tc gazi üniversitesi sağlık bilimleri enstitüsü tıbbi biyoloji ve genetik
advertisement
T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK ANABİLİM DALI TİROİD KANSER HÜCRE HATLARINDA TİMOKİNON ve GENİSTEİN’İN TELOMERAZ AKTİVİTESİ ve APOPTOZİS ÜZERİNE ETKİSİ DOKTORA TEZİ Dr. Sibel Azizenur ÖZTÜRK Tez Danışmanı Prof. Dr. Sevda MENEVŞE İkinci Danışman Prof. Dr. Erdal KARAÖZ ANKARA Ağustos 2012 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK ANABİLİM DALI TİROİD KANSER HÜCRE HATLARINDA TİMOKİNON ve GENİSTEİN’İN TELOMERAZ AKTİVİTESİ ve APOPTOZİS ÜZERİNE ETKİSİ DOKTORA TEZİ Dr. Sibel Azizenur ÖZTÜRK Tez Danışmanı Prof. Dr. Sevda MENEVŞE İkinci danışman Prof. Dr. Erdal KARAÖZ Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından 01/2010-68 proje numarası ile desteklenmiştir. ANKARA Ağustos 2012 İÇİNDEKİLER Sayfa No Kabul ve Onay I İçindekiler II Şekiller ve Grafikler VI Tablolar IX Semboller, Kısaltmalar X 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Tiroid Karsinomu 3 2.1.1. Tiroid Bezi Embriyolojisi 3 2.1.2. Tiroid Bezi Histolojisi 3 2.1.3. Tiroid Kanser Etyolojisi 5 2.1.4. Tiroid Kanser Sınıflandırması 5 2.1.5. Tiroid Karsinogenezi 7 2.1.5.1. Multistep Tiroid Karsinogenez Teorisi 7 2.1.5.2. Multistep Karsinogenez Teorisine Karşı Gelişen Şüpheler 7 2.1.5.3. Fetal Hücre Tiroid Karsinogenezi 9 2.2. Telomer ve Telomeraz 13 2.2.1. Telomerler 13 2.2.2. Telomeraz 14 2.2.2.1. Telomerazın Katalitik Alt Birimi (hTERT) 15 2.2.2.2. Telomerazın RNA Alt Birimi (hTER) 17 2.2.3. İnsanda Telomeraz Aktivitesinin Kontrolü 17 2.2.3.1. Telomeraz Aktivitesinin hTERT Seviyesindeki Kontrolü 17 2.2.3.2. Telomeraz Enziminin Telomerik Proteinler Tarafından 19 Kontrolü II 2.2.4. Telomeraz Aktivitesi ve Kanser 22 2.3. Programlı Hücre Ölümü: Apoptozis 24 2.3.1. Apoptotik Hücrede Görülen Değişiklikler 24 2.3.2. Apoptotik Sinyal Yolakları 25 2.3.3. Apoptoz Mekanizması 27 2.3.4. Apoptozun regülasyonu (anti/pro-apoptotik proteinler) 29 2.3.5. Apoptoz ve kanser 30 2.4. Araştırılan genler 32 2.4.1. VEGF-A geni 32 2.4.2. pTEN geni 33 2.4.3. p21 geni 34 2.4.4. NF-κB geni 35 2.5. Kullanılan Fitoterapötik İlaçlar 36 2.5.1. Timokinon (TQ) 36 2.5.2. Genistein (Gen) 37 3. GEREÇ VE YÖNTEM 39 3.1. Kullanılan Araç ve Gereçler 39 3.1.1. CAL-62 ve CGTH-W1 Hücre Hatları 39 3.1.2. Kullanılan Cihazlar 39 3.1.3. Kullanılan Sarf Malzemeler 40 3.1.4. Kullanılan Kimyasal Maddeler 40 3.1.5. Kullanılan Kitler 41 3.2. Besiyeri ve Çözeltilerin Hazırlanışı 41 3.2.1. % 10’luk DMEM Besiyerinin Hazırlanışı 41 3.2.2. %10’luk RPMI-1640 Besiyeri Hazırlanışı 41 3.2.3. % 1’lik DMEM Besiyerinin Hazırlanışı 42 3.2.4. %1’lik RPMI-1640 Besiyeri Hazırlanışı 42 III 3.2.5. MTT Karışımının Hazırlanması 42 3.3. Yöntem 43 3.3.1. Hücre Kültürü 43 3.3.2. MTT Hücre Canlılığı Deneyi 43 3.3.3. Kaspaz-3 Sandwich Elisa Deneyi 44 3.3.4. Hücre Kültüründe Total RNA’nın Elde Edilmesi 45 3.3.5. Komplementer DNA (cDNA) Sentezi (RT-PCR) 46 3.3.5.1. Reverse Transkriptaz PCR (RT-PCR) Programı 47 3.3.6. Gen İfadesinin Real Time PCR ile Belirlenmesi 47 3.3.6.1. hTERT Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi 48 3.3.6.2. VEGF-A Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi 48 3.3.6.3. pTEN Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi 49 3.3.6.4. NF-κB Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi 50 3.3.6.5. p21 Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi 50 3.3.6.6. GAPDH Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi 51 3.3.6.7. hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κB, p21 ve GAPDH Genleri İçin Real Time PCR Tepkime Karışımları 52 3.3.6.8. Light Cycler (LC) Deney Programı 52 3.4. İstatistiksel Analiz Yöntemleri 53 4. BULGULAR 54 4.1. CAL-62 ve CGTH-W1 Hücrelerinin Timokinon ve Genistein’e Duyarlılığının MTT Hücre Canlılığı Yöntemi ile İncelenmesi 54 4.2. Gen İfade Düzeylerinin Kantitatif Değerlendirilmesi 55 4.3. Gen İfade Düzeylerinin Karşılaştırılması 61 4.3.1. Timokinon ve Genistein’in hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κB ve p21 Genlerinin İfade Düzeylerine Etkisi 61 4.4. Aktif Kazpaz-3 Düzeyinin Belirlenmesi 65 5. TARTIŞMA 67 6. SONUÇ 79 IV 7. ÖZET 81 8. SUMMARY 83 9. KAYNAKLAR 85 10. EKLER 124 11. ÖZGEÇMİŞ 126 V ŞEKİLLER ve GRAFİKLER Sayfa No Şekil 1: Tiroid bezi 4 Şekil 2: Multi-step karsinogenez modeli 7 Şekil 3: Fetal hücre karsinogenezi ile multistep karsinogenez modellerinin karşılaştırması 10 Şekil 4: Tiroid karsinomunda gen ekspresyon profili 11 Şekil 5: Tiroid kanseri için kök hücre modeli 12 Şekil 6: DNA replikasyonunda 3’ ve 5’ uçlarında farklı sentez mekanizmaları 14 Şekil 7: Telomeraz enzim kompleksi ve fonksiyonu 15 Şekil 8: hTERT geni 15 Şekil 9: Telomeraz proteininin avuç içi modeli 16 Şekil 10: hTERT aktivasyonunun kontrolü 18 Şekil 11: Shelterin kompleksi 21 Şekil 12: İki basamaklı hücresel senesens ve immortalizasyon hipotezi 23 Şekil 13:Apoptozun sinyal yolakları, mekanizması ve morfolojisi 25 Şekil 14: Ölüm reseptörü aracılı ve mitokondri aracılı apoptoz sinyal yolakları 27 Şekil 15: Genistein’in hücre yaşamı, hücre döngüsü ve apoptotik apoptotik yolaklara etkisi. 34 Şekil 16: Timokinon ve Genistein’in kimyasal yapısı 36 Şekil 17: Kanserde timokinonun etki mekanizmaları 37 VI Şekil 18: Genistein, VEGF, NF-kB’ı inhibe ederek, PTEN ve p21’i indükleyerek apoptozu arttırmakta, anjiogenezi ise azaltmaktadır. 38 Şekil 19: CAL-62 ve CGTH-W1 hücre hatları 39 Şekil 20: hTERT mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşim 48 Şekil 21: VEGF-A mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi 49 Şekil 22: pTEN mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi 49 Şekil 23: NF-κB mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşim 50 Şekil 24: p21 mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi 51 Şekil 25: GAPDH mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi 51 Şekil 26: hTERT geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. 57 Şekil 27: VEGF-A geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. 58 Şekil 28: pTEN geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. 58 Şekil 29: NF-κB geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. 59 Şekil 30: p21 geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. 59 Şekil 31: GAPDH geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. 60 VII Grafik 1-2: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin (10.000 hücre/kuyu) Timokinon ile 48 ve 72 saat inkübasyonu sonunda belirlenen hücre canlılık oranları. 54 Grafik 3-4: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin (106 hücre/kuyu) Genistein ile 48 ve 72 saat inkübasyonu sonunda belirlenen hücre canlılık hücre oranları. 55 Grafik 5-6: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin (106 hücre/kuyu) Timokinon ve Genistein kombinasyonu ile 48 ve 72 saat inkübasyonu sonunda belirlenen hücre canlılık oranları. 56 Grafik 7-8: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin doza bağlı olarak Timokinon ve Genistein uygulanması sonrasında hTERT geninin mRNA düzeylerindeki değişiklik. 62 Grafik 9-10:.CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin doza bağlı olarak Timokinon ve Genistein uygulanması sonrasında VEGF-A geninin mRNA düzeylerindeki değişiklik. 62 Grafik 11-12: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin doza bağlı olarak Timokinon ve Genistein uygulanması sonrasında pTEN geninin mRNA düzeylerindeki değişiklik. 63 Grafik 13-14: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin doza bağlı olarak Timokinon ve Genistein uygulanması sonrasında NF-κB geninin mRNA düzeylerindeki değişiklik. 64 Grafik 15-16: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin doza bağlı olarak Timokinon ve Genistein uygulanması sonrasında p21 geninin mRNA düzeylerindeki değişiklik. 65 Grafik 17-18: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin Timokinon ve Genistein uygulanması ile doza bağlı 72 saat inkübasyon sonunda görülen Aktif Kaspaz-3 oranları. 66 VIII TABLOLAR Sayfa No Tablo 1: Tiroid kanserinin klinikopatolojik özellikleri 7 Tablo 2: Tiroid kanserlerinde genetik defektler 9 Tablo 3: RT-PCR tepkime karışımı 44 Tablo 4: Otomatik ısı döngüsü cihazında uygulanan program 44 Tablo 5: hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κB, p21 ve GAPDH Real-Time PCR tepkime karışımı 49 Tablo 6: hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κB, p21 ve GAPDH genlerinin ifade düzeylerinin belirlenmesi için kullanılan Real Time PCR tepkime programı 50 IX SEMBOLLER ve KISALTMALAR 0 : Santigrad Derece µl : Mikrolitre Μg : Mikrogram AIF : Apoptosis Inducing Factor ALT : Alternative Lenghtening of Telomere Mechanisms Apaf-1 : apoptosis Protease Activating Factor-1 bç : Baz çifti Bcl-2 : B hücre lenfoma onkogeni CAL-62 : İnsan Anaplastik Tiroid Kanseri CAD : Caspase-Activated Deoxyribonuclease cDNA : Komplementer DNA CGTH-W1 : İnsan Folliküler Tiroid Kanser Hücre Hattı Cp : Crossing point DEPC : Dietilpirokarbonat DD : Death Domain Dk : Dakika dH2O : Distile su DISC : Death Inducing Signaling Complex DMEM : Dimetil Sülfoksit DMSO : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DNA : Deoksiribonükleik asit dNTP : Deoksiribonükleotidtrifosfat EDTA : Etilendiamintetraasetikasit ELISA : Enzyme-linked immünosorbent assay ER : Endoplasmik Retikulum FADD : Fas Associated Death Domain Protein FCS : Fetal Calf Serum GAPDH : Gliseraldehit 3 Fosfat Dehidrojenaz Gen : Genistein C X HAT : Histon Asetil Transferaz HDAC : Histon Deasetilaz hTR : İnsan telomerazı RNA komponenti hTERT : İnsanTelomeraz Revers Transkriptaz IAP : Inhibitor of Apoptosis Protein IC50 : %50 inhibitör konsantrasyon ICAD : Inhibitor of Caspase-Activated Deoxyribonuclease IkB : Inhibitor of NF-kB kb : Kilo baz LC : Light Cycler LDH : Laktat Dehidrojenaz M1 : Mortalite Faz 1 M2 : Mortalite Faz 2 MgCI2 : Magnezyum Klorür MMP : Matriks Metalloproteinaz MTT : Metil Tiyazol Tetrazolyum nM : Nanomolar NOS : Nitrik Oksit Sentaz NF-κB : Nükleer Faktör Kappa Beta P21 : Protein 21 P53 : Protein 53 PBS : Phosphate Buffer Saline PCR : Polimeraz Zincir Tepkimesi PI3K : Fosfatidil Inozitol 3 Kinaz PINX1 : pin2/trf1-interacting protein1 Pmol : Pikomol POT1 : Protecting of Telomerase1 pTEN : Fosfat ve Tensin Homolog Rb : Retinoblastoma REST : Relatif Ekspresyon Software Tool RNA : Ribonükleik asit XI RNaz A : Ribonükleaz A RNP : Ribonükleoprotein ROS : Reactive Oxygen Species rpm : Dakika başına dönme sayısı RT : Revers Transkriptaz RTK : Reseptör Tirozin Kinaz RT-PCR : Ters Transkriptaz-Polimeraz Zincir Tepkimesi S : Saat Sn : Saniye Sp1 : Özgüllük proteini 1 TGF- β : Transforme Edici Büyüme Faktörü- β TIN2 : TRF-interacting nuclear factor 2 TNFR : Tümör Nekroz Faktör Reseptörü TMB : Tetrametilbenzidin TNF- α : Tümör Nekroz Faktörü-α TP1 : Telomerase associated protein TQ : Timokinon TRAIL : TNF Related Apoptosis Inducing Ligand TRF-1 : TTAGGG repeat binding factor 1 TRF-2 : TTAGGG repeat binding factor 2 TSH : Tiroid Stümüle Eden Hormon UPL : Universal Prob Kütüphanesi UV : Ultraviyole V : Voltaj VEGF : Vasküler Endotelyal Büyüme Faktör XIAP : X kromozom bağlı IAP proteini XII 1. GİRİŞ Tiroid karsinomları, klinikte görülen tümörlerin %1 kadarını oluşturup, yavaş ilerleyen kanserlerdir. Genelde sağkalımı iyi olmakla birlikte, tüm endokrin organ kanserlerinden daha çok ölüme sebep olurlar. “Fetal hücre karsinogenezi” olarak adlandırılan yeni bir tiroid karsinogenez hipotezi, undiferansiye (anaplastik) tiroid kanser hücrelerinin normal tirositler yerine, direkt fetal tiroid hücre kalıntılarından, yani kök hücrelerden kökenlendiğini ileri sürmektedir. Bu teoriye göre iyi diferansiye (folliküler) tiroid kanserleri farklılaşmanın daha ileri basamaklarında oluşan hasarlar nedeniyle meydana gelmektedir. Telomerik DNA, her çoğalma döngüsü esnasında yaklaşık 100 bç’i kadar kısalır. Bu kayıp, bir revers-tanskriptaz olan “telomeraz” enzimi tarafından giderilir. Telomeraz, somatik hücrelerde inaktif iken, kök hücreleri ve germ hücrelerinde aktiftir. Ayrıca kanser hücrelerinde %90’ın üzerinde pozitif olduğu saptanmıştır. Kanser kök hücrelerinin normal kök hücrelerinden daha kısa telomerlere sahip olması nedeniyle, telomeraz inhibisyonu ile normal kök hücrelere zarar vermeden, tümör hücreleri ve kanser kök hücrelerini hadeflemenin mümkün olacağı düşünülmektedir. Doğal gelişim veya patolojik aksaklıklar sonucu meydana gelebilen “apoptozis” (programlanmış hücre ölümü); istenmeyen veya hasar görmüş hücrelerin ortadan kaldırılmasıyla, hücre sayısının regülasyonunu sağlayan, etkin bir hücre kontrol mekanizmasıdır. Hücre 1 yapım ve yıkımı arasındaki dengenin apoptoz aleyhine bozularak baskılanması sonucu kanserler ortaya çıkmaktadır. “Timokinon”, çörek otunun (Nigella sativa) uçucu yağında bulunan temel aktif bileşendir. Antioksidan, antitümör gibi özellikleriyle; göğüs, kolorektal, pankreatik ve prostat kanseri gibi birçok tümör hücrelerinin çoğalması üzerine baskılayıcı etki gösterdiği görülmüştür. “Genistein”, soya fasülyesinde doğal olarak bulunan isoflavondur. Antioksidan özelliğiyle DNA hasarını önlemek suretiyle kanser gelişimini engellemektedir. Kanser hücrelerinde ise apoptoz oluşumunu sağladığı, çoğalmayı, invazyonu ve metastaz oluşumunu ise önlediği bildirilmektedir. Bu bilgilerin ışığında, Timokinon ve Genistein’in ayrı ayrı ve birlikte kullanımları ile, CAL-62 (anaplastik) ve CGTH-W1 (folliküler) tiroid kanser hücre hatları üzerindeki telomeraz aktivitesinin ve apoptotik, antiproliferatif ve anti-anjiyogenik etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla, apoptotik ve proliferatif yolakda önemli rolleri olduğu bilinen NFκβ, PTEN, p21 ve anjiyogenez gelişiminde kritik öneme sahip VEGF-A geninin mRNA ifade düzeyleri üzerine, seçilen ilaçların etkisi araştırıldı. Ayrıca tiroid kanser hücrelerinin bu fitoterapötik ilaçlara verdiği apoptotik yanıtlar da araştırılarak, ilacların hücre ölümüne olan etkisi değerlendirildi. Böylece bu araştırma ile, kemoterapiye dirençli kanser kök hücrelerini de içine alan tümör moleküler mekanizmalarını anlamaya çalışmak suretiyle, kanser hücre apoptozunu yüksek seçicilik ve etkinlikte indükleyen, ancak normal hücrelere minimal toksik etkili olan ilaç ve tedavileri geliştirmek için bilime katkı yaratmayı hedefledik. 2 2. GENEL BİLGİLER 2.1 Tiroid Karsinomu 2.1.1 Tiroid Bezi Embriyolojisi Tiroid bezi, embriyoda gelişen ilk endokrin bezdir. Esas gövdesi, fertilizasyondan sonra yaklaşık 24. günde ilkel farinks tabanında, median bir endoderm kalınlaşmasından oluşmaya başlar. Embriyo büyürken, tiroid bezi taslağı gelişen hyoid ve larinks kıkırdaklarının ventralinden geçerek yavaşca aşağıya iner. 7. haftada tam şeklini almakta ve boyundaki erişkin konumuna ulaşmaktadır. 11. haftada fonksiyonel farklılaşma ile tiroglobülin ve tiroid hormon sentezi görülmektedir 1, 2, 3. 2.1.2. Tiroid Bezi Histolojisi Tiroid bezi lobüllerden oluşur. Her lobülde ortalama 40 follikül vardır. Yaklaşık 3x106 follikül içeren erişkin tiroide her bir follikül, içi kolloid dolu bir lümeni çepeçevre saran, tek sıralı küboidal-kollumnar epitel olan follikül hücrelerinden oluşur. Follikül hücresi (tirosit), tiroid hormonlarının yapım ve salınımından sorumludur. Tiroid hormonlarının oluşumu eksojen iyot alımına bağımlıdır ve TSH (tiroid stimulating hormone)’nın etkisi altındadır. TSH uyarısı T3 ve T4 salınımına neden olurken, kandaki T3 ve T4 artışı hipofizden TSH salınımını inhibe eder. Tiroid hormonları, follikül içinde tiroglobiline (Tg) bağlı olarak kolloidde depolanır ve bu depo, vücudun 1-3 aylık kadar ihtiyacını karşılamaya yeterlidir (Şekil 1) 4, 5, 6 . 3 4 Şekil 1: Tiroid bezi . Tiroksin (T4) ve triiyodotironin (T3) hormonları, genel olarak bazal metabolizmayı düzenleyen, bu nedenle yaşam için mutlak gerekli hormonlardır. Pasif diffüzyonla veya ATP bağımlı aktif transportla hedef hücreye geçerek hücre çekirdeğindeki kendi reseptörüne bağlanır ve protein yapımını regüle ederler. Ayrıca, membran yapısındaki enzimlerin aktivitesini kontrol etmek, mitokondride oksidasyon olaylarını hızlandırmak gibi diğer fonksiyonları da vardır. T3 ve T4 sekresyonunun artması, metabolizma hızını %60-100 oranlarına kadar arttırabildiği gibi; sekresyonun olmaması ise, metabolizma hızını normalin %40 altına düşürebilir 3, 4 2.1.3. Tiroid Kanser Etyolojisi Radyasyonun, tiroid karsinom gelişiminde önemi belgelenmiştir ve radyasyona maruz kalmadan sonra genellikle papiller tiroid karsinom görülmektedir. Diyette iyot yetersizliği ise genellikle folliküler tiroid karsinomu gelişimine neden olmaktadır. Tiroid karsinomlarında kadın/erkek oranı 2.5/1’dir. Kadınlarda insidans yüksek, fakat prognoz iyidir. Daha önce var olan tiroid hastalıkları (Graves hastalığı, Hashimoto tiroiditi), geçirilmiş tiroid ameliyatları (parsiyel tiroidektomi), guatrojen diyet, bazı ilaçlar (fenobarbital, prolaktin inhibitörleri, oral kontraseptifler, östrojen preparatları gibi) ve androjen, östrojen gibi hormonlar da etyolojide etkilidir. Çocuklarda nadirdir, orta yaşla beraber frekansı da artmaktadır 4, 8, 9. 2.1.4. Tiroid Kanser Sınıflaması Tiroid kanserleri, over kanserinden sonra en sık görülen endokrin sistem kanseridir. Prevalansı, her yıl 100.000 kişide 4 yeni vaka şeklindedir. Diferansiye tiroid kanserleri (papiller ve folliküler) ve undiferansiye (anaplastik) tiroid kanseri olarak başlıca iki ana gruba ayrılır. Diferansiye kanserler, TSH ile uyarılabilen, iyot tutma yeteneğini koruyan, tiroid hormonu ve tiroglobulin sentezleyebilen karsinomlardır ve tüm tiroid kanserlerinin %90’ından fazlasını oluştururlar. Prognozu genellikle iyidir; 10 yıllık sağkalım oranı %85-90’dır. Ayrıca histolojik özellikler, tümör yayılımı (tiroid içine, çevresine yayılım, uzak metastaz), yaş, cinsiyet ve tedaviye yanıt, tiroid kanseri prognozunda yer alan önemli faktörlerdir 1, 4, 8, 9 . 5 4 Tablo 1: Tiroid kanserlerinin klinikopatolojik özellikleri . Papiller Tiroid Karsinomu (PTC); tüm tiroid kanserlerinin %85-90’ını oluşturur. PTC etyolojisinde eksternal radyasyonun önemli bir rolü vardır. Lenf nodu tutulumu çok görülür (%50 civarında) (Tablo 1) 4, 8. Folliküler Tiroid Karsinomu (FTC); 2. sıklıkta (%5-10 oranında) görülen diferansiye tiroid karsinomudur. FTC iyot açlığı olan bölgelerde ve daha yaşlı populasyonda sık görülür. Prognoz genellikle iyidir, 5 yıllık yaşam %90’ın üzerindedir. Vasküler invazyona eğilimlidir, hematojen yayılır. Sıklıkla; akciğer, karaciğer ve merkezi sinir sistemine metastaz yapar. Uzak metastaz sıklığı %20 kadardır (Tablo 1) 4, 8. Anaplastik tiroid karsinomu (ATC); %2 oranında seyrek görülen, hızla büyüme göstererek çevre dokulara kısa zamanda invazyon yapan undiferansiye tiroid kanserleridir. Tiroid tümörlerinin en agresif tipidir. Genellikle ATC’de 5 yıllık yaşam süresi %1-10’dur (Tablo 1) 4, 8. 6 2.1.5. Tiroid Karsinogenezi 2.1.5.1.Multistep Karsinogenez Teorisi Çok basamaklı karsinogenez modeli, normal hücrelerin genomlarında gelişen genetik hasarlar sonucu kontrolsüz büyümenin geliştiğini ve genetik düzensizliğe yol açan ilave mutasyonlarla kanseröz yapının daha agresif biçimlerine ilerlediğini ileri sürmektedir (Şekil 2) 4, 6. 4 Şekil 2: Multi-step Karsinogenez Modeli . 2.1.5.2. Multistep Karsinogenezine Karşı Gelişen Şüpheler Multistep karsinogenez teorisi, neoplastik transformasyonun, mutasyonlar nedeniyle normal tiroid hücrelerinde önce adenomlara neden 7 olduğunu, daha sonra olayın ilerlemesiyle karsinomlarının geliştiğini ileri sürmektedir. iyi diferansiye tiroid Ancak tirositler ile iyi diferansiye tiroid karsinom hücrelerini birbirine bağlayan ara hücre tiplerine hiç rastlanmamış, hatta rastlantısal mikropapiller karsinomaların bile tirositten belli morfolojik farklılık gösterdiği görülmüştür 10, 11, 12, 13. Yine bu teoriye göre; farklılaşması daha iyi, diferansiye tiroid tümörlerinde ortaya çıkan yeni ilave mutasyonlar, hücrelerin dediferansiye özellik kazanarak, daha ilkel, undiferansiye formlar geliştirmesine neden olmaktadır. Fakat iyi-diferansiye tiroid karsinomlarındaki genomik değişikliklerin, undiferansiye tiroid karsinomlarında görülmemesi multistep karsinogenez hipotezine karşı şüpheleri arttırmıştır (Tablo 2) 10, 11, 12, 13. 4 Tablo 2: Tiroid kanserlerinde genetik defektler . 