyerlerinde farklı davranabilirler. Bu yüzden çalışmanın amacına göre hücrenin besiyeri ihtiyaçlarının belirlenmesi gerekir (1, 7, 11). Hücrelerin canlılıklarının devamı ve çoğalmaları için aminoasitler, karbonhidratlar, lipitler, vitaminler, iyonlar ve proteinlerin ortamda bulunması şarttır. Hücre kültüründe iyon bileşimi bakımından ekstrasellüler ortama en yakın olan, bunun yanı sıra hücre çoğalması için serum içeren çözeltiler kullanılır. Çözeltilerin pH’ sı 7,4 civarında olmalıdır, çoğunda pH indikatörü olarak fenol kırmızısı bulunur. Fenol kırmızısı, pH 7,4’ te kırmızı, 7’ de turuncu, 6,5’ te sarı, 7,6’ da koyu pembe ve 7,8’ de mor renk vermektedir (1). 22 Hücreler hem kültür çözeltisinin pH’ sının kontrol edilebilmesi, hem de çoğalabilmesi için bikarbonata gereksinim gösterirler. Bu nedenle, içindeki karbondioksit düzeyi ayarlanabilen inkübatörler kullanılmalıdır. H2O + CO2→ H2CO3→H + HCO3 pH yükselir. Nötralizasyonu için ortama NaHCO3 ilave edilir. NaHCO3→Na + HCO3 pH 7.4 olur. Çözeltilere tampon olarak eklenen bikarbonat iyonu, karbondioksit ile dengededir. Bu yolla oluşan karbondioksit çözeltiden havaya karışarak pH’yı yükseltir. Hücrelerin oluşturduğu laktik asit ise pH’yı düşürür. Bu değişimleri tamponlamak için içlerine 510 mM Hepes eklenmektedir (15). Çözeltiler, inorganik iyon bileşimleri bakımından, dengeli tuz çözeltileridir. 1950’li yıllarda yayınlanmış olan Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS), Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM), Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) ve bunların zenginleştirilmiş formları; EMEM’e Dulbecco modifikasyonu (DMEM) , Ham’s F12, DMEM ve F12 nin 1:1 karışımı olan DMEM/ F12, RPMI 1640, M199 en sık kullanılan çözeltiler olmaktadır. Bunlara eklenen diğer moleküller, esansiyel amino asitler, vitaminler (özellikle B vitaminleri), hormonlar (insülin, hidrokortizon) ve glikozdur (1). Ortama % 5- 20 oranında eklenen serum, hücrelerin çoğalmasını sağlar. Bazı hücreler için bu ortamın fizyolojik olmadığı, serumlu ortamın yalnızca iyileşen yara içinde oluşabildiği unutulmamalıdır. Hücre kültüründe kullanılan temel besiyeri ve solüsyonlar şunlardır: Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM) Hücre kültürlerinde olması gereken temel aminoasit kombinasyonu ilk defa Eagle tarafından 1955’de tanımlanmıştır. Kendi ismini taşıyan Minimum Eagle’s Medium (MEM) isimli besiyeri bazı modifikasyonlarla bugüne kadar gelmiştir. Dulbecco tarafından modifiye edilen MEM solusyonu bugün somatik hücre kültürlerinde en sık kullanılan besiyeri bileşenidir. DMEM hücrelerin beslenebilmeleri için gerekli glukoza, canlılıklarını sürdürebilmeleri için uygun ozmolarite ve pH’a, fonksiyonlarını 23 görebilmeleri için gerekli aminoasitlere ve vitaminlere sahiptir. Ancak tek başına hücre gelişimi için yeterli değildir (11, 14, 16). Fetal Bovine Serum (FBS) Serum hücrelerin tutunabilmeleri ve çoğalmaları için kullanılan ve içeriği tam olarak tanımlanmamış zengin bir protein çözeltisidir. Bu protein çözeltisinin içinde hormonlar, enzimler, hücrenin büyümesi ve çoğalmasını sağlayan büyüme faktörleri, yüzeylere tutunabilmesini sağlayan hücrelerarası matriks proteinleri bulunur. Hücre çeşidine ve uygulamalara göre besiyerindeki serum oranı değişebilir. Standart bir somatik hücre kültüründe serum oranı %10’ dur. Serum üretimi pahalı ve zahmetli bir süreçtir. Sığır embriyolarının kanlarının toplanmasıyla hazırlanan serumların üretiminde bir standart yoktur. Farklı hayvanlardan elde edilen serumlar birbirlerinden farklılık gösterirler. Bu da deneylerin sonuçlarını etkilemektedir. Bu dezavantajlarından dolayı bazı laboratuarlar serumsuz besiyerlerini kullanmaktadırlar. Serum kullanılmayan bir besiyerinin çeşitli büyüme ve tutunma faktörleriyle desteklenmesi gerekir, bu da çalışmaya göre serumdan daha pahalı olabilir (11, 14, 17). Phosphate Buffer Saline (PBS) Hücre içi ve dışındaki ozmotik basıncı dengede tutan bir tuz solüsyonudur. İçeriğindeki inorganik tuzlar ve su, hücre metabolizmasını destekler, pH’yı tamponlayarak hücreler için uygun bir ortam sağlar (11). Tripsin Tripsin hücre pasajlamalarında kullanılan temel enzimdir. Tripsin, bir serin proteaz tipi enzimdir, lizin ve arjinin aminoasitlerinden peptidleri yıkar. Tripsin kullanımında dikkat edilmesi gereken bazı noktalar şunlardır: 1) -20 ºC’de saklanır, daha yüksek sıcaklıklarda bekleyen tripsinin aktivitesi düşer, bu yüzden aligotlanarak saklanması en uygunudur. 2) Serum tripsin inhibitörlerini içerir, hücrelere tripsin uygulanmadan önce mutlaka bir kez Ca+2 ve Mg+2 içermeyen PBS ile yıkanmalı ve yüzeylerindeki serum uzaklaştırılmalıdır. 3) Tripsin hücrelerin yüzeyini örtecek kadar uygulanır. 