deney hayvanı çalışmalarında hücre kültürünün yeri
advertisement
DENEY HAYVANI ÇALIŞMALARINDA HÜCRE KÜLTÜRÜNÜN YERİ Dr. Zekiye Altun DEU Onkoloji Enstitüsü Temel Onkoloji AD Sunum Planı • Hücre kültürünün önemi • Hücre kültür tarihçesi • Hücre kültür ekipmanları • Primer HUVEC kültürü Hücre kültürünün önemi • Hücre kültürü çalışmaları ile yeni ajanların canlılar üzerinde denenebilecek test dozları hakkında ön bilgiler • Canlılarda gerçekleştirilmesi zor olan moleküler düzeyde ki mekanizma çalışmaları değişik hastalık modellerinin hücre kültürlerinde oluşturulması Hayvan kökenli hücre kültürleri • Sağlıklı normal hücre kültürleri • Kanser hücre kültürleri • Embriyonik Hücre kültürleri Hücre Kültürü Çalışmaları • 100 yıl öncesinde 1860’larda • Sydney Ringer’in Hücre Kültürü Çalışmaları Kalp dokusunun vücut dışında yaşamasını sağlayan tuz solusyonu olan Ringer Laktat üretimi : izole organperfüzyon sistemi Hücre Kültürü Çalışmaları • Roux: 1885 ⇒ SF içinde Embryonik tavuk hleri • İlk başarılı hücre kültürü: Ross Harrison – 1907: nöroblastları kurbağa lenf sıvısı içinde kültür • 1911: Lewis ⇒ İlk sıvı ortam : Deniz suyu, serum, embryo ekstraktı, tuzlar ve peptonlar ⇒Sınırlı tek tabaklı büyüme Hücre Kültürü Çalışmaları • 1913: Aseptik teknikler ile uzun süreli kültür ⇒Carrel • 1916: Rous ve Jones: Proteolitik enzim Tripsin ⇒ Adherent hler için • 1940: Kültür kontaminasyonlarının azaltılması⇒ AB ler Penicillin ve streptomycin • 1948: Sanford ⇒ Fare L-hlerinden ilk hücre suş klonu Hücre Kültürü Çalışmaları • 1913: Aseptik teknikler ile uzun süreli kültür ⇒Carrel • 1916: Rous ve Jones: Proteolitik enzim Tripsin ⇒adherent hler için • 1940: Kültür kontaminasyonlarının azaltılması⇒ AB ler Penicillin ve streptomycin • 1948: Sanford ⇒ fare L-hlerinden ilk hücre suş klonu • 1955: Gey ⇒İlk sürekli hücre hattı: HeLa ⇒Puck daha sonra klonladı Hücre kültüründe Terminoloji • Organ kültürü – İn vivo dokunun bazı/tüm özelliklerini gösteren 3 Boyutlu ayrıştırılmamış doku • Hücre kültürü – Tek hücreler- Doku olarak organize olamaz⇒Orijinal d.dan ayrıştırılan hlerden elde edilir. • Primer hücre kültürü – Hayvandan direkt olarak explant olarak elde edilir – Genelde belli zaman süresinde yaşar – Dokunun enzimatik ve mekanik ayrımı ile heterojen bir popülasyondan ilgi duyulan hücrenin seçim basamakları ile hücrelerin izole edilmesi Neden Hücre Kültürü? Gen manüplasyonu Kanser çalışmaları için memeli hücre kültür Genetik mühendislik: Protein, antikor, aşı üretimi Viroloji Doku kültürü ile yeni bitkilerin üretilmesi Neden Primer Hücre Kültürü? Çeşitli model Sistemler oluşturmak: Hler arası ve hücre içi etkileşimler Hastalık-ajan-hücre ilişkisinin anlaşılması İlaçların hlere etkisi Yaşlanma-besinsel ilişkiler Hücre biyolojisinin anlaşılması Neden Primer Hücre Kültürü? Çeşitli model Sistemler oluşturmak: İlaç geliştirme ve Toksisite değerlendirme Kanser araştırmaları: Kimyasallar, viruslar ve Radyoterapinin Normal hücre—Kanser hücre transformasyonu üzerindeki etkileri Hücre hatları- Primer doku özellikleri The Clinical Relevance of Cancer Cell Lines2012 NCI Neden Primer Hücre Kültürü? TAZE DOKUDAN Enzim yardımı ile hücreleri tek tek ayırma: Epitel, Fibroblast.. Sınırlı yaşam ömrü Hücre Hatlarında farklı olarak İmmortalize/transforme /bazı GF ler olmadan yaşayabilir DEĞİL Kültürü zor! Neden Primer Hücre Kültürü?Zorluklar Sterilite Taze doku gerektirmesi Pasaj sayısı sınırlı Hücrenin özellikleri hızlı değişimi-Diferansiasyon Deneyler arası varyasyon↑ Neden Primer Hücre Kültürü?Zorluklar Besin değişimi-h değişimi Enzim özelliklerinin değişmesi Deneyimli çalışmacı Para ve zaman Types 1- ORGAN KÜLTÜRÜ • Dokunun bütün olarak-disosiye edilmeden üç boyutlu kültürü: İn vivo daki histolojik özelliklerin bir kısmı ya da tamamı korunur • Tüm embriyo ya da organlar çıkarıldıktan sonra kültüre edilir. 