Reverse Transkriptaz ile cDNA Üretimi

Reverse Transkriptaz ile
cDNA Üretimi
Arş. Gör. F. Necmiye KACI
Erzurum Teknik Üniversitesi
Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü
cDNA (complementary DNA)
cDNA tek veya çift zincirli olabilir.
mRNA kalıbından revers transkriptaz kullanılarak sentezlenir.
Bu proses, RT reaksiyonu ve tek zincirli cDNA sentezi olarak bilinir.
Eğer yapılan deney çift sarmallı cDNA gerektiriyorsa, bir başka DNA
sentez basamağı ile gerçekleştirilebilir.
Bu metodla, mRNA ekspresyon seviyeleri belirlenebilir ve
klonlanan cDNA sayesinde genlerin ekspresyonu kalitatif ve
kantitatif olarak daha ayrıntılı incelenebilir.
RT-PCR Tekniği
Sensitivitesi yüksek bir deteksiyon tekniğidir.
Düşük kopya sayısı içeren az miktarda RNA bu yöntem ile saptanabilir.
mRNA’yı cDNA‘ya çevirmenin amacı mRNA’yı, daha dayanıklı cDNA
sayesinde daha kolay ve ayrıntılı inceleyebilmektir.
İncelenen hücredeki genlerin ekspresyon seviyeleri belirlenebilir.
mRNA sekansları cDNA formunda klonlanabilir ve bir hücrede
eksprese edilen tüm genleri içeren cDNA arşivleri oluşturulabilir.
RT-PCR ile klonlanan cDNA sayesinde genlerin ekspresyonu RNA ve
protein seviyesinde daha ayrıntılı incelenebilir.
RT Reaksiyonu
Tek sarmallı RNA’nın
 Kalıp RNA
 Reverse transkriptaz enzimi
 Reverse transkriptaz buffer
 Primer
 dNTP‘ ler
 RNaz inhibitör
kullanılarak cDNA’ya transkripsiyonu
RT reaksiyonu için üç tip primer
kullanılabilir:
Oligo (dT) primerler,
Random (hexamer) primerler,
Gen spesifik primerler
Reverse transkriptaz enzimi:
Retrovirüslerden elde edilen,
 AMV (Avian Myeloblastosis Virus)
 MMLV ( Moloney Murine Leukemia Virus)’e ait reverse
transkriptaz enzimleri kullanılır.
cDNA Sentezi Reaksiyonu
•
•
•
•
•
•
•
Random hexamer primer (50-250 ng)
Reaksiyon buffer (5x)
Rnase inhibitör (40 units/µl)
dNTP mix (10 mM)
ddH2O
RNA (10 pg- 5 µg total RNA)
RT (200 units/µl)
• Total Rxn Hacmi
1 µl
4 µl
1 µl
2 µl
15 µl
1 µl
1 µl
25 µl
PCR Conditions
• 25°C
• 37°C
• 85°C
10 dk (Random primer kullanıldığı için)
120 dk
5 dk (Reaksiyon durdurulur)
• 4°C
∞