24 4) Tripsin sıcaklık arttıkça daha etkili çalışır. Tripsin uygulanan hücreler inkübatöre konduklarında daha çabuk yüzeylerden ayrılırlar, oda sıcaklığındaysa daha yavaş ayrılırlar. 5) Hücreler yüzeyden ayrılır ayrılmaz tripsinin inhibe edilmesi önemlidir. Tripsin hücreleri yüzeyden ayırdıktan sonra hücre membranlarına zarar vermeye başlar. 6) Hücrelerin yüzeylerden ayrılma hızı değişebilir. Besiyerindeki serum oranı, hücre tipi, petrideki hücre yoğunluğu, tripsinin aktivitesi ve son pasaj üzerinden geçen zamana göre hücreler farklı zamanlarda kalkarlar. 7) Farklı şişelerdeki tripsinler birbirlerine her zaman eş değer olmayabilir. 8) Tripsini inhibe etmek için tripsin hacminin en az iki katı kadar %10 FCS’li besiyeri uygulanmalıdır. Daha sonra hücreler pipetlenerek birbirlerinden ayrılırlar (1, 11). 2.10. HÜCRE KÜLTÜRÜ ÇALIŞMALARINDA YAPILAN İŞLEMLER 2.10.1. Hücrelerin Beslenmesi Her hücre tipi için kullanılacak büyüme çözeltisi alındığı yerden ya da yazılı kaynaklardan öğrenilmelidir. Büyüme çözeltilerinde, hücre dışı ortamla izoosmotik bir tuz karışımı, tampon olarak sodyum bikarbonat ve besleyici amaçlı çeşitli aminoasitler, vitaminler ve pH indikatörü olarak fenol kırmızısı bulunur (1). Büyüme çözeltileri ya hazır olarak ya da belirli hacimde, çözelti yapılabilecek toz materyal olarak satın alınırlar. Toz materyal çözelti haline getirilip pH’ sı ayarlandıktan sonra 0.22 µm filtreden süzülerek sterilize edilir (7). Çoğu hücre, pH; 7.4 civarında optimal olarak büyüyüp çoğalmaktadır. Büyüme çözeltilerine % 5-20 oranında (v/v) serum eklenir. En sık kullanılan serum fetal buzağı serumudur. Bazı hücreler at serumuna hatta bazı primer hücreler elde edildikleri canlının serumuna gereksinim duyarlar. Antibiyotikler sıklıkla ortama eklenirler ancak 37oC’de stabiliteleri kısa süreli olduğundan kontaminasyona karşı koruyuculukları sınırlı olmaktadır. 25 En sık kullanılan standart antibiyotikler: (37oC’ deki yarı ömürleri parantez içinde belirtilmiştir) - Gentamisin 5- 10 mg/ml stoktan 50 µm/ml olacak şekilde (15 gün) - Penisilin 10,000 U/ml stoktan 100 U/ml (2 gün) ve streptomisin 10 mg/ml stoktan 100 µg/ml olacak şekilde (4 gün). Büyüme çözeltileri pek çok dayanıksız madde içerdiğinden, +4oC’de saklanmalı, ancak hücrelere eklenmeden hemen önce 37oC’lik su banyosunda on dakika ısıtılmalıdır. Hücreler haftada iki kez büyüme çözeltileri değiştirilerek beslenmelidir (1). Kültür ortamını dört faktör etkiler. Bunlar; 1. pH’ ın düşmesi: pH 7’ den 6.5’ e düşerse bir çok hücrenin büyümesi durur ve pH 6-6.5 arasında ölmeye başlarlar. Ortamın pH’ sı düştüğünde indikatör olan fenol kırmızısının rengi önce turuncuya sonra sarıya döner. Bu durumda besiyeri değiştirilmelidir. 2. Hücre konsantrasyonu: Kültürde yüksek hücre konsantrasyonu varsa besiyeri daha çabuk tükenir. Bu durum çoğunlukla pH değişimine neden olur. 3. Hücre türü: Normal hücreler yüksek hücre yoğunluğuna ulaştıkları zaman bölünmeyi durdururlar. G1 fazında kalan hücreler uzun süre canlı kalabilirler. Dönüştürülmüş, ölümsüzleştirilmiş hücreler ve bazı embriyonik hücreler ise kültürde yüksek konsantrasyona ulaştıklarında, kültür değiştirilmez veya subkültüre edilmezse hızla bozulurlar. 4. Hücre morfolojisi: Eğer kültürde çekirdek çevresinde granüllerin belirmesi, hücrelerin yuvarlaklaşıp tabandan ayrılması gibi olaylar başlamışsa kültürde morfolojik bozulmalar olmuş demektir. Bu belirtiler kültürün ortam değişikliğine ihtiyaç duyduğunu gösterir veya kültürdeki hücreler yaşlanmış, mikrobiyolojik kontaminasyona uğramış, toksik ortamla karşı karşıya gelmiş anlamına gelir. Kültürde daha ciddi sorunlarla karşılaşmamak için, kültür rutin olarak kontrol edilmelidir (1). 26 2.10.2. Hücrelerin Pasajlanması Hücre pasajlama işlemi; flasklarda tek tabaka halinde bulunan hücre dizilerinin zarar verilmeden yüzeyden ısı ve tripsin yardımıyla kaldırılıp sıvı içinde süspanse ederek başka ortamlara aktarma prensibine dayanır. Aktarılan ortam % 5 CO2’li etüvde 37o C’ de hücreler tam tabaka olana kadar inkübe edilir (10). Her hücre tipi, kendine özgü bir hızla bölünerek çoğalır. Genelde hücre sayısının ikiye katlanması 24 saat sürmektedir. Bölme öncesinde tutunan hücrelerin kaldırılması gereklidir. Büyüme çözeltisinin ortamdan çekilmesinden sonra hücreler bir kez daha PBS ile yıkanır ve ekstrasellüler matriks (EM) proteinlerini parçalamak amacı ile tripsin enzimi, integrin – EM etkileşiminde şart olan kalsiyum iyonunu ortadan kaldırmak için EDTA ya da Tripsin- EDTA birlikte kullanılabilir. Kaldırılan hücreler sağlıklı bir sonuç için sayılmalı ve her bir flask 105 hücre/ ml olacak şekilde birkaç flaska bölünmelidir (1). 