1- ORGAN KÜLTÜRÜ • Dezavantajları: – Organın büyütülmesi tavsiye edilmez – Büyümesi yavaş – Her deney için taze doku gerekmesi 2- DOKU KÜLTÜRÜ • Doku kültürü: Organ ve hücre kültürünü içerir • Dokudan eksize edilen fragmanlar kültür ortamında çoğaltılır/büyütülür • Dokudan eksize edilen fragmanlar plastik/cam- sıvı alana yapışma sonrası solid substrat düzleminde hücrelerin migrasyonu ile çoğalır 2- DOKU KÜLTÜRÜ • Avantajları: • - Bazı normal fonklar devam ettirilebilir/korunabilir • - Büyütme/küçültme için Organ kültüründen daha iyi ancak ideal değil. • Dezavantajları: – Dokunun orijinal organizasyonu kaybolur 3- Hücre Kültürü Orijinal dokudan hücrelerin Primer kültürü- ⇒sonrasında hücre hattı Enzimatik/mekanik/kimyasal disagregasyonu Hücrelerin tek tek düşürüldüğü: Hücre süspansiyonu • Solid substrat üzerinde: Tek tabakalı adheren kültür, • Kültür ortamında süspanse kültür • • • • Primer Hücre Kültürü – Direkt olarak dokunun ekzisyonu ya da kültürü ile elde edilirler • Kültürde eksize edilen dokunun büyümesi • Tek hücreye ayrımı (enzimatik sindirim ya da mekanik ayrım ile) Primer Hücre Kültürü – Avantajları: • Genelde in vivo diferansiye hücrenin birçok özelliği devam eder • Major fonksiyonel özellikler açısından sürekli hücre hatlarına göre daha fazla temsil ederler. • Hücre hattı oluşturma Primer Hücre Kültürü -Avantajları: – Primer doku bankacılığına olanak tanıması – Tanı ve tedavi için önemli moleküler belirteçlerin çalışılması – Tedavi ajanlarının hastadan elde edilen örnekler üzerinde denenerek etkinlik/toksisite çalışmaları Primer Hücre Kültürü – Dezavantajları: • Başlangıçta heterojen- daha sonra fibroblastlar domine olur. • Hazırlanması- emek yoğun bir işlem • İn vitro olarak belli zaman süresince devam ettirilebilir Primer Hücre Kültürü Primer kültürler genelde hücrelerin *fonksiyonel özelliklerini devam ettirmek, *hücre-hücre etkileşimlerini, *dış uyaranlar ile hücrelerde ortaya çıkabilecek fonksiyonel değişiklikleri belirlemek amacıyla kullanılırlar. Primer Hücre Kültürü • Hücreler alt-kültüre edildikçe : • Çoğalma potansiyelleri daha iyi hale gelirken • Dokunun fonksiyonel durumunu yansıtacak olan hücre-hücre etkileşimleri ve • Primer dokuyu temsil yetenekleri giderek azalır. Primer Hücre Kültürü: Hangi hücreler?? • Nöronlar, • Myositler ya da • T hücreleri Normal terminal diferansiye hücreler in vivo bölünmezler .American Type Culture Collection Primer Hücre Kültürü: Uygulama alanları • Hasarlı dokuların rekonstrüksiyonu ya da nonfonksiyonel hücre ya da dokuların replasmanı • Endüstriyel amaçlı çeşitli moleküllerin sentezi ya da üretilmesi • Hücre fizyolojisi ya da metabolik regülasyon Primer Hücre Kültürü: Uygulama alanları • Hayvan deneyleri ile ortaya çıkan etik konulardan kaçınmayı sağlar • in vivo da gerçekleştirilemeyecek deneyleri insan dokusu üzerinde çalışmak Primer Hücre Kültürü: Uygulama alanları • Hayvan