8 Ayrıca, çok yavaş büyüyen iyi diferansiye tiroid kanserlerinin, birçok kez bölünmediklerinden dolayı, genetik değişikliklerin birikimiyle anaplastik kanseröz yapının ele geçirilmiş olmasına inanç da güçleşmiştir. Yine iyi diferansiye tiroid kanserlerinde, lokal invazyon ve metastazın sık görülmesine rağmen prognozun iyi olması da dikkat çekici olmuştur 10, 11, 12, 13 . İlginç olarak, iyi diferansiye folliküler kanserlerin genellikle tiroid tümörlerinin büyük yüzdesini oluşturmasına rağmen, Çernobil kazası sonrasında radyasyonla indüklenen tiroid tümörlerinin hepsinin papiller karsinom olması (Tablo 2) ve Çernobil kazasındaki radyoaktif iyodun yetişkinleri etkilemeyip, küçük çocuk ve bebekleri etkilemiş olması, tiroid kanserlerinin yetişkinlerde olmayan ama, küçük çocuk ve bebeklerde bulunan bazı bilinmeyen kaynaklardan geliştiği düşüncesini akla getirmiştir 10, 11, 12, 13 . Öte yandan, tek hücre klonundan kaynaklanan tümörlerin nasıl olup da çok sayıda heterojenite gösterebildiği tartışmalı bir konu olmuş, çoğalma potansiyeli ve süregelen mutasyonlar (özellikle de yavaş büyüyen tiroid kanserleri için) bu heterojeniteyi kısmen açıklayabilmiştir 15. 2.1.5.3.Fetal Hücre Tiroid Karsinogenez Teorisi 2000 yılında, Takano tarafından geliştirilen “Fetal Hücre Karsinogenez”i, tiroid kanser hücrelerinin fetal tiroid hücre kalıntılarından kökenlendiğini ileri sürer. Farinksten kökenlenen fetal tiroid, yavaşça büyüyerek, kademe kedeme boynun ön tarafına doğru hareket eder. Bu ise, bu modele göre; fetal tiroid hücrelerinin yavaş büyüme ve diğer 9 hücreler içine hareket etme yeteneğinin olduğunu gösterir ve bu teori, iyi diferansiye tiroid kanserlerinde görülen lokal invazyon ve uzak metastazın sık (fetal hücrelerin yüksek migrasyon özelliğiyle uyumlu) olmasına karşın, anlaşılamayacak şekilde prognozun iyi olma nedeninin, fetal tiroid hücrelerine benzemesinden (yavaş büyümesinden) dolayı olduğunu ileri sürer (Şekil 3) 10, 11, 12, 13, 14. Şekil 3: Fetal hücre karsinogenezi ile Multi-step karsinogenezinin karşılaştırması Bu doğrultuda yapılan tiroid kanser hücrelerinin 11 . gen ifadelenme çalışmaları, fetal tiroid hücrelerinin 3 tipi ile uyum göstermiştir. Bunlar: “Protirositler”, “Tiroblastlar” ve “Tiroid Kök Hücreleri” dir. Bunların kanseröz karakter kazanmasının, sırasıyla ile; folliküler tümörlerin, papiller karsinomların ve anaplastik karsinomların gelişmesine neden olduğu bildirilmiştir. Bu gen ekspresyon çalışmaları, anaplastik tiroid karsinomaları ile tiroid kök hücrelerinin benzer şekilde, bir fetal protein olan onkofetal-fibronektin (onfFN)’i ifade ettiğini fakat tiroglobülin (Tg)’i (diferansiye özellik) ifade etmediğini; papiller tiroid karsinomaları ile tiroblastların benzer şekilde, hem onfFN’i hem de Tg’i ifade ettiğini ancak 10 folliküler formasyon (daha diferansiye özellik) oluşturmadığını; folliküler tiroid karsinomaları ile protirositlerin ise, onfFN’i değil ama hem Tg’i ifade ettiğini hem de folliküler formasyon oluşturduğunu göstermiştir (Şekil 4) 10, 11, 12, 13. Şekil 4: Tiroid karsinomunda gen ekspresyon profili 10, 11 . Öte yandan bu teoriye göre, fetal tiroid hücrelerinin farklılaşma basamaklarından birinde oluşacak herhangi bir engelleme, fetal hücreyi bir alt basamağa ilerlemekten alıkoyacak ve kanseröz karakter geliştirmesine karsinogenezi, bu neden yönüyle olacaktır multistep (Şekil 5). Fetal karsinogenez hücre modeline benzemektedir. Ancak tek farkı, undiferansiye özelliğin son basamaktaki değil, ilk basamaktaki hadiseler nedeniyle meydana gelmesidir 10, 11, 12, 13, 14 . 11 Şekil 5: Tiroid Kanseri için Kök hücre Modeli 10, 11 . Bu hipotezi destekler nitelikteki bir başka çalışmada, doğum sonrası tiroiditis gibi sağlık sorunu bulunan kadınların tiroid dokularında fetal kökenli olduğu düşünülen hücrelerin tespit edilmesidir 16 . Yine doğum sonrası çeşitli sağlık sorunları bulunan kadınların ilgili dokularında (serviks, ince bağırsak, safra kesesi ve karaciğer) fetal kökenli hücrelerin saptanması sonucu, bu hücrelerin gebelik sırasında oluşan doku hasarına yanıt olarak, fetusdaki fetal kökenli hücrelerin (olasılıkla mezenkimal kök hücreleri) hareketlenip hasarı tamir için transdiferansiye oldukları kanısına varılmıştır 17. 12 2.2. Telomer ve Telomeraz 2.2.1. Telomerler Sağlıklı bir yaşamın sürdürülebilmesi için gerekli olan genom bütünlüğü ve kararlılığının korunması, lineer kromozomların uçlarında bulunan telomerik yapılar sayesinde olur 18,19 . Telomerler, kısa ardışık DNA tekrar dizileri ve özel proteinlerden oluşan nükleoprotein yapılardır. Uzunluğu yaklaşık 10-15 kb kadar olan ve kromozomları şapka gibi örten telomerik DNA, insanda (TTAGGG)n olarak belirlenmiştir 20, 21 . Telomerler, kromozomları hasarlı DNA olarak algılanmaktan ve rekombinasyonlardan, uç uca birleşmelerden korumakta; replikasyonun tam olarak gerçekleşmesini, kromozomların mayozda ve nükleusda fonksiyonel organizasyonunu sağlamakta; ayrıca moleküler saat gibi davranarak bir hücrenin bölünme kapasitesini belirlemektedir 22, 23, 24. Lineer kromozomların DNA replikasyonu, her iki iplikde farklı olduğu için önemli bir soruna neden olmaktadır: İki zincir ayrıldığında yeni bazlar 5’→3’ yönünde eklenmek zorundadır. Öncül (leading) zincirde, sentez yönü ile zincir yönü birbirine uyumlu olduğu için kesintisiz sentez yapılır. Diğer (lagging) zincirde replikasyon çatalına ters yönde, RNA primerlerinin öncülük ettiği, kesik kesik segmentler (Okazaki fragmanları) şeklinde sentez yapılır (Şekil 6). Ancak kromozom sonuna gelindiğinde, RNA primerinin yapışacağı kadar DNA yoktur. Sonuçta fragmanlar bir araya getirilip, devamlı zincir oluşturulduğunda yeni oluşan sarmalın 5’ ucunda küçük bir boşluk kalır ve bu dizi kayıpları zamanla kromozomun kısalmasına yol açar. “Uç replikasyon problemi” denilen bu olayda her hücre bölünmesi, 50-150 bç’i kadar telomerik kayıpla sonuçlanır. Uzama 13 ile dengelenmezse, telomerlerin sürekli kısalarak kritik bir boya ulaşması, kromozom instabilitesine ve bunu takiben hücre ölümüne neden olur 19, 25 . Şekil 6: DNA replikasyonunda 3’ ve 5’ uçlarında farklı sentez mekanizmaları (www.en.wikipedia.org/wiki/File:Dnareplication.png adlı siteden alınmıştır). 2.2.2. Telomeraz Tüm ökaryotik hücrelerin uzun süreli çoğalması telomer erezyonunu engelleyecek “Telomeraz” enzimi gibi bir mekanizmanın varlığına bağlıdır 26, 27 . Telomeraz enzimi, 550 kDa’luk, ribonükleoprotein (RNP) yapısında, yüksek derecede korunmuş ve özelleşmiş bir hücresel revers transkriptazdır (RT). Telomeraz sahip olduğu RNA’yı kalıp olarak kullanarak, kromozomun distal ucundaki tek zincirli telomerik DNA’yı uzatır (Şekil 7). Bu zincire komplamenter zincir (C-zincir) sentezi ise, normal hücresel replikasyon mekanizması tarafından gerçekleştirilir. Sentezlenen telomerik DNA tekrarları, dizi spesifik DNA bağlanma proteinleri ve bunlarla ilişkiye geçen diğer proteinler ile kompleks oluşturarak özel bir yapılanma kazanır 20, 28. İnsan telomeraz enziminin kor bileşenleri; RT olan hTERT, RNA kalıbı hTER ve Telomeraz-ilişkili protein olan TP1’dir 21, 29, 30. 14 Şekil 7 : Telomeraz enzim kompleksi ve fonksiyonu. (www.uke.de/kliniken/medizinische-klinik-1/index_43074.php adlı siteden alınmıştır) 2.2.2.1. Telomeraz katalitik alt birimi (hTERT) hTERT geni 40 kb’a yayılan 16 ekzon ve 15 introndan oluşur (Şekil 8) 31, 32 . İnsan diploid hücrelerinde hTERT geni, 5p15.33 bölgesi üzerinde tek kopya olarak bulunur. Bu bölge, 5. kromozomun kısa kolu üzerindeki en uç bölgede bulunan banttır. hTERT geninin subtelomerik bölgede yer alması, hTERT gen ekspresyonunun telomer yerleşimine bağlı olarak baskılanabileceğini düşündürür 32, 33. Şekil 8 : hTERT geni 48 . 15 İnsan telomerazı RT geni (hTERT), 127 kDa’luk bir protein kodlar. hTERT proteini sağ el avuç içine benzetilmiştir (Şekil 9); avuç içi bölgesi RT domaini, diğer parmak bölgeleri ise T motifini içerir. RT domaini: N ucundan C ucuna doğru 1, 2, A, B, C, D, E olmak üzere 7 motiften oluşur ve taşıdıkları aspartik asitlerin telomerazın aktifleşmesinde önemli rolü vardır. Bu aspartik asitlerin mutasyonu sonucu alanine değişmesi ile kısa telomer tipi ve dolayısı ile hücre yaşlanması görülür. Ayrıca hTERT’le ilişkili p23 ve p90 proteinleri, aktif telomerazı oluşturmak için komponentlerin doğru olarak bir araya getirilmesini sağlar 22, 29, 31,34,35, 36 . Şekil 9: Telomeraz enzim proteininin avuç içi modeli; avuç içi bölgesinde DNA’sı ile telomeraz RNA’sının bulunuşu telomer 36 . 16 2.2.2.2 Telomeraz RNA altbirimi (hTER) İnsan telomerazı RNA bileşeni (hTER), 5’ ucundaki 1-6 adet kadar 5’-CUAACCCUAAC-3’ dizisiyle telomerik tekrarların sentezi için kalıp görevi görür. hTER geni, 3q26.3 bölgesinde yer alan tek kopya gendir. Meme kanseri ve baş-boyun skuamöz hücreli karsinomlarında gözlenen amplifikasyonu, hTER’in bir onkogen gibi davranabileceğini göstermektedir 19, 37 . İnsan telomeraz enzimi RNA bağlanma proteini olan Diskerin’in mutasyonu sonucu gelişen X’e bağlı, Diskeratozis Konjenita’da ise 5 kat azalmış hTER’in görülmesi, bu proteinin telomeraz RNA’sının işlenmesinden veya stabilitesinden sorumlu olduğunu göstermiştir 38. 2.2.3. İnsanda Telomeraz Aktivitesinin Kontrolü İnsanda telomeraz aktivasyonunun kontrolü, sadece katalitik bileşen hTERT seviyesinde olduğu kabul edilir, çünkü diğer bileşenler genellikle sürekli eksprese edilir. Ayrıca telomer-ilişkili proteinler de telomeraz aktivasyonu ve fonksiyonunda önemli rol oynamaktadır 20, 22. 2.2.3.1. Telomeraz enziminin hTERT seviyesinde kontrolü hTERT’in transkripsiyonel regülasyonu hiç şüphesiz ki telomeraz aktivitesinin düzenlenmesinde primer mekanizmadır 20, 22 . hTERT transkripsiyonunun gelişimsel süreçte düzenlenmesi ve hTERT promoterlerinde CpG adalarının yaygın olması, metilasyonun hTERT baskılanması ile ilgili olduğunu düşündürür 20, 29 . Örneğin Myc gibi bazı 17 aktivatörler ile Mad gibi bazı baskılayıcılar fonksiyonlarını, sırasıyla Histon Asetil Transferaz (HAT) ve Histondeasetilaz (HDAC) komplekslerinin toplanmasıyla gösterirler. Ayrıca Sp1, kanser hücrelerindeki aktivatör fonksiyonuna karşılık, normal hücrelerde hTERT transkripsiyonunu baskılamak üzere HDAC toplanmasını sağlar (Şekil10) 26, 39 . İlginç bir durum, telomeraz-negatif olup alternatif yolla telomerlerini uzatan 2 hücre soyunun (SUSM-1 ve GM847), DNA-metilasyon inhibitörü 5-azasitidinle muamelesi sonucu hTERT transkripsiyonunu indüklendiğinin gösterilmesidir 40. Bunlara ilaveten, p53, pRB, E2F, WT1, Myeloid hücre spesifik protein 2, IFNα ve TGF-β, gibi bazı transkripsiyon faktörlerinin hTERT’i negatif olarak regüle ettiği; Human Papilloma Virus 16E6 ve steroid faktörlerin (östrojen gibi) ise pozitif yönde regüle ettiği gösterilmiştir (Şekil10) 20,26, 29. Şekil 10: hTERT geninin transkripsiyonel regülasyonu 26 . 18 Normal kromozomların telomeraz-pozitif hücrelere transferi ile, hTERT ekspresyonu ve telomeraz aktivitesinin baskılanabildiğinin gözlenmesi, insan hücrelerinde hTERT transkripsiyonunu baskılayan genlerin varlığını düşündürmüştür. Delesyon analizleri kromozom 3p21.3 ve 3p12-21.1 bölgelerinin, hTERT transkripsiyonunu baskılayan genleri içerdiğini göstermektedir delesyonlar 41 saptanmıştır. . İnsan kanserlerinin çoğunda, bu bölgelerde Benzer bir durum, telomeraz-pozitif hepatosellüler karsinom hücre soyunda (Li7HM) 10p15.1 bölgesi için bir 42 , yine insan papilloma virüs-16 (HPV-16) ile ölümsüzleştirilmiş insan keratinositleri ve servikal kanser hücre serisinde de kromozom-6 için gözlenmiştir 20, 43. Ayrıca PKC, Akt protein-kinaz ve c-Abl moleküllerinin, hTERT’in fosforilasyonu yoluyla telomeraz aktivitesini arttırabileceği yönünde veriler olup, bu yöndeki bilgiler her geçen gün artmakmaktadır 29. 2.2.3.2.Telomerazın telomerik proteinler tarafından kontrolü İnsan telomerlerinde, daha uzun olan ve tek zincirli DNA ile sonlanan 3’ ucu (75-300 nükleotit kadar), telomerik DNA dubleksi arasına girerek t-loop yapısını oluşturur. Yapılan çalışmalar, telomerazın telomer sentezi yapabilmesi için 3’ uzantısına ulaşabilmesi gerektiğini göstermiştir. Böylece t-loop yapısı, telomerlerin korunmasına yapısal bir çözüm getirmekle birlikte; telomerazın, telomerlere erişimini engellemek suretiyle de telomeraz aktivitesinin kontrolünü sağlamaktadır 38. 19 Telomer yapısı ve işlevini korumaktan, DNA onarım sistemiyle iletişim kurmaktan ve telomerazın telomerle etkileşimini düzenlemekten sorumlu birçok telomerik protein tanımlanmıştır 20, 28, 38 . İlk tanımlanan; TRF1 ve TRF2 ((TTAGGG) tekrar bağlanma faktörü 1, 2)’dir. Telomer devamlılığı için fonksiyonel açıdan birbiriyle ilişkili olan bu proteinler, çift zincirli DNA’ya bağlanarak t-loop oluşumunu sağlayan kritik faktörlerdir (Şekil11A) 20, 28, 38, 44 . Uzun telomerler daha fazla TRF1,TR2 bağlayacağı ve diğer proteinlerle birlikte kolayca katlanarak kararlı bir yapı oluşturacağı için, bu yol telomer uzunluğu bakımından bir çeşit negatif kontrol sağlar ve telomerazın neden öncelikle kısa telomerleri uzattığını açıklayabilir (Şekil11D). TRF1’in aşırı ifadesi insan hücrelerinde kısalmış telomerler ile sonuçlanmakta, hem TRF1’in hem de TRF2’nin azalmış ekspresyonu ise telomerlerin uç uca füzyonuna neden olmaktadır 20, 28, 38, 44 . Yapılan çalışmalar, TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, POT1 ve TPP1 proteinlerinin, telomerleri oluşturduğunu göstermiştir regüle etmek üzere kompleks 20 . Bu kompleks, “Shelterin” (şelterin) olarak genel bir isim altında toplanmıştır 28 . Şekil11 A’da POT1 proteininin, tek zincirli telomerik DNA’ya dizi spesifik bağlanması,ve şelterin kompleksinin bilinen 6 alt birimi, bunların birbirleri ile ilişkileri ve DNA bağlanma durumları görülmektedir. B’de t-loop yapısı, C’de ise şelterin kompleksinin t-loop yapısındaki yerleşimi gösterilmektedir. Şekil 11D’de ise, uzun ve kısa telomerik DNA üzerinde şelterin kompleksinin yerleşimi verilmektedir. 20 Sekil 11: Shelterin Kompleksi: (A) POT1 proteinin tek zincirli DNA’ya bağlanma bölgesi ve Selterin kompleksinin bilinen 6 alt birimi ve telomerik DNA üzerinde selterin kompleksinin yerlesimi, (B) t-loop yapısı, (C) Selterin kompleksinin t-loop yapısına girmesi, (D) uzun ve kısa telomer yapılarında Selterin kompleksinin 28 telomeraz aktivitesine etkisi . 21 İnsanda tek-zincirli telomerik DNA’ya bağlandığı bilinen tek protein POT1’dir. POT1 , telomer uzunluğunun negatif regülasyonundan sorumlu OB kıvrım yapısıyla, spesifik olarak G’den zengin tek zincirli telomerik DNA’ya bağlanır (Şekil 11A). Böylece, t-ilmek yapısının karalılığını sağlayarak telomerazın 3’ uzantısına erişmesini engellediği düşünülmektedir 20, 38 .Yine komplekste, POT1’in TRF1’e bağlanmasından sorumlu, TPP1 de tanımlanmıştır 44, 45 . Ayrıca kompleksde bulunan TIN2’nin, TRF1’in telomerik DNA bölgeleriyle ilişki kurma yeteneğini kuvvetlendirdiği ve TIN2’nin telomer uzunluğunu düzenlemede telomeraz bağımlı olduğu bildirilmektedir (Şekil 11A) 38, 44 . Telomeraz inhibitörü olarak karakterize PINX1’in de TRF1’le etkileşdiği bildirilmektedir 46. 2.2.4. Telomeraz Aktivitesi ve Kanser Normal hücrelerde telomer kısalması, hücrelerin bölünmesini sınırlayan hücre içi moleküler bir sayım mekanizması gibi davranır. Böylece hücreler, “Hayflick limit” olarak adlandırılan maksimum bir sayıya kadar bölünebilmektedir. Bu sınırdan sonra, “replikatif yaşlanma” (senesens) veya “1. Mortalite evresi” (M1) olarak adlandırılan, büyümeyi duraklatan bir engelle karşılaşırlar 24, 29, 44, 47,48 . Replikatif yaşlanmanın, hücreyi, çok sayıda onkojenik mutasyonun birikimine karşı koruduğu ve böylece tümör baskılayıcı olarak iş gördüğü düşünülür 29, 47, 48, 49 . Şayet P53 gibi hücre döngüsünün kontrolünde görev alan kritik genlerin inaktivasyonu olursa, replikatif yaşlanmadan hücreler kaçarak bölünmeye devam edebilmektedir. Sonuç olarak kritik seviyede kısalarak işlevsizleşmiş telomerlerin ve çoğunlukla birleşmiş veya anormalleşmiş kromozomların oluştuğu; “kriz” veya “2. Mortalite evresi” (M2) olarak adlandırılan ve kitlesel hücre ölümü ile sonuçlanan ikinci bir engelle hücreler karşırlar. Şayet telomeraz enzimi aktive olursa, telomer boylarını 22 koruyabilen ve krizi aşarak hayatta kalan nadir hücreler, sınırsız olarak bölünebilme yeteneği kazanırlar (hücresel immortalizasyon) 24, 29, 44, 47 . Böylece hücreler, ölümsüzleşme üzerine stabil hale gelmekte ve bunu da telomeraz aktivitesinin başlattığı bildirilmektedir. Bu durum ise, aktif telomerazın varlığına rağmen, kısa telomerlerin görülmesine bir açıklık getirmektedir.Telomeraz, trajik düzeyde telomer kaybının ardından, yıpranmış uçları stabilize ederek aktive olmaktadır (Şekil 12) 24, 29, 44, 47. Sekil 12: İki basamaklı hücresel senesens ve immortalizasyon hipotezi 44 . Öte yandan telomeraz aktivitesine sahip olmayan fakat telomer boylarını uzatabilen kanser hücreleri de bildirilmiştir. Mekanizması henüz tam olarak aydınlatılamamış ALT (Alternative Lengthening of Telomeres) üzerine yapılan bazı çalışmalarda telomere DNA görülmüştür taşımak için 20, 50, 51 rekombinasyonların , telomerden diğer meydana geldiği 50, 52 . Ayrıca telomeraz enziminin, bazı onkogenlerle işbirliği yaparak ve bazı tümör baskılayıcı genleri ise baskılayarak, normal insan epitelyal hücrelerinin ve fibroblastlarının tümörojenik dönüşümüne neden olduğu gösterilmiştir 24 . Tüm bu veriler, telomerazın kanser tanı ve takibinde bir belirteç olabileceğini; telomeraz inhibisyonunun ise kanserle mücadelede yeni yaklaşımlara ışık tutabileceğini düşündürmektedir 53. 23 2.3. Programlı Hücre Ölümü: Apoptoz şartlarda Fizyolojik ihtiyaç duyulmayan veya patolojik koşullarda fonksiyonları bozulan hücrelerin, çevreye zarar vermeden, genetik faktörlerin kontrolünde programlı bir şekilde olan ölümüne “apoptoz” denilir 54, 55, 56 . Apoptoz çok sayıda fizyolojik, adaptif ve patolojik olayda kullanılır ve hücrelerin yaşam ve ölüm arasındaki dengesinin korunması için esansiyeldir 57, 58, 59 . Apoptoz denge için olduğu kadar çoğalma ve farklılaşma için de önemlidir. Örneğin, embriyogenezde elayak parmakları arasındaki hücrelerin yıkılmasında; erişkin dönemde ise, menstruasyondaki endometrial hücrelerde ve barsak kript epitelinde olduğu gibi apoptoz görülmektedir. Ayrıca hipoksi, ısı, radyasyon ve çeşitli anti-tümör ilaçları gib hasar oluşturan çeşitli etkenler normalde hücrenin nekrozuna sebep olurken, düşük dozlarda apoptoz oluşturabilmektedir 60, 61, 62 . Bugünkü birçok anti-tümör ilaçlarının olası etki mekanizmaları ise, hedef tümör hücrelerinde apoptozise neden olma yetenekleriyle ilgilidir 63, 64, 65 . 2.3.1. Apoptotik Hücrede Görülen Değişiklikler Apoptoz mekanizmasının sonuçları benzerdir. Özelleşmiş yüzey yapılarını, diğer hücrelerle temas yüzeylerini kaybederek hücreler arası kontak kesilir; kromatin, çekirdek membranına yakın kısımlarda yoğunlaşır; su kaybı ile hücreler ve çekirdek büzüşür ve küçülür. Apoptotik hücrenin en önemli özelliği, membran bütünlüğünün korunmasıdır ve organeller genelde sağlamdır. Daha sonra hücre membranla çevrili “apoptotik cisim” denilen küçük parçalara bölünür ve çevre fagositler tarafından yutularak ortadan kaldırılır (Şekil 13) 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61, 62, 66. 24 Şekil 13: Apoptozun sinyal yolakları, mekanizması ve morfolojisi (Elsevler. Kumar: Robbins Basic Pathology 8e- www.studentconsult.com ). 2.3.2. Apoptotik Sinyal Yolakları Apoptotik kaskad iki ana yol tarafından başlatılabilir: 1- Ekstrinsik ya da ölüm reseptörü yolu, 2- İntrinsik ya da mitokondri yolu. Bu iki yol bağlantılıdır ve bir yolakta yer alan molekül diğerini etkiler 67, 68, 69 . Apoptoz, hücre ölüm reseptörü olarak bilinen Fas (APO-1, CD95)’ın ligandı (FasL) ile ve tümör nekroz faktör reseptörü (TNFR)’nün ilgili ligandları (sitokinler) ile uyarılması sonucu, kendilerinde doğal olarak bağlı bulunan ölüm bölgeleri (DD) (Fas ile ilişkili ölüm bölgesi =FADD ve TNFR-1 ile ilişkili ölüm bölgesi =TRADD) ile interaksiyona girerek “ölüm başlatan sinyal kompleksi”ni (DISC) oluştururlar. Bu ölüm komplesi ise 25 kaspazların kaskad tarzında aktivasyonlarını başlatan prokaspaz-8’i aktifleştirir. Aktif kaspaz-8 ise bir yandan pokaspaz-3’ün aktifleşmesini sağlarken, diğer yandan sitokrom-c’nin mitokondriden sitoplazmaya salınmasını da uyarır (Şekil 14) 70, 71, 72. Mitokondri, apoptoz başlatan yolların kesişme noktasıdır ve geri dönüşümsüz bir döneme girildiğine işaret eder. Bid ekstrinsik ve intrinsik yollara bağlanır. Kaspaz-8 tarafından Bid’in yarılması, mitokondri dış membran permeabilizasyonu Bax ya da Bak aracılığı ile başlatır 73, 74, 75 . Bax/Bak’ın mitokondriye translokasyonu sitokrom-c’nin, “apoptoz- indükleyici faktör” (AIF, Apoptosis-Inducing Factor) ile birlikte mitokondriden sitoplazmaya salınmasını ve sitoplazmik protein APAF-1’e bağlanarak, ardından ATP’nin de katılımıyla “apoptozom” adı verilen bir kompleksin oluşmasını sağlar. Bu kompleks inaktif olan prokaspaz-9’u, o da prokaspaz-3’ü aktive eder (Şekil 14) 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82. 