2.10.3. Hücrelerin Dondurularak Saklanması İstenen özellikleri taşıyan ve kontaminasyon içermeyen bir hücre hattı üretildiğinde ya da klonlanmış bir hücre türü seçildiğinde bir “ asıl” stok donmuş olarak saklanmalıdır (18). Sıvı azotta saklama günümüzde tercih edilen hücre koruma yoludur (19). Hücreler sıvı azot içinde -196oC’de, bu düşük sıcaklığa dayanacak özel plastik tüpler veya cam vialler içinde saklanır. Hücreler geç logaritmik faza kadar büyütülür ve yüksek bir hücre yoğunluğunda süspansiyon hazırlanır (1). Hücreler, büyüme çözeltileri besiyerine % 1020 serum ve % 5-10 gliserol veya DMSO eklenerek dondurulabileceği gibi, % 90 serum ve % 10 DMSO içeren çözeltide de dondurulabilir (1). Hücre süspansiyonu tercihen yüksek bir konsantrasyonda olmalı ve yavaşça, dakikada 1oC hızıyla dondurulmalıdır. Kontrollü yavaş dondurma işlemi için vialler izopropanole gömülür ve takiben -80°C’lik derin dondurucuya kaldırılması ile her dakikada 1- 3°C düşme sağlanır. Kaliteli bir dondurma sağlayabileceği gibi -80°C’de hücreler ortalama 6 ay 1 yıl saklanabilir (10). 27 Dondurulacak olan tüpler bir kriyo tüp dondurma kutusunda ya da iki strafor köpük parçası (2.5 cm kalınlığında) arasında sandviç yapılarak – 80oC’ye ulaştıktan sonra mümkün olduğu kadar çabuk sıvı azota nakledilmelidir. Gerektiğinde hücreler hızla çözülmeli ve asgari geri kazanım açısından yüksek bir konsantrasyonda ekilmelidir (19). Dondurma işlemi hücreler için letaldir. Buz kristallerinin hücreye zararı neticesinde elektrolit konsantrasyonu değişir, hücrede dehidrasyon meydana gelir ve pH değişir. Dondurma işleminin etkilerini en aza indirmek için bazı önlemler geliştirilmiştir. İlk olarak önerilen, hücrelerin uzun ömürlü olmaları için dondurma işleminden önce taze besiyerinde 24 saat log fazında bekletilmeleridir. İkinci olarak soğuktan koruyucu (cryoprotectiv) ajanlar (donma noktasını düşürmek için gliserol veya DMSO) eklenmesidir. Ömürlü hücreler, 5. veya 10. pasaj sonrasında yeterli sayıda çoğalırlar ve stoklanabilirler. Sürekli hücreler, daha hızlı ürerler, daha kolay klonlanırlar ve genetik olarak daha labildirler. Yeterli miktarda üretildikten sonra stoklanabilirler (10). 2.10.4. Hücreleri Çözme Dondurularak saklanan hücreler bir çalışmada kullanılmadan önce azot tankından ya da - 80oC’ lik soğutucudan çıkarılır ve sıcaklığı 37oC’ ye ayarlanmış su banyosunda hızla çözdürülür. Çözdürülen hücre çözeltisi taze besiyeri ile dilüe edilir. Santrifüj işlemi ile dondurma aşamasında kullanılan maddeler uzaklaştırılır. Pellet taze besiyerinde süspanse edilerek, yine taze besiyeri içeren petrilere aktarılır. 37oC’ de % 5 CO2’ li inkübatörde inkübasyona kaldırılır. Dondurulmuş hücrelerin devitrifikasyon ve rekristalizasyon harabiyetlerini minimuma indirmek için hızla çözdürülmesi gereklidir. Donma sırasında şekillenen küçük buz partikülleri, çözdürme esnasında erir. Çözdürme esnasında, hücrelerin hızlı rehidrasyonu sırasında ozmotik strese bağlı olarak hasarlar meydana gelebilir. Bu nedenle çözdürme hızı çok önemlidir (7). 2.10.5. Hücre Canlılığı ve Sitotoksite Ölçüm performansı ve tekrarlanabilirlik başarısı için ya da çalışmalarda karşılaştırma yapmak için hücre popülasyonlarının miktarlarının belirlenmesine ihtiyaç vardır. Bu 28 nedenle hücre popülasyonlarında hücre canlılığı ve proliferasyonlarını belirlemek için bazı metotlar geliştirilmiştir (20). Direkt hücre sayımında canlı ve cansız hücreleri ayırt etmek için genellikle hemositometre ile birlikte vital bir boya (trypan blue) kullanılır. Bu metot kolay, çabuk ve ucuzdur ve toplam hücre süspansiyonundan sadece küçük fraksiyonlar gerektirir (21). 2.10.5.1. Hemositometre ile hücre sayımı Hücre sayımı için en genel metot hemositometre kullanmaktır. Kalın düz sayım odacıklı lamın üzerine lamel konması temeline dayanmaktadır. Temel olarak lam üzerinde çizgi ile kesin olarak kazınmış 1 mm kareler ve daha küçük kareler içerir. Hücre süspansiyonları lam lamel arasına doldurulduğu zaman hücreler mikroskop altında gözlenebilir ve seçili kare çizgisi içindeki hücreler sayılır. Bu sayımdan süspansiyonun mililitresindeki hücre sayısı hesaplanabilir (1, 21). 2.10.5.2. Trypan blue canlılık testi Trypan blue canlılık testi genellikle hücre ayırma, dondurma veya çözme gibi potansiyel olarak travmatik bir işlemden sonra canlı kalan hücrelerin oranını ölçmek için kullanılır. Birçok canlılık testi membran bütünlüğünün bozularak hücrenin, normalde geçirgen olmadığı bir boyayı alması esasına dayanır (1). Bu metodun temel prensibi, canlı hücreler boyayı almaz iken ölü hücrelerin almasıdır. Hücre süspansiyonu trypan blue ile dilüe edildiğinde canlı hücreler küçük, yuvarlak ve refraktil olarak görünürler. Ölü hücreler sis, büyük ve koyu mavi hale gelirler. Her iki hücrenin total sayısı mililitre basına ve canlı hücrelerin yüzdesi olarak belirlenebilir (21). 