deneyleri ile ortaya çıkan etik konulardan kaçınmayı sağlar • Deneysel çalışmalarda ki 3R ilkesine uygun olarak) – Hayvan refinementı sağlanır – Hayvan sayısı azalır (gereksiz kullanım vs) Primer Hücre Kültürü: Klinik Uygulama alanları • Hastaların kendi örneklerinde yeterince hücre elde edilerek ve genetik olarak manüple ederek – fonksiyon kaybının yerine konması, – immün rejeksiyon ya da – yetersiz doku problemlerini aşmak – İlaçların test edilmesi Primer Hücre Kültürü: • Bazı hücrelerin in vitro olarak pasajlar boyunca kullanılan hücre kültür şartlarına ile diferansiye özelliklerini devam ettirmeleri zor • Primer kültür hücreleri ölene ya da kültür şartları sağlanana kadar sürekli bir değişim gösterirler. Primer Hücre Kültürü: • Birden çok hücre içermeleri – Hücre şekilleri, – hücre-hücre etkileşimleri, – hücrelerden salgılanan faktörler ve reseptörleri, – hücre yüzeyinde bulunan diğer hücre yüzey proteinleri sürekli değişir.... Primer Hücre Kültürü: • Primer hücre kültürü yaparken sonuçların nasıl yorumlanacağı • Kültürün ne kadar süre ile devam ettirileceği ? Primer Kültür ve Klinik Uygulama • Kanser hücrelerinin – mekanik/enzimatik ayrımı ve – tek tabakalı hücre kültürüne uygun hale getirerek – değişik dozlarda KT ilaçları ile kısa süreli kültürde – hücre canlılığı/sitotoksisiteyi kemolüminesans ölçümle belirlemek – Hücreler diferansiye olmadan ve primer doku özelliklerini kaybetmeden test etme olanağı sağlar Cell morphologies vary depending on cell type Fibroblastic Epithelial Endothelial Neuronal Primer Kültür ve Klinik Uygulama • 1) • Kanser doku hücreleri primer kültürü ile KT ilaçların etkinlik/toksisite çalışmaları • Ör: ATP-TCA yöntemi kullanarak Primer Kültür ve Klinik Uygulama • 2) • Kanser doku hücreleri primer kültürü yaparken aynı dokuda ki mononükleer hücreler dansite gradient yöntemi ile (Ficol) ayrılarak ⇒⇒Kısa süreli testler • Lenfosit çoğalaması İL-2 gibi ajanlarla in vitro indüklenebilir • Daha sonra primer kültür ile ko-kültür yapılarak kanser hücre kültür davranışı değerlendirilebilir Primer Kültür ve Klinik Uygulama • 3) • Primer kanser hücreleri ile mononükller kültür (TIL) yapılarak ko-kültür ⇒ TIL ler hastaya geri verme • GNP şartları • Rosebnerg ve ark. Melanoma ve renal hli Ca tedavisi Primer Kültür ve Klinik Uygulama • 4) • Primer kanser dokusundan dendiritik hücre izolasyonu ve aşı geliştirme • GNP şartalarında Primer Kültür ve Klinik Uygulama • 5) • Primer kanser dokusundan ⇒ Gen ekspresyonu çalışarak- Hedeflenmiş ilaç seçimi Ör: – EGFR – K-RAS – Her-2 – BRAF Primer Kültür ve Klinik Uygulama • 6) • Primer kanser dokusundan ⇒ Kİ hücre kültürü- Sitogenetik Analiz• Tanı ve tedavi seçimi Ör: – KML-Bcr-Abl füzyon geni kromozom analizi Primer Kültür ve Klinik Uygulama • 7) • Amniyon hücre kültürü∼4-5 hafta • Kromozomlarda sitogenetik analiz – PRENATAL TANI Kromozom anomali tesbiti ör. Down sendromu, .. – Cinsiyet Primer Kültür ve Klinik Uygulama • • • • • 8) Tüp Bebek İnsan yumurta-sperm⇒Embriyo kültürü Moleküler genetik analizler İmplantasyon/olası metabolik genetik hast tanı/ sağlıklı embryo seçimi Primer Kültür ve Klinik Uygulama • 9) • Metabolik/genetik hastalıkların tanısı ve tedavisi • İnsan fibroblast kültürü • Genetik analizler Primer Kültür ve Klinik Uygulama • • • • • 10) Kök hücre üretimi Genetik analizler Hematolojik malignite tedavisi Nöromusküler hastalık