80 Şekil 14:Ölüm reseptörü aracılı ve mitokondi aracılı apoptoz sinyal yolları . 26 2011 Hücre Ölümü Terminoloji Komitesi; intrinsik apoptozu, kaspaza bağlı ve kaspazdan bağımsız olarak ikiye ayırmıştır83. Bu yol, T hücre aracılı sitotoksisiteyi ve perforin-granzim bağlı hücre ölümünü kapsamaktadır. Perforin–granzim yolu granzim-A ya da B kullanılarak apoptoza neden olur. Granzim-A yolu kaspaz bağımsız hücre ölüm yoludur ve tek zincirde DNA hasarı oluşturmak suretiyle aktivite gösterir 84,86 . Granzim-B ve ekstrinsik yollar aynı terminal yol üzerinde birleşirler (Şekil 13) 87, 88. Son zamanlarda, diğer iki yoldan farklı olarak endoplazmik retikulum (ER) aracılı apoptotik yol tanımlanmıştır. ER stresinin, hücre ölümünü tetiklediği gösterilmiştir. Artan kalsiyum seviyeleri ile kalpainin ER’u etkilemesi sonucunda prokaspaz-12 aktiflenerek sitoplazmaya yönelir, kaspaz-9 ile etkileşerek sitozolik kaspaz kaskadını aktive eder 89. 2.3.3. Apoptoz Mekanizmaları Apoptoz, iç ve dış sinyallerle tetiklendiğinde hücre içinde “kaspaz” (CASPASE; Cysteine-dependent ASPartate specifik proteASEs, sistein bağımlı aspartata spesifik proteaz) adı verilen bir grup sistein proteaz aktive olur ve hedef polipeptitlerin aspartik asitten sonraki peptid bağını kırmak suretiyle etki ederler. Bugüne kadar memelilerde 14 tane kaspaz tespit edilmiştir. Apoptotik hücre ölüm yolağının ana regülatörleri olan kaspazlar, 400’den fazla substratı proteolitik olarak keserek görev yaparlar.Kaspazlar ayrıca, inflamasyon, hücre farklılaşması, proliferasyon, hücre döngüsünün regülasyonu ve füzyon gibi pek çok fizyolojik süreçte de yer almaktadır 90, 91, 92, 93, 94, 95. 27 Kaspazlar apoptotik programda biyolojik olarak iki farklı grupta incelenmektedir. A) Apoptozu başlatıcı (initiator) kaspazlar (kaspaz-2, 8, 9, 10); çeşitli hücre-içi ya da hücre-dışı sinyalleri proteolitik aktiviteye çevirerek kaspaz kaskadının başlatılmasından sorumlu olan kaspazlardır. Hücre dışı sinyallerle aktifleşen başlatıcı kaspazlar (örneğin kaspaz-8) reseptör aracılı (ekstrensek) yolağı, hücre içi sinyaller aracılığı ile aktifleşen başlatıcı kaspazlar ise (örneğin kaspaz-9) mitokondri aracılı (intrensek) yolağı başlatarak kaspaz kaskadını tetikler. B) Apoptozu sonlandırıcı (executioner) kaspazlar (kaspaz-3, 6, 7) ise; hücre içerisindeki spesifik polipeptid hedeflerini proteolitik olarak keserler. Ayrıca kaspaz-1, 4, 5, 11, 12 ve 14 pro-inflamatuar sitokinlerin inflamasyon sürecinde görev alan kaspazlar olarak sınıflandırılmaktadır 96, 97, 98, 99. Kaspazlar, sağlıklı hücrelerde enzimatik olarak inaktiftir ve aktif forma göre daha uzun bir polipeptid zincir şeklinde bulunurlar. Buna “zimogen form” denilir ve 100 amino asitten fazla uzun öncül bölge başlatıcı kaspazların, 30 amino asitten az kısa öncül bölge ise sonlandırıcı kaspazların karakteristiğidir. Uzun öncül bölgelerde bulunan motifler, adatör proteinlerle etkileşimi sağlar 100, 101 . Başlatıcı kaspazlardan kaspaz- 9, monomerik bir proteindir ve katalitik sistein ve histidin kalıntıları ters yerleşerek substratın ulaşımı engellenir. Kaspaz-9’un dimerizasyonu sonucu konformasyonel değişim gerçekleşir ve substratın bağlanması ile katalitik kalıntılar aktivite gösterir. Sonlandırıcı kaspaz enzimlerini keserek aktif hale getirir ve böylece apoptoz süreci başlamış olur. Prokaspaz-8 ve 10, ekstrensek yolak kaspazları olup, bunlarda benzer şekilde dimerizasyon ile aktifleşen monomerlerdir. Sonlandırıcı kaspazların zimojenleri ise, başlatıcı kaspazların aksine fizyolojik koşullarda dimerik yapıdadır ve çeşitli aspartat kalıntılarından kesilmeleri ile aktivasyonları gerçekleşmektedir 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111. 28 Kaspaz aracılı protein yıkımı apoptotik hücrelerde gözlenen bazı biyokimyasal olayların da temelini oluşturmaktadır. Kaspazlar substratlarında en az 4 amino asidi tanırlar ve tanıdıkları tetrapeptidlere göre gruplara ayrılırlar 112, 113 . Kaspaz-3, endonükleaz inhibitör proteinini (Inhibitor of Caspase-Activated Endonuclease, ICAD) keserek serbest kalan CAD enzimi (Caspase-Activated Endonuclease) ile DNA’nın fragmantasyonunun gerçekleşmesini sağlar. Kaspaz-3’ün, ayrıca aktin kesici enzim gelsolin’i keserek aktifleştirmesi, apoptozun en karakteristik morfolojik değişimlerinden olan plazma membranında tomurcuklanmaya neden olmaktadır. Bunun yanı sıra kaspaz-3, laminin-B, sitokeratinler ve nükleer-mitotik aparat proteini (nuMA) gibi hücre-iskelet elemanlarının kesiminden de sorumludur. Kaspaz-3 aynı zamanda pek çok protein kinaz enzimini hedefleyerek bu enzimlerin inhibitör bölgelerini kesmek suretiyle aktivasyonunu sağlamaktadır. Bu protein grubundan olan protein kinaz C enziminin aktivasyonu ile fosfatidilserinin normal koşullarda bulunduğu plazma membranının iç kısmından dış kısmına dönüşünü katalizleyen “phospholipid scramblase” enzimi aktifleşir. Hücre membranının fosfolipid asimetrisindeki bu kayıp apoptozun karakteristik göstergelerinden biridir ve makrofajların yüzeylerinde bulunan fosfatidilserin reseptörleri tarafından apoptotik hücrelerin tanımlanması ile fagositozu gerçekleşmektedir 116, 117, 118, 119, 120 114, 115, . Bu nedenle kaspaz enzim aktivitesinin belirlenmesi apaptozun izlenmesinde temel yöntemlerden birini oluşturmaktadır. 2.3.4. Apoptozun Regülasyonu (Anti/Proapoptotik Proteinler) P53; apoptozda kritik öneme sahiptir. Hücrede DNA hasarı oluştuğunda S fazına geçişi bloke eder. Böylece DNA tamiri için zaman kazanılır. Tamir mümkün değilse hasarlı hücre apoptozla yok edilir 121. 29 Bcl-2 ailesi; apoptotik kaskadın kontrolünde merkezi bir rol oynar. Mitokondri dış zarının sitoplazmik yüzeyinde, ER ve çekirdek zarında lokalize olmakta ve iyon transportunu düzenlemektedir. Bcl-2 ailesi birbirine zıt etkili iki gruptan oluşur. Bu gruplardan biri pro- diğeri anti-apoptotik etkiye sahip olup bu üyelerin dengesi, yaşam ile ölüm arasındaki seçeneği belirler. Bcl-2’nin anti-apoptotik etkisi, sitokrom-c veya AIF (apoptotik uyarıcı faktör)’in mitokondriden çıkmasını engelleyerek göstermektedir ve bu grubun en iyi bilinen üyeleri: bcl-2, bcl-XL, Mcl-1 iken; pro-apoptotik olanlar ise: bax, bcl-Xs, Bad, Bim, Bak ve Bid’dir. Bax, Bad ve Bid normalde sessiz halde bulunur, aktive edildiklerinde sitokromc’nin sitoplazmaya salıverilmesini sağlarlar. Bcl-2’nin, antioksidan bir etkiye sahip olduğu ve böylece “oksidatif stresin” neden olduğu apoptozu baskılayabildiği bulunmuştur 122, 123. XIAP, cIAP1, cIAP2, NAIP; antiapoptotik protein ailesinden “apoptoz protein inhibitörleri” (IAP; Inhibitor of APoptozis) programlanmış hücre ölümünün negatif regülatörleridir. Hücre ölümünü kaspaz-3, kaspaz7 ve kaspaz-9’a direkt bağlanıp inhibe ederek gerçekleştirirler 124, 125, 126, 127, 128 . 2.3.5. Apoptoz ve Kanser Apoptoz mekanizmasının tetiklenememesi (p53 gen defekti) veya mekanizmanın herhangi bir basamağında meydana gelen değişiklik (bcl-2’nin artışı, Fas gen defektleri gibi), tümör gelişiminde rol oynamaktadır. Ayrıca tümör hücrelerinin doğal immün mekanizmalarla ortadan kaldırılamamasının da tümör gelişiminde, özellikle de tümör hücrelerinin yayılımında, önemli olduğu düşünülmektedir. Malign hücrelerin, konak immünitesinden kaçışı ve sitotoksik immün sistem 30 hücrelerinin tümör hücreleri tarafından ortadan kaldırılması kanser gelişimi ve progresyonu açısından çok önemlidir. Bu olgularda tümör hücrelerinin, ölüm faktörü üreterek (FasL) sitotoksik T lenfositlerinde ve natural killer hücrelerinde apoptozu başlattığı düşünülmektedir. Tümör hücrelerinin, sitoplazmik membranda FasL artışı ve Fas reseptör düzeyinde azalmanın oluşu, apoptoza direnç geliştirmesine neden olmaktadır. Bunun yanında kanser hücreleri, apoptoz karşıtı olan bcl-2, c-myc gibi sağkalım genlerini aşırı derecede eksprese ederek ve ölümden sorumlu genleri de baskılayarak, ölüm sinyallerinin alınmasını önlerler 129, 130. Günümüzde farklı kanserlerin tedavisinde kanser hücrelerini ölüme götürmek için radyoterapi ve kemoterapiden sıklıkla yararlanılmaktadır. Ancak bu tedavi metodlarının etkinliği p53 tümör baskılayıcı proteinin fonksiyonel olmasına bağlıdır 131 . Özellikle çeşitli ileri evre kanserlerinde, p53 geninde meydana gelen mutasyonlar, bu tedavi metodlarına dirençle kendini gösterir. TNF ailesi ölüm ligantlarının ise (TNF-a, FasL..vb), apoptozu p53 bağımlı yollarla indükleyebildikleri bildirilmiştir 132, 133 . Apoptoz oluşturan ajan TRAIL’in ROS’da olduğu gibi normal doku ve hücrelere zarar vermeden seçici bir tedaviye olanak sağladığı son yıllarda gösterilmiştir 134, 135, 136, 137 . Bid aktivasyonu yapan yöntemlerin, çeşitli kanser hücrelerinde apoptoz oluşturduğu saptanmıştır 138 . Yapılan bazı çalışmalarda engellenmesiyle ekspresyonunun sağlandığı gösterilmiştir ise, antiapoptotik apoptotik sürecin Bcl-2 gen başlamasının 139 . Kaspaz-3, 6, 8 ve 9’un aktivasyonunu arttıran in vivo ve in vitro çalışmalarda da kanserde gerileme ya da durma yanıtları alınmıştır 140, 141 . Çeşitli tedaviler ile apoptozun uyarıldığı kanser hücrelerinde, tedavinin hangi transkripsiyon faktörlerinin ekspresyon miktarını değiştirdiğinin belirlenmesi, o kanser hücresinde apoptozun hangi düzeyde regüle edildiğinin anlaşılması sağlar 142. 31 2.4. Araştırılan Genler 2.4.1. VEGF-A Geni Tümörler 1-2 mm3’den daha fazla büyüyecekleri zaman, besin ve oksijen sağlamak amacıyla önceden var olan damarlardan yeni kan damarlarının oluşumunu sağlarlar. Bu şekilde tümör büyümesi ve sistemik dolaşımla metastaz gözlenmektedir143,144. Tümör anjiyogenezi tümör hücreleri tarafından anjiyogenik faktörlerin salınımı, proteolitik enzimlerin aktivasyonu ve endotelyal hücrelerin proliferasyonu, göçü ve farklılaşmasını içeren çok aşamalı kompleks bir mekanizmadır 144 . VEGF tümör anjiyogenezinde ve tümör endotelyal hücrelerinin yaşamasında anahtar rol oynayan bir moleküldür. VEGF geni 8 exon ve 7 introndan oluşur, kromozom 6p21.3’te lokalizedir. VEGF-A, human VEGF, vasküler permeabilite faktörü olarak da bilinir. 35-45 kDa ağırlığında disülfid bağları ile birbirine bağlanmış dimerik bir glikoproteindir145,146. VEGF ekspresyonu lokal doku oksijen konsantrasyonu tarafından kontrol edilir. Hipoksik koşullarda hücre çekirdeğindeki VEGF promotor bölgesine HIF-1bağlanır. Bu bağlanma sonucu VEGF gen transkripsiyonu ve mRNA sentezinde artış saptanır147. Endotel hücreleri dışında beyin, karaciğer, böbrek ve dalak gibi pek çok doku tarafından salgılanır. VEGF’in yeni damar gelişiminin düzenlenmesinde görevli en önemli faktör olduğu ve tümör tarafından salınan VEGF’in, vasküler endotel hücrelerin büyümesi ve poliferasyonunu, endotel hücrelerinin göçünü, olgunlaşmamış endotel hücrelerinin apoptozdan korunarak sağkalımını ve artmış kapiller vasküler permeabiliteyi sağlayarak anjiogenez indüksiyonuna katkıda bulunduğu bildirilmektedir148,149,150,151,152,153,154.Tiroid kanserlerinde VEGF ifadelenmesi yüksek seviyede bulunmuştur155, 156, 157. 32 2.4.2. PTEN Geni Fosfataz ve tensin homolog (pTEN), 10q23 kromozom bölgesinde lokalize olan ve bir enzimatik fonksiyonu olduğu bilinen ilk tümör supresör moleküldür. Hem protein hem de lipid fosfataz özelliği ile dual etkilidir158,159. PTEN, reseptör tirozin kinazlar tarafından hücre içine aktarılan ve daha sonra fosfoinozitid-3-kinaz (PI3K) aracılığı ile nükleusa ulaştırılan sinyal iletim yolağında işlev görmektedir.PTEN, tümör supressör özelliği olan lipid fosfataz aktivitesi ile bu yolaktaki PI3K ürünleri olan fosfotidilinozitol trifasfatları (PIP3) defosforile etmekte 160, böylece hücrenin büyümesi, yaşamını sürdürmesi, proliferasyon ve migrasyon gibi birçok hücresel fonksiyonu etkileyen PI3K/Akt-bagımlı hücre büyüme yolağını antagonize ederek; apoptoz ve G1 hücre siklusunda duraklamaya sebep olur. PTEN aktivasyonunda azalma ile PIP3 artısı meydana gelir161,162. PTEN’in bir başka özelliği de hücre iskeleti proteinlerinden tensin ve auxilin ile sekans homlojisini taşımasıdır. Tensin, fokal adezyonlarda aktin flamentlerine bağlanan ve integrin-aracılı hücre adezyonunda rol alan bir hücre iskeleti proteinidir. PTEN, protein tirozin kinaz aktivitesi ile fosforile tirozin,serin, treonin amino asitlerini parçalamaktadır. Sonuçta, fokal adezyonlarda integrin aracılı hücre sinyalleşmesini inhibe ederek hücre-ekstrasellüler matriks ilişkilerini ve hücre yayılmasını kanserlerinde en selektif fazla olarak bozmaktadır163. mutasyonu görülen PTEN genlerden insan birisidir. Glioblastoma, malign melanom, meme, prostat, endometrium ve tiroid karsinomları en sık gösterilen PTEN anomalili kanserlerdir164,165,166,167,168. 33 2.4.3. p21 Geni p21 bir CDK inhibitörüdür. Siklin-bağımlı kinazlar hücre döngüsünün girisini düzenleyen kontrol molekülleridir ve bu proteinlerin incelenen tüm ökaryotlarda yüksek derecede korunmuş dizilere sahip oldukları bilinmektedir. p21 geni DNA hasarı sonucu hücre döngüsünün durdurulması ya da hücrelerin apoptozise yönlendirilmesi sürecinin anahtar bileşenlerindendir169,170,171. p21 miktarındaki artış, hücrelerin G1 fazından S fazına ya da S fazından G2 fazına geçişlerini engeller ve böylece hücreler genomik onarım tamamlanıncaya kadar G1 fazında durdurulur170,171. p21’in G2/M kontrol noktasında da rol oynadıgı rapor edilmiştir 171 .p21 geni insanda göz, bagırsak, karaciger, kemik, serviks ve deri olmak üzere birçok hücre ve dokuda ifade edilir. ilerleyen yaşla birlikte p21 miktarındaki artışın, Araştırmalar apopitozis mekanizmasında önemli bir olay oldugunu ve CDK’lerin inaktivasyonunda etkin rol üstlendiğini kanıtlamıştır169,172. Şekil 15:Genisteinin, hücre yaşamı,hücre döngüsü ve apoptotik yolaklara etkisi 308 . 34 2.4.4. NF-κB Geni Nükleer faktör-kappa B (NF-κB), evrimsel süreçte göze çarpan korunmuş yapı ile bütün hücre tiplerinde bulunur ve stres, sitokinler, serbest radikaller, ultraviyole ısınları, bakteriyel ve viral ajanlar gibi uyaranlara hücresel cevap oluşumunu bağımsız ve koordineli bir şekilde düzenleyen bir tanskripsiyon faktördür. NF-ĸB, birçok farklı gen üzerindeki alışılmamış düzenleme mekanizması ile 150’den fazla gende anlatım düzenlemesi yapar173,174,175. Uyarılmamış hücrelerde NF-κB, inhibitör kappa Bα (IκBα) proteini ile inaktif bir kompleks oluşturur ve sitoplazmada bulunur ve NF-κB çekirdeğe taşınamaz. Hedef genin transkripsiyonu için uygun sinyal alındığı zaman IκBα, mitojen ile aktive edilmiş protein kinaz (MAPK),IkB kinazlar (IKK) veya PKC tarafından fosforillenir. Fosforillenmiş IkBα, ubikütin aracılı proteolizle yıkılır. NF-κB ise serbest kalarak, çekirdeğe girer, hedef gen üzerindeki promotöre veya enhancer bölgesine bağlanır ve hedef genin transkripsiyonunu aktive eder175,176,177. NF-κB, hücre çoğalması, farklılaşma, apoptozis, hücre transformasyonu ve tümör gelişiminin düzenlenmesi için önemlidir.Yüksek metastatik kanser hücrelerinin en önemli özelliklerinden birinin NF-κB trankripsiyon faktörlerinin sürekli aktivasyonu olduğu bilinmektedir173. NFκB’nin aktivasyonu ve aşırı ekspresyonu kolorektal kanser175,178,göğüs kanseri179, melanoma176,177, over kanseri180, multiple myeloma181 gibi çeşitli kanser oluşumuyla tiplerinde 182,183,184 tümör oluşumu, büyümesi ve metastaz ilişkili olduğu bilinmektedir. NF-ĸB aktivitesi kanserli hücrelerin kemoteropotik ilaçlara karşı olan dirençlerinin artmasına yol açmaktadır185,186. NF-ĸB aktivasyonu aynı zamanda birçok proapoptitik genin (bax) baskılanmasında da rol alır187,188. Birçok enflamatuvar ve antikanser ilaçlarının bir bölümü, sadece NF-ĸB aktivasyonunu inhibe edecek şekilde tasarlanmışlardır174,189. 35 2.5. Kullanılan Fitoterapötik İlaçlar 2.5.1. Timokinon (TQ) Timokinon (TQ) (2-İ-isopropyl 5-methyl-1,4-benzoqoinone), (C10 H12 O2) (164,201 g/mol) bir monoterpen kinon olup çörekotu (Nigella Sativa) uçucu 190 yağının temel biyoaktif bileşeni olarak bulunmakta ve 2000 yılı aşkın süredir halk ilacı olarak kullanılmaktadır191. Yapılan deneylerin sonuçlarına 192,193,194 göre TQ; antioksidan 199 antidiyabetik , anti-inflamatuar , antihepatotoksik antikardiyotoksik 205,206 195,196 , antiülser1 200, 201, 202 , antinörodejeneratif , antinefrotoksik 207, 208 97,198 , 203, 204 , özellikleri ile ilgili in vivo ve in vitro birçok çalışmalar bulunmaktadır. Son yıllarda TQ’un antikanserojenik etkileri olduğuna dair raporlar oldukça dikkat çekicidir Yapılan çalışmalarda TQ’nun, hücre siklus arresti apoptotik 212 210 , antiproliferatif 209 . 211 , ve antianjiojenik213 aktivitesi olabileceği bildirilerek, bu etkileriyle kemoterapötik potansiyelli, bir antikanser ilaç adayı olarak rapor edilmiştir 214 . Önceki çalışmalarda Timokinon’un meme215, over215, kolorektal kanser216, pankreatik adenokarsinom217 ve prostat kanseri218 gibi çok çeşitli kanser hücre hatlarında hücre çoğalması üzerine inhibe edici etkisi gösterilmiştir. Tiroid kanserleri üzerine ise henüz bir araştırmaya rastlanmamıştır. Ayrıca kanserli hücrelerin etrafındaki sağlıklı hücrelere de minimum düzeyde toksik etki gösterdiği bildirilmektedir219. Şekil16: Timokinon ve Genistein’in kimyasal yapısı. 36 Şekil 17: Timokinon’un kanserde etki mekanizmaları 214 . 2.5.2. Genistein Genistein (4,5,7-trihydroxyisoflavone) soya fasülyesinde doğal olarak bulunan bir isoflavondur ve bir fitoöstrojendir220. Değişik derecelerde östrojenik etkinliğe sahip olan fitoöstrojenler, organizmada bulunan doğal östrojenlerle yarışa girer, reseptörlere bağlanarak etkinlik gösterirler. Fitoöstrojenler, östrojenik ve antiöstrojenik, antioksidant, antiproliferatif ve antianjiogenetik, antinflamatuar özellikler gösterebilmektedir. Östrojenik ve antiöstrojenik özellikleri ile daha çok menopoz veya osteoporoz ile ilişkili iken, antioksidant özellikleri ile kanserle ilişkili olduğu bildirilmiştir 221,222,223,224 . Genistein ayrıca protein tirozin kinaz (PTK) inhibitörü olarak tanımlanmıştır ve kanser hücrelerinde PTK aracılı sinyal mekanizmasını inhibe ederek hücre büyümesini geciktirmektedir225. Yapılan çalışmalarda Genistein’in, DNA hasarını önlediği, bununla birlikte östrojen agonisti ya 37 da antagonisti olarak hareket ettiği gösterilmiştir226,227. Östrojen vasküler sistemde, direkt olarak vasküler dokularda östrojen reseptörlerine yerleşerek, dolaylı olarak ise; lipoprotein profilini değiştirerek etkili olmaktadır228. Genistein de östrojen gibi davranarak bu etkilere benzer etkiler göstermektedir, antioksidan özelliklerinin ise kanser ile ilişkili olduğu belirtilmiştir229. Gen, hücre döngüsünün inhibe etmekle birlikte230, hücre proliferasyonuna, apoptozuna231, invazyon ve metastazına231 neden olan genlerin düzenlenmesinde rol oynayarak göstermektedir. Yine meme233, kanser önleyici etkiler 234 , pankreas235, prostat236, oral skuamöz hücreli237 gibi çeşitli kanserlerde, ayrıca tiroid kanserlerinde (folliküler, papiller, anaplastik)238 de antiproliferatif etkili olduğu bildirilmiştir. Bununla birlikte, hücrelerdeki Gen’in etki mekanizması henüz tam açık değildir239. Şekil 18: Genistein, telomerazı, VEGF’i, NF-kB’ı inhibe ederek, pTEN ve p21’i indükleyerek apoptozu arttırmakta, anjiogenezi ise azaltmaktadır. 38 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1 Kullanılan Araç ve Gereçler 3.1.1. CAL-62 ve CGTH-W1 Hücre Hatları Çalışmamızda, Alman Hücre ve mikroorganizma bankasından (DSMZ; German collection of microorganisms and cell cultures) alınan insan tiroid kanseri hücre hattı olan CAL-62 ve CGTH-W1 hücreleri kullanıldı. Şekil 19: CAL-62 ve CGTH-W1 hücre hatları (50 µM). 