12.12.2014 Dr. Selcen Çelik HÜCRE KÜLTÜR TEKNİĞİ SORU

1
HÜCRE BİYOLOJİSİ LABORATUARI DERSİ (2014-2015 GÜZ DÖNEMİ)
12.12.2014
Dr. Selcen Çelik
HÜCRE KÜLTÜR TEKNİĞİ
SORU: Kültür nedir? Hücre kültürü deyince ne anlıyorsunuz?
-
Hücre kültürü, canlı hücrelerin ait oldukları organizma dışında laboratuar ortamında
(in vitro) kültüre edilmesidir.
SORU: Peki neden kültür edelim?
-
Bu derste şimdiye kadar yaptığımız nükleik asit ve protein izolasyonları, mikroskobik
inceleme gibi birçok deneysel araştırmanın kaynağı olan biyolojik materyali sağlar.
Hücre kültürü ilk kez 1907 yılında kurbağa sinir hücrelerinin incelenmesinde kullanılmıştır.
Daha sonra tavuk kalp hücrelerinde denenmiştir. Bu uygulamaların yaygınlık kazanmasıyla
birçok canlı ve hücre için başarıyla geliştirilen hücre kültürleri, 1940’larda viroloji (virüs bilimi)
çalışmaları için de kullanılmaya başlanmıştır. Böylece araştırıcılar viral bir hastalık olan
çocuk felcine karşı aşı geliştirerek 1954 yılında Nobel Tıp Ödülüne layık görülmüşlerdir. 1943
yılında ise ilk kez fare hücre serisi oluşturulmuştur. İnsan kanser hücreleri ise ilk kez 1951
yılında servikal karsinomalı (rahim kanalı kanserli) bir hastadan alınarak hücre kültürü
ortamında çoğaltılmış ve “HeLa hücre serisi” olarak adlandırılmıştır (Henrietta Lacks).
Hücrelerin ait olduğu hasta 1951 yılında ölmesine rağmen, hastaya ait olan bu hücrelerinin
ölümsüz olduğu tespit edilmişti. Elde edilen bu HeLa hücre serisi günümüzde hala kanser
çalışmaları için sıklıkla tercih edilen ve yaygınlıkla kullanılan kültürü yapılmış en eski insan
hücreleridir. Birbirinden bağımsız olan çeşitli araştırma grupları, aynı hücreleri kullanarak
elde ettikleri RNA, DNA ve protein moleküllerini analiz ederek farklı ve yeni hipotezler
üzerinde çalışabilirler.
SORU: O halde hücre kültürünün amacı için ne diyebiliriz?
-
Hücre kültürü virüslerin incelenmesi, aşı geliştirilmesi, organ (doku) yenilenme, gen
tedavilerinin geliştirilmesi, kanserlere karşı ilaç geliştirme ve aklınıza gelebilecek her
türlü canlı ve ona ait biyokimyasal moleküllerin incelenmesi için kullanılır.
SORU: Peki hücre kültür ortamı nasıl olmalı?
-
Hücrelerin canlı ortamı dışında ama o ortamdaymış gibi yaşayabilmesi için, doğal
yaşam şartlarının sağlanması gerekir. Bu şartlar her canlı tipi için değişkenlik
gösterebilir. Örneğin, böcek hücreleri 28ºC’de yaşarken, memeli hücreleri 37ºC’de
2
yaşamaktadır. Kültürde ayrıca hücrelerin besinlerini karşılayacak bir ortam olmalıdır.
Bunun dışında oksijen ve gerekli ise karbondioksit (memelide %5 karbondioksit
gerekli) de sağlanabilmelidir. Hücre kültür ortamı besinlerin yanı sıra hücrenin
büyümesi için gerekli büyüme faktörlerini de içermelidir. O halde kültür besiyerinde;
o
Besinler (amino asitler, glikoz, vitaminler, tuzlar)
o
FBS (fetal bovine serum) (büyüme faktörleri)
o
Oksijen-karbondioksit olmalıdır ve
o
Besiyeri sıcaklığı ve pH’ı çalışılan hücrelerin ihtiyacına uygun olmalıdır.
o
Bunların yanında,