tedavisi Primer Kök Hücre Kültürü Hücre Kültürü ve Güvenlik Sağlığa zararlı maddeler: Karsinojenler: KT ilaçları, potansiyel ajanlar, HCV gibi viruslar Hygromycin⇒ Olası karsinojen Teratojenler: *Fetusta mutajenik olabilecek maddeler • Mutasyona yol açarak sonraki jenerasyona geçebilecek • Ör: Gentamycin ve Thapsigargin Streptomycin⇒ Mutajen Bulaşıcı ve/veya enfekte materyaller ile çalışma Hücre Kültürü ve Güvenlik • Atık yönetimi • Hücrelerle temas eden tüm atıkların otoklavlanarak atılması • Pipettler, flasklar, diğer kaplar ve eldivenler otoklav torbasında toplanarak • Sıvı atıklar ayrı bir atık kabında (dezenfektan HCl içeren) toplanarak atılmalı • Kağıt atıklar başka atık kaplarında (mavi torbada) saklanmalı Hücre Kültürü ve Ekipman • Hücre kültürü çalışmak için özel ekip ve ekipmanlar hatta Ayrı ODA gerekli! • Hücre kültür çalışma prensiplerinin öğrenilmesi Hücre Kültürü ve Ekipman • Hücre kültürü çalışmak için özel ekip ve ekipmanlar Ayrı ODA gerekli! • Air-Flow kabinet: Class II/III • Pastör fırını/su banyosu • İnverted Mikroskop • Otomatik pipetör • Steril hücre kültür kapları • Steril hücre kültür pipetleri • Buzdolabı (+4°C ve -20°C) • Santrifüj • Dolap Hücre Kültürü ve Ekipman • Hücre kültürü çalışmak için özel ekip ve ekipmanlar Ayrı ODA gerekli! • Air-Flow kabinet: Class II/III • Pastör fırını/su banyosu • İnverted Mikroskop • Otomatik pipetör • Steril hücre kültür kapları • Steril hücre kültür pipetleri • Buzdolabı (+4°C ve -20°C) • Santrifüj • Dolap Hücre Kültürü ve Ekipman_Oda • İzole, giriş çıkışı kontrol edilebilir bir oda olmalı • Geniş, havalandırması özel: Hava çekişi olan , direkt air-flow üzerine üfleyen havalandırma sistemi olmamalı • Oda ısısı kontrollü • Oda düzeni içinde bankolarda esya olmamalı Hücre Kültürü ve Ekipman • • • • • • Hücre kültür ekipmanları aynı odada olmalı UV sterilizasyon Çalışan kişiler; önlüklü, maske, galoş Odanın temizliği özel Aynı anda çok kişi çalışmamalı Çöpler odada bırakılmamalı Bulaşıcı ve/veya enfekte materyaller ile çalışma Sınıf II • Biyolojik güvenlik kabinleri – Ön açık, vertikal laminar hava Sınıf I akışı, – Ön açık, hava akışı içeriye doğru,– İçe ve dışa hava HEPA – Dışa hava çıkışı HEPA filtreden filitrasyon – Yalnızca personel koruyucu – Personel ve ürün koruyucucu Sınıf III – Eldiven tip • Pipetler Mikrobiyal Kontaminasyon Langdon SP, 2003 Hücre Kültür Ekipmanı-ASEPSİAir-Flow kabinet • Bio güvenlik • Bioajan: Bir enfeksiyon, alerji, toksisite ve/veya insanda herhangi bir zarara yol açabilecek mikroorganizma (genetik olarak modifiye edimiş olanlar dahil), hücre ve endoparazitler Hücre Kültür Ekipmanları-Kaplar • Tek kullanımlık, steril, polistren • Flasklar: 25, 75, 125 cm2 • Plate: 384, 96 24, 12, 6 well/Plate • Kaplanmış kültür kaplar: matrigel, kollajen.. • İnsertler • Petri kapları… Hücre Kültür Ekipmanlarıı-Tüpler • Tek kullanımlık, steril • 15, 50 mL • Etekli, düz tabanlı • Ependorf tüpler, • PCR ependorf, • Criyovial • Cell scraper Pipetler • Steril polistren pipetler • Tek kullanımlık • 2,5,10,25 mL.. Mr. Frosty CO2 inkübatör • CO2 seviyesini ve nemi düzenler (% 510) • Isı (37o C): – in vivo koşulları taklit eder. Su Banyosu • Ortam, Tirpsin, PBS i hleri uygulama öncesi ısıtmak için • Mantar ve bakteri üreyebilir. Kabinet içine almadan %70 alkol ile silinmeli • 10-15 dk-30 dk arası ortamlar • Tripsin EDTA daha kısa