3.1.2. Kullanılan Cihazlar Biyogüvenlik kabini (DanLaf, Danimarka) Buzdolabı (Arçelik, Türkiye) Derin dondurucu, -30°C (Sanyo, Japonya) Derin dondurucu, -86°C (Sanyo, Japonya) Hassas terazi (AND-ER-182A, Japonya) Otomatik ısı döngü cihazı (Eppendorf, ABD) 39 Invert mikroskop (Zeiss, Almanya) Işık mikroskobu (DCM 4000, Leicia, Almanya) Karbondioksitli etüv (Sanyo, Japonya) LightCycler 480 Real-Time PCR cihazı (Roche, Almanya) Mikropipetler, 10μL, 100μL, 1000μL (Bt10, Bt100, Bt1000 Biohit, CLP, ABD) Mikroplaka okuyucu (Spectramax M3, Molecular Devices, ABD) Soğutmalı santrifüj (Hettich Mikro 22 R, Almanya) Spektrofotometre (NanoDrop ND-1000) (Thermo Scientific, ABD) Spin vorteks (Biosan, Rusya) 3.1.3 Kullanılan Sarf Malzemeler Hücre dondurma ampülü (Greiner, Almanya) Hücre kültür flaskları, 25 cm2 ve 75 cm2 (Corning, ABD) Kültür tüpleri (Corning, ABD) Mikrosantrifüj tüpleri (CLP, Almanya) Petri kabı, 35mm, 60mm ve 100mm (Corning, ABD) Pipet uçları (CLP, Almanya) 3.1.4. Kullanılan Kimyasal Maddeler Timokinon (Sigma, Amerika) Genistein (Sigma, Amerika) Dimetil sülfoksit (DMSO) (Amresco, ABD) Etanol (Sigma, ABD) İnaktive edilmiş fetal sığır serumu (FCS) (HyClone, Thermo, ABD) Penisilin/Streptomisin (HyClone, Thermo, ABD) 40 Primerler (Alfa DNA, Almanya) DMEM besiyeri (HyClone, Thermo, ABD) Tripsin-EDTA (HyClone, Thermo, ABD) Universal Probe Library (UPL) Probları (Roche, Almanya) 3.1.5. Kullanılan Kitler Hücre canlılığı Kiti (MTT) (Roche, Almanya) PathScan® Cleaved Kaspaz-3 (Asp175) Sandwich ELISA Kit TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA kiti (Roche, Almanya) High Pure RNA İzolasyon Kiti (Roche, Almanya) LC 480 Master Mix (Roche, Almanya) Transcriptor First Strand cDNA Sentez Kiti (Roche, Almanya) 3.2. Besiyeri ve Çözeltilerin Hazırlanışı 3.2.1. % 10’luk DMEM Besiyerinin Hazırlanışı 450 ml DMEM besiyeri içerisine, 50 ml fetal sığır serumu (FCS), 200 mM L-glutaminden 10 ml ve son konsantrasyonu 100 IU/ml penisilin ile 100 µg/ml streptomisin olacak şekilde hazırlandı. 3.2.2. % 10’luk RPMI-1640 Besiyerinin Hazırlanışı 450 ml RPMI-1640 besiyeri içerisine, 50 ml fetal sığır serumu (FCS), 200 mM L-glutaminden 10 ml ve son konsantrasyonu 100 IU/ml penisilin ile 100 µg/ml streptomisin olacak şekilde hazırlandı. 41 3.2.3. % 1’lik DMEM Besiyerinin Hazırlanışı 495 ml DMEM besiyeri içerisine, 5 ml FCS, 200 mM Lglutaminden 10 ml, 100 IU/ml penisilin, 100 µg/ml streptomisin eklenerek hazırlandı. 3.2.4. % 1’lik RPMI-1640 Besiyerinin Hazırlanışı 495 ml RPMI-1640 besiyeri içerisine, 5 ml FCS, 200 mM Lglutaminden 10 ml, 100 IU/ml penisilin, 100 µg/ml streptomisin eklenerek hazırlandı. 3.2.5. MTT Karışımının Hazırlanması MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] stok solüsyonu hazırlamak için toz halinde olan MTT 1 ml’de 5 mg olacak şekilde tartılarak distile suda çözüldü. Daha sonra filtreden geçirilerek steril hale getirildi. 3.2.6. 1X PBS Çözeltisinin Hazırlanması 1.09 g Na2HPO4, 0.32 g NaH2PO4 ve 9 g NaCl2 tartılıp 800 ml distile su içerisinde çözüldükten sonra pH’sı 7.4’e ayarlanıp son hacim distile su ile 1 litreye tamamlandı. 42 3.3. Yöntemler 3.3.1. Hücre Kültürü CAL-62 hücreleri, %10’luk DMEM besiyerinde %95 nem ve %5 CO2 içeren ortamda 37 C’de kültüre edilerek çoğaltıldı. CGTH-W1 hücreleri ise %10’ luk RPMI-1640 besiyerinde %95 nem ve %5 CO2 içeren ortamda 37 C’de kültüre edilerek çoğaltıldı. 3.3.2. MTT Hücre Canlılığı Deneyi Hücre canlılığı 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) kullanılarak belirlendi. Hücreler 96 kuyulu doku kültür kabında her bir kuyuya 10 4 hücre gelecek şekilde ekildi ve hücrelerin yüzeye tutunması için bir gece 37 0C’ de bekletildi. CAL-62 hücrelerine 0,5-20 μM arasında CGTH-W1 hücrelerine ise 10-150 μM arasında değişen dozlarda Timokinon uygulandı. Aynı şekilde CAL-62 hücrelerine 10-200 μM arasında CGTH-W1 hücrelerine ise 10-300 μM arasında değişen dozlarda Genistein uygulandı. Bir grup hücreye ise 24 ve 48 saat süre ile 25 μM sabit dozda Genistein ile birlikte değişen dozlarda Timokinon birlikte uygulandı. İnkübasyon süresi bittikten sonra 10 μl MTT (5 mg/ml) her bir kuyucuğa eklendi ve 4 saat süre ile inkübe edildi. İnkübasyon süresi bittikten sonra her bir kuyucuğa 100 μl DMSO eklendi ve formazan kristalleri çözündükten sonra 570 nm’ de Spectramax M3 mikroplate okuyucu (Molecular Devices, ABD) ile ölçüldü. Her bir doz için deney 5 tekrarlı yapılarak ortalama absorbans değerleri belirlendi. Elde edilen ortalama absorbans değerleri, madde uygulaması yapılmayan kontrole oranlanarak hücre canlılığı üzerine ilaçların etkisi belirlendi. 43 3.3.3. Kaspaz-3 Sandwich Elisa Deneyi 1. CAL-62 ve CGTH-W1 hücreleri 6 kuyucuklu kültür kaplarında her bir kuyucuğa 106 hücre gelecek şekilde ekildi. Bir gece bekletildikten sonra belirtilen dozlarda Timokinon, Genistein ve Timokinon + Genistein ile muamele edildi. 2. İnkübasyon sürelerinin dolmasından sonra kültür ortamından ilaçlı besiyeri uzaklaştırıldı ve hücreler soğuk PBS ile bir defa yıkandı. 3. PBS uzaklaştırıldıktan sonra 1mM PMSF içeren 0.5ml soğuk 1X Lizis tamponu eklendi ve 5 dakika beklendi. 4. Hücreler kültür kabından kazınarak uzaklaştırıldı ve mikrosantrifüj tüpüne alındı. Enjektör yardımıyla hücrelerin parçalanması sağlandı. 5. Hücre lizatı 10 dakika soğuk ortamda santrifüj edilip üstte kalan sıvı (dökelti, süpernatan) yeni bir mikrosantrifüj tüpüne alındı. 6. 100μL hücre lizatı ile 100μL örnek dilüent çözeltisi primer antikor ile kaplanmış mikroplaka kuyucuklarına dağıtıldı ve 37°C’de 2 saat süreyle inkübe edildi. 7. Kuyucukların içeriği boşaltıldıktan sonra her bir kuyucuk, 4’er defa 200μL yıkama tamponu (1X) ile yıkandı. 8. Her bir kuyucuğa 100μL belirleyici antikor eklendi. 37°C’de 1 saat süreyle inkübe edildi. 9. Her bir kuyucuk, 4’ er defa 200μL yıkama tamponu (1X) ile yıkandı. 10. Her bir kuyucuğa 100μL HRP (horseradish peroksidaz) bağlanmış ikincil antikor eklendi ve 37°C’de 30 dakika süreyle inkübe edildi. 44 11. Her bir kuyucuk, 4’er defa 200μL yıkama tamponu (1X) ile yıkandı. 12. Her bir kuyucuğa 100μL TMB (tetrametilbenzidin) substratı eklendi ve 37°C’de 10 dakika süreyle inkübe edildi. 13. Renksiz olan TMB eklendiğinde reaksiyonun belirteci olan mavi renk dönüşümü gerçekleşti. 14. Her bir kuyucuğa 100μL durdurucu solüsyon eklendi. Birkaç saniye yavaşça sallandı. 15. Durdurucu solüsyonun eklenmesinden 30 dakika sonra mavi olan rengin sarı renge dönüştüğü gözlendi. 16. Aynı zamanda, durdurucu solüsyonun eklenmesini takiben 30 dakika içerisinde ELISA okuyucu ile 450nm dalga boyundaki absorbans değerleri okundu. 3.3.4. Hücre Kültüründen Total RNA’nın Elde Edilmesi Timokinon ve Genistein ile inkübasyon sürelerinin dolmasıyla, hücrelerden RNA izolasyonu, “High Pure RNA Isolation Kiti” kullanılarak, aşağıda yazılı olan protokole göre biyogüvenlik kabininin içinde yapıldı. 1. Hücrelerin üzerine 200 μL soğuk PBS ve 400 μL Lizis tamponu eklenip 15 saniye vortekslendi. 2. Filtre, toplama tüpüne yerleştirilip tüm karışım filtre üstüne aktarıldı. 3. Tüp 9000 rpm’de 15 saniye santrifüj edildi. 4. Toplama tüpünde toplanan sıvı atılıp filtre aynı tüpe tekrar yerleştirildi. 5. Her bir örnek için 90 μL DNaz inkübasyon tamponu steril tüpe alındı ve 10μL DNaz I eklendi. Pipetaj ile karıştırıldıktan sonra karışım filtrenin ortasına bırakıldı. 15 dakika oda sıcaklığında bekletildi. 45 6. 500 μL’lik 1. yıkama çözeltisi filtre üzerine eklendi ve 9000 rpm’de 15 saniye santrifüj edildi. Filtre altında toplanan kısım atıldıktan sonra aynı toplama tüpü içerisine yerleştirildi. 7. 500 μL’lik 2. yıkama çözeltisi filtre üzerine eklendi ve 15 saniye 9000 rpm’de santrifüj edildi. Filtre altında toplanan kısım atıldıktan sonra aynı toplama tüpü içerisine yerleştirildi. 8. 200 μL’lik 3. yıkama çözeltisi filtre üzerine eklendi ve 3 dk 13500 rpm’de santrifüj edildi. 9. Toplama tüpü atıldı. Filtre, steril 1.5 ml’lik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirildi. 10. Filtre üzerine 20 μL örnek seyreltme çözeltisi eklendi ve 9000 rpm’de 1 dk santrifüj edildi. 11. Elde edilen RNA’ların miktarları ve saflığı “NanoDrop ND-1000 Spektrofotometre” cihazında ölçülerek RT-PCR’da kullanılana kadar 80 °C derin dondurucuda saklandı. 3.3.5. Komplementer DNA (cDNA) Sentezi (RT-PCR) Elde edilen RNA’lar spektrofotometrede 260 nm dalga boyunda ölçülerek mikrolitredeki mikrogram değerleri belirlendi. Primer olarak random hekzamerler kullanılarak cDNA sentez kiti ile total RNA’dan cDNA sentezi yapıldı. cDNA sentezi sırasında kullanılan kimyasallar ve miktarları Tablo 3’de verilmiştir. 46 Tablo 3: RT-PCR tepkime karışımı. Steril H2O-PCR grade Reaksiyon Tamponu dNTP Random hekzamer primeri RNaz inhibitörü Transkriptor Ters Transkriptaz Total RNA Son Konsantrasyon 1x (8mM MgCl2) 1mM 60µM 20 ünite 10 ünite 1µg Hacim RNA miktarına göre değişken 4μL 2μL 2μL 0.5μL 0.5μL 1µg olacak şekilde cDNA için PCR karışımı ince çeperli 0.2 ml’lik tüplere dağıtıldıktan sonra elde edilen total RNA eklendi. 3.3.5.1 Reverse Transkriptaz PCR (RT-PCR) Programı Otomatik ısı döngüsü cihazı, Tablo 4’de belirtilen programa ayarlanarak cDNA sentezi yapıldı. Tablo 4: Otomatik ısı döngüsü cihazında uygulanan program. Primer Bağlanması Ters Transkripsiyon İnaktivasyon Soğutma Sıcaklık 25°C 50°C 85°C 4°C Zaman 10dk 60dk 5dk - Döngü sayısı 1 1 1 1 Reaksiyon sonucunda elde edilen cDNA örnekleri Real-Time PCR’da kullanılana kadar -20 °C’lik derin dondurucuda saklandı. 3.3.6. Gen İfadesinin Real-Time PCR ile Belirlenmesi hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κβ ve p21 genlerinin mRNA miktarları, Real-Time PCR yöntemi ile Light Cycler (LC) cihazı kullanılarak belirlendi. Amplifikasyonlar 20 μL toplam tepkime hacmi içerisinde; cDNA, mRNA’ya özgü primerler, UPL probu, LightCycler 480 Master karışımı ve 47 distile su kullanılarak gerçekleştirildi. hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κβ ve p21 gen ifade miktarlarını normalize etmek için GAPDH mRNA düzeyi referans olarak alındı. 3.3.6.1. hTERT Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi hTERT genine ait UPL prob ve primerlerin dizileri aşağıda verilmiştir. Prob ve primerlerin cDNA’daki yerleşimi ise Şekil 20’de gösterilmiştir. hTERT Forward primer: 5’- AAGCTGTTTGCGGGGATT -3’ hTERT Reverse primer: 5’- CCAACAAGAAATCATCCACCA -3’ 68 numaralı prob dizisi: 5’-CTGCTCCT-3’ Şekil 20: hTERT mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000310581 giriş no’lu dizi) Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır. 3.3.6.2. VEGF-A Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi VEGF-A genine ait UPL prob ve primerlerin dizileri aşağıda verilmiştir. Prob ve primerlerin cDNA’daki yerleşimi ise Şekil 21’de gösterilmiştir. 48 VEGF-A Forward primer: 5’- AGTGTGTGCCCACTGAGGA -3’ VEGF-A Reverse primer: 5’- GGTGAGGTTTGATCCGCATA -3’ 9 numaralı prob dizisi: 5’CATCACCA3’ Şekil 21: VEGF-A mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000372067 giriş no’lu dizi) Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır. 3.3.6.3. pTEN Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi pTEN genine ait UPL prob ve primerlerin dizileri aşağıda verilmiştir. Prob ve primerlerin cDNA’daki yerleşimi ise Şekil 22’ de gösterilmiştir. PTEN Forward primer: 5’-CGAACTGGTGTAATGATATGTGC-3’ PTEN Reverse primer: 5’- CGCCTCTGACTGGGAATAGT-3’ 60 numaralı prob dizisi: 5’- TGGGGAAG -3’ Şekil 22: pTEN mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000371953 giriş no’lu dizi) Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır. 49 3.3.6.4. NF-κβ Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi NF-κβ genine ait UPL prob ve primerlerin dizileri aşağıda verilmiştir. Prob ve primerlerin cDNA’daki yerleşimi ise Şekil 23’ de gösterilmiştir. NF-κβ Forward primer: 5’- CTGGCAGCTCTTCTCAAAGC -3’ NF-κβ Reverse primer: 5’- TCCAGGTCATAGAGAGGCTCA -3’ 22 numaralı prob dizisi: 5’-TGGTGGAG-3’ Şekil 23: NF-κβ mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000226574 giriş no’lu dizi) Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır. 3.3.6.5. p21 Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi p21 genine ait UPL prob ve primerlerin dizileri aşağıda verilmiştir. Prob ve primerlerin cDNA’daki yerleşimi ise Şekil 24’ de gösterilmiştir. 50 P21 Forward primer: 5’-TCACTGTCTTGTACCCTTGTGC-3’ P21 Reverse primer: 5’-GGCGTTTGGAGTGGTAGAAA-3’ 85 numaralı prob dizisi: 5’-GACCTGGA-3’ Şekil 24: p21 mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000244741 giriş no’lu dizi) Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır. 3.3.6.6. GAPDH Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi GAPDH genine ait UPL prob ve primerlerin cDNA’daki yerleşimleri Şekil 25’ de gösterilmiştir. GAPDH Forward primer: 5’- AGCCACATCGCTCAGACAC -3’ GAPDH Reverse primer: 5’- GCCCAATACGACCAAATCC -3’ 60 numaralı prob dizisi: 5’- TGGGGAAG -3’ Şekil 25: GAPDH mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000229239 giriş no’lu dizi). 51 3.3.6.7. hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κβ, p21 ve GAPDH Genleri için Real Time PCR tepkime karışımları hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κβ, p21 ve GAPDH genlerine uygun verilen primer ve problar kullanılarak Real-Time PCR tepkimesi LC cihazında gerçekleştirildi. Tepkime karışımını hazırlamak için kullanılan bileşenlerin miktarları Tablo 5’de verilmiştir. Tablo 5: hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κβ, p21 ve GAPDH Real-Time PCR tepkime karışımı dH2O MgCI2 (25mM) Primer F (10pmol/μL) Primer R (10pmol/μL) TaqMan prob (100pmol/μL) LC 480 Master karışımı cDNA Son Konsantrasyon Hacim 4mM 2.5pmol 2.5pmol 10pmol 4.7μL 1.2μL 0.25μL 0.25μL 0.1μL 2.5μL 1μL - 3.3.6.8. Light Cycler (LC) Deney Programı Real-Time PCR karışımları hazırlandıktan sonra 96 kuyucuklu plate’ in her bir kuyusuna bir örnek gelecek şekilde dağıtıldı ve üzerine cDNA’ler eklendi. Plate cihaza yerleştirildikten sonra Tablo 6’de belirtilen amplifikasyon programı kullanılarak PCR tepkimesi gerçekleştirildi. hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κβ, p21 ve GAPDH genleri için aynı program kullanıldı. Reaksiyon sonucu, hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κβ, p21 ve GAPDH genlerinin mRNA ifade düzeylerini gösteren Crossing point (Cp) değerleri belirlendi. hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κβ ve p21 ifade düzeyleri GAPDH ifade düzeyine göre normalize edildi. 52 Tablo 6: hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κβ, p21 ve GAPDH genlerinin ifade düzeylerinin belirlenmesi için kullanılan Real Time PCR tepkime programı. Program 1. Ayrılma (Denatürasyon) Program Verisi Değer Döngüler 1 Analiz Modu - Sıcaklık Hedefleri Kısım 1 Hedef Sıcaklık (°C) 95 İnkübasyon zamanı (s:dk:sn) 10:00dk Sıcaklık Geçiş Hızı (°C/sn) 20.0 Program 2. Primer Bağlanması ve Uzama (Hibridizasyon ve Polimerizasyon) Program Verisi Değer Döngüler 40 Analiz Modu Çoğalma Sıcaklık Hedefleri Kısım 1 Kısım 2 Hedef Sıcaklık (°C) 95 60 İnkübasyon zamanı (s:dk:sn) 10sn 20sn Sıcaklık Geçiş Hızı (°C/sn) 20.0 10.0 Program 3. Soğutma Program Verisi Değer Döngüler 1 Analiz Modu - Sıcaklık Hedefleri Kısım 1 Hedef Sıcaklık (°C) 40 İnkübasyon zamanı (s:dk:sn) 30sn Sıcaklık Geçiş Hızı (°C/sn) 20.0 3.4. İstatistiksel Analiz Yöntemleri Doza ve zamana bağlı olarak değişen, hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κβ ve p21 mRNA ifade düzeylerindeki farklılıklar “REST (2009 V2.0.13)” istatistik programı ile karşılaştırıldı 165 . Hücre canlılığı, Aktif kaspaz-3 ve apoptoz oranlardaki değişimler ise “tek yönlü Anova” testiyle karşılaştırıldı. Veriler “SPSS 15.0” istatistik programı kullanılarak değerlendirildi. 0.05’den küçük olan p değerleri istatistiksel açıdan anlamlı olarak kabul edildi. 53 4. 4.1. Timokinon’ a BULGULAR CAL-62 ve CGTH-W1 Hücrelerinin Genistein ve duyarlılığının MTT Hücre Canlılığı Yöntemi ile İncelenmesi Genistein ve Timokinon’ un CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin canlılığı üzerine etkisini belirlemek için öncelikle MTT yöntemi uygulandı. Grafik 1-2: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin (10.000 hücre/kuyu) Timokinon ile 48 ve 72 saat inkübasyonu sonunda belirlenen hücre canlılık oranları. Grafik 1-2’ de 48 ve 72 saat inkübasyon sonucunda hücrelerin Timokinon’ a olan cevabı hücre canlılık oranları ile gösterilmektedir. Buna göre CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin canlılık oranlarının TQ dozuna bağlı olarak düştüğü belirlendi. CAL-62 hücrelerinde kullandığımız en yüksek Timokinon konsantrasyonu olan 20μM’da hücre canlılığının 48 saatte yaklaşık %19, 72 saatte ise yaklaşık %22 olduğu görülmektedir. CGTH-W1 hücrelerinde kullandığımız en yüksek Timokinon konsantrasyonu olan 150μM’da hücre canlılığının 48 54 saatte yaklaşık %25, 72 saatte ise yaklaşık %13 olduğu belirlendi. Sonuçlarımıza göre Timokinon için IC50 dozunun CAL-62 hücrelerinde 48 ve 72 saat inkübasyon sonunda yaklaşık 10μM olduğu gözlendi. CGTHW1 hücrelerinde ise 48 saat inkübasyon sonucunda IC50 dozu 100μM iken 72 saat inkübasyon sonucunda IC50 dozunun yaklaşık 80μM olduğu belirlendi. Bu sonuçlara göre Timokinon’ un CGTH-W1 hücrelerine göre CAL-62 hücrelerinin canlılığını daha düşük konsantrasyonlarda etkilediği gözlendi. Grafik 3-4: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin (10.000 hücre/kuyu) Genistein ile 48 ve 72 saat inkübasyonu sonunda belirlenen hücre canlılık oranları. Grafik 3-4’ de 48 ve 72 saat inkübasyon sonucunda hücrelerin Genistein’ a olan cevabı hücre canlılık oranları ile gösterilmektedir. Buna göre CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin canlılık oranlarının Genistein dozuna bağlı olarak düştüğü belirlendi. CAL-62 hücre canlılığının CGTH-W1 hücrelerine göre Genistein’ in artan dozlarından daha fazla etkilendiği gözlendi. CAL-62 hücrelerinde kullandığımız en yüksek Genistein konsantrasyonu olan 200μM’da, hücre canlılığının 48 saatte yaklaşık %35, 72 saatte ise yaklaşık %17 olduğu görülmektedir. Sonuçlarımıza göre Genistein için IC50 dozunun CAL-62 55 hücrelerinde 72 saat inkübasyon sonunda yaklaşık 150μM olduğu gözlendi. CGTH-W1 hücrelerinde kullandığımız en yüksek Genistein konsantrasyonu olan 300μM’ da, hücre canlılığının 48 saatte yaklaşık %39, 72 saatte ise %36 olduğu gözlendi. CGTH-W1 hücrelerinde 48 ve 72 saat inkübasyon sonucunda IC50 dozunun yaklaşık 250μM olduğu belirlendi. Bu sonuçlara göre Genistein’ nin CAL-62 hücrelerine göre CGTH-W1 hücrelerinin canlılığını daha yüksek konsantrasyonlarda etkilediği gözlendi. Grafik 5-6: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin (10.000 hücre/kuyu) Timokinon ve Genistein ile 48 ve 72 saat inkübasyonu sonunda belirlenen hücre canlılık oranları. Grafik 5-6’ de 48 ve 72 saat inkübasyon sonucunda hücrelerin Genistein ve Timokinon birlikteliğine olan cevabı hücre canlılık oranları ile gösterilmektedir. Buna göre CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin canlılık oranlarının Timokinon ve Genistein’ nin birlikte kullanımı sonucu doza bağlı olarak düştüğü belirlendi. CAL-62 hücrelerinde kullandığımız en yüksek Timokinon+Genistein konsantrasyonu olan 25μM Gen+20μM TQ’ da, hücre canlılığının 48 ve 72 saatte yaklaşık % 20 olduğu görülmektedir. CGTH-W1 hücrelerinde ise kullandığımız en yüksek Timokinon+Genistein konsantrasyonu olan 25μM Gen+ 200μM TQ’ da hücre canlılığının 48 saat 56 sonunda yaklaşık %17, 72 saat sonunda ise yaklaşık %30 olarak bulundu. Sonuçlarımıza göre CAL-62 hücrelerinde 48 ve 72 saat inkübasyon sonunda IC50 dozunun yaklaşık 25μMGen+10μMTQ olduğu belirlendi. CGTH-W1 hücrelerinde ise 48 ve 72 saat inkübasyon sonucunda IC50 dozunun yaklaşık 25μMGen+80μMTQ olduğu gözlendi. 