hücre kültürü

16.04.2008
GÜVENLİ VE ETKİN
LABORATUVAR UYGULAMALARI
111-546
HÜCRE KÜLTÜRÜ
Doç. Dr. Hilâl Özdağ
FİZİKİ ALTYAPI
•
•
•
•
•
•
•
Ayrı bir oda
ClassII Biyogüvenlik Kabini
Soğutmalı santrifüj
Ters mikroskop
Pipet seti
Pipet yardımcısı
Tezgah altı buzdolabı ve derin dondurucu
1
16.04.2008
KÜLTÜR TİPLERİ
• Hücrelerin kökeni: Fetal veya erişkin hayvan dokusu;
Tümör dokusu; Primer hücre hattı …..
• Büyütülme usulleri: Süspansiyon; adherent; ankoraj
bağımlı veya bağımsız…
KÜLTÜR TİPLERİ
Orijin
• Primer hücre kültürleri hayvan veya bitki dokusundan izole edilip
kültüre alınan hücrelerden oluşur.
• Devam hücre kültürleri daha hızlı bölünen, tümörijenitesi daha
yüksektir.
• Transforme hücreler normal hücreden kanser hücrelerinin birçok
özelliğini taşıyan hale geçen hücrelerdir.
–
–
–
–
Yüksek yoğunlukta ürerler
Büyüme faktörü ve seruma daha az ihtiyaç duyarlar.
Daha ziyade ankoraj bağımsızdırlar.
Sonsuz bölünme kapasiteleri mevcuttur.
2
16.04.2008
KÜLTÜR TİPLERİ
Büyüme Tipi
• Süspanse hücreler besiyerinde asılı olarak büyürler. Kültür
edildikleri kaba bağlanmadan yaşayıp çoğalma özelliğine
sahiptirler. Kan, dalak, kemik iliğinden alınan hücreler genelde
süspanse olarak büyürler.
• Yapışık hücreler tek kat halinde kültür kabına bağlanarak büyürler.
Ektodermal veya endodermal embriyonik hücre katmanları
genellikle bu şekilde büyür. Buna fibroblastlar ve epitelyal hücreler
dahildir.
KÜLTÜR TİPLERİ
Büyüme Tipi
• Ankoraj bağımlı hücreler hücre çoğalması için bir yüzeye ihtiyaç
duyar.
• Ankoraj bağımsız hücreler kültür kabının yüzeyine zayıf olarak
tutunmuşlardır. Büyüme için yüzeye ihtiyaç duymazlar.
3
16.04.2008
HÜCRELERİN GÖZLEMLENMESİ
• Besiyerinin rengi: Besiyerlerinin çoğunda pH indikatörü bulunur.
Sarı ise asidite, mor gibi ise alkaliliği işaret eder. Besiyerinin çok
bazik veya asidik olması kontaminasyonu, fazla üremiş kültürü,
ölmüş kültürü, veya hatalı C02 ölçüm veya verimini işaret eder.
• Besiyerinde bulutsu görüntü kontaminasyonu veya fazla üremiş
kültürü işaret eder.
• Süspanse bir kültürde topaklanmış hücreler ile yapışık kültürde
soyulmuş hücreler bir problemi işaret eder.
HÜCRELERİN GÖZLEMLENMESİ
• Flasktaki hücrelerinizi kabin içine almadan 40X objektif altında
ters mikroskopta incelemeyi rutin haline getirin.
– Yapışık hücreler: yüzeyde düzenlice yerleşmiş olurlar. Her tip hücrenin
kendine göre bir şekli vardır (yuvarlak, üçgenimsi, karemsi, uzamış).
– Süspanse hücreler: Küre şeklindedirler. Bazı hücreler flaskın yüzeyine
hafifçe tutunmuş olabilir.
4
16.04.2008
HÜCRELERİN ELDE EDİLİŞİ
• Primer hücre hatları veya kan hücreleri ile çalışan bir
laboratuvarda çalışıyorsanız mutlaka Hepatit B aşısı
yaptırmalısınız.