2.10.5.3. Neutral red boyası ile canlılık testi Neutral red (3-amino-7-dimethyl-2-methylphenazine hydrochloride) canlı hücrelerin lizozomunda biriken suda çözünen bir boyadır. Neutral red testi in vitro sitotoksisite tespiti için geliştirilen hücre canlılığı testidir. İn vitro doku kültür çalısmalarının başlangıcında neutral red boya, viral sitopatogenetik değerlendirme ve immunotoksisite 29 testleri için geliştirilmiştir. Neutral red testinde, hücrelerle boyanın inkübasyonu sonrasında boya, canlı hücrelerin lizozomunun içine girer. Hücre içine boya alımı plazma membranından pasif taşıma ile gerçekleşir. Lizozom içinde neutral red birikmesi ya polisakkaritler gibi lizozomal matriks içinde oluşur ya da lizozomun neutral red içinden proton alışverişiyle gerçekleşir. Hasarlı ya da ölü hücrelerin lizozomlarında neutral red bulunmaz ve plazma membranı, hücre içerisinde neutral red tutulduğu için görev yapamaz (21). 2.10.5.4. Floresan boya tutucularla canlılık sayımı Basit boyama (hemositometre) dışında alternatif yaklaşım intrasellüler komponentleri floresan boyamadır. Bazı metotlarda akridin orange-propidium iodide gibi kombine boyaların kullanılır. Akridin orange plazma membranına girer ve intrasellüler nükleik asidi boyar, düşük boya konsantrasyonunda yeşil flouresan üretir. Propidium iodide plazma membranına tamamen giremez, fakat hasar görmüş hücrelerin membranına girebilir, tekrar intrasellüler nükleik asidi boyar böylece floresanda kırmızı parlar. Boya acridin orange’ ı hasarlı hücrelerin nükleusundan dışarıda tutar. Böylece ikili boyadan sonra tüm sağlam hücreler ve hasarlı hücreleri aynı görüş alanı içinde en güçlü floresansla tanımlamak mümkündür (22). 2.10.5.5. MTT testi MTT (3-[4,5-Dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue) yöntemi ile bir hücre topluluğundaki canlı hücreler, kolorimetrik yöntemle kantitatif olarak saptanabilmektedir. Bu yöntem sağlam mitokondrianın MTT boyasının tetrazolium halkasını parçalayabilmesi ilkesine dayanmaktadır (23). MTT suda çözünen bir tetrazolium tuzu olup fenol kırmızısı içermeyen medyum veya tuz solüsyonlarında hazırlandığında sarımtırak bir solüsyon oluşturur. Tetrazolium halkasının süksinat dehidrogenaz enzimlerince parçalanması sonucu MTT mor renkli insolubl formazana dönüşür. Bu dönüşüm canlı hücrelerin mitokondrileri aracılığı ile olur. Oluşan bu formazan izopropanol veya başka bir çözücü yardımı ile solubl hale getirilir ve oluşan renk reaksiyonu spektrofotometrik olarak okunup kantite edilir (25). Sonuç olarak canlı ve mitokondri fonksiyonu bozulmamış hücreler mor renkte boyanmakta, ölü ya da mitokondri fonksiyonu bozulmuş hücreler boyanmamaktadır. Bu 30 yöntem hücrelerin MTT boyasıyla inkübasyonu, presipite reaksiyon ürününün çözünür hale getirilmesi ve reaksiyon ürününün kolorimetrik olarak ölçümü basamaklarından oluşmaktadır (24). Kolorimetrik yöntem için kullanılan temel parametre canlı hücrelerin metabolik aktiviteleridir. Örneğin MTT tetrazolium tuzu kullanılan bir mikroliter plate testi genellikle hücre proliferasyonu ve sitotoksitesinin kantitasyonunu belirlemede kullanılır. Tetrazolium tuzunun sadece metabolik aktivitesi olan hücreler tarafından renkli formazanlara indirgenmesinden dolayı bu yöntem sadece canlı hücreleri saptar. Örneğin MTT içerisinde canlı hücreler renkli, suda çözünmez, formazan tuzu tarafından indirgenir. Formazan kristalleri çözündükten sonra, çabuk ve kolayca klasik mikroplate okuyucusunda (maximum absorbans) 570 nm de miktarı belirlenebilir (14,20). Çoğalan hücreler prolifere olmayan hücrelerden metabolik olarak daha çok aktivite gösterdiği için, bu yöntemle sadece hücre canlılığı ve sitotoksite değil hücre aktivasyonu ve proliferasyonu da belirlenir. MTT kültür ortamındaki mitokondrial aktivitesi devam eden canlı hücrelerin kantitasyonunu sağladığından en sık kullanım alanları, sitokinlerin, büyüme faktörlerinin medyum komponentlerinin hücreler üzerine etkilerinin araştırılması ve sitotoksik ajanların etkinliğinin test edilmesidir (25). 2.10.6. Hücre Kültüründe Kontaminasyon Hücre kültürlerinin kontaminasyonu hücrelerin fizyolojisini ve metabolizmasını bozarak, araştırmaların ve endüstriyel çalışmaların verimliliğini olumsuz yönde etkilemekte, hastalıkların tanılarının doğru bir şekilde konulmasını engellemektedir. Ayrıca virüs aşılarının hazırlandığı hücre kültürlerindeki kontaminasyon, insan sağlığı açısından ciddi bir tehlike oluşturmaktadır (26). Hücre kültürü çalışmalarında sterilizasyon çok önemlidir. Kültürde yabancı bir mikroorganizma olmamalıdır. Mikroorganizma varlığı, 1. Kültürde koyu bir bulanıklık ve hızlı bir tahribatın varlığı 2. Bulanıklık olmadan hücrelerde oluşan sitopatik etkilerin tespiti ile anlaşılabilir. Kontaminasyon genellikle, hücre kültürlerini oluşturmakta kullanılan doku numunesinden kaynaklanır veya bakteriyel, fungal, viral ya da hücresel olabilir. 