sürede 5-10 dk ısıtılır Vakum Pompası • Sıvıların aspirasyonunda (ortam, PBS ve Tripsin-EDTA). • Ucu keskin/steril pastör pipetler kull. Inverted Faz Mikroskop • Faz kontrast mikroskop spesmenin altında bulunur. • Halka şeklindeki faz plağı hlerin farklı alanlarındaki, çevresindeki bölgelerde kontrast oluşturarak refraktif indeksteki değişikliklerle farklılıklar belirlenir. Karşılaştırırsak Faz kontrast mikroskobu Yaşayan hlerde kullanışlı Işık mikroskobu Ölü hleri, boya gerektirerek görüntüler Dezenfeksiyon • • • • • • Hücre kültür oda temizliği İnkübatör Kabinet Banko … % 70 lik ALKOL Hücre Kültür Ortamları • • • • • • • Kullanılacak hücre tipine göre değişmekte Glukoz Su AAler Büyüme Faktörleri Sitokinler Tuzlar Hücre kültürü çalışmalarında kullanılan ortamlar: DMEM Hücre kültürü çalışmalarında kullanılan ortamlar DMEM Suda ve yağda çözünenler Hücre Kültür- Çoğaltma (Complete) Ortamları Ortamlara eklenmesi gerekenler: • Penislin/Streptomisin (%1) • Fetal Bovin Serum (FBS) (%10) • L-Glutamin (%1) Primer Hücre Kültürü Subkültür Hücre Hattı Klonlama Fiziksel ayırım Alt Hücre Hattı ya da Hücre soyu Hücre kültürü Ortam Hazırlığı • Ortam, Pen-Strep, L-glutamin 37°C ısıtılmalı • Air-Flow kabinet açılmalı • % 70 lik Alkol/ dezenfektan ile silinmeli • UV- lamba 15-30 dk çalıştırılmalı • Malzemeler (Steril tüp, pipet, atık kabı vs) ayarlanmalı Primer HUVEC Kültür • • • • • • • • Gerekli malzemeler: DMEM (Gibco, Invitrogen, Sigma) Iscove modified Dulbecco’s medium (IMDM) (Sigma) Culture medium MCDB 131 (Sigma) ya da M199 medium (Biowhittaker) Fetal Bovin Serum (Hücre kültür grade) (ısı ile inaktive edilmiş)(Gibco, Invitrogen, Sigma) L-glutamin (Hücre kültür grade) (Gibco, Invitrogen, Sigma) PenisilinG(5000 U/mL) /Streptomisin(5000 μg/mL) (Hücre kültür grade) (Gibco). Amphotericin B (Hücre kültür grade) (Sigma) (25µg/mL) HUVEC-Cord Primer HUVEC Kültür Gerekli malzemeler: Endothelial cell growth supplement (BD Biosciences). Heparin (Sigma). Phosphate buffer saline (PBS) (Hücre kültür grade) (Gibco, Invitrogen, Sigma) • Collegenase A (Sigma). Pen/Sterp içeren(50 U/mL and 50 g/mL) serumsuz DMEM’de 13 mg/100 mL olacak şekilde çözülür. 0.2uM filtre edilir ve HUVEC izolasyonu öncesi taze olarak hazırlanmalıdır. • % 0.2 Gelatin. 10 mL jelatin çalışma solüsyonu hazırlamak için %2 lik 1mL stok jelatinden (Sigma) 9 mL PBS içinde dilüe edin. Her defasında taz hazırlayın. • • • • Primer HUVEC Kültürü • • • • • Transfer Ortamı 50U/mL pen/50ug/mLStrep 10ug/mL Amphotericin B 800u/mL Heparin içeren IMDM Toplam 50 mL için (200mL lik şişe içinde transfer edilmeli) Primer HUVEC Kültürü • Kollejenaz solusyonu 37°C’de 30 dk once ısıtılmış olarak hazırlanır. 12-20 cm lik bir kord için yaklaşık 25 mL • HUVEC hücreleri jelatin kaplı kültür plaklarına tutunarak daha kolay ürerler. • Hücre süspansiyonunu +4°C’de 300g de 5 dk santrifüjlenir HUVEC Hücrelerin Çoğaltılması-PASAJLAMA • Hücrelerin confluensi düzeyleri değerlendirilir (%75-100) • Hücrelerin ortamları uzaklaştırılır • PBS ile yıkama • Tripsin-EDTA ile yapıştıkları yüzeyden kaldırma • Tripsin-Enzim inaktivasyonu-Komplte Ortam ekleme • Santrifüj yeni kültür kaplarına/kabına 1/3-1/4 oranında aktarım Hücrelerin Dondurulması-saklanması Dondurma ortamı: DMSO, gliserol FBS Bazal ortam içinde criyoviallere konarak • -196 °C azot tankı ya da -80 °C de saklanır • • • • Sıvı Nitrojen