HÜCRELERİN ELDE EDİLİŞİ
Primer Hücreler
• Primer hücrelerin zor ve zahmetlidir. Bir hayvanın öldürülüp
dissekte edildikten sonra hücrelerin izole edilip kültüre alınmasını
gerektirir. Birçok hücre tipinin primer kültüründe hücre sayısı azdır
ve hücrelerin ömrü kısadır. Ancak “gerçek” hücreye en yakın
model primer hücrelerdir. Primer hücreleri kendiniz üretmeye
kalkışmadan önce:
– Kendi labınızda veya bölümünüzde bu hücrelerle çalıştığını bildiğiniz bir
meslektaşınızdan rica edebilirsiniz. Hücrelerin hazırlanmasına yardımcı
olabilirsiniz. Bu hücrelerin hazırlanması çok zahmetli olduğu için talebiniz
reddedilirse şaşırmayın.
– Başka bir labdan isteyebilirsiniz ancak bu genellikle ortak çalışma
protokolünü beraberinde getireceği için böyle bir yola girmeden önce
patronunuzla konuşun.
5
16.04.2008
HÜCRELERİN ELDE EDİLİŞİ
Primer Hücreler
• Primer hücreleri bir başka araştırıcı veya labdan alıyor olsanız da
hücrelerin elde ediliş prosedürünü en az bir kez izleyin. Bir gün
hücreleri kendiniz hazırlamanız gerektiğinde hazırlıklı olmuş
olursunuz. Ayrıca verilen emeğe saygı gösterdiğinizi de ifade etmiş
olursunuz.
• Hastane ve tıp fakülteleri bazı insan doku ve hücrelerini elde
etmek için iyi bir kaynaktırlar.
HÜCRELERİN ELDE EDİLİŞİ
Devamlı Hücreler
• Eğer bir hücre hattı iyi ve hızlı bölünüyorsa hücrelerin eldesi
kolaydır ancak bölünmesi problemli ise primer hücre hatlarında
olduğu gibi zorluklarla karşılaşılır.
• Unutmayın ki devam hücre hatları sürekli kültür edilmeleri nedeni
ile fenotipik kayma yaşarlar. Bu nedenle aynı hücre hattı iki farklı
labda farklı karakteristikler gösteriyor olabilir.
• Labdaki diğer araştırmacılarla aynı hücre hattını kullanıyorsanız bir
çalışma arkadaşınızdan bir tüp donmuş hücre isteyebilirsiniz.
Donmuş hücreleri yeni split olmuş hücreye tercih edin zira pasaj
sayısı daha az olacaktır.
6
16.04.2008
HÜCRELERİN ELDE EDİLİŞİ
Devamlı Hücreler
• Devamlı hücre hatlarını “The European Collection of Cell Cultures
(ECACC)“ veya “American Type Culture Collection (ATCC)”den satın
alabilirsiniz. Bu kaynaklar insan ve hayvan hücrelerinin yanısıra
mikroorganizma, virus, DNA probları sağlayan özel kuruluşlardır.
Kültürlerin yaşar durumda ve kontaminasyonsuz olmaları
garantilidir. Aksi durumda hücreler yenileri ile ücretsiz olarak
değiştirilmektedir.
• Çalışacağınız hücreleri elde etme arayışında bu hücrelerle yapılmış
en iyi yayınların materyel-metod kısımlarını inceleyin. Buradaki
pasaj sayısı, besiyeri benzeri ayrıntılara dikkat edin.
Dondurulmuş Hücrelerin
Kültüre Edilmesi
• Ökaryotik hücreler serumlu besiyeri ve dondurucu ajan (DMSO)
varlığında dondurulup sıvı nitrojende (-196oC) saklanır.
• Dondurulmuş hücreler kuru buzda transfer edilir.
• Dondurulmuş hücrelerin hızlıca çözülüp derhal kültüre edilmesi
hücrelerin hayatiyetlerinin sağlanması için esastır
7
16.04.2008
Hücrelerin Bakımı
Rutin
• Beslenmeli: Taze besiyeri ile
• Split Edilmeli (bölünmeli): Kültür flaskı kapasitesi doldukça
hücreler split edilmeli.
• Dondurulmalı: Hücreleri depolamak şarttır. Üretilen hücrelerin bir
kısmı sıvı nitrojende dondurulmalıdır.
Hücrelerin Bakımı
Rutin
8
16.04.2008
Hücrelerin Bakımı
Besleme ve Pasaj
• Hücreler ne kadar hızlı büyüyorlarsa o kadar sık beslenip
bölünmeleri gerekir.
• Bir hücre aldığınızda ilk öğrenmeniz gerekenler:
–
–
–
–
–
Antibiyotik kullanılmış mı?
Hangi antibiyotik kullanılmış?
Hangi besiyeri tercih edilmiş?
Hücrelerin seruma ihtiyacı var mı?
