SADE ve SAGE ve Gen Ekspresyonunun Seri Analizi

SADE ve SAGE
ve Gen Ekspresyonunun Seri
Analizi
Prof.Dr. Nermin GÖZÜKIRMIZI
Gen Anlatımının Belirlenmesi
•
•
•
•
DNA mikroçalışmaları
Makroçalışmaları
EST (Expressed sequence tag)
Gen anlatımının seri analizi (SAGE)
Gen anlatımının seri analizi (SAGE)
teknolojisi Velculescu tarafından 1995
yılında geliştirilmiştir.
SAGE, transkriptin miktarı ve çeşidi ile ilgili
detaylı ve hızlı bilgi vermektedir.
SAGE, mRNA saflaştırılması, cDNA
taglarının oluşturulması, izolasyonu ve PCR
ile çoğaltımı basamaklarından oluşmaktadır.
SAGE nin etkinliğini arttırmak için PCR
döngü sayısı arttırılarak elde edilen ürünün
miktarının arttırılması amaçlanmaktadır.
• SAGE yönteminin mikroadaptasyon formu
olan SADE tekniğinde ise az sayıdaki
(30.000 – 50.000) hücrede nicel gen
anlatımı belirlenebilmektedir.
• Her iki metod arasında az miktarda cDNA
elde edilmektedir. Bunun sebebi pekçok
faktör tarafından biotinalat DNA
bağlanımının değişmesidir. Bu faktörler,
serbest biotin ve fenolün varlığı, biotinilatlı
DNA parçasının uzunluğu, kompozisyonu
ve biotin molekülü ile oligo (dT) arasındaki
mesafedir.
• Bu metodlar büyük miktardaki biyolojik
materyallerin (1-5 mikro gram polyA mRNA)
analizini gerçekleştirebilecek şekilde
tasarlanmıştır. Bununla birlikte, memeli dokuları
özel fizyolojik fonksiyonları ve özel gen anlatımı
paternlerine sahip farklı hücre tiplerinden
oluşmaktadır. Bu da yüksek organizmada geniş
skaladaki anlatım bilgisinin yorumlanmasının
karmaşık hale geldiğini göstermektedir. Bu
sebepten dolayı belirlenmiş hücre popülasyonunun
analizi için daha uygun metotların çıkarılması
gerekmektedir.
SAGE Yapım Aşamaları
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Boncuklarla RNAs yakalanması
cDNA içinde RNA nın çevrilmesi
Bir kısımda iki tane tag bulunur
Di-tag ın PCR ile milyonlarca kopyası yapılır
Uzun bir concatamer içindeki modüller ve yapışkan Di-tag
birlikte uzaklaştırılır
Concatamerler bakteri içine konur ve milyonlarca kopyası
elde edilir.
En iyi konsatamerler bulunur ve dizilemesi yapılır
Kaç tane cDNA olduğunun belirlenmesi bilgisayar
ortamında yapılır ve sayılır
RNA dan elde edilen gen ile herbir tag ın dizisi eşleştirilir
Tags and Ditags from Sequencing Gel
SAGE Teknolojisinin Avantajları
• Bilinen genlerin önceki seçimi dışında
bütün transkriptlerin analizi (transcriptome).
• Bilinen ve bilinmeyen genlerin herikisi
içinde kantitatif veri sağlar.
• Deneysel bir uygulamanın (karsinojen,
hormon) sonucu olarak gen anlatımında
belirlenen değişiklikler için uygundur.
• Geniş olarak gen anlatım çalışmaları çeşitli
teknikler kullanılarak rutin olarak yapılmaktadır.
cDNA ve oligonükleotid array ler, Gen
Anlatımının Seri Analizini (SAGE) içeren
tekniklerdir. Birçok memeli dokusu markalı
hücresel heterojenite gösterir. Saflaştırılan hücre
popülasyonları ve anatomik olaral belirlenmiş
doku fragmentlerinin analizi ile uyumlu metodları
yapmak için oldukça tercih edilir. Bu amaçla
SADE teknolojisi geliştirilmiştir. SADE
SAGE Deneysel olarak 3 prensibe dayandırılmıştır.
• Transkriptin spesifitesini sağlayan ve yeterli
bilgiyi taşıyan yaklaşık 10 baz çifti uzunluğunda
tagların oluşturulması.
• Concatamer olarak adlandırılan, klonlanıp
dizilenebilen seri halindeki uzun molekülleri
oluşturmak üzere tag ların birbirlerine bağlanması
• Elde edilen transkript tag larının kantitatif analizi
ile gen anlatım profillerinin kurulması.
SAGE tekniği differantial display gibi diğer
farklılaşmış gen anlatım tekniklerinden çok daha
güçlü bir tekniktir. Parçalı dizi ve herbir mRNA
nın bolluğu hakkında kantitatif bilgi sağlanır.
Bu yaklaşım, yalnız herhangi bir zamanda
kanserli ve normal hücrede anlatım yapan bütün
transkriptlerin belirlenmesinde değil aynı zamanda
herbir transkriptin nisbi bolluğu ile ilgili de
kantitatif bilgi sağlar. Örnekler arasında
farklılıkların istatiksel analizini sağlar.
• SAGE nin bir dezavantajı nispeten kısa bir
zamanda yüzlerce örneğin karşılaştırılması için
uygun değildir. Ancak, bu yalnızca laboratuvar
çalışmalarında dizileme gücünün
sınırlandırmasıdır. Açık olarak, dizileme hızı
artarsa analiz edilebilir örnek sayısı da artar.
SAGE Kullanımının Teknik
Avantajları
• Özellikle düşük miktarda RNA ve küçük miktarlardaki
örneklerin kullanımı önemli bir avantajdır.
• SAGE mRNA popülasyonlarının istatistiksel olarak
açıklanmasını sağlar.
• SAGE metodunun değişik formları geliştirilmiştir . Bu
metodlar MicroSAGE, SAGE lite ve SAGE Adaptation
to Downsized Extracts (SADE) dir.
• SADE beyin transkriptomları ve fare böbreğinin
karakterizasyonu için yapılan çalışmalarda kullanılır.
Böbrek çalışmalarında spesifik mikro seviyesindeki
küçük parçalardaki nefron segmentlerinden anlatım
kütüphanelerinin gelişmesi mümkündür.
• Beyin bölgesi için spesifik olan moleküler
markerlar belirlenmiştir.
• SAGE kullanılarak spesifik hücre alt
popülasyonlarının analizi sağlanarak çeşitli
metodlarla (microdissection veya
immunopurification) purifiye edilen hücre
ekstraktlarından mRNA elde edilir.