Subtraktif Melezleme

Subtraktif Melezleme
-Farklı dağılım gösteren nükleik asitlerin (RNA/DNA)
belirlenmesinde kullanılan bir yöntemdir:
- Farklı anlatımı yapılan
- Farklı koşullarda bulunan
- İki veya daha fazla kaynakta farklı olarak
düzenlenen;
Farklı hücreler, farklı populasyonlar
veya hücre tipleri, farklı dokular, hastalık ve
gelişim süreçleri
• İlk kez Davis ve ark. tarafından 1984 yılında Tlenfositlere özgü transkriptlerin analizinde
geliştirilmiştir.
• TEMEL AŞAMALAR:
• Nükleik asit problarının hazırlanışı,
• Probların hibridizasyonu,
• Eşleşmeyen cDNA’ların klonlanması ve
subtraktif kitaplık oluşturulması,
• Kitaplığın taranması için prob hazırlanması
ve işaretlenmesi,
• Klonların analizi.
• Hedef koşul için ss-cDNA ya da ds-cDNA,
kontrol için poly A bağlı RNA, ss-cDNA ya da dscDNA kullanılabilir.
• Genellikle hedef koşul için ss-cDNA ve kontrol
için de poly A bağlı RNA kullanılır.
• Bu yöntem uygulanırken kullanılan prosedürler
hemen hemen aynıdır. Bazı durumlarda
subtraktif cDNA kitaplığı, cDNA lara adaptör
moleküllerin eklenmesi ve daha sonra bir
vektöre ligasyon ile gerçekleştirilir.
• Bir örnekte mevcut olan (=tester), fakat
diğerinde olmayan transkriptler (=driver)
araştırılır.
• Örneğin; driver hastalıklı hücrelerden
türevlensin, öyle ki bu tür hücrelerde anlatımı
yapılmayan genlerin tanımlanması yapılacaktır.
• İlk aşamada her iki örnekten de mRNA’lardan
cDNA kopyaları elde edilir.
• Driver’den elde edilen örnek biotin ile işaretlenir
• Biotinin streptavidine ilgisi yüksek olduğundan,
biotin içeren tüm moleküller kolaylıkla ayrılabilir.
• İkinci aşama, biotin işaretli driver cDNA ile tester
cDNA moleküllerinin karıştırılması, denatüre
edilmesi ve karışımdaki moleküllerin tekrar
birleştirilmesini içerir.
• Çıkarılan tester transkriptler daha sonra bir gen
kitaplığının taranmasında prob olarak
kullanılabilir.
• Yöntemin en önemli dezavantajı göreceli olarak
çok miktarlarda mRNA’ya ihtiyaç duyulmasıdır.
• Eşleşmeyen ss-cDNA’lar öncelikle ds-cDNA’ya
çevrilmelidir.
• ss-cDNA’lara primer bağlanması için 5’ ucuna terminal
deoksitransferaz enzimiyle bilinen bir dizi eklenir.
• ds-cDNA eldesi ve bunların çoğaltılması için de taq DNA
polimeraz kullanılır.
• ds-DNA’ları vektöre sokabilmek için çoğaltmada
kullanılan primerler aynı zamanda enzim kesim bölgeleri
içerir.
• Vektör olarak plazmidler ya da lambda tabanlı vektörler
kullanılır.