Hücreleri ne kadar sıklıkla besleyip split etmem gerekecek?
Hücrelerin Bakımı
Antibiyotik
• Antibiyotik kullanımı birçok lab için standart uygulama olmakla
beraber eğer layıkıyla aseptik teknikler uygulanıyorsa antibiyotiğe
çok da ihtiyaç olmaz.
• Değerli veya kontaminasyona hassas hücrelerde tedbirli olup
antibiyotiği ihmal etmemekte fayda vardır.
• Antibiyotikler toz halinde steril şişelerde gelir. Steril su ile
sulandırılırlar. Filtre sterilizasyona gerek yoktur.
9
16.04.2008
Hücrelerin Bakımı
Kültür Kapları
• Flask veya petri kapları kullanılır.
• Tek kullanımlık, polistrenden mamuldur ve radyasyon ile sterilize
edilmiştir.
• Yapışık hücreler için işlem görmüş plastik malzeme tercih
edilmelidir (Polistren yüzey amino grupları ile kaplanmış olabilir).
• Plate’ler ise non-spesifik bağlanarak pozitif yüzey oluşturan bir
protein ile (poly-D-lysine) kaplanmış olabilir.
• Kültür kapları laboratuvar şartlarında da işlem görebilir.
Hücrelerin Bakımı
Besiyeri
• Hazır olarak satın alınır.
• Raf ömrü dolmuş olan besiyerlerini hücre yıkamada kullanmak
mümkündür.
• Besiyerleri birbirlerine benzer görüntü olarak. Genellikle pH
indikatörü olarak hepsinde fenol kırmızısı bulunur.
• Alacağınız besiyerinin mikoplazma kontaminasyonuna karşı
garantili olmasına dikkat edin.
10
16.04.2008
Hücrelerin Bakımı
Besiyeri
• Fenol Kırmızısı
–
–
–
–
–
–
–
Limon sarısı < pH 6.5
Sarı
pH 6.5
Turuncu
pH 7.0
Kırmızı
pH 7.4
Pembe
pH 7.6
Mor
pH 7.8
Birçok hücre pH 7.4’te optimum üreme gösterir.
• Sarımsı asidik besiyeri:
– Fazla üremiş kültürü
– Bakteri kontaminasyonunu
– Fazla CO2’i işaret ediyor olabilir.
•
Morumsu bazik besiyeri:
–
–
–
Ürememiş kültürü
Küf kontaminasyonunu
Az CO2’i işaret ediyor olabilir.
Hücrelerin Bakımı
Besiyeri
• Besiyeri kullanılmadan önce 37oC’ye ısıtılmalıdır. Su banyosunun
içinde (yaklaşık 10 dak). Besiyerinin içindeki bazı bileşenler
(antibiyotik) uzun süre sıcakta beklemeye dayanıklı değildir.
11
16.04.2008
Hücrelerin Bakımı
Serum
• Serum pahalıdır. Her zaman bölünüp dondurularak saklanmalıdır.
Besiyerine kullanmadan önce eklenir. Erimiş parçalar tekrar
dondurulmadan buzdolabında birkaç hafta saklanabilir.
• Bilinmesi gerekenler:
– Serumun yüzdesi: %5-20
– Serumun tipi: Standart olan dana serumudur. Fetal dana serumu da tercih
eden hücreler mevcuttur.
– Isı ile inaktive edilmiş mi: Gerekiyorsa kendiniz donmuş serumu erittikten
sonra 65oC’de 30 dak tutup parçalara ayırıp tekrar dondurarak prosedürü
tamamlayabilirsiniz.
– Serumu nereden almalısınız: Üretimden üretime fark gösterebilen bir
bileşendir. Ucuza kaçmamalısınız.
Hücrelerin Bakımı
Hücrelerin Ayrılması (split)
•
•
•
•
•
Hücrelerin üreme hızına bağlıdır.
Genellikle haftada iki kez yetecektir.
Hücreleri ayırmak için çok beklemek (fazla üremiş kültür)
Yeteri kadar ürememiş hücreleri ayırmak
Taze besiyeri yerine eski besiyeri kullanarak hücreleri ayırmak sık
yapılan hatalar arasındadır.
• Hücreleri split ederken flask/petri yüzeyinden ayırmak gerekir
bunun için ekstraselüler matriksi degrade eden Tripsin ve bu
bağlanmada esas teşkil eden Ca2+’yı bloke eden EDTA
kullanılmaktadır.