4.2. Gen İfade Düzeylerinin Kantitatif Değerlendirilmesi hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κβ ve p21 genlerinin ifade düzeyinin kantitatif değerlendirilmesi için Light Cycler cihazı kullanıldı. CAL-62 ve CGTH-W1 hücre hatlarından elde edilen cDNA’larda hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κβ ve p21 ile bu genlerin normalizasyonu için seçilen GAPDH genlerine özgül primerler ve UPL LNA probları kullanılarak mRNA ifade düzeyleri çalışıldı. hTERT geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren Real-Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 26’de gösterildi. Şekil 26: hTERT geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. hTERT geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir. 57 VEGF-A geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren Real-Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 27’da gösterildi. Şekil 27: VEGF-A geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. VEGF-A geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir. pTEN geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren Real-Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 28’de gösterildi. Şekil 28: pTEN geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. pTEN geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir. 58 NF-κβ geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren Real-Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 29’de gösterildi. Şekil 29: NF-κβ geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. NF-κβ geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir. p21 geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren Real-Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 30’de gösterildi. Şekil 30: p21 geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. p21 geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir. 59 GAPDH geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren Real-Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 31’de gösterildi. Şekil 31: GAPDH geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. GAPDH geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir. Göreceli gen ifadesi sonuçları REST programı kullanılarak “Pfaffl” matematiksel yöntemi ile hesaplandı. Pfaffl eşitliği aşağıda belirtilmiştir. Eşitlikte belirtilen Ct, tepkime sırasında oluşan floresan sinyalin eşik değeri geçtiği andaki döngü sayısını ifade etmektedir. Ct değeri tepkimenin başında mevcut olan mRNA (cDNA) miktarı ile ters orantılıdır. ΔCt değeri ise kontrol ile örneklerin Ct değerleri arasındaki farkı göstermektedir. Eşitlikte belirtilen E, PCR etkinliğini, elde edilen R ise ifade oranını göstermektedir. 60 4.3. Gen İfade Düzeylerinin Karşılaştırılması 4.3.1. Genistein ve Timokinon’ un’ hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κβ ve p21 Genlerinin İfade Düzeylerine Etkisi CAL-62 ve CGTH-W1 hücre hatlarında Genistein ve Timokinon uygulanmasından sonra hTERT, VEGF-A, pTEN, NF-κβ ve p21 genlerinin ifade düzeylerinin doza bağlı olarak karşılaştırmalı değerlendirmesi yapıldı. Bu genlerin mRNA ifade düzeylerini belirlemek için kantitatif Real-time PCR yöntemi kullanıldı. CAL-62 hücrelerinde hTERT mRNA ifade düzeyinin 72. saatte Genistein ve Timokinon uygulamasından sonra doza bağımlı olarak anlamlı düzeyde azaldığı belirlendi (p<0.05). Kullanılan en yüksek konsantrasyon olan 25Gen+10TQ konsantrasyonunda hTERT mRNA düzeyinin yaklaşık 6,5 kat azaldığı gözlendi (p<0.05). CGTH-W1 hücrelerinde ise Genistein ve Timokinon’ un yüksek konsantrasyonlarında hTERT mRNA düzeyinin düştüğü görüldü. Düşük konsantrasyonlarda ise hTERT mRNA düzeyinde azalma olduğu ancak bu azalmanın istatistiksel olarak anlamlı olmadığı belirlendi. Kullanılan en yüksek konsantrasyon olan 25Gen+80TQ konsantrasyonunda hTERT mRNA düzeyinin yaklaşık 3 kat azaldığı gözlendi (p<0.05) (Grafik 7-8). 61 Grafik 7-8: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin doza bağlı olarak Genistein ve Timokinon uygulanması sonrasında hTERT mRNA düzeylerindeki değişiklik. Hedef genin ifade düzeyleri GAPDH mRNA ifade düzeyi temel alınarak normalize edildi. *; p<0.05. CAL-62 hücrelerinde VEGF-A mRNA ifade düzeyine baktığımızda, Timokinon ve Genistein uygulandığında VEGF mRNA düzeyinin önemli ölçüde azaldığı gözlendi (p<0.05). Kullanılan en yüksek doz olan 25Gen+10TQ konsantrasyonunda VEGF-A mRNA düzeyinin yaklaşık 18 kat azaldığı belirlendi (p<0.05). Grafik 9-10: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin doza bağlı olarak Genistein ve Timokinon uygulanması sonrasında VEGF-A mRNA düzeylerindeki değişiklik. Hedef genin ifade düzeyleri GAPDH mRNA ifade düzeyi temel alınarak normalize edildi. *; p<0.05. 62 CGTH-W1 hücrelerinde ise benzer şekilde artan Genistein ve Timokinon konsantrasyonlarında VEGF mRNA düyeninin anlamlı derecede düştüğü belirlendi (p<0.05). 25Gen+80TQ kullanıldığında VEGFA mRNA düzeyinin yaklaşık 10 kat azaldığı görüldü (p<0.05). (Grafik 910). CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinde anjiyogenezde rolü olduğu bilinen pTEN mRNA ifade düzeyinin artan Genistein ve Timokinon konsantrasyonlarında ve bu moleküllerin birlikteliğinde anlamlı düzeyde artışa neden olduğu belirlendi (p<0.05). CAL-62 hücrelerinde kullanılan en yüksek konsantrasyon olan 25Gen+10TQ uygulamasında pTEN mRNA düzeyinin yaklaşık 4.5 kat arttığı gözlendi. Grafik 11-12: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin doza bağlı olarak Genistein ve Timokinon uygulanması sonrasında pTEN mRNA düzeylerindeki değişiklik. Hedef genin ifade düzeyleri GAPDH mRNA ifade düzeyi temel alınarak normalize edildi. *; p<0.05. CGTH-W1 hücrelerinde ise en yüksek doz olan 25Gen+80TQ uygulaması sonrasında pTEN mRNA düzeyinin yaklaşık 3 kat arttığı belirlendi (p<0.05) (Grafik 11-12). 63 CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinde NF-κβ mRNA ifade düzeyinin artan Genistein ve Timokinon konsantrasyonlarında anlamlı düzeyde azalmaya neden olduğu belirlendi (p<0.05). CAL-62 hücrelerinde kullanılan en yüksek konsantrasyon olan 25Gen+10TQ uygulamasında NF-κβ mRNA düzeyinin yaklaşık 4.5 kat azaldığı gözlendi. CGTH-W1 hücrelerinde ise en yüksek doz olan 25Gen+80TQ uygulaması sonrasında NF-κβ mRNA düzeyinin yaklaşık 3.5 kat azaldığı belirlendi (p<0.05) (Grafik 13-14). Grafik 13-14: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin doza bağlı olarak Genistein ve Timokinon uygulanması sonrasında NF-κβ mRNA düzeylerindeki değişiklik. Hedef genin ifade düzeyleri GAPDH mRNA ifade düzeyi temel alınarak normalize edildi. *; p<0.05. CAL-62 hücrelerinde p21 mRNA ifade düzeyine baktığımızda, Timokinon ve Genistein uygulandığında p21 mRNA düzeyinin önemli ölçüde arttığı gözlendi (p<0.05). Kullanılan en yüksek doz olan 25Gen+10TQ konsantrasyonunda p21 mRNA düzeyinin yaklaşık 3 kat arttığı belirlendi (p<0.05). CGTH-W1 hücrelerinde ise benzer şekilde artan Genistein ve Timokinon konsantrasyonlarında p21 mRNA düyeninin anlamlı derecede arttığı belirlendi (p<0.05). 25Gen+80TQ kullanıldığında 64 p21 mRNA düzeyinin yaklaşık 2.5 kat arttığı görüldü (p<0.05) (Grafik 1516). Grafik 15-16: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin doza bağlı olarak Genistein ve Timokinon uygulanması sonrasında p21 mRNA düzeylerindeki değişiklik. Hedef genin ifade düzeyleri GAPDH mRNA ifade düzeyi temel alınarak normalize edildi. *; p<0.05. 4.4. Aktif Kaspaz-3 Düzeyinin Belirlenmesi CAL-62 ve CGHT-W1 hücreleri 72 saat süre ile belirtilen konsantrasyonlarda Genistein ve Timokinon ile inkübe edildikten sonra, hücrelerde ilaca verilen apoptotik cevap sırasında oluşan aktif kaspaz 3 düzeyi ELISA yöntemini kullanarak belirlendi. Buna göre, belirlenen aktif kaspaz-3 miktarının doza bağlı olarak artma eğiliminde olduğu belirlendi (p<0.05). Çalışılan dozlar arasında en yüksek aktif kaspaz-3 düzeylerine CAL-62 hücreleri için 25μM Gen+10μM TQ birlikteliğinde CGTH-W1 hücreleri için ise 25μM Gen+80μM TQ birlikteliğinde erişildiği bulundu (p<0.05) (Grafik 17-18). 65 CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerine Genistein ve Timokinon birlikte uygulandığında belirlenen aktif kaspaz-3 miktarlarının, tek başına Timokinon uygulandığı duruma göre daha yüksek olduğu Grafik 17-18’de görülmektedir. 10μM Timokinon tek başına uygulandığında aktif kaspaz-3 miktarının CAL-62 hücrelerinde yaklaşık 2 kat arttığı görüldü. CGTH-W1 hücrelerinde ise 80μM Timokinon uygulandığında aktif kaspaz-3 miktarinın yaklaşık 1.7 kat arttığı belirlendi (p<0.05). CAL-62 hücreleri için 25μM Gen+10μM TQ birlikteliğinde kspaz-3 miktarının yaklaşık 2.8 kat, CGTHW1 hücreleri için ise 25μM Gen+80μM TQ birlikteliğinde aktif kaspaz-3 miktarının yaklaşık 2.7 kat arttığı gözlendi (p<0.05). Grafik 17-18: CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerinin Genistein ve Timokinon ile doza bağlı 72 saat inkübasyonu sonunda görülen aktif kaspaz 3 oranları. *; p<0.05. 66 3. TARTIŞMA Hücrelerin yaşamı ve ölümü arasındaki denge, doku homeostazını sağlar 59, 133 . Karsinogenez oluşumunu sağlayan iki temel olay, hücre proliferasyonunun regülasyonundaki bozulmalar ile sınırsız çoğalma ve ölüm yollarında defektlerle apoptoza karşı direnç gelişmesidir 59, 64, 133, 240, 241, 242 . Bu ise hem tümör hücrelerinin çoğalmasına neden olmakta hem de tümörü tedaviye dirençli hale getirmektedir 65, 129 . Bu nedenle proliferasyon ve apoptoz mekanizmaları, yeni hedeflenmiş tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi ve uygulanmasında önemli bir kavşak noktasıdır. Günümüzdeki kemoterapötik ajanlar sitotoksik etkileri ile tümör hücrelerinin apoptozuna neden olmakla birlikte, tümör dokusu çevresindeki normal hücrelerde de yan etkilerini göstermektedir. Bundan dolayı ilaçların kullanım ve verimliliğini kısıtlamaktadır normal hücresel sistemler üzerinde kemoterapötik ajan arayışı, 243, 244 . Bu nedenle, sitotoksik etkileri minimal olan araştırmaları doğal bitkisel ürünlere yönlendirmiştir. Biz de çalışmamızda, anti-neoplastik etkili ve güçlü antioksidan doğal bitkisel ürünler olan, Timokinon (TQ) ve Genistein (Gen)’in etkilerini, tiroid kanser hücreleri üzerinde test ettik. Bu araştırmada, daha önce yapılan çalışmalarda bir fetal protein olan onkofetal-fibronektin (onfFN) varlığının gösterilmesi üzerine kanser kök hücre özelliğinde olduğu bildirilen anaplastik tiroid kanser (ATC) hücreleri ile onfFN ifadelenmesi gösterilemeyen folliküler tiroid kanser (FTC) hücreleri kullanılmıştır. Böylece biri kök hücreli (CAL-62) (ATC) ve diğeri kök hücre olmayan (CGTH-W1) (FTC) iki kanser hücre 67 dizisinde, fitoterapötik ajanların modülasyonu karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Çalışmamızda MTT yöntemiyle, iki hücre hattında TQ ve Gen’in doz-cevap ilişkisi ile hücre canlılık oranları belirlendi. Hem TQ hem de Gen’in, CGTH-W1 hücrelerine göre CAL-62 hücrelerinin canlılığını daha düşük konsantrasyonlarda etkilediği gözlendi. Sonuçlar, TQ ve Gen muamelesine kanser kök hücrelerinin bulunduğu tiroid tümörlerinin daha hassas olduğunu göstermektedir. Timokinon (TQ), Genistein (Gen) ve TQ-Gen modülasyonunun, CAL-62 ve CGTH-W1 hücreleri üzerinde aktif Kazpaz-3 protein düzeyleri ölçülerek apoptotik etkileri ve hTERT mRNA düzeyleri ölçülerek telomeraz aktivitesi araştırıldı. Ayrıca bu hücreler üzerine, bu ilaçların muamelesi ile çeşitli apoptoz, proliferasyon ve anjiogenik hücre sinyal yolaklarında görevli bazı genlerin mRNA düzeyleri de incelendi. Yapılan çeşitli in vivo ve in vitro çalışmalarda TQ ve Gen’in anti-tümör etkisine sahip olduğu farklı kanser hücrelerinde belirli sitotoksik etkiler gösterdikleri bulunmuştur çalışmada, TQ’un hepatosellüler 245,246,247 . 2008 yılında yapılan iki karsinoma (HepG2) hücre dizisi üzerindeki etkisine bakılmış ve TQ’un kaspaz-3 ve 9 seviyelerini arttırarak ve hücre döngüsünde G1/S’de hücreleri durdurmak yoluyla appoptozu indüklediği gösterilmiştir 248,249 . Yine yakınlarda yapılan bir araştırmada, kaspaz-3 seviyeleri inhibe olmuş olarak bulunan meme kanserinde, Gen’e cevap olarak kaspaz-3’ün aktive olduğu çalışmalarda ise TQ etkisi sonucu osteosarkoma gösterilmiştir250. 251 , meme 252 Diğer ve prostat253 kanser hücrelerinde kaspaz-3 aktivasyonunu ile, glioblastoma hücrelerinde 68 kaspaz-3 ve 9 aktivasyonu ile hücre ölümü görüldüğü bildirilmiştir254. 2010 yılında ALL hücrelerinde TQ etkisine bakılmış ve TQ’ un G1 hücre arrestini indükleyerek, mitokondriyal membran potansiyelinin değişimi, kaspaz-3 aktivitesinin artması ve ROS ürünleri yoluyla apoptozu indüklediği görülmüştür255. Benzer sonuçlar 2012 yılında yapılan bir çalışmada da bildirilmiştir. TQ etkisi ile hücre döngüsünün inhibisyonu, kaspaz aktivasyonu, p53, pTEN, ROS artışı sonucu hücrelerde apoptoz görülmüş, yine TQ’ nun anti-anjiojenik, antimetastatik etkili olduğu bildirilmiştir256. Ayrıca insan prostat kanser hücrelerinde257 ve meme kanserinde250 Gen etkisi ile kaspaz-3 aktivasyonu sonucu apoptozun indüklendiği gösterilmişir. İnsan osteosarkom hücrelerinde ise, p53’ün artan etkisi ile p21 artışı gösterilmiş ve hücrelerin G2’ den M fazına geçemediği belirtilmiştir. Ayrıca aynı çalışmada kaspaz-3,9 aktivasyonu ile apoptozun indüklendiği de bildirilmiştir258. 2005 yılında yapılan başka bir çalışmada TQ’un kanser hücre çoğalmasını durdurucu etki gösterdiği, apoptozu uyardığı, mitokondriyal membran potansiyelini bozduğu gösterilmiş ve myeloblastik lösemi hücre hattı olan HL-60 hücrelerinde kaspaz 8,9 ve 3’ün aktivasyonunun tetiklendiği belirtilmiştir259. Yine genisteinin, MDAMB-435 ve MCF-7 meme kanseri hücrelerinde260, PC3 ve LNCaP prostat kanseri hücrelerinde261, H460 ve H322 küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücrelerinde262 ve HN4 baş ve boyun skuamöz karsinoma hücrelerinde263,264 apoptozu uyardığı gösterilmiştir. Bizim çalışmamızda da, CAL-62 ve CGTH-W1 hücre dizilerinde, TQ ve Genistein’in apoptotik etkilerini incelemek için Aktif Kaspaz-3 düzeylerine bakıldı. Literatürle uyumlu olarak, hem TQ’un hem Genistein’nin hem de kombine grubların iki hücre dizisine uygulanması sonrası, doza bağımlı olarak aktif kaspaz-3 düzeyinde artışa neden olduğu belirlendi. Kombine dozlar, CAL-62 için 25µM Gen + 10µM TQ, CGTH-W1 69 için 25µM Gen + 80µM TQ dozları 72 saatte (sırasıyla 2.8-2.7 kat artış) en yüksek aktif kaspaz-3 düzeylerini gösterdi. Bu sonuçlara göre iki hücre hattı karşılaştırılacak olursa, TQ ve Gen, kanser kök hücre özelliği gösteren ve göstermeyen kanser hücrelerini hemen hemen eşit oranda apoptoza uğratmaktadır. Buradan kanser kök hücrelerinin kaspaz-3 aktivasyonu yönünden, TQ ve Gen’e direnç geliştirmediği anlaşılabilir. Birçok kanser hücreleri gelişimlerini sürdürebilmek için telomeraz aktivitesine ihtiyaç duyarlar265. Normal somatik hücrelerde telomeraz aktivitesinin belirlenememesine karşılık insan kanser hücrelerinin %90’ının üzerinde telomeraz aktivitesi tespit edilmiştir266,267. Telomerazın yeniden aktifleşmesinin, tümörleşme sürecinde telomeraz baskılatıcılarının inaktivasyonu sonucu gerçekleştiği düşünülmektedir268. Yine telomeraz aktivitesi varlığının, bazı kanser tiplerinde hastalığın kötü prognozu ile de ilişkili olduğu bildirilmiştir 269, 270, 271, 272, 273,274. Literatüre baktığımız zaman telomeraz aktivitesinin inhibisyonu üzerine TQ ve Gen ile ilgili birkaç araştırmaya rastlandı. 2010 yılında Gurund ve ark. glioblastoma hücreleri üzerinde yaptıkları bir çalışmada, TQ’un telomerazı inhibe ederek telomer kısalmasına neden olduğunu ve DNA hasarı sonucu apoptozun geliştiğini göstermişlerdir 275. Yine prostat kanserleri üzerine yapılan araştırmalarda, Real Time PCR ile hTERT ifadelenme düzeyine bakılmış ve Gen ile muamele sonucunda doza bağımlı belirlenmiştir bir şekilde telomeraz aktivitesinde azalma olduğu 276 . Ayrıca yapılan bir diğer çalışmada c-myc ekspresyonunun azalmasının hTERT transkripsiyonel aktivasyonunu baskıladığı, Akt yolunun inhibisyonu ile de hTERT’in posttranslasyonel modifikasyonunun baskılandığı rapor edilmiştir277. 2009 yılında meme kanseri üzerine yapılan bir araştırma da ise Gen’inin dimetil-H3K4 azalması ve trimetil-H3K9 artışı 70 ile hTERT promotörünün yeniden düzenlenmesini sağladığı bildirilmiştir 278. Ayrıca yapılan bir başka araştırmada hTERT promoterine E2F-1’in bağlanmasında artış olduğu da bildirilmiştir279. Bu sonuçlar göstermektedir ki, hTERT promoterinde bulunan bazı transkripsiyon faktörlerine özgü (cmyc, E2F, AP2, NF-κβ ve CREB/ATF) bağlanma bölgeleri metilasyona duyarlı olduklarından bu bölgedeki metilasyonun hTERT transkripsiyonunu etkilemesi olası bir mekanizmadır280,281. Bizde çalışmamızda TQ ve Gen’in telomeraz aktivitesine etkilerini belirlemek için hTERT mRNA düzeylerine bakmayı seçmemizin nedeni; telomerazla ilgili diğer bileşenlerin telomeraz aktivitesinin etkinliğine bakmaksızın devamlı eksprese edilmesine karşılık, hTERT mRNA’sının telomeraz aktivitesiyle ilgili olarak artmasıdır ki, bu, hTERT’in telomerazı denetleyen faktör olduğunu göstermektedir. Bizim yaptığımız çalışmada, hTERT mRNA ifade düzeyi 72. saatte CAL-62 hücrelerinde doza bağımlı olarak oldukça anlamlı düzeyde azalma gösterirken, CGTHW1 hücrelerinde ise ancak yüksek dozlarda TQ ve Gen ile TQ+Gen’ nin etkili olduğu görüldü. Yani CGTH-W1 hücrelerinin telomeraz enzimi yönünden bu ajanlara daha dirençli olduğu gözlendi. Yine 25µM Gen + 10µM TQ kombinasyonu CAL-62’de hTERT’i 6.5 kat azaltarak en çok etkinin görüldüğü doz olarak belirlendi. Bu sonuçlar genel olarak TQ ve Gen’in, kanser kök hücre özelliği gösteren hücre dizisine anlamlı olarak daha çok etkili olduğunu göstermektedir. Ancak kanser kök hücrelerinde telomeraz aktivitesinin farklı düzenlemelerinin olup olmadığı, daha detaylı araştırmalarla aydınlatılması gereken sorulardan biri gibi gözükmektedir. Kanser oluşumunun temelinde daima genetik hasarlanma yatmaktadır282. Tedavide ise kullanılan ajanların bu hasarlanmayı nasıl 71 etkilediği önemlidir283. TQ’un etki ettiği anti-tümör mekanizmalarını tayin etmek amacıyla yapılan çalışmalar göstermiştir ki TQ, konsantrasyon bağımlı bir şekilde metastazı tetikleyen faktörleri inhibe etmektedir. Bunlar; tip 4 kollojenaz, metalloproteinaz ve serin proteinaz inhibitörleri, anjiojenik protein-fibroblastik büyüme faktörü, doku tip plazminojen aktivatörü, ürokinaz tipi aktivatörüdür284. plazminojen Yine Gen ile yapılan çalışmalarda ise Gen’in, VEGF reseptör-2 aktivasyonunu üzerine direkt etkili olmadığı, Akt aktivasyonunu inhibe etmek suretiyle endotel hücre migrasyonunu, invazyonunu, tüp oluşumuna etki ettiği285 ve VEGF’yi inhibe ettiği bildirilmiştir285, karsinomunda (MCF-7 286, 287, 288, 289 ve . Ayrıca Gen’in, insan meme MDA-MB-231), metalloproteinaz-1 doku inhibitörünü aktive ettiği ve MMP-9’u inhibe ettiği290, baş-boyun kanserinde MMP-2 ve 9’u inhibe ettiği291,292,293 ve pankreatik karsinomda VEGF’in ana regülatörlerinden biri olan HIF-1’i inhibe ettiği gösterilmiştir. Buna karşılık Gen’in plazminojen aktivatör inhibitör-1, endostatin, anjiostatin ve trombospondin gibi anjiogenez inhibitörlerini arttırdığı293 gösrerilerek290, invaziv ve metastatik kanser hücrelerini potansiyel olarak azaltıcı etkide bir ajan olduğu bildirilmiştir. Biz de araştırmamızda literatüre uyumlu olarak, TQ ve Gen uygulamaları sonucu her iki hücre hattında VEGF düzeylerinde doza bağımlı olarak anlamlı bir azalma olduğunu gözledik. CAL-62 hücrelerinde bu ilaç gruplarının (özellikle de 25µM Gen + 10µM TQ yaklaşık 18 kat azaltma ile) VEGF mRNA düzeyini çok daha belirgin olarak etkilediğini gördük. CGTH-W1 hücrelerinde ise yine kombine dozlar en etkili olarak saptanmıştır (25µM genistein + 80µM TQ kombinasyonu yaklaşık olarak 10 kat azaltma). Bu bulgular yukarda değinilen literatür bulguları ile uyumlu olup, hem TQ hem de genisteinin anti-tümör etkilerinin yanında anti-anjiojenik etkilerinin de yüksek olduğunu göstermektedir. İki hücre hattını karşılaştıracak olursak, yine kanser kök hücre özelliğindeki 72 hücrelerde anjiogenezin, TQ ve Gen’e bu kadar hassasiyetinin nedeninin anlaşılması ve buna yönelik hedefli tedavi geliştirilmesi için daha detaylı araştırmalar yapılması gerektiği açıktır. Daha önce yapılan araştırmalarda, Gen’in hücre proliferasyonu ve onkogenezinin potansiyel inhibitörü olarak görülmesinin nedeni, bir protein kinaz inhibitörü olmasıyla295 alakalı olabilir. Bilindiği gibi VEGF reseptörü de bir protein kinazdır ve karsinogenez, anjiogenez, hücre büyümesi ve apoptozda önemli roller oynamaktadır145, 146,148. Bir tümör supressör protein olan pTEN’in ise, hücre büyümesi ve apoptoz için gerekli sinyalleri düzenlemekte ve sinyal iletiminde öneli rolü olan PI3K’nın etkisini engellemede önemli bir yere sahiptir296. Meme kanserlerinde ve prostat kanserinde yapılan çalışmalar ile Gen tarafından PTEN ekspresyon düzeylerinde artış olduğu ve bunun sonucunda apoptozun indüklediği gösterilmiştir297, 298, 299 . 2011 yılında yapılan bir çalışmada doksorubisine dirençli MCF-7 insan meme kanseri hücrelerinde TQ’un Bax/Bcl-2 oranında artışa neden olarak apoptozu indüklediği gösterilmiştir. Bu etkinin nedenini anlamak için PTEN susturulmuş ve bu durum, TQ-indüklü apoptozun baskılanması ve hücre yaşamının artması ile sonuçlanmıştır. Bunun nedeni olarak da; PTEN’in bu hücrelerde Akt fosforilasyonunu inhibe etmesi, p53 düzeyini arttırarak G2/M arrestine ve apoptoza neden olması ile ilgili olduğu rapor edilmiştir300. Yine çalışmamızda, TQ’un her iki kanser hücrelerine de ancak yüksek dozlarında pTEN seviyelerini anlamlı olarak arttırabildiği görülmektedir. Özellikle, 25µMGen+10µMTQ yine kombine modülasyonu 4.5 dozlarda kat, (CAL-62 CGTH-W1 için için 25µMGen+80µMTQ modülasyonu 3 kat artma ile) çok daha büyük bir etki gözlenmiştir. 