Penisilin, streptomisin antibiyotikleri

Fenol kırmızısı olabilmektedir.
Hücre kültür aşamaları:
1. Kültür medyası (besiyeri) hazırlama (filtre edilmeli ve kullanmadan önce
hücrenin ihtiyacına göre – örn 37ºC’de – ısıtılmalıdır)
2. Hücre kültürü oluşturma (Kültür flaskı-kabı- kullanarak)
3. Hücreleri büyütme (karbondioksitli inkübatörde büyürler, mikroskopla takip
edilir)
4. Pasajlama (subculture) ve çoğaltma (çoğalmış hücreler genellikle enzim –
tripsin–
kullanılarak kültür flasklarından ayrılır ve daha fazla sayıda yeni
flasklara konarak pasajlanır. Pasajlanan hücreler ya kullanılır ya da stoklanır)
5. Azot tankında saklama (Kullanılmayan veya daha sonra kullanılmak üzere 196ºC’de azot tankında saklanırlar. Bu saklama için DMSO (dimetilsülfoksit)
veya PVP (polivinil pirolidon) kullanılır. DMSO kristal formu oluşturarak
hücrelerin ölmeden yavaş yavaş donmasını sağlar.)
6. Dondurulan hücrelerin çözülmesi (tanktan çıkarılan tüpteki hücreler sıcak suda
40ºC’de çözüldükten sonra, üzerine hücre besiyeri eklenerek santrifüj edilir ve
böylece DMSO uzaklaştırılır. Üzerine taze, steril ve ısıtılmış besiyeri konarak 3
numaralı aşamadan devam edilir)
Şema çiz
Doku oluşumuna göre kültür çeşitleri
1. Organ kültürü: Organın tamamı veya bir kısmının kültür edilmesini ifade eder.
Bu çalışmalar bilhassa organ yetmezliklerinde umut ışığıdır. İdrar kesesi,
böbrek, karaciğer, hatta kulak ve atan kalp bile laboratuar ortamında
üretilebilmiştir.
3
2. Primer eksplant (doku) kültürü: Bir doku parçasının bir substrata bağlanarak
büyümesi ile oluşturulan kültürlerdir. Bir dereceye kadar histolojik karakter
gösterirler.
3. Hücre kültürü: Tek tip hücrelerden oluşturulan kültürlerdir. Histolojik
karakterleri yoktur, doku oluşturmazlar.
Hücrelerin tutunma ihtiyacına göre kültür çeşitleri
*** Yapışan hücre kültürü (örn bağ dokusu, fibroblast hücreleri): bulundukları
yüzeye
tutunma
bağımlılığı
olan
hücreler
kültür
edildikleri
flasklara
(yapışmalarını sağlayan yüzeye sahip) yapışarak tek tabaka (monolayer)
halinde büyürler. Pasajlama sırasında bir enzim veya mekanik kuvvet
yardımıyla yüzeyden koparılarak, besiyeri içinde santrifüj edilir ve yeni
flasklara aktarılır.
*** Süspanse hücre kültürü (kan hücreleri): tutunma bağımlılıkları olmadığı
için kültür flaskına yapışmadan büyürler. Pasajlama sırasında besiyeri içinde
santrifüj edilir ve yeni flasklara aktarılır.
Hücre kültürü oluşturma çeşitleri
1. Primer (ilk, öncü) kültür: Canlıdan alınarak direkt kültür edilen hücrelerin
oluşturduğu hücrelerdir.
2. Hücre soyu (strain): Primer kültürdeki hücrelerin pasajlanarak çoğaltılmasıyla
oluşan kültürlerdir. Belli bir çoğalma kapasiteleri vardır.
3. Hücre serisi (line): Hücre soyundaki hücrelerin transformasyona uğratılarak
(veya kendiliğinden) ölümsüz olma ve sınırsız çoğalma kapasitesine sahip
olmasıyla oluşan kültürlerdir (örneğin HeLa hücreleri). Çeşitli özelliklere sahip
hücre serilerini üreterek ticari olarak satan birçok firma vardır.
Hücre kültürünün avantajları
1. Ortamın kontrolü: Canlı hücrelerin fizikokimyasal (sıcaklık, pH, ozmotik basınç,
oksijen ve karbondioksit konsantrasyonu gibi) ve fizyolojik çevre şartları (büyüme
faktörleri ve besin konsantrasyonları gibi) araştırmacı tarafından kontrol altında
tutulabildiğinden denemeler daha güvenilir yapılabilir.
2. Model oluşturma: Canlının bir bütün olarak incelenmesi zor olduğundan ve yeni
ilaç vs denenmesi için direk canlıları kullanılamadığından, canlının bütününü deği
de hücrelerinin incelenmesi bütün organizma hakkında fikir verir.
4
3. Etik izine gerek olmaması: Hayvan ve insan deneyleri için direk canlının kendi
kullanılmadığı için etik kurul izini almaya gerek yoktur. Böylece çalışma daha hızlı
ilerleyebilir.
4. Ekonomi: Bütün bir organizmayla denenecek kimyasal vs nin miktarı hücrelerde
yapılacak denemeler için daha fazladır. Dolayısıyla hücre kültürü ekonomik olarak
avantaj sağlar.
5. Homojenite sağlama: Devam eden hücre kültüründe, aynı tip olan hücreler bir
sonra ki pasajlamada da birbirlerinin aynısı olduklarından homojenlik sağlarlar.
Böylece deneysel araştırmalarda önemli risk oluşturabilen parametre değişikliğine
sebep olmazlar.
Hücre kültürünün dezavantajları
1. Kontaminasyona hassasiyet
2. Donanımlı personel gerekliliği
3. Miktar: ürün anlamında çok fazla hücreye ihtiyaç olabilir.
4. Farklılaşma ve kararsızlık: uzun süreli, kontrolsüz veya kendiliğinden bazen
hücreler farklılaşabilmekte ya da çoğalma hızları her pasajda değişebilmektedir.
DENEY
-
Bombyx morie (ipek böceği) den elde edilmiş hücre kültürü (3 günlük) – mikroskopta
inceleme
-
Kirli besiyeri atılır.
-
Yerine 4 ml taze besiyeri konur.
-
Mekanik kuvvetle hücreler yapıştıkları yüzeyden koparılır.
-
0.5 ml hücre alınır ve yeni flaska konur.
-
3.5 ml besiyeri yeni flaska eklenir.
-
Eski flaskın hacmi de 0.5 ml ile 4 ml’e tamamlanır.
-
Böylece bir flasktan iki flask hücre kültürü yapılmış olur – mikroskopta inceleme.