12
16.04.2008
Hücrelerin Bakımı
Hücrelerin Dondurulması
• Hücreleri dondurmadan önce
– ATCC kataloğundan kullandığınız hücrenin dondurulma protokolünü kontrol edin.
– Laboratuvarda uygulanan prosedürü arkadaşlarınızdan öğrenin. Olası modifikasyonları ATCC
protokolü ile karşılaştırarak tespit edin.
– Eğer yeni bir hücre hattı ise hattı geliştiren lab ile irtibata geçin veya literatüre bakın.
–Hücreler kryotüplerde dondurulup sıvı nitrojen tanklarında saklanır. Saklama için kullanılan sıvı
nitrojen tanklarının raklı sistemde olması gerekir. Tüpler bu tanklara kataloglanarak yerleştirilmelidir.
–Nitrojen tanklardaki sıvı nitrojen tankın özelliğine bağlı bir hızda buharlaşır. Periyodik olarak nitrojen
seviyesinin kontrolü ve tamamlanması gerekmektedir.
–Sıvı nitrojen tankları ile çalışılırken mutlaka kryoeldivenler giyilmeli ve koruyucu gözlük takılmalıdır.
–Sıvı nitrojen buharı solunmamalıdır. Elinizle oluşan buharı dağıtmamaya gayret edin.
Hücrelerin Bakımı
Kontaminasyon
• Kontaminasyon bakteri, küf, mantar, mikoplazma veya başka hücre
kültürlerinden kaynaklı olabilir.
• Makroskopik olarak
– Bulutsu görünüm
– Besiyerinin renk değişimi
– Koku: Flask kapağı açılıp koklanmaz şüphesiz ancak ilerlemiş kontaminasyon
inkübatörün kapısı açılır açılmaz kendisini hissettirecektir.
• Mikroskopik olarak
– Diğer organizmaların varlığı bakteri veya küf gibi kendisini hemen
gösterecektir.
– Hasar görmüş hücreler mikroskop altında kolayca gözlenir.
13
16.04.2008
Hücrelerin Bakımı
Mikoplazma Kontaminasyonu
• Mikoplazmalar 0.3um büyüklüğünde çok küçük organizmalardır.
Çoğunlukla ters mikroskopta gözlenmezler. Hücre duvarları yoktur
ve bu nedenle antibiyotikten etkilenmezler. Özel boyama yolları ve
tekniklerle varlıkları tespit edilebilir. Enfeksiyon ağır ise hücre
hasarı da enfeksiyonun varlığını gösterecektir.
• Mikoplazma kontaminasyonunu engellemek için kullanılan
besiyeri ve serumların mikoplazmasız olması gerekir. Garantili
ürün kullanın. Başka bir araştırmacıdan hücre aldığınızda
mikoplazma testi yapılıp yapılmadığını sorun, en iyisi siz kendiniz
bu testi yapın.
Hücrelerin Bakımı
Mikoplazma Kontaminasyonu
• Mikoplazma kontaminasyonun varlığı bir hücre yüzey proteinine
karşı onca uğraşıya rağmen neden antikor üretilememiş olmasının
nedeni olabilir.
• Mikoplazma testi için
– Floresan boyama
– PCR
• Eğer kontaminasyon varsa
– İlgili hücreyi atın
– Mikoplazma hücrenin biyolojisini bozar. Deneylerinizi ve sonuçlarınızı
anlamsız kılar.
– Bir karantina hücre kültürü odanızın olması ve test edilmemiş hücreleri
yalnızca burada açmanız mikoplazma kontaminasyonunun hücrelerinize
yayılmasını engelleyecektir.
14
16.04.2008
Hücrelerin Bakımı
Hücreden hücreye kontaminasyon
• Hücrelerinizi güvenilir kaynaktan alın.
• Aynı anda birden fazla hücre tipi ile çalışmayın.
• Asla aynı pipeti farklı hücreler için kullanmayın.
• Hücreye kullandığınız bir pipetle asla besiyeri şişesine girmeyin.
Hücrelerin Bakımı
CO2 İnkübatörleri
• İnkübatör içindeki tepsiyi steril distile su ile doldurmayı unutmayın
ve her hafta bu suyu tazeleyin.
• Her hafta rafları %70 EtOH ile silip her ay otoklavlayın.
• İnkübatör kapısını uzun süre açık bırakmayın.
• CO2 okumasının doğruluğunu zaman zaman kontrol ettirin.
• Isı takibi için ayrıca bir termometreyi inkübatör içinde bulundurun.
15