73 Yapılan çalışmalarda Gen’in p21 aracılığıyla hücre döngüsünü engellemesinden dolayı kanser hücrelerinin büyümesini inhibe ettiği bildirilmiş ve meme kanseri290, 302, 303 kolon/kolorektal kanserleri 301 , gastrik adenokarsinoma, , prostat kanseri ve insan melanoma kanser hücrelerinde G2/M geçişinin engellendiği gösterilmiştir261,304,305,306. Diğer yapılan çalışmalarda birçok insan tümör hücrelerine karşı TQ’un sitotoksik etkilerinin, p53 ekspresyonlarındaki artış ve anti-apoptotik Bcl-2 protein inhibisyonu ile alakalı olarak bu hücrelerin, hücre döngüsünü G1/S fazını geçemeyerek durduğu ve apoptozun tetiklendiği bildirilmiştir245,307. P53’ün hücre döngüsü üzerindeki durdurucu etkisini p21 arcılığıyla yaptığı düşünülürse, çalışmamızda mRNA düzeylerine baktığımız hücre döngüsü inhibitörü olan p21’in doza bağımlı olarak her iki hücrede de TQ ve Gen’in yüksek dozlarında anlamlı olarak arttığı görüldü. Tüm deneylerde olduğu gibi burada da en etkili sonuçlar 25µM Gen’in olduğu kombine dozlarda görüldü (CAL-62’de 3 kat, CGT-W1’de 2.5 kat artış) ve her iki kanser hücrelerinde de ilaç gruplarının etkileri benzer sonuçlar verdi. Yapılan birçok çalışmada Gen’in, hücrenin canlılığı açısından önemli olan NF-κβ ve Akt sinyal yolunda güçlü bir inhibitör olduğu, ayrıca Bax/Bcl-2 oranını ve kaspaz-3’ün aktivasyonunu arttırdığı bulunmuş ve bunun da apoptoz yoluna götürdüğü görüşüne varılmıştır 308,309. Bilindiği gibi NF-κβ hücre çoğalması olaylarında birçok geni kontrol etmektedir. Pankreatik karsinom hücrelerinde TQ’un, NF-κβ, Bcl-2 ve NF-κβ ile ilişkili antiapoptotik genlerin (survivin,siklooksijenaz 2 ) ifadelenmesini azalttığı, buna ilave olarak, TQ'un pankreas kanseri tedavisinde kullanılan Gemcitabine ve Oxaliplatin kemoterapötik ilaçların etkilerini önemli derecede arttırdığı gösterilmişdir. Böylece hücrelerin apoptoza gitmesine yol açtığı bildirilmiştir309. Yapılan bir çalışmada, Gen’in NF-κβ’nın nükleer translokasyonunu ve DNA’ya bağlanmasını önlediği bildirilmiştir310. Bu 74 sonuç, TQ ve Gen’in NF-κβ’nın aktivasyonu üzerine etkili, ekspresyonu üzerine etkili olmayabileceğini de düşündürmüştür. 2008 yılında Sethi ve ark., TQ’un antiinflamatuar ve anti-kanser aktivitesinin etki mekanizmasının anlaşılması üzerine yaptıkları bir çalışmada, NF-κβ regülasyonu ile, anti-apoptotik, proliferatif ve anjiojenik (VEGF) yolaklarda etkili birçok genin ekspresyonlarının arttığını, TQ’un, NF-κβ aktivasyonunu engelleyerek etkisini gösterdiği bulunmuştur. Buna ilave olarak, NFkappaB aracılığıyla oluşan ve kanser oluşumuna etki eden antiapoptotik (IAP1, IAP2, XIAP Bcl-2, Bcl-xL, ve survivin), proliferarif (cyclin D1, cyclooxygenase-2, ve c-Myc), and anjiogenik (MMP-9 ve VEGF) maddelerin etkilerinin TQ tarafından yok edildiği gösterilmiştir311. Yaptığımız çalışmada, TQ-Gen’in kombine dozlarının, NF-κβ düzeylerini doza bağlı olarak, oldukça anlamlı bir (CAL-62’de 4.5 kat, CGTH-W1’de ise 3.5 kat şekilde düşürdüğü kontrole göre azalma) görüldü. CAL-62 ve CGTH-W1 hücrelerine TQ ve Gen’in kombine dozlarının daha etkili olduğu görülmektedir. Ayrıca CAL-62 hücrelerinde TQ ve genisteinin tek başına yüksek dozlarda etkili olduğu, CGTH-W1 hücrelerinde ise sadece genisteinin yüksek dozda etkili olduğu gözlendi. Yapılan çalışmalar sonucu, nükleusda hTERT’in NF-κβ ile direkt ilişkili olduğu ve bu ilişkinin çekirdek translokasyonuna aracılık ettiği in vivo olarak gösterilmiş312, ayrıca hTERT- NF-κβ kompleksinin, hTERT’in regüle ettiği genlerin promotere toplanmasını sağlayarak, birçok genin regülasyonu üzerinde rol oynayabileceği önerilmiştir313. hTERT’in çeşitli genler üzerinde düzenleyici etkisinin olduğu bazı çalışmalarda rapor edilmiştir. Örneğin; kanser hücrelerinde artmış olarak görülen ve tümör metastazında rolü olan, Mac-2BP (tümör antijen Mac-2 bağlayan protein) sekresyonunu hTERT’in arttırdığının gösterilmesi metastazdaki rolünü314, 75 315 , yine p53’ün, pRB’nın negatif regülatörü olması ve p21 ekspresyonunu azaltması, siklin D1 ekspresyonunu ise arttırması, hücre siklusundaki rolünü göstermektedir29,277,316,317. Daha önce yapılan çalışmalar, telomeraz ve hTERT ekspresyonunun, c-myc tarafından aktive edilerek düzenlendiğini bildirirken; daha sonra yapılan çalışmalar ise, hTERT’in, cmyc’in ekspresyonunu arttırarak regüle ettiğini göstermiştir318,319,320. Son zamanlarda yapılan çalışmalarla, özel bir revers transkriptaz olan telomeraz enzimine ait bilgilerimiz, hTERT’in farklı fonksiyonlarının keşfi ile artmaktadır. Telomerazın katalitik proteini olan hTERT kısmında yer alan 20 amino asitlik sinyal peptid uzantısının, molekülü mitokondriye yönlendirerek organelde telomeraz aktivitesini sağladığı bulunmuş ve hTERT’in, bu çekirdek dışına çıkma eylemini ise, H2O2’nin mitokondri DNA’sı üzerine yaptığı hasar gibi oksidatif stresin indüklediği bildirilmiştir321,322. Telomeraz aktivitesinden bağımsız olan bu çekirdek dışına çıkma işleminin, hTERT’in mitokondrial pro-apoptotik aktivitesiyle sonuçlandığı yapılan araştırmalar ile desteklenmektedir322. Ayrıca diğer yapılan çalışmalar, telomerazın mitokodriden sitokrom-c salınımı ve apoptozu indükleyen faktörleri baskılamak yoluyla, antiapoptotik etkisinin de olduğunu göstermektedir. Araştırmaların sonuçları, telomerazın DNA hasar yanıtı mekanizmasında rol oynayan proteinler (Mre11/Rad50/NBS, Ku, BLM/WRN ve ERCC1/XPC proteinleri) ile yakın ilişkisinin olması ve hücrede telomeraz ekspresyonunun artmasıyla bu proteinlerin de miktarında artma olduğunu göstermektedir. Bu bulgulardan yola çıkılarak, telomerazın anti-apoptotik etkisinde, bu DNA tamir mekanizmasının düşünülmektedir bir parçası olmasının da katkısı olduğu 323,324 . 76 2001 yılında baş-boyun kanseri üzerine yapılan bir çalışmada Genistein inkübasyonu ile MMP-2,9, NF-κβ, Bcl-2, siklin B1 düzeylerinde azalma, bax ve p21 düzeylerinde ise artma olduğu gösterilmiştir. Ayrıca Genisteinin hTERT translokasyonunu önleyerek telomerazı inhibe bildirilmiştir291. ettiği Bunun ve telomer dışında kısalmasına Genisteinin, neden NF-κβ’nın olduğu nükleer translokasyonunu ve DNA’ya bağlanma aktivitesini düşürerek etki ettiği ve toksik ajanlarla (H2O2) birlikte verildiğinde NF-κβ’nın inaktive olmasını engellediği bildirilmiştir310,325. Bu bilgilerin ışığında, TQ ve Gen’ nin, NFκβ’nın ifadelenme düzeyinde değil, fonksiyonunda etkili olabileceği de düşünülebilir. Ayrıca antioksidanların, hTERT’in çekirdek dışına çıkışını inhibe ettiği de diğer yapılan bir araştırmada bildirilmektedir322. Dikkat çekici diğer bir konu ise, kanser hücrelerinin artan metabolik strese ve proliferatif hızına bağlı olarak normal hücreden daha fazla reaktif oksijen türleri (ROS) ürettiklerinin bilinmesidir326,327,328. Bu literatür bilgilerine göre, aşırı oksidatif stres, DNA-hasar tamir mekanizmasının bir parçası olarak, hTERT ekspresyonunu arttırıyor olabilir. H2O2 gibi toksik durumlarda ise inaktive edilemeyen NF-κβ, artan hTERT ile kompleks oluşturarak, VEGF, Bcl-2, siklin D1 artışı, p53, p21 azalışı gibi proliferatif, anjiojenik ve antiapoptotik etkili genleri düzenliyor olabilir. Kanserlerin oluşum mekanizmalarının anlaşılması ve kanserle mücadelede yeni yaklaşımların ortaya konması, telomerazı kontrol eden ve telomerazın kontrol ettiği tüm bu mekanizmaların, daha detaylı çalışmalarla aydınlatılmasını sağlayabilecektir. Yine, kanser hücrelerindeki bu artan ROS nedeniyle, kanser ve normal hücrelerin 77 seçiciliğine gidilerek, kanser hücresi-ROS hedefli tedavi yaklaşımları da son zamanlarda önerilen yaklaşımlarından biridir326,329. İlginç olan şu ki; kanser hücrelerinde bu artan ROS, bir süre sonra niçin hücrenin kendi kendine apoptoza gitmesini sağlamıyor? Ayrıca TQ ve Gen gibi güçlü antioksidan ajanlar, artmış ROS üretimi olan kanser hücrelerini tamir etmek yerine, yapılan birçok çalışmada ve bizim çalışmamızda görüldüğü gibi, niçin ölüme götürüyor? Bunlar gerçekten açıklanması gereken sorular olarak karşımızda durmaktadır. Ayrıca Genistein ve TQ’ nun tek başına ve birlikte görülen apoptotik etkisinin yanısıra diğer kemoterapötik ajanlarla olan etkisinin belirlenmesi de ayrı bir çalışma konusu oluşturarak farklı tedavi yaklaşımlarının ortaya çıkmasında katkı sağlayacaktır. Bunun dışında Genistein ve Timokinon’ nun Tiroid kanseri hücrelerindeki etkisinin moleküler düzeyde tam anlamıyla anlaşılması için hücre proliferasyonu ve apotoz ile ilgili çeşitli sinyal yolaklarının ayrıntılı bir şekilde araştırılması yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi açısından faydalı olacaktır. 78 6. SONUÇ Kanser kemoterapisinin temel sorunu, kanser kemoterapötik ilaçlarının spesifik olmayan hedeflemeler nedeniyle, normal ve kanseröz hücrelerin her ikisine de olan yan etkileridir. En fazla üzerinde durulan konu; normal hücreler üzerinde minimal toksik etkili ancak seçici olarak tümör hücrelerini hedefleyerek etkili olan, yeni bileşiklerin keşfi üzerinedir. Bu nedenle son yıllarda, normal hücresel sistemler üzerinde daha düşük sitotoksik etkileri nedeniyle insan tümörlerinde potansiyel kemoterapötik olan, doğal bitkisel ürünlere ilgide artış olmaktadır. Biz de bu çalışmamızda doğal bitkisel ürünler olan Timokinon ve Genistein’in apoptotik etkilerini, tiroid kanser hücreleri üzerinde test ettik. Bizim bulgularımız literatürde yayınlanan önceki çalışmalarla da uyumlu olarak, Timokinon ve Genistein’le indüklenen apoptoza tiroid hücrelerinin çok hassas olduğunu gösterdi. Buna ilaveten Timokinon ve Genistein’in, özellikle birlikte kullanılan kombine dozlarında en fazla olmak üzere, proliferatif, anjiojenik yolaklarda etkili gen ürünlerini anlamlı bir şekilde azaltarak, hücre döngüsü inhibitörü ve tümör supressör özellikdeki bazı gen ürünleri üzerinde ise anlamlı bir artişa neden olarak tiroid kanser hücrelerinde etkili olduğunu gösterdi. Kemoterapi ilaçlarının çoğunluğu hücre ölümünü tetikleyerek işlev gören ajanlardır. Ancak tümör hücreleri zaman içinde kemoterapi ve radyoterapiye direnç gösterirler. Telomeraz, apoptoza dirençli kanser hücrelerinde kritik rol oynar ve telomeraz inhibisyonu apoptozu indükler. Bu bakımdan bizim bu çalışmamız, tiroid kanser hücreleri üzerinde Timokinon ve Genisteinin, hTERT mRNA ifadelenmesinde önemli bir 79 azalmaya neden olarak, telomeraz enzimini inhibe ettiğini göstermesi açısından da bir ilk niteliğindedir. Ayrıca çalışmamızdaki hTERT’in kantitatif miktar tayini, kanser teşhisi, takibi ve tedavisi hususundaki düşünceleri de destekler nitelik taşımaktadır. Bizim sonuçlarımız; tüm deneylerde özellikle Timokinon ve Genistein kombinasyonunun çok daha etkili olduğu üzerinde yoğunlaştı. Bu bakımdan bu iki doğal bitkisel bileşik, tiroid kanserinin tedavisi için kemoterapötik ajan olarak potansiyel bir aday olabilir. Ayrıca çalışmamızda, kanser kök hücre özelliğinde olan ve olmayan iki tiroid kanser hücre hattı, karşılaştırmalı olarak çalışılmıştır. Tüm deneylerde TQ ve Gen etkilerine, in vitro olarak tiroid kanser kök hücrelerinin daha hassas olduğunun görülmesi sonucuyla da araştırmamız bir ilk niteliğinde olup, bu yönde yapılacak araştırmalara ışık tutması açısından da bilime katkı yaratacağını düşünmekteyiz. Ancak ortamında farklı, hücrelerin organizmada davranış biçimlerinin, ait oldukları dokuda hücre kültürü farklı olduğu gerçeğinden hareketle, araştırmalarda kullanılan deneysel modellerin, toksisite yaratarak oluşturulan hücre kültürü modellerinden hayvan modelleri yönündeki daha detaylı çalışmalarla da desteklenmesi, bu yönde daha net cevaplar bulunmasını sağlayacaktır. 80 7. ÖZET Tiroid kanser hücre hatlarında Timokinon ve Genistein’in telomeraz aktivitesi ve apoptozis üzerine etkisi Bugünkü kanser tedavisinde temel iki sorun vardır; kanser ilaçlarının normal hücreler üzerinde de toksik etkilerinin bulunması ve kanser kök hücrelerinin mevcut tedavilere dirençli olmasıdır. Bu nedenle bu araştırmada, tedaviye dirençli kanser kök hücrelerini de içine alan tümör moleküler mekanizmalarını araştırmak üzere, kanser hücre apoptozunu yüksek seçicilik ve etkinlikte indükleyen, kanser telomerazını inhibe eden ancak normal hücrelere minimal toksik etkili ilaç ve tedavilerin geliştirilmesi için bir ön çalışma amaçlanmıştır. Anaplastik ve folliküler tiroid kanserleri malign tümörlerdir. Anaplastik tiroid kanser hücrelerinin kök hücrelerinden geliştiği bildirilmiştir. Çalışmamızda, normal hücrelere minimal toksik etkili, antioksidan ve antitümör etkileri gösterilmiş tıbbi bitkiler olan Timokinon ve Genistein’in tek tek ve kombine uygulamalarından sonra anaplastik tiroid kanser (CAL-62) ve folliküler tiroid kanser (CGTH-W1) hücre dizilerinde karşılaştırmalı olarak telomeraz aktivitesi ve apoptoz üzerine olan etkilerini araştırmak için; hTERT, PTEN, NF-kB, p21 ve VEGF-A genlerinin mRNA (transkripsiyon) düzeylerindeki ve aktif kaspaz-3 (translasyon) düzeylerindeki değişimleri incelenmiştir. İlk olarak hücre canlılığını belirlemek için MTT testi kullanılırken, mRNA analizi için Real-Time PCR yöntemi uygulanmıştır. Ayrıca aktif kaspaz-3 seviyelerinin belirlenmesi için de Kaspaz-3 Sadwich ELİSA kiti kullanılmıştır. 81 Bulgularımız, ilk kez Timokinon ve Genistein’in, özellikle kombine dozlarının tiroid kanser hücre dizilerinde istatistiksel olarak oldukça anlamlı düzeylerde apoptoz indüksiyonuna, telomeraz anjiogenez inhibisyonuna ve yol açtığını göstermektedir. Bunlara ilaveten bizim sonuçlarımız, kanser kök hücre özelliğinde olan ve olmayan iki farklı tiroid kanser hücre hatlarının karşılaştırılarak Timokinon ve Genistein’in etkilerine, tiroid kanser kök hücrelerinin daha hassas olduğunu göstermesi yönünden de bir ilk niteliğindedir. Bütün olarak bu veriler, Timokinon ve Genistein’in tiroid tümörlerinde potansiyel kemoterapötik ajanlar olarak kullanılabileceğini önermektedir. Anahtar Kelimeler: Tiroid kanseri, Timokinon, Genistein, Kanser kök hücresi, Telomeraz, Apoptoz, Anjiogenez. 82 8. SUMMARY The Effect of Thymoquinone and Genistein treatment on Telomerase activity and Apoptosis in Tyroid cancer cell lines There are two main problems of today’s cancer treatment: acancer drugs have toxic effects on normal cells, and b- cancer stem cells are resistant to current treatments. Therefore, to investigate the molecular mechanisms of tumor, which include treatment-resistant cancer stem cells, that induce high selectivity and efficiency to cancer cell apoptosis, and also inhibit telomerase and angiogenesis in cancer, and this study was aimed a preliminary analysis to develop treatments and drugs with minimally toxic effects on normal cells. Anaplastic and follicular thyroid cancers are malignant tumours. It has been reported that anaplastic thyroid cancer cells were developed from the stem cells. After individual and combined dose applications of Thymoquinone and Genistein medicinal plants, which showed to be minimally toxic effects, we investigated the effects of these drugs on telomerase activity, angiogenesis and apoptosis as compared in anaplastic (CAL-62) and follicular (CGTH-W1) thyroid cancer cell lines. mRNA levels of hTERT, PTEN, NF-kB, p21 and VEGF-A genes and an active caspase-3 protein level have been measured in our study. We conducted MTT assay to determine cell viability, and than Real-Time PCR method was used for the analysis of mRNA. In addition, Kaspas-3 Sandwich Elisa kit was used to determine the levels of active caspase-3 protein. 83 Our findings have demonstrated for the first-time that especially the combined dose application of Thymoquinone and Genistein resulted in statistically high level of apoptosis induction and inhibition of telomerase and angiogenesis in thyroid cancer cell lines. In addition, our results also have showed that thyroid cancer stem cells is more sensitive to the effects of Thymoquinone and Genistein treatment as compared thyroid cancer cell lines which of both cancer stem cell and non-cancer stem cell. Finally, these data indicated that the combined use of Thymoquinone and Genistein can be good choise of potential chemotherapeutic agents in the management of thyroid tumours. Keywords: Thyroid cancer, Thymoquinone, Genistein, Cancer stem cell, Telomerase, Apoptosis, Angiogenesis. 84 9. KAYNAKLAR 1. İşgör A. Tiroit Hastalıkları ve Cerrahisi. Avrupa Tıp. 2000; 365-459. 2. Moore KL. Clinically Oriented Anatomy. 3’th Edition. Williams & Wilkins. 1992; 817-820. 3. Klonisch T, Hoang-Vu C, Klonisch SH. Thyroid stem cells and cancer. Thyroid. 2009; 19(12): 1303-15. 4. Kondo T, Ezzat S, Asa S. Pathogenik mechanisms in thyroid follicularcell neoplasia. Nature. 2006; April, Vol:6, 292-306. 5. Akslen L.A, Livolsi A.V. Prognostic Significance of Histological Grading Compared with Subclassification of Papillary Thyroid Carcinoma. Cancer. 2000; 88:1902-1909. 6. Farid NR, Shi Y, Zou M. Molecular basis of thyroid cancer. Endocr Rev. 1994; 15:202-232. 7. Karapanou O, Papadimitriou A. Thyroid hormone transporters in the human. Hormones. 2011; 10 (4): 270-9. 8. Collins SL. Thyroid cancer:controversies and etiopathogenesis. Thyroid. 1997; 495-564. 9. Kilfoy BA, Zheng T, Holford TR, Han X, Ward MH, et al. International patterns and trends in thyroid cancer incidence 1973-2002. Cancer Causes & Control. 2009; 20: 525-531. 10. Takano T, Hesegawa Y, Matsuzuka F, Miyauchi A, Yoshida H, Higashiyama T, Kuma K, Amino N. Gene expression profiles in thyroid carcinomas. Br J Cancer. 2000; 83: 1495-1502. 85 11. Takano T. Fetal cell carcinogenesis of the thyroid: A hypothesis for better understanding of gene expression profile and genomic alternation in thyroid carcinoma. Endocr J. 2004;51(6):509-515. 12. Takano T, Amino N. Fetal cell carcinogenesis: a new hypothesis for better understanding of thyroid carcinoma. Thyroid. 2005;15: 432-8. 13. Takano T, Ho Y, Matsuzuka F, Miya A, Koboyashi K, Yoshida H, Miyauchi A. Expression of oncofetal fibronectin mRNA in thyroid anaplastic carcinoma. Jpn J Clin Oncol. 2007; 37(9): 647-651. 14. Takano T. Fetal cell carcinogenesis of the thyroid: theory and practice. Semin Cancer Biol. 2007; 17: 233-40. 15. Wicha MS. Cancer stem cell heterogeneity in hereditary breast cancer. Breast Cancer Res 2008;10(2):105. 16. Srivatsa B, Srivatsa S, Johnsob KL,Samura O, Lee SL, Bianchi DW. Microchimerism of presumed fetal orijin in thyroid specimens from women: a case-control study. Lancet. 2001; 358: 2034-2038. 17. Khosrotehrani K Johnson KL, Cha DH, Salomon RN, Bianchi DW. Transfer of fetal cells with multilineage potential to maternal tissue. JAMA. 2004;292(1): 75-80. 18. Blackburn E.H. Structure and function of telomeres. Nature 1991; 350: 569-573. 19. Chan S R W L, Blackburn E. H. Telomeres and telomerase. Phil.Trans. R. Soc. Lond. 2004; 359: 109-121. 20. Liu D, O’connor M S, Quin J, Songyang Z. Telosome:mammalian telomere-associated complex formed by multiple telomeric proteins. J. Biol. Chem. 2004; 279: 51338-51342. 86 21. Dong C K, Masutomi K., Hahn W C. Telomerase: regulation,function and transformation. Crit. Rev. Oncol. Hamatol. 2005; 54: 85-93. 22. Shay J W, Zou Y, Hiyama E., Wright W E. Telomerase and cancer. Hum. Mol. Genet. 2001; 10: 677-685. 23. Grander M P, Wright W E, Shay J W. Telomerase in cancer and aging. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2002; 41: 29-40. 24. Hahn W C. Telomere and telomerase dynamics in human cells. Curr. Mol. Med. 2005; 5: 227-31. 25. Ohki R, Tsurimoto T, Ishikawa F. In vitro reconstitution of the end replication problem. Mol Cell Biol. 2001; Sep;21(17):5753-66. 26. Horikawa I and Barrette JC. Transcriptional regulation of the telomerase hTERT gene as a target for cellular and viral oncogenic mechanisms. Carcinogenesis. 2003; 24(7): 1167-76. 27. Greider CW, Blackburn EH. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. 1985; 43:405-413. 28. De Lange T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 2005;19: 2100-2110. 29. Cong Y S, Woodring E, Shay J W. Human telomerase and its regulation. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002; 66: 407-425. 30. Bailey S M, Murnane J P. Telomeres, chromosome instability. Nucleic Acids Res. 2006; 34: 2408-2417. 87 31. Armbruster BN, Banik SS, Guo C, Smith AC, Counter CM. N terminal domains of the human telomerase catalytic subunit required for enzyme activity in vivo. Mol Cell Biol 2001;21:7775-7786. 