31 Mikroorganizmaların varlığı bazen uzun bir dönem anlaşılamayabilir. Bu da deneysel sonuçları olumsuz yönde etkiler (27). Hücre kültüründeki kontaminasyon çoğunlukla numunedeki antibiyotiklerin varlığından dolayı fark edilemeyebilir. Antibiyotikler kontaminasyonu maskeleyebilir veya aldatıcı negatif sonuçlara neden olabilir (27). Antibiyotik kullanılmayan hücre kültürlerinde kontaminasyon oluşmuşsa, mikoorganizmalar tipik olarak hızlı bir şekilde büyür ve 18- 24 saat içerisinde koyu bir bulanıklık oluşturur. Medyumdaki antibiyotikler, duyarlı mikroorganizmaları öldürür ve dirençli olanlar seçilir. Pseudomonas ve küf gibi dirençli mikroorganizmalar hızlı bulanıklık oluşturabilirler. Yavaş büyüyen mikroorganizmalar rutin teste tabi tutulsalar bile belirlenemeyebilir. Mycoplazma, mikobakteri, anaerobik mikroorganizmalar, Haemophylus türleri, fastidiyoz difteroidler ve mayaların, antibiyotik içeren hücre kültürlerinden izole edildiği çalışmalar mevcuttur (5). 32 3. ECZACILIK FAKÜLTESİ ARAŞTIRMA LABORATUARINDA U937 MAKROFAJ HÜCRELERİNİN KÜLTÜRÜ 3.1. ÇALIŞMADA KULLANILAN TAMPON, SOLÜSYON VE BESİYERLERİ Phosphate Buffer Saline (PBS) Tamponu: Aşağıdaki formüle göre PBS hazırlandı: K2HPO4………………………………..1,20 gr Na2HPO4……………………………….0,22 gr NaCl……………………………………8,5 gr Distile su……………………………….1000 ml Hazırlanan PBS’nin pH’ı, pH metre cihazı (WTW 340, Almanya) ile pH 7,0’ ye ayarlandı. Daha sonra otoklavda (Hiroyama, Japonya) 121oC’de on beş dakika steril edildi. Fetal Bovine Serum (FBS): İnaktive edilmiş fetal bovine serum (Biological, İsrail) ticari olarak satın alındı. Biyolojik güvenlik kabininde (Nüve, Türkiye) 10 ml’lik steril falcon tüplere bölünerek kullanılıncaya kadar -20oC’de saklandı. 33 Penisilin Streptomisin Solüsyonu: Penisilin (10000 U/ ml) – streptomisin (10 mg/ ml) solüsyonu (Gibco, Almanya) ticari olarak satın alındı. Biyolojik güvenlik kabininde 2ml’lik streril eppendorf tüplere bölünerek kullanılıncaya kadar -20oC’de saklandı. Hücre dondurma Solüsyonu: FBS………………………………….....9 ml DMSO………………………………….1 ml Steril falcon tüpte karıştırıldı, 0,22 m’lik filtreden geçirilerek steril edildi. Hücre yıkama Solüsyonu: PBS……………………………………10 ml Penisilin- streptomisin …...………….300 l Steril falcon tüpte karıştırıldı, 0,22 m’lik filtreden geçirilerek steril edildi. RPMI-1640 Besiyeri: Hücre mediumu olarak kullanılacak RPMI-1640 besiyeri aşağıdaki şekilde hazırlandı: RPMI- 1640 ( 25mM HEPES ve L- Glutamin içeren).…88 ml İnaktif FBS ……………………………………………...10 ml Penisilin- streptomisin ……………………………...……2 ml Ticari olarak satın alınan RPMI- 1640 (Sigma, USA) besiyeri üzerine % 10 oranında inaktive edilmiş steril FBS ve % 2 oranında penisilin- streptomisin solüsyonu ilave edildi. Hazırlanan besiyeri miktarı 1 haftalık ihtiyaca göre ayarlandı ve kullanılıncaya kadar +4oC’de saklandı. 34 3.2. U-937 HÜCRESİNİN TEMİN EDİLMESİ VE ÜRETİLMESİ LGC Promochem’den elde edilen ATCC U-937 insan makrofaj hücresi ile çalışıldı. 3.2.1. Hücrelerin Çözdürülmesi Çözdürülecek hücreler için taze besiyeri ( %10 FBS, %2 penisilin-streptomisin ilaveli RPMI-1640) oda sıcaklığında hazır bulunduruldu. Su banyosu (Nüve, Türkiye) 37 oC’ye ayarlandı. Hücre -80oC soğutucudan (Operon, Kore) çıkarıldı, sıcaklığı 37 oC’ye ayarlı su banyosunda hızla çözdürüldü. Çözdürülen hücre çözeltisinden 1 ml, 9 ml taze besiyeri içine eklenip pipetaj yapıldı. 1500 devirde 5 dk santrifüj edildi. Süpernatan çekilip uzaklaştırıldı. Pellet üzerine 4 ml kadar taze besiyeri eklenip süspansiyon haline gelene kadar pipetaj yapıldı. Bu süspansiyondan 1’er ml, 9’ar ml taze besiyeri içeren hücre kültür flasklarına eklendi. Flasklar % 5 CO2’li inkübatöre (Sanyo, Japonya) 37oC ye kaldırıldı. 3.2.2. Hücrelerin Pasajlanması Hücreler düzenli olarak invert mikroskopta (Leica, Almanya) hücrenin morfolojisi ve sayısı yönünden incelendi. Hücrelerin durumuna göre ortalama 2 günlük aralıklarla pasajı yapıldı. %5 CO2’li inkübatörden çıkarılan hücre kültür flaskları biyolojik güvenlik kabinine alındı. Hücre kültür flasklarındaki medium pastör pipeti ile pipetaj yapılarak konik tabanlı santrifüj tüplerine aktarıldı. 1500 devirde 5 dk oda sıcaklığında santrifüj edildi. Süpernatan atılıp pellet hücre yıkama çözeltisi ile yıkandı. Tekrar santrifüj edildi. Pellet oda sıcaklığına getirilen, 4ml hücre mediumu ile süspanse edildi. Bu süspansiyondan 1’er ml; 9’ar ml taze besiyeri içeren hücre kültür flasklarına eklendi. 35 İnvert mikroskop ile hücreler kontrol edildi. Hücre kültür flaskları üzerine pasaj sayısı ve tarih yazılarak, 37oC’de %5 CO2’li inkübatöre kaldırıldı. (Şekil 3.3) 3.2.3. Hücrelerin Canlılık Kontrolü Her pasaj işleminde hücrelerin canlılığı trypan blue (Biological, İsrail) ile kontrol edildi. Lam üzerine 10l hücre süspansiyonu ve 10l trypan blue boyası koyularak karıştırıldı. Işık mikroskobunda (Leica, Almanya) x 40 büyütmede 100 hücre sayıldı. Boya almayan hücrelerin (canlı hücreler) yüzde oranı hesaplandı. (Şekil 3.4) 3.2.4. Hücrelerin Dondurulması Hücreler pasajlanırken, 4.