cDNA kitaplık - AVES - İstanbul Üniversitesi

cDNA Kitaplık Hazırlanışı
Uzm.Bio.Veysel Sabri HANÇER
İstanbul Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Doktora Programı
2602043040
Genetik Bilginin İki Kaynağı
Vardır;
 Genomik DNA
 mRNA
Ökaryotlardaki genomik DNA’yı ele
alıyorsak göz önünde bulundurmamız
gereken iki önemli nokta vardır
 İlgilenilen genin kodlayan bölgesi bir
yada fazla intron bölgesi ile kesilmiş
olabilir,böylece tüm kodlayan bölge çok
uzun olabilir.
 İzolasyon için hangi dokuyu
kullandığımızın bir önemi yoktur çünkü
genomik içerik tüm dokularda aynıdır.
Ökaryotlardaki mRNA ile
ilgileniyorsak bazı avantajların
farkında olmalıyız
 İntronlar kırpılacak ve mRNA
kesintisiz kodlama yapan bir bölge
içerecektir
 Proteinin doku spesifik ekspresyonu
bize yüksek seviyede mRNA
sağlayabilir (genin kopyalarından
çok daha fazla sayıda mRNA
molekülü vardır).
Kitaplıklar
Bir kitaplık genetik bilginin
uygun depo mekanizmasıdır
 Genomik veya cDNA, her iki
şekildede bilgi vericidirler
 Polipeptit bilgiden sonuç
çıkarılmış genetik diziler bir
kitaplık dahilinde spesifik
genetik bilgi tanımlanmasında
kullanılabilirler.
cDNA Kitaplık Yapımı
Geri transkripsiyon
mekanizması ile mRNA’nın
içerdiği genetik bilgi tekrar çift
zincirli DNA formuna çevrilebilir.
Bu işlemden sorumlu enzim,bir
RNA bağımlı DNA polimeraz olan
reverse transcriptase’dır.
 Ticari olarak satılan RNA
polimerazların en uygunlarından biri
Moloney Murine Leukemia Virus
(MMLV)’dür.Bu RNA bağımlı DNA
polimeraz RNA yı kalıp alarak 5’-3’
doğrultuda nükleotit ekler.3’-5’
ekzonukleaz aktivitesi yoktur.
 Bir primere ihtiyacı vardır.
Uzatma yeteneği vardır ama
sentezleyemez. Bu yüzden mRNA’yı
kalıp olarak kullanacaktır.
 RNA’daki nick bölgeler RNaz H
enzim aktivitesi ile tanımlanabilir,
bu enzim 5’-3’ ve 3’-5’
ekzoribonukleaz aktivitesi gösterdiği
kadar endonukleolitik kesim
aktivitesini de gerçekleştirir.
Bu RNA parçaları E.coli Pol.I ile DNA sentezi
için primerler olarak rol alabilirler.
cDNA’nın Plazmide Eklenişi
Kullanışlı bir cDNA kitaplığı yapımını
tamamlamamız için cDNA’mızı korumak
ve üretmek için bir yola ihtiyacımız var:
Bunu cDNA’yı bir plazmide aktararak
yapabiliriz
Bunu başarmanın iki klasik yolu vardır;
• Homopolimerik kuyruk ekleme
• Bağlayıcı (Linker) ekleme
Homopolimerik Kuyruk Ekleme
Terminal transferaz sadece ökaryotik bir
hücre tipi prelimfositte bulunan ender bir
DNA polimerazdır.
Enzim, DNA’nın 3’ hidroksil ucuna dNTP
eklenişini katalizler. Bir pürin eklenecekse
Mg kullanılır, primidin eklenecekse Co
kullanılır.Reaksiyon şartlarına bağlı olarak
üç’ten binlerce baza kadar ekleme
yapılacaktır.
Bunu bir plazmide nasıl dahil edebiliriz ?
Plazmidimizi keser ve terminal transferaz
ile muamele edersek tamamlayıcı bazı
ekler, cDNA’yı plazmide bağlarız
C- kuyruklu cDNA’nın vektörde Gkuyruklu PstI bölgesine eklenişinin yararı
şu şekildedir;
1. PstI’in tanıma dizisi ve kesim bölgesi
5’ CTGCAG 3’
3’ GACGTC 5’
2. Bu bölgenin PstI ile kesimi G-kuyruğu eklenişi
ile devam eder
5’ CTGCA(G)G 3’
3’ G(G)ACGTC 5’
Böylece PstI tanıma kesim bölgesi tekrar yapılandırıldı ve Ckuyruklu cDNA eklenişi kitaplık vektöründen tekrar kesilebilir
Bağlayıcılar (Linkers)
• Bağlayıcılar tek veya tekrarlı
restriksiyon endonukleaz tanınma
dizileri içeren tipik palindromik olan
kısa oligonukleotitlerdir (18-24 mer)
Bağlayıcı Ekleniş Adımları
• cDNA’nın S1 nukleaz ile muamelesi (cDNA
dupleksinde kalması muhtemel 5’ şapka parçasını
çıkarmak için)
• Son kısımlar için Pol I muamelesi
• Eco RI metilaz ile muamele
• T4 DNA ligaz kullanarak Bağlayıcıları ekleyiş
• Eco RI kullanarak bağlayıcıları kesiş
• Agaroz jel elektroforezi ile cDNA parçalarından
linker parçalarını ayırım
• cDNA’yı vektör DNA parçasına bağlayış (Eco RI
ile açılmıştı)
cDNA Kitaplık Hazırlanışı
mRNA
5’
Geri transkripsiyon
5’
mRNA Geri
cDNA Trans.
hibrid 5’
5’
AAAAAAAAAAA3’
TTTTTTTTTTTT5’
AAAAAAAAAAA3’
TTTTTTTTTTTT5’
AAAAAAAAAAA3’
RNaz uygulamasından sonra cDNA
5’
RN
TTTTTTTTTTTT5’
az
DNA polimerazdan sonra çift zincirli cDNA
5’
5’
Bir vektöre yerleştirme
DNA
Pol
TTTTTTTTTTTT5’
AAAAAAAAAAA3’