32. Wick M, Zubov D, Hagen G. Genomic organisation and promoter characterization of the gene encoding the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) . Gene 1999; 232:97-106. 33. Bryce LA, Morrison AN, Hoare SF, Muir S, Keith WN. Mapping of the gene for the human telomerase reverse transcriptase, hTERT, to chromosome 5p15.33 by fluorescence in situ hybridization. Neoplasia 2000;2:197-201. 34. Koutroumba, P. Polychronopoulou, S. Haidas, S. Structure and function of telomeres/telomerase and their role in preleukemia and haematologic malignancies. Haema. 2003; 6 (1): 35-47 35. Forsythe HL, Jarvis J L, Turner JW, Elmore L W, Holt SE. Stableassociation of hsp90 and p23, but Not hsp70, with active human telomerase. J Biol Chem. 2001;276:15571–15574. 36. Linger J, Hughes TR, Shevchenko A. Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase. Science. 1997; 276(5312): 561-67. 37. Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al.: Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science 1994, 266: 2011-15. 38. Smogorzewska A, de Lange T. Regulation of telomerase by telomeric proteins. Annu. Rev. Biochem. 2004; 73: 177-208. 88 39. Cong YS, Bacchetti S. Histon deacetylation is involved in the transcriptional repression of hTERT in normal human cells. J Biol Chem 2000; 275:35665-35668. 40. Bechter OE, Eisterer W, Dlaska M, Kuhr T, Thaler J.CpG island methylation of the hTERT promoter is associated with lower telomerase activity in Bcell lymphocytic leukemia. Exp Hematol 2002; 30:26-33. 41. Oshimura M, Barrett JC. Multiple pathways to cellular senescence: role of telomerase repressors. Eur. J. Cancer. 1997; 33: 710-715. 42. Nishimoto A, Miura N, Horikawa I, Kugoh H, Murakami Y, Herohashi S, et al. Functional evidence for telomerase repressor gene on human chromosome 10p15.1. Oncogene. 2001; 20:828-835. 43. Steenbergen R D, Kramer D, Meijer C J, Walboomers J M,Trott D A, Cuthberg A P. Telomerase suppresion by chromosome 6 in a human papilloma virus type 16-immortalized keratinocytecell line and in a cervical cancer cell line. J. Natl. Cancer. 2002; Inst. 93: 865-872. 44. Sakaran VG, Soares J, Jarstfer MB. Structures of telomerase subunits provide functional insights. BBA Proteins and Proteomics. 2010; 1804 (5): 1190-1201. 45. Ye J ZS, Hockemeyer D, Krutchinsky A N, Loayza D,Hooper S M, Chait BT, et al. POT1-interacting protein PIP1: a telomere length regulator that recruits POT1 to the TIN2/TRF1 complex. Genes & Dev. 2004; 18: 1649-1654. 46. Zhou X Z, Lu K P. The PIN2/TRF1-interacting protein PINX1 ıs a potent telomerase inhibitor. Cell. 2001;107: 347-359. 89 47. Greenberg R A. Telomeres, crisis and cancer. Curr. Mol. 2005;Med. 5: 213-218. 48. Shvartzon DA, Rabzova MP, Zvereva ME, Kiselev RL, Donzova OA. The regulation of telomerase in oncogenesis. Acta Naturae. 2012 AprJune; 4(1-1). URL: htt://www. Actanaturae.ru/article.aspx?id=142. 49. Klingelhutz A J. Telomerase activation and cancer. J. Mol. Med. 1997; 75: 45-49. 50. Reddel R R, Bryan T M. Alternative lengthening of telomeres: dangerous road less traveled. Lancet. 2003; 361: 1840-1841 51. Stewart S A. Telomere maintenance and tumorigenesis: an “ALT”ernative road. Curr. Mol. Med.2005; 5: 253-257. 52. Cesare AJ, Griffith JD. Telomeric DNA in ALT cells is characterized by free telomeric circles and heterogeneous t-loops. Mol Cell Biol. 2004; Nov;24(22):9948-57. 53. Shay JW. Telomerase in cancer: Diacnostic, prognostic and therapeutic implications. Cancer J Sci Am. 1998; 4: 26-34. 54. Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics. Br J Cancer. 1972; 26(4): 239-57. 55. Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol. 2007; 35(4): 495-516. 56. Zaber IZ and Lockshin RA. Cell Death: History and Future. Adv Exp Med Biol. 2007; 615: 1-11. 90 57. Danial NN, Korsmeyer SJ. Cell death: critical control points. Cell 2004;116:205-19. 58. Schimmer AD. Apoptosis in leukemia: from molecular pathways to targeted therapies. Best Pract Res Clin Haematol 2008; 21(1): 5-11. 59. Wyllie AH. Apoptosis and the regulation of cell numbers in normal and neoplastic tissues: an overview. Cancer and Metastasis Reviews. 1992; 11: 95-103. 60. Horvitz, H. R. Genetic control of programmed cell death in the nematode Caenorhabditis elegans. Cancer Res. 1999; 59: 1701–6. 61. Norbury, C. J., and Hickson, I. D. Cellular responses to DNA damage. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2001;41: 367–401. 62. Öztürk F. Apopitoz. İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, 2002; 9(2):143–148. 63. Öniz H. Apoptoz: ölmeye yatmak. SSK Tepecik Hast Derg, 2004; 14(1):1–20. 64. Fadeel B, Orrenius S. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in human disease. J Ġnternal Med. 2005; 258: 479-517. 65. Redd J. Apoptosis based the therapies. Nature Rev Drug Discover. 2002; 1. 111-121. 66. Saikumar P, Dong Z, Mikhailov V, Denton M, Weinberg JM, Venkatachalam MA. Apoptosis: definition, mechanisms, and relevance to disease. Am J Med 1999, 107(5): 489-506. 91 67. Green DR, Reed JC. Mitokondria and apoptosis. Science. 1998; 281. 1309-12. 68. Gastman BR. Apoptosis and its clinical impact. Head Neck, 2001; 23:409–25. 69. Jones BA, Gores GJ. Physiology and pathophysiology of apoptosis in epithelial cells of the liver, pancreas, and intestine. Am J Physiol, 1997; 273:1174–88. 70. Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis. Nature. 2000; 407: 770-6. 71. Strasser A, O'Connor L, Dixit VM. Apoptosis signaling. Annu Rev Biochem 2000, 69: 217-45. 72. Jin Z, El-Deiry WS. Overview of cell death signaling pathways. Cancer Biol Ther 2005, 4(2): 139-63. 73. Li HL, Zhu H, Xu CJ,et al. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas patway of apoptosis. Cell. 1998; 94: 491-501. 74. Degardes J, Osen-Sand A, Nichol SA, et al. Bid-induced conformational change of Bax is resposible for mitochondrial cytochrome c release during apoptosis. J Cell Biol. 1999; 144: 891901. 75. Er E, Oliver L, Cartron P, Juin P, Manon S, Vallette FM. Mitochondria as the target of the proapoptotic protein Bax. Biochimica Et Biophysica Acta, 2006; 1757:1301–1311. 92 76. Adrain C, Martin SJ. The mitochondrial apoptosome: a killer unleashed by the cytochrome seas. Trends in Biochemical Sciences, 2001; 26(6):390–397. 77. Mohamad N, Gutiérrez A, Núñez M, Cocca C, Martín G, Cricco G, Medina V, Rivera E, Bergoc R. Mitochondrial apoptotic pathways. Biocell, 2005; 29(2):149–161. 78. Green D, Kroemer G. The central executioners of apoptosis: caspases or mitochondria? Trends in Cell Biology,1998; 8:267–271. 79. Ekert PG, Vaux DL. The mitochondrial death squad: hardened killers or innocent bystanders? Current Opinion in Cell Biology, 2005; 17:626–630. 80. Bishopric NA, Andricka P, Slepak T, Webster KA. Molecular mechanisms of apoptosis in the cardiac myocyte. Curr Opin Pharmacology. 2011; 1(1-2): 141-150. 81. Wang X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Rev. 2001; 15: 2922-33. 82. Zhou P, Chou J, Olea RS, Yuan J, Wagner G. Solution structure of Apaf-1 CARD and its interaction with caspase-9 CARD: A structural basis for specific adaptor/caspase interaction. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96: 11265-70. 83. Galluzzi L, Vitale I, Abrams JM, Alnemri ES, Baehrecke EH, Blagosklonny MV, et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committe on Cell Death 2012. Cell Death Different. 2011; 15: 1-14. 93 84. Martin Valet D, Zhu D, Lieberman J. Granzyme A induced caspaseindependent mitochondrial damage a required first step for apoptosis. Immunity. 2005; 22: 355-70. 85. Chipuk JE, Green DR. Do inducers of apoptosis trigger caspaseindependent cell death? Nat Rev Mol Cell Biol. 2005; 6: 268-75. 86. Bröker LE, Kruyt FAE, Graccone G. Cell death independent of caspase: a review. Clin cancer Res. 2005; 11(9). 3155-62. 87. Thornberry NA, Rono TA, Peterson EP, Rasper DM, Timkey T, Garcia-Calvo M,et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme-B. J Biol chem. 1997; 272(29): 17907-11. 88. Jeffrey C, Thompsan R. The control effectors of cell death in the immun system. Annu Rev Immunol. 1999; 17: 781-828. 89. Rao RV, Hermel E, Obregon SC, Rio G, Ellerby LM, Ellerby HM, Bredesen DE. Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program mechanism of caspase activation. The Journal Of Biologıcal Chemistry, 2001; 276(36):33869–33874. 90. Dorin N, Cathelin S, Jacquel A, Guery L, Garrido C, Fontenay M, et al. A role for caspase in the differantiation of erythroid cells and macrophages. Biochimie. 2008; 90: 416-22. 91. Lamkanfi M, Festjens N, Declercq W, Vanden Bergle T, Vandenabeele P. Caspases in cell survival, proliferation and differentiation. Cell Death Differ. 2007; 14: 44-55. 92. Nhan TQ, Liles WC and Schwartz SM. Physiological functions of caspases beyond cell death. Am J Pathol. 2006; 169: 729-37. 94 93. Iannola G, Conticello C, Memeo l,et al. Apoptosis in normal and cancer stem cells. Crit Rev Oncol Hemet. 2008; 66: 42-51. 94. Danial MN, Korsmeyer SJ. Cell death: critical control points. Cell. 2004; 116: 205-19. 95. Thornberry N. The caspase family of cysteine proteases. British Medical Butetin. 1996, 53(3): 478-490. 96. Heath-Engel HM, Shore GC. Mitochondrial membrane dynamic, cristae remodelling and apoptosis. Biochim Biophys Acta. 2006; 1763: 549-60. 97. Kim R, Emi M, Tanabe K, et al. Regulation and interplay of apoptotic and non-apoptotic cell death. J Pathol. 2006; 208:319-26. 98. Kumar S. Mechanisms of caspase activation in cell death. Cell Death Differ. 1999; 6: 1060-66. 99. Salvesen GS. Caspases and apoptosis. Essays Biochem. 2002; 38: 919. 100. Kumar S. Caspase function in programmed cell death. Cell Death Differ. 2007; 14: 32-43. 101. Zhivotovsky B. Caspases: The enzymes of death. Essays Biochem. 2003; 39. 25-40. 102. Renatus M, Stennicke HR, Scott FL, Liddington RC, Salvesen GS. Dimer formation drives the activation of the cell death protease caspase 9. Proc Natl Acad Sci USA. 2001; 98: 14250-5. 103. Boatright KM, Renatus M, Scott FL, et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 2003; 11(2): 529-41. 95 104. Creagh EM, Martin SJ. Caspases: cellular demolition experts. Biochem Soc Trans. 2001; 29: 696-702. 105. Donepudi M, Grutter MG. Structure and zymogen activation of caspase. Biophsical Chem. 2002; 101: 145-53. 106. Puentes-Prior D and Salvesen GS. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem J. 2004; 384: 201-232. 107. Yuan J and Yanker B. Apotosis in the nervous system. Nature. 2000; 407: 802-9. 108. Shi Y. Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis. Mol Cell 2002, 9(3): 459-70. 109. Kumar S. Caspase function in programmed cell death. Cell Death and Differentiation, 2006; 1–12. 110. Calvo MG, Peterson EP, Rasper DM, Vaillancourt JP, Zamboni R, Nicholson DW, Thornberry NA. Purification and catalytic properties of human caspase family members. Cell Death And Differentiation, 1999; 6:362–369. 111. Riedl S, Yigong S. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat Rev Mol Biol. 2004; 5: 897-907. 112. Baliga BC, Read SH and Kumar S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 2004; 11: 1234-41. 113. Zhivotovsky B and Orrenius S. Caspase-2 function in response to DNA damage. Biochem Biophys res Commun. 2005, 331: 859-67 96 114. Emeto Y, Monome Y, Meinhardt G, et al. Proteolytic activation of protein kinase-C by an ICE-like protease in apoptotik cells. EMBO J. 1995; 14(24): 6148-56. 115. Frasch SC, Henson PM, Kailey JM, et al. Regulation of phospholipid scramblase activity during apoptosis and cell activation by protein kinase C delta. J Biol Chem. 2000; 275: 23065-73. 116. Hoffman P, deCathelineau AM, Ogden CA, et al. Phosphatidylserine (PS) induces PS receptormediated macropinocytosis and promotes clearance of apoptotic cells. J Cell Biol. 2001; 155: 649-59. 117. Salvesen GS and Dixit VM. Caspase activation: The inducedproximity model. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96: 10964-67. 118. Wolf BB and Green DR. Suicidal Tendencies: Apoptotic cell death by caspase family proteinases. J Biol Chem. 1999; 274(29): 20049-52. 119. Choen GM. Caspases: The executioners of apoptosis. Biochem J. 1997; 326: 1-16. 120. Timmer JC, Salvesen GS. Caspase substrates. Cell Death and Differentiation, 2007; 14:66–72. 121. Cregan SP, Mac Laurin JG, Craig CG, Robertson GS, Nicholson DW, Park DS, Slack R. Bax-dependent caspase-3 activation is a key determinant in p53-induced apoptosis in neurons. J neuroscr. 1999, 19 (18): 7860-69 122. Hockenbery DM. The bcl-2 oncogene and apoptosis. Seminars in Immunology. 1992; 4: 413-420. 97 123. Virkajarvi N, Paakkö P, Soini Y. Apoptotic index and apoptosis influencing proteins Bcl–2, Mcl–1, Bax and caspases 3, 6 and 8 in pancreatic carcinoma. Histopathology, 1998; 33:432–439. 124. Holeik M,Korneluk R. XIAP, the guardin angel. Nature Rev Mol Cell Biol. 2001; 2: 550-56. 125. Deveraux Q, Takahashi R, Salvesen G, Reed J. X-linced IAP is a direct inhibitor of cell-death proteases. Nature. 1997; 388: 300-3. 126. Salvesen G, Duckett C. IAP proteins: blocking the road to death’s door. Nature Rev Mol Cell Biol. 2002; 3: 401-410. 127. Schimmer Ad. Inhibitor of apoptosis proteins: Translating basic knowledge into clinical practice. Cancer Research. 2004; 64: 718390. 128. Schimmer A, Dalili S, Batey R, Riedl S. Targeting XIAP fort he treatment of malignancy. Cell Death and Different. 2006; 13: 179188. 129. Igney FH, Krammer PH. Death and anti-death: Tumor resistance to apoptosis. Nat Rev Cancer. 2002; 2: 277-88. 130. Okada H and Mak TW. Patway of apoptotik and non-apoptotik death in tumour cells. Nat Rev Cancer. 2004; 4: 592-603. 131. Levin AJ. P53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell. 1997; 83(3): 323-31. 132. Reed JC. Mechanisms of apoptosis. Am J Pathol. 2000; 3(4): 40916. 98 133. Evan GI, Vousden KH. Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer. Nature. 2001; 411: 342-48. 134. Vigneswaran N, Wu J, Nagaraj N, et al. Diferential susceptibility of metastatic and primary oral cancer cells to TRAIL-induced apoptosis. Int J Oncol. 2005; 26: 103-12. 135. Liu J, Guo Q, Chen B, et al. Cathepsin B TSRC1, correlate with TNFinduced apoptosis of ovarian cancer cells OV-90. FEBS Lett. 2006; 580: 245-50. 136. Nagaraj NS, Vigneswaran N, Zacharias W. Cathepsin B mediates TRAIL-induced apoptosis in oral cancer cells. J Cancer Res Clin Oncol. 2006; 132: 171-83. 137. Deiry W. Thr TRAIL to an anti-cancer agent. Drug Res Uptades. 1999; 2: 79-80. 138. Garnett TO, Flippova M, Duerken-Hugles PJ. Bid is cleaved upstream of caspase-8 activation during TRAIL-mediated apoptosis in human osteosarcoma cells. Apoptosis. 2007; 12: 1299-315. 139. O’Brien S, Moore JO, Boyd TE,et al. Randomized phase ııı trial of fludarabine plus cyclophosphamide with or without oblimersen sodium (Bcl-2 antisense) in patient with relapsed or refractory vhronic lymphocytic leukemia. J Clin Oncol. 2007; 25: 1114-20. 140. Philchenkov A. Caspases: Potential targets for regulating cell death. J Cell Mol Med. 2004; 8. 432-44. 141. Calus BA and Vaux DL. Caspase inhibitors: viral, cellular and chemical. Cell Death Differ. 2007; 14: 73-78. 99 142. Burstein E, Duckett CS. Control of cell death by transcriptional regulation of the apoptotic machinery. Curr Opin Cell Biol. 2003, 2 (15): 732-37. 143. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid, and other disease. Nat Med 1995;1:27–31. 144. Folkman J. Tumor angiogenesis. Adv Cancer Res.1974;19:331-358. 145. Clauss M. Molecular biology of the VEGF and the VEGF receptor family. Semin Thromb Hemost 2000; 26: 561-9. 146. Ferrara N, Davıs-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocrine Reviews 1997; 18: 4-25. 147. Kimura H, Weisz A, Ogura T, Hitomi Y, Kurashimo Y, Hashimato K, et al. Identification of hypoxia-inducible factor1(HIF-1) ancilary sequence and its function in vascular endothelial growth factorgene induction by hypoxia and nitric oxide. J Biol Chem 2000; 276: 22922298. 148. Koch S, Tugues S, Li X,et al. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Biochem J. 2011; 437(2): 16983. 149. Achen MG, Stacker SA. The vascular endothelial growth factor family; proteins which guide the development of the vasculature. Int J Exp Pathol. 1998; 79(5): 255-65. 150. Hoeben A, Landuyt B, Highley MS, Wildiers H, Van Oosterom AT, De Bruijn EA. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 2004; 56(4): 549-80. 100 151. Thomas K.A. Vascular endothelial growth factor, a potent and selective angiogenic agent. The Journal of Biological Chemistry 1996;271: 603-606. 152. Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor in the regulation of angiogenesis. Kidney İnt 1999; 56: 794-814. 153. Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor in regulation of physiological angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol 2001; 280: 1358-1366. 154. Dvorak HF, Sioussat TM, Brown F, Berse B, Nagy JA, Sotrel A, Manseau EJ, Van De Water L, Senger DR. Distribution of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) in tumors: concentration in tumor blood vessels. J Exp Med 1991; 174: 12751278. 155. Soh EY. et al. Vascular endothelial growth factor expression is higher in differentiated thyroid cancer than in normal or benign thyroid. J Clin Endocrinol Metab. 1997; 82, 3741–3747. 156. Bunone G. et al. Expression of angiogenesis stimulators and inhibitors in human thyroid tumors and correlation with clinical pathological features. Am. J. Pathol. 1999;155, 1967–1976. 157. Katoh R. et al. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in human thyroid neoplasms. Hum. Pathol. 1999; 30, 891– 897. 158. Mayers MR, Stolanov JP, Eng C,et al. P-TEN, the tumor suppressor from human chromosome 10q23, is a dual-specificity phosphatase. Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94: 9052-57. 101 159. Di Cristofano A, Pandolfi PP. The multiple roles of PTEN in tumor suppression. Cell. 2000;100:387-89. 160. Maehama T, Dixon JE. The tumor suppressor, PTEN/MMAC1, dephosphorylates the lipid second Messenger phoshatidylinositol 3, 4, 5- triphosphate. J Biol Chem. 1998; 273: 13375-78. 161. Mayers MP, Pass I, Batty IH,et al. The lipid phosphatase activity of PTEN is critical its tumor suppressor function. Proc Natl Acad Sci USA. 1998; 95: 13513-18. 162. Ali IU, Schriml LM, Dean M. Mutational spectra of PTEN/ MMAC1 gene: a tumor suppressor with lipid phophatase activity. J Natl Center Inst. 1999; 91: 1922-32. 163. Tamura M, Gu J, Matsumoto K,et al. Inhibition of cell migration, spreading and focal adhesion by tumor suppressor PTEN. Science.1998; 2080: 1614-17. 164. Maria LS, Ramon P: PTEN:from pathology to biology. TRENDS in Cell Biology. 2003; 13,9:478-481. 165. Lionel ML, Suzanne JB: PTEN function in normal and neoplastic growth. Cancer Letters.2006; 241:184-196. 166. Frisk T,Foukakis T, Dwight T, et al: Silencing of the PTEN tumorsuppressor gene in anaplastic thyroid cancer. Genes Chromosome Cancer. 2002; 35:74–80. 167. Weng LP, Gimm O, et al: Transient ectopic expression of PTEN in thyroid cancer cell lines induces cell cycle arrest and cell typedependent cell death. Human Mol. Genet. 2001;10:251–258. 102 168. Dahia PL, Marsh DJ, Zheng Z,et al. Somatic delesion and mutations in the cowdon disease gene, PTEN, in sporadic thyroid tumors. Cancer Res. 1997; 57: 4710-13. 169. Elledge SJ, Harper JW. Cdk inhibitors: on the threshold of checkpoints and development. Curr Opin Cell Biol. 1994; 6: 847-52. 170. El-Deiry WS, Harper JW, O'Connor PM, Velculescu VE, Canman CE, Jackman J, Pietenpol JA, Burrell M, Hill, DE, Wang Y, et al. WAF1/CIP1 is induced in p53-mediated G1 arrest and apoptosis. Cancer Res 1994; 54:1169-1174. 171. Niculescu AB, 3rd Chen X, Smeets M, Hengst L, Prives C, Reed SI. Effects of p21(Cip1/Waf1) at both the G1/S and the G2/M cell cycle transitions: pRb is a critical determinant in blocking DNA replication and in preventing endoreduplication. Mol Cell Biol. 1998; 18, 629−643. 172. Won HK, Kyung HK, Mie YK, Kyung HC. Induction of p53independent p21 during ceramid-induced G1 arrest in human hepatocarcinoma cells. Biochem Cell Biol. 2000; 78:127-135. 173. Richmond, A. NF-kappa B, chemokine gene transcription and tumour growth. Nat. Rev. Immunol. 2002; 2 (9): 664–674. 174. Baldwin Jr, A.S.Series introduction: the transcription factor NFkappaB and human disease. J. Clin. Invest. 