-10. pasaj sayısı aralığında bazı hücrelerin pasajı devam ettirilirken, bir kısım hücre ileri çalışmalarda tekrar kullanılabilmesi amacıyla dondurularak saklandı. Hücre kültür flasklarındaki medium pastör pipeti ile pipetaj yapılarak konik tabanlı santrifüj tüplerine aktarıldı. 1500 devirde 5 dk oda sıcaklığında santrifüj edildi. Süpernatan atılıp pellet hücre yıkama çözeltisi ile yıkandı. Tekrar santrifüj edildi. Pellet, dondurma çözeltisinde süspanse edilerek son hacim yaklaşık 5 x 106- 2 x 107 hücre/ ml olacak şekilde ayarlandı. Eş zamanlı olarak trypan blue ile canlılık kontrolü yapıldı. Bu karışımdan 2’şer ml, -80oC’ye dayanıklı krio tüplerine aktarıldı. Krio tüpleri üzerine tarih, pasaj sayısı ve canlılık oranı not edildi. Dakikada 1oC soğutan izopropil alkollü özel kontainer içinde -80oC soğutucuya kaldırıldı. 36 3.2.5. Hücrelerin Sayımı Hücre sayımında thoma lamı kullanıldı. Thoma Lamı ile Hücre Sayımı Thoma lamının esası, 0,1 mm3 hacimde sayım yapılmasıdır. Thoma lamının yandan görünüşü şekil 3.1. de verilmiştir. Şekil 3.1. Thoma lamı yandan görünüş Şekilde görüldüğü gibi lamın çukur bir kısmı vardır. Kültür, bu kısım üzerine aktarılır, lamel kapatıldığında bu çukurda 0,1 mm yüksekliğinde bir sıvı kalır. Sayım yapılacak alan cam yüzeyindeki çizgilerle belirlenmiştir (Şekil 3.2.). Lamel konduktan sonra üzerine bastırılarak lamın çukuru dışında kalan düz kısmı ile lamel arasında bir sıvı katmanının kalması önlenir. Böylece çukur alan içinde tam olarak 0,1 mm yüksekliğinde sıvı bulunması sağlanmış olur. Thoma lamında 1 büyük kare 16 orta boy kare, her orta boy karede 25 küçük kare olmak üzere toplam 400 küçük kare vardır. Sayım bu karelerde yapılır. Şekil 3.1.’de bir küçük kare gösterilmiştir. Şekilde görüldüğü gibi, küçük kare olarak belirtilen gerçekte bir kare prizmadır. Derinlik boyutu, şekilde verilen çukurun derinliğini göstermekte olup, 1/10 = 0,1 mm dir. 1 küçük kare olarak belirtilen kare prizmanın hacmi = 0,05 mm x 0,05 mm x 0,1 mm = 0,00025 mm3 = 1/4.000 mm3'dür. Bir sayım alanında 16 x 25 = 400 küçük kare olduğundan toplam sayım hacmi = 0,00025 mm3 x 400 = 0,1 mm3'dür. (Şekil 3.5) 37 Şekil 3.2. Thoma lamı üstten görünüş Thoma lamında sayım sonucu A x SF x16 x 10.000 formülü ile hesaplanır. A : Bir orta boy karede sayılan hücre adedi SF : Seyreltme faktörü 16 : 16 adet orta boy kare olduğundan tüm kare sonucuna erişmek için kullanılan çarpan 10.000 : 0,1 mm3' deki sayım sonucunu 1 ml' deki sayıya dönüştürmek ve standart sonuç elde etmek için kullanılan bir değişmez. Şekil 3.3. U937 hücrelerinin ışık mikroskobunda görüntüsü Şekil 3.4. Trypan blue canlılık testi 38 Şekil 3.5. Thoma lamı ile hücre sayımı 39 4. HÜCRE KÜLTÜRÜ ÇALIŞMALARINA ÖRNEKLER Bal ve arkadaşları, kromazomal anomali riski yüksek 30 olguyu, doğum öncesi sitogenetik tanı endikasyonları çerçevesinde belirlemişler, fetal kromozomların ve kromozomal anomalilerin saptanması amacı ile amniyotik hücre kültürü yapmışlardır (28). Yapılan bir diğer çalışmada aloe emodin ve cisplatinin iki ve üç boyutlu hücre kültürü yöntemi kullanılarak sıçan glioma hücrelerinde, hücre çoğalması ve hücre siklusu sentez fazı üzerine etkileri araştırılmıştır (29). Bir diğer çalışmada ise 160 olgu üzerine yüksek riskli gebeliklerde 2. trimesterde genetik amniyosentez yapılmıştır. Annenin yaşının büyük olması, önceki gebelikte fetal- perinatal kayıp veya anomali öyküsü amniyosentez endikasyonlarının başında yer almıştır. Başarılı kültür oranı %93, prenatal tanı verebilme oranı %96 olarak belirlenmiştir. Amniyotik hücre kültürü yöntemi ile kromozom anomalisi saptanan altı olgudan biri Klinefelter sendromu (47,XXY), dördü dengeli translokasyon: 46,XX,t(13:15), 46,XX,t(4:10), 46,XY,t(2:15), 46,XX,t(6:7), sonuncusu ise poliploidi olarak tespit edilmiştir (30). Ceyhan ve arkadaşları, genç yetişkin sıçan kemik iliği stromal hücrelerinin kültüre edilebilirliği ve kültür hücrelerinin genel histomorfolojik ve osteoblastik formasyon yönünden değerlendirilmesini amaçlamışlardır. Sonuç olarak sıçan kemik iliği hücrelerinin kültürde üreme yüzdesi % 93.8 oranında yüksek bulunmuştur. Kültür flasklarında, zamanla birbirine yapışarak çoğalan farklı morfolojide stromal hücreler ve 40 aralarında pikrotionin ile boyanan çok nükleoluslu büyük çekirdekli osteoblastlara benzeyen hücreler saptanmıştır (31). Başka bir çalışmada ise tavşan modelinde in vitro fonksiyonel özafagus segmenti hazırlamaya yönelik olarak, fetus ve erişkin distal özofagus düz kas hücrelerinin morfolojik özellikleri ve büyüme kinetiklerinin hesaplanarak karşılaştırılması amaçlanmıştır. Erişkin ve fetus Yeni Zelanda tipi tavşanların özofaguslarının distal kısımındaki dokuların kas tabakası kültüre edilmiş ve üreyen hücreler anti-aktin ve antimiyozin antikorları ile immünositokimyasal boyama yapılarak tiplendirilmiştir. Bu çalışmanın bir sonucu olarak, farklı dokulardan elde edilen düz kas hücrelerinin kültür ortamında benzer üreme özellikleri gösterdikleri belirtilmiştir (32). Soysal ve arkadaşları, antioksidan etkileri bildirilmiş maddeler olan melatonin, karoten ve genotoksik bir madde olan Mitomisin C’ nin tek tek veya birlikte in vitro ortamda sağlıklı 11 bireyin periferik kan lenfosit kültüründe kardeş kromatid değişimi üzerindeki etkilerini araştırmışlardır (33). Homosisteinin, nitrik oksit sentezini, biyoyararlanımını ve yıkımını nasıl etkilediğini ortaya koymak amacı ile endotel hücre kültüründe endotelyal nitrik oksit sentaz ve dimetilarjinin dimetilaminohidrolaz gen ekspresyonları ile nitrik oksit düzeyleri, başka bir hücre kültürü çalışmasında araştırılmıştır. Çalışmanın sonucu olarak, homosisteinin nitrik oksit üzerine etkisinin endotelyal nitrik oksit sentaz ve dimetilarjinin dimetilaminohidrolaz gen ekspresyonları düzeyinde olmadığı bu nedenle özellikle substrat düzeyinde denetim mekanizmaları üzerine yoğunlaşılması gerektiği düşünülmüştür (34). Bir başka çalışmada 70 hayat kadını hücre kültürü ve enzim immünoassey (EIA) yöntemi ile genital herpes simpleks virüsü (HSV) enfeksiyonu açısından taranmıştır. Her iki yöntemin birlikte değerlendirilmesi sonucu İstanbul’ da hayat kadınlarında HSV 2 ile genital enfeksiyon prevelansı % 3 olarak saptanmıştır (35). Coronnello ve arkadaşları tarafından bazı organik altın bileşiklerinin A2780 insan kanser hücrelerine sitotoksik etkileri araştırıldığında test edilen bileşiklerin önemli antiproliferatif etkileri olduğu ortaya konmuş ve organik altın bileşiklerinin platin 41 bileşiklerinden daha fazla hücre döngüsünde değişikliklere sebep olduğu gösterilmiştir (36). Ray ve arkadaşları K562 insan lösemik hücre soyunda tributylin halo benzoat içeren bazı farklı bileşiklerin sitotoksik etkilerini ve bu hücrelerde ekstraselüler kalsiyum iyon girişini incelemişler, K562 hücrelerinin düşük membran kolesterol içeriğine sahip olduğunu bulmuşlardır. Sonuç olarak Tributylin benzoatın K562 hücrelerine toksik etkisinden membran kolesterol içeriğinin sorumlu olduğunu belirtmişlerdir (37). 42 5. SONUÇ Hücre kültürü, hücrelerin belirli bir besiyerinde çoğaltılması olup, bugün birçok alanda uygulanabilirliğinden ve deney hayvanı kullanımını azaltması açısından büyük öneme sahiptir. Günümüzde hücre kültürü ile viral tanı, aşı, enzim, hormon ve monoklonal antikor üretimi, sitogenetik ve sitotoksik çalışmalar, enfeksiyon ve ilaç araştırmaları vb. yapılabilmektedir. Ayrıca somatik gen tedavisi, tümör aşıları, canlı aşıların greft amaçlı kullanılması, üç boyutlu dokuların oluşturulması konularında da gelecek vadetmektedir. Bu çalışma ile insan makrofaj hücreleri kullanılarak hücrelerin çoğaltılması, pasajlanması, dondurularak saklanması, canlılık kontrolü gibi hücre kültürünün temel aşamaları ile hücre kültür laboratuarının genel kuralları öğrenilmiştir. 43 KAYNAKLAR 1. Baysal K, Serhatlı M, Adıgüzel Z, ve ark. İleri moleküler hücre biyolojisi teknikleri eğitimi, TÜBİTAK MAM Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Enstitüsü, Kocaeli, 12-16 Mayıs 2008; 5-14. 2. Ovalı E, Uçar F. Hematolojide uygulamalı hücre teknikleri kurs kitabı. Trabzon, 2003; 217: 7-16 . 3. www.medicine.ankara.edu.tr/temel_tip/biyokimya/files/Hucre%20kulturu.doc Erişim tarihi: 2006. 4. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Isolating cells and growing them in culture, Walter P. (Eds.). Molecular Biology of the Cell, New York Garland Science, 2002; 32-50. 5. Fresney RI. Culture of animal cells: A manual of basic technique. John Wiley and Sons, New Jersey, 2005; 15-19. 6. Griffithd B. The Development of Animal Cell Product: History and Overview, ed. Glyn Stacey and John Davis, Medicines from Animal Cell Culture. John Wiley and Sons Ltd., England, 2007; 11-18. 7. Aydıntuğ YS, Mutlu İ. Hücre kültürü ve diş hekimliğindeki uygulamaları, GATA Sağlık Bilimleri Enstitüsü Diş Hekimliği Bilimleri Merkezi, Ankara, 2003; 2-22. 8. Alberts B, Bray D, Hopkin K, et al. Manipulating genes and cells, Essential cell biology. GS Garland Science, Taylor & Francis Group, New York, 2004; 323327. 9. Stock - holm. Postgraduate Course- Airway epithelial cell culturing techniques: Opportunities and limitations. European respiratory society annual congress 2002. 10. Çiçek C, Bilgiç A. Klinik viroloji laboratuarında uzmanlık öğrencisine verilen hücre kültürü eğitim programı. İnfeksiyon Dergisi 2006; 20 (3): 231-241. 11. Çetinkaya G, Taş A, Arat S. Primer hücre kültütü uygulamalı kursu. TÜBİTAK MAM Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Enstitüsü, 23-24 Ocak 2008; 3-8. 12. Hardingham TE, Kielty CM, Canfield AE, et al. Cell Culture in Tissue Engineering. Stacey G, Davis J, Medicines from Animal Cell Culture. John Wiley and Sons Ltd, England, 2007; 113-125. 13. Hynes RO, Bye JM. Density and cell cycle dependence of cell surface proteins in hamster fibroblast. Cell 3, 1974: 112- 120. 44 14. Oktar N. K562 Hücre dizisinde fosfin bileşiklerinin sitotoksik ekisinin MTT ile araştırılması.Yüksek Lisans Tezi, Çukurova Üniversitesi, Adana, 2009; 20-25. 15. Başaran N. Tıbbi genetik ders kitabı. (7. Baskı), Güneş & Nobel Tıp Kitabevi, Bursa, 1999; 186-187. 16. Hirst SJ, Airway smooth muscle cell culture: application to studies of airway wall remodelling and phenotype plasticity in asthma. Eur Respir J 1996; 9: 808820. 17. Sakkas D, Jaquenoud N, Leppens G, et al. Comparison or results after in vitro fertilized human embriyos are cultured in routine medium in coculture on vero cells: A randomized study. Fertil Steril, 1994:61: 521-525. 18. Tucker JM, Kort HI, Toledo AA, et al. Effect of coculture on subsequent survival and implantation of cryopreserved human embryos.J Assist Reprod Gen 1995:12: 689-692. 19. Menezo Y,Guerin JF, Czyba JC. İmprovement of human early embryo development in vitro by coculture on monolayers of Vero cells. Bio Reprod. 1990:42: 301-306. 20. Doyle A. Griffiths JB. Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. John Wiley&Sons. 1998; 57-64. 21. Freshney RI. Culture of Animal Cells; A Manual of Basic Techniques. WileyLiss. New York ,1994; 486. 22. Fısher D, Franscıs GE, Rıckwood D. Cell Seperation A practical apprıoach, Oxford University Pres.1998; 259: 21-27. 23. McGahon AJ. Martin SJ, Bissonnette RP, et al. Green DR: The end of the (cell) line: methods for the study of apoptosis in vitro. In: Schwartz LM, Osborne BA (eds), Methods in Cell Biology, Cell Death. Academic Press. San Diego, 1995; 46: 150-181. 24. Yaka E, Eğilmez MY, Keskinoğlu P, ve ark. Alzheimer hastalığında beyin omurilik sıvısında (BOS) biyolojik belirteçler ve BOS’ un PC12 hücre hattı canlılığı üzerine in vitro etkisinin değerlendirilmesi, Turkish Journal of Geriatrics 2006; 9 (1): 1-7. 25. Mosman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and cytotoxicty assays. Journal of immunological Methods, 1983; 65: 55-63. 26. Karaaslan A, Özsan M. Hücre kültürlerinde mycoplasma kontaminasyonu, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Mecmuası. 1998; 3; (51); 169- 172. 45 27. McGarrity GJ. Detection of contamination. In: Jakoby WB, Pastan IH (eds), Cell Culture. Acedemic Press, Inc.-New York-1979; 18-29. 28. Bal F, Oğur G, Yıldız A, ve ark. Kromozomal anomali riski taşıyan gebeliklerde amniyotik hücre kültürü ile fetal kromozomlarım incelenmesi. T Klin Jinakol Obst 1995; 5. 29. Gazi C, Tapul L, C6 sıçan glioma hücreleri üzerine aloe emodin ve cisplatinin etkilerinin iki ve üç boyutlu hücre kültür modellerinde incelenmesi. İstanbul Tıp Fakültesi Dergisi 2006; 69:110-116. 30. Yayla M, Bayhan G, Yalınkaya A, ve ark. Yüksek Riskli Gebeliklerde 2. Trimester Genetik Amniyosentez: 165 Olgunun Klinik Değerlendirmesi. Perinatoloji Dergisi 1999; 7: 40-46. 31. Ceyhan T, Bilir A, Karaca Ç, ve ark. Sıçan kemik iliği stromal hücrelerinin kültüre edilebilirliği ve osteoblastik formasyonun değerlendirilmesi. Acta Orthop Traumatol Turc 2006; 40 (1): 67-71. 32. Korkmaz M, Yakut T, Güvenç BH, ve ark. Fetal ve Erişkin Tavşan Özofagus Düz Kas Hücrelerinin Morfolojik Özelliklerinin ve Büyüme Kinetiklerinin Karşılaştırılması. Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 2004; 30 (1): 27-30. 33. Soysal Y, Şahin Fİ, Menevşe S. Melatonin, karoten, Mitomisin C’ nin kardeş kromatid değişimine etkisi. S.D.Ü. Tıp Fak. Derg. 2008: 15 (3); 23-29. 34. Akkiprik M, Çevik D, Özer A, ve ark. Homosisteinin insan göbek kordon ven endotel hücre kültüründe eNOS ve DDAH gen ekspresyonlari üzerine etkisi. Marmara Medical Journal 2007; 20 (3); 144-149. 35. Yılmaz G, Bozkaya E, Türkoğlu S, ve ark. Hayat kadınlarında genital Herpes Simpleks virüsü enfeksiyonu prevelansının hücre kültürü ve enzim immünoessey yöntemleri ile saptanması. Klinik dergisi 1991; 2 (4); 72-73. 36. Giovagnini L, Ronconi L, Aldinucci D, et al. Synthesis, characterization, and comparative in vitro cytotoxicity studies of Platinum(II), Palladium(II), and Gold(III) Methylsarcosinedithiocarbamate Complexes. J. Med. Chem, 2005; 48: 1588-1595. 37. Ala S, El Aziz A. Macromolecules Containing Metal and Metal-Like Elements. Wiley Interscience 2004; 218 (3): 63-64. 46 ÖZGEÇMİŞ Mehmet Kaan TİRYAKİ 02.05.1987’ de Kırşehir’ de doğdu. İlk ve orta öğrenimini sırasıyla Aşıkpaşa İlköğretim Okulu, Cacabey İlköğretim Okulu ve Hacı Fatma Erdemir Anadolu Lisesi’nde tamamladı. 2005-2010 yılları arasında Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesi’nde lisans eğitimini aldı.