2001;107: 3–6. 175. Aggarwal, B.B. Nuclear factor-kappaB: the enemy within. Cancer Cell. 2001; 6: 203–208. 103 176. Yang J, Richmond A. Constitutive IkappaB kinase activity correlates with nuclear factor-kappaB activation in human melanoma cells. Cancer Res.2001; 61 (12): 4901–4909. 177. Shattuck-Brandt RL, Richmond A. Enhanced degradation of IkappaB alpha contributes to endogenous activation of NF-kappaB in Hs294T melanoma cells. Cancer Res. 1997; 57(14): 3032–3039. 178. Lind DS, Hochwald SN, Malaty J, Rekkas S, Hebig P, Mishra G, Moldawer LL, Copeland EM, Mackay S. Nuclear factor-kappa B is upregulated in colorectal cancer. Surgery. 2001; 130: 363–369. 179. Biswas DK, Cruz AP, Gansberger E, Pardee AB. Epidermal growth factor-induced nuclear factor kappa B activation: a major pathway of cell-cycle progression in estrogen-receptor negative breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 2000; 97 (15): 8542–8547. 180. Huang,S, Robinson JB, Deguzman A, Bucana CD, Fidler IJ. Blockade of nuclear factor-kappaB signaling inhibits angiogenesis and tumorigenicity of human ovarian cancer cells by suppressing expression of vascular endothelial growth factor and interleukin 8. Cancer Res. 2000b; 60(19): 5334–5339. 181. Feinman R, Siegel DS, Berenson J. Regulation of NF-kB in multiple myeloma: therapeutic implications. Clin Adv Hematol Oncol. 2004; 2(3): 162–166. 182. Amiri KI, Richmond A. Role of nuclear factor-kappa B in melanoma. Cancer Metastasis Rev. 2005; 24(2): 301–313. 183. Dolcet X, Llobet D, Pallares J, Matias-Guiu X. NF-kB in development and progression of human cancer. Virchows Arch. 2005; 446(5): 475–482. 104 184. Huang S, DeGuzman A, Bucana CD, Fidler IJ. Level of interleukin-8 expression by metastatic human melanoma cells directly correlates with constitutive NF-kappaB activity. Cytokines Cell Mol. Ther. 2000a; 6(1): 9–17. 185. Wang CY, Mayo MW, Baldwin Jr A.S. TNF- and cancer therapyinduced apoptosis: potentiation by inhibition of NF-kB. Science. 1996; 274: 784–787. 186. Wang CY, Cusack Jr JC, Liu R, Baldwin Jr AS. Control of inducible chemoresistance: enhanced anti-tumor therapy through increased apoptosis by inhibition of NF-kB. Nat. Med. 1999; 5: 412–417. 187. Delhalle S, Blasius R, Dicato M, Diederich M. A Beginner's Guide to NF-B Signaling Pathways. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2004; 1030: 1–13. 188. Bentires-Alj, M., Dejardin, E., Viatour, P., Van Lint, C., Froesch, B., Reed, J.C., Merville, M.P., Bours, V. Inhibition of the NF kB transcription factor increases Bax expression in cancer cell lines. Oncogene. 2001; 20: 2805–2813. 189. Chen F, Castranova V, Shi X, Demers LM. New insights into yhe role of nuclear factor-ĸB, a ubiguitous transcription factor in the initiation of diseases. Clinical Chemistry. 1999; 45(1): 7–17. 190. Pagola S, Benevente A, Rasehi A,Romano E, Molina MA, Stephens PW. Cristal structure determination of thymoquinone by highresolution x-ray powder diffraction. AAPS Pharm Sci Tech. 2004; 5(2) Article 28. 191. Hosseinzadeh H, Parvardeh S, Asl mn, Sadeghnia HR, Ziaee T. Effect of thymoquinone and Nigella Sativa seeds oil on lipid 105 peroxidation level during global cerebral ischhemia –reperfusion injury in rat hippocampus. Phytomedicine.2007; 14(9): 621-7. 192. Badary OA, Taha RA, Gamal El-Din AM, Abdel-Wahab MH. Thymoquinone is a potent superoxide anion scavenger. Drug Chem Toxicol. 2003;26(2): 87-98. 193. El-Mahoudy A, Matsuyama H, Borgan MA, Shimizu Y, El-Sayed Mg, Minomato N,et al.Thymoquinone suppresses expression of inducible nitric oxide synthase in rat macrophages. Int. Immunopharmacol. 2002; 2: 16-3-11. 194. Mansour MA, Ginawi OT, El-Hadiyah T, El-Khatib AS, Al-Shabanah OA, Al-Sawaf HA. Effects of volatile oil constituents of Nigella sativa on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in mice: evidence for antioxidant effects of thymoquinone. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 2001; 110: 239-251. 195. Raghep A, Attia A, Eldin WS, Elbarbry F, Gazarin S, Shoker A. The protective effect of thyoquinone,an antioxidant and antiinflammatory agent,against renal injury:a review. Saudi J Kidney Dis Transpl. 2009; 20: 741-752. 196. El-Dakhakhny M, Madi NJ, Lembert N, Ammon HP. Nigella sativa oil, nigellone and derived thymoquinone inhibit synthesis of 5- lipoxygenase products in polymorphonuclear leukocytes from rats. J. Ethnopharmacol, 2002; 81: 161– 164. 197. Kanter M, Coskun O, Uysal H. The antioxidative and antihistaminic effect of Nigella Sativa and its majot constituent thymoquinone on ethanol-induced gastric mucosal damage. Arc Toxicol. 2006; 80: 217-224. 106 198. El-Abhar HS, Abdallah DM, Saleh S. Gastroprotective activity of Nigella sativa oil and its constituent, thymoquinone, against gastric mucosal injury induced by ischaemia/reperfusion in rats. J. Ethnopharmacol, 2003; 84: 251– 258. 199. EI-Mahmoudy A, Shimizu Y, Shiina T, Matsuyama H, Nikami H, Takewaki T. Macrophage-derived cytokine and nitric oxide profiles in type I and type II diabetes mellitus: Effect of thymoquinone. Acta diabetol. 2005; 42: 23-30. 200. Daba MH, Abdel-Rahman MS. Hepatoprotective activity of thymoquinone in isolated rat hepatocytes. Toxicology letters. 1998; 95: 23-29. 201. Nagi MN, Alam K, Badary OA, AI-Sahabanah OA, AI-Sawaf HA, AIBekairi AM. Thymoquinone protects against carbon tetracloride hepatotoxicity in mice via an antioxidant mechanism. Biochem Mol Biol Int. 1999; 47: 153-159. 202. Al-Gharably NM, Badary O, Nagi M, Al-Shabanah O, Al-Sawaf H, Rikabi A, Al-Bekairi A. Protective effect of thymoquinone against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in mice. Res. Comm. Pharmacol. Toxicol, 1997; 2: 41–50. 203. Badary OA, Nagi MN, AI-Shabanah OA, AI-Sawaf HA, AI-Sohaibani MO, AI-Bekairi . Thymoquinone amelioratesthe nephrotoxicity induced by cisplatin in rodents and potentiates its antitumor activity. Can J Physiol Pharmacol. 1997; 75(12): 1356-61. 204. Sayed-Ahmed MM, Nagi MN. Thymoquinone supplementation prevents the development of gentamicin-induced acute renal toxicity in rats. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2007; 34(5-6): 399-405. 107 205. AI-Shabanah OA, Badaryo A, Nagi MN, AI-Gharably NM, AI-Rikabi AC, AI-Bekari AM. Thymoquinone protecets against doxorubicininduced cardiotoxicity without compromising its antitumor activity. J Exp Clin Cancer Res. 1998;17(2): 193-8. 206. Nagi MN, Mansour MA. Protective effect of thymoquinone against doxorubicin-induced cadiotoxicity in rats: a possible mechanism of protection. Pharmacol Res. 2000; 41(3): 383-9. 207. AI-Mayed AA, AI-Omar FA, Nagi MN. Neuroprotective effects of thymoquinone against transient forebrain ischemia in the rat hippocampus. Eur J Pharmacol. 2006; 543(1-3): 40-7. 208. Kanter M. Nigella sativa and Derived Thymoquinone Prevents Hippocampal Neurodegeneration After Chronic Toluene Exposure in Rats. Neurochem. Res, 2008; 33: 579-588. 209. Badary OA, AI-Shabanah OA, Nagi MN, AI-RikabiAC, Elmazar MM. Inhibition of benz(a)pyrene-induced forestomach carcinogenesis in mice by thymoquinone. Eur J Cancer Prev. 1999; 8(5): 435-40. 210. Gali-Muhtasib M, Kuester D, Mawrin C, Bajhouj K, Diestel A, Ocker M, et al. Thymoquinone triggers inactivation of the stres response patway sensor CHEK1 and contributes to apoptosis in colerectal cancer cell. Cancer Res. 2008; 68(14): 5609-5618. 211. Sayed AAR, Marcos M. Thymoquinone decreades AGE-induced NFkB activation in proximal tubular epithelial cells. Phytotherapy Res. 2007; 21(9): 898-99. 212. Worthen DR, Ghosheh OA, Crooks PA. The in vitro anti-tumor activity of some crude and purified components of blackseed, Nigella sativa L. Anticancer Res. 1998; 18(3A):1527-32. 108 213. Firlay TM, Abdullahalek S, Gilmar A, Gusso C, Jayanth P, Ray S, et al. Thymoquinone-induced Neu4 sialidase activates NF-kB in macrophage cells and pro-inflammatory cytokines in vivo. 214. Woo CC, Kumar AP, Sethi G, Tan KHB. Thymoquinone: potential cure for inflammatory disorders and camcer. Biochemical Pharmacology. 2012; 83(4): 443-51. 215. Shoieb AM, Elgayyar M, Dudrick PS, Bell JL and Tithof PK. In vitro inhibition of growth and induction of apoptosis in cancer cell lines by thymoquinone. International Journal of Oncology. 2003; 22, 107–113. 216. Gali-Muhtasib H, Diab-Assaf M, Boltze C, et al. Thymoquinone extracted from black seed triggers apoptotic cell death in human colorectal cancer cells via a p53-dependent mechanism. Int J Oncol 2004;25:857–66. 217. Tan M, Nowood A,May M, Tucci M, Benghuzzi H. Effects of (-) epigallocatechin gallate and thymoquinone on proliferation of a PANC-1 cell line in culture. Biomedical Sciences. 2006; 42: 363-71. 218. Kaseb AO, Chinnakannu K, Chen D, Sivanandam A, Tejwani S, Menon M, Dou QP, Reddy GP. Androgen receptor and E2F-1 targeted thymoquinone therapy for hormone-refractory prostate cancer. Cancer Res. 2007;67(16):7782-8. 219. Al-Ali A, Alkhawajah AA, Randhawa MA, Shaikh NA. Oral and intraperitoneal LD50 of thymoquinone, an active principle of Nigella sativa, in mice and rats. J Ayub Med Coll Abbottabad. 2008; 20(2):25-7. 220. Polkowski K, Mazurek AP. Biological properties of genistein. A review of in vitro and in vivo data. Acta Pol Pharm 2000; 57: 135-155. 109 221. Magee JP, Rowland R. Phytooestrogens, their mechanism of action; current evidence for e role in breast and prostate cancer. Br J Nutr. 2004; 91: 513–531. 222. Rowland I, Faughan M, Hoey L, Wahala K. Bioavailability of phytooestrogens. Br J Nutr. 2003; 89 (supp 1):pp 45–58. 223. Bingham SA, Atkinson C, Liggins J, Bluck L, Coward A. Phytooestrogens: where are we now? Br J Nutr. 1998; 79: 393–406. 224. Cornwell T, Cohick W, Raskin I. Dietary phytoestrogens and health. Phytochemistry. 2004; 65: 995–1016. 225. Markovits J, Linassier C, Fossé P, Couprie J, Pierre J, JacqueminSablon A, Saucier JM, Le Pecq JB and Larsen, AK. Inhibitory effects of the tyrosine kinase inhibitor genistein on mammalian DNA topoisomerase II. Cancer Res. 1989; 49(18):5111-7. 226. Fritz WA, Wang j, Lamartiniere CA. Dietary genistein: perinatal mammary cancer prevention, bioavailability and toxicity testing in the rat. Am J Carcinogenesis. 1998; 2151–2158. 227. Kuiper GG, Lemmen JG, Carlsson B, Corton JC, Safe SH, van der Saag PT, van der BB,Gustafsson JA. Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogenreceptor beta. Endocrinology.1998; 139: 4252–4263. 228. Wangen KE, Duncan AM, Kurzer MS. Soy isoflavones improve plasma lipids in normocholesterolemic and mildly hypercholesterolemic postmenapausal women. Am J Clin Nutr. 2001;73: 225-31. 110 229. Ruiz-Larrea MB, Mohan AR, Paganga G, Miller NJ, Bolwell GP, RiceEvans CA. Antioxidant activity of phytoestrogenic isoflavones. Free Radic Res. 1997;26: 63–70. 230. Chen WF and Wong MS. Genistein enhances insulin-like growth factor signaling patway in human breast cancer (MCF-7) cells. J Clin Endocrinol Metab. 2004; 89(5): 2351-9. 231. Zava DT and Duwe G. Estrogenic and antiproliferative properties of genistein and other flavonoids in human breast cancer cell in vitro. Nutr Cancer. 1997; 27(1): 31-40. 232. Fotsis T, Pepper M, Adlercreutz H, Fleischmann G, Hase T, Montesano R and Schweigerer L. Genistein, a dietary-derived inhibitor of in vitro angiogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90(7):2690-4. 233. Chinni SR, Ahlasan SA, Multani AS,Pathale S, Sarkar FH. Pleotropic effects of genistein on MCF-7 breast cancer cells. Int J Mol Med. 2003; 12(1): 29-34. 234. Zin S, Wu J, Shen ZZ, et al. Genistein exert multiple suppressive effects on human breast carcinoma cells. Cancer Res. 1998; 58: 4851-57. 235. Benerjee S. Molecular evidence for increased antitumor activity of gemcitabine by genistein in vivo- in vitro using an orthotopic model of pancreatic cancer. Cancer Res. 2005; 65(19): 9064-72. 236. Takahashi, Y., Lavigne, J.A., Hursting, S.D., Chandramouli, G.V., Perkins, S.N., Barrett, J.C. and Wang, T.T. Using DNA microarray analyses to elucidate the effects of genistein in androgen-responsive 111 prostate cancer cells: identification of novel targets. Mol Carcinog. 2004;41(2): 108-19. 237. Myoung H, Hang SP, Yun PY, Lee JH and Kim Mj. Anticancer effect of genistein in oral squamous cell carcinoma with respect to angiogenesis in vitro invasion. Cancer Sci. 2003; 94(2): 215-220. 238. Yin F, Giuliano AE,Van Herle AJ. Growth inhibitory effects of flavonoids in human thyroid cancer cell lines. Thyroid.1999; 9(4): 369-76. 239. Ulusoylu M, 2004. İzoflavonlar. Marmara Universitesi Eczacılık Fakultesi Farmakognozi ABD.www.nutrisyon.com. 240. Liebermann DA, Hoffman B. Differentiation primary response genes and proto-oncogenes as positive and negative regulators of terminal hematopoietic cell differentiation. Stem Cells. 1994;12(4):352–69. 241. Morse MA, Stoner GD. Cancer chemoprevention: principles and prospects. Carcinogenesis. 1993; 14(9): 1737-46. 242. Wattenberg LW. Chemoprevention of cancer. Cancer Res. 1985; 45(1): 1-8. 243. Vuorelaa P, Leinonenb M, Saikkuc P, Tammelaa P, Rauhad JP, et al. Natural products in the process of finding new drug candidates. Curr Med Chem. 2004; 11: 1375–1389. 244. Akyol H. Kemoterapinin temel ilkeleri. XIII. TPOG Ulusal Pediatrik Kanser Kongresi, Hemsire Programı, 2004; 159–163. 245. Gali-Muhtasib H, Roessner A, Schneider-Stock R. Thymoquinone: a promising anti-cancer drug from natural sources. Int J Biochem Cell Biol. 2006; 38(8): 1249-53. 112 246. Banerjee S, Li Y, Wang Z and Sarkar FH. 2008. Multi-targeted therapy of cancer by genistein. Cancer Lett.2008; 269(2):226-42. 247. Effenberger K, Breyer S, Schobert R. Terpene conjugates of the Nigella sativa seed-oil constituent thymoquinone with enhanced efficacy in cancer cells. Chemistry&Biodiversisity. 2010; 7: 129-139. 248. Ahmed WA, Hassan SA, Galeb FM, El-Taweel MA, Abu-Bedair FA. The in vitro promissing therapeutic activity of thymoquinone on hepatocellular carcinoma (Heo G2) cell line. Global Veterinaria. 2008; 2(5): 233-241. 249. Hassan SA, Ahmed WA, Galeb FM, EL-Taweel MA, Abu-Bedir FA. In vitro challenge using thymoquinone on hepatocellular carcinoma (HepG2) cell line. Iranian J Pharmaceutical Res. 2008; 7(4): 283-290. 250. Yang S, Zhou Q, Yang X. Caspase-3 status is a determinant of the differential responses to genistein between MDA- MB-231 and MCF7 breast cancer cells. BBA Mol Cell Res. 2007; 1773(6): 903-11. 251. Roepke M, Diestel A, Bajbouj K, Walluscheck D, Schonfield D, Roessner A,et al. Lack of p53 augments thymoquinone- induced apoptosis and caspase activation in human osteosarkoma cells. Cancer Biology&Therapy. 2007; 6(2): e1-11. 252. Rooney S, and Ryan MF. Modes of action of alfa-hederin and thymoquinone, active constituents of Nigella Sativa, against HER-2 cancer cells. Anticancer Res. 2005; 25: 4255-4259. 253. Kumi-Diaka J, Sanderson NA, Hall A. The mediating role of Caspase-3 protease in the intracellular mechanism of genisteininduced apoptosis in human prostatic carcinoma cell lines. DU145 and LNap. Biol Cell. 2000; 92:595-604. 113 254. Hussani IM, Amos S, Sirupson K, Redpath CI, Lyas C, Dipierro C. Nigella sativa and thymoquinone induce caspase-9/3 activation and glioblastoma cell death. Neuro Oncol. 2011;13(3):107-20. 255. Alhosin M, Abusnina A, Achour M, Sharif T, Muller C, Peluso J,et al. Induction of apoptosis of thymoquinone in ılmphoblasstic leukemia jurkat cells mediated by a p73-dependent patway which targets the epigenetic integration UHRF1. Biochem Phar. 2010, 79(9). 1251-60. 256. Woo CC, Kumar AP, Sethi G, Tan KH.Thymoquinone: potential cure for inflammatory disorders and cancer. Biochem Pharmacol. 2012; 83(4): 443-51. 257. Kumi-Diaka J, Butler A. Caspase-3 protease activation during to process of genistein- induced apoptosis in Tm4 testicular cells. Biology of cell. 2000; 92: 115-24. 258. Roepke M, Diestel A,et al. Lack of p53 augments thymoquinoneinduced apoptosis and caspase activation in human osteosarkoma cells. Cancer Biolgy & Theraoy. 2007; 6(2): e1-e10. 259. El- Mahdy MA, Zhu Q, Wang Q-E, Wani G, Wani AA. Thymoquinone induces apoptosis through activation of caspase-8 and mitochondrial events in p53-null myeloblastic leukemia HL-60 cells. Int. J. Cancer, 2005; 117: 409-417. 260. Pagliacci MC, Smacchia M, Migliorati G, Grignani F, Riccardi C and Nicoletti I. Growth-inhibitory effects of the natural phyto-estrogen genistein in MCF-7 human breast cancer cells. Eur-J-Cancer. 1994; 30A(11): 1675-82. 261. Davis JN, Singh B, Bhuiyan M, Sarkar FH. Genistein induced upregulation of p21WAF1, downregulation of cyclin B, and induction 114 of apoptosis in prostate cancer cells. Nutr Cancer. 1998; 32: 123– 131. 262. Lian F, Li Y, Bhuiyan M, Sarkar FH. p53-independent apoptosis induced by genistein in lung cancer cells. Nutr Cancer 1999; 33: 125–131. 263. Alhasan SA, Pietrasczkiwicz H, Alonso MD, Ensley J, Sarkar FH. Genistein-induced cell cycle arrest and apoptosis in a head and neck squamous cell carcinoma cell line. Nutr Cancer 1999; 34: 12–19. 264. Alhasan SA, Ensley JF, Sarkar FH. Genistein induced molecular changes in a squamous cell carcinoma of the head and neck cell line. Int J Oncol. 2000; 16: 333–338. 265. Shay JW, Bacchetti S . A survey of telomerase activity in human cancer. EurJ Cancer 1997;33:787-791. 266. Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PL, Coviello GM, Wright WE, Weinrich SL, Shay JW. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science 1994;266: 2011 -2015. 267. Greider CW, Blackburn EH. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell 1985;43:405-413. 268. Oshimura M, Barrett JC. Multiple pathways to cellular senescence : role telomerase repressors. Eur J Cancer 1997;33:710-715. 269. Klingelhutz AJ. Telomerase activation and cancer. J. Mol. Med.1997; 75:45-49. 115 270. Jong HS, Park YI, Kim S, hong JH, Kang SH, Song H, Bang YJ, Kim NK. Upregulation of human telomerase catalytic subunit during gastric carcinogenesis. 1999; Cancer. 86: 559-565. 271. Yokozaki H, Yasui W, Tahara E. Genetic and epigenetic changes in stomach cancer. Int. Rev. Cytol. 2001;204: 49-95. 272. Granger MP, Wright WE, Shay JW. Telomerase in cancer and aging. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2002;41: 29-40. 273. Nowak J, Januszkiewich D, Lewandowski K, Nowickakujewska K, Pernak M, Emboeska J, Nowak T, Wysocki J. Activity and expression of human telomerase in normal and malignant cells in gastric and colon cancer patients. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 2003;15: 7580. 274. Yoo J, Park SY, Kang SJ, Kim BK, Shim SI, Kang CS. Expression of telomerase activity, human telomerase RNA, and telomerase reverse transcriptase in gastric adenocarcinomas. Mod. Pathol. 2003;16:700707. 275. Grund RL, Lim SN, Khaw AK, Soon JFF, Shoney K, Mohamed Ali S, et al. Thymoquinone induces telomerase shortening, DNA damage and apoptosis in human glioblastoma cells. Plas One. 2010; 5(8): 111. 276. Ouchi H, Ishiguro H, Ikeda N, Hori M, Kubota Y, Uemura H. Genistein induces cell growth inhibition in prostate cancer through the suppression of telomerase activity. Int J Urol 2005; 12: 73–80. 277. Jagadeesh S, Kyo S and Banerjee PP Genistein represses telomerase activity via both transcriptional and posttranslational 116 mechanisms in human prostate cancer cells. Cancer Res. 2006; 66(4): 2107-15. 278. Li Y, Liu L, Andrews LG, Tollefsbol TO. Genistein depletes telomerase activity through cross-talk between genetic and epigenetic mechanisms. Int J Cancer. 2009; 125: 286-96. 279. Khaw AK, Yang JWY, Kalthur G, Prakash H. Genistein induces growth arresr and suppresses telomerase activity in brain tumor cells. Genes Chromosome and Cancer. 2012; 51 (9) 280. Poole JC , Andrews LG, Tollefshol TO. Activity, function and gene regulation of the catalytic subunit of telomerase (hTERT). Gene 2001;269:1-12. 281. Campanero MR, Armstrong MI, Flemington EK. CpG methylation as a mechanism for the regulation of E2F activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000;97:6481- 6486. 282. Ponder B. Cancer genetics. Nature. 2001; 411: 336-41. 283. Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science. 1995; 267: 1456-62. 284. Awad EM. In vitro decreases of the fibrinolytic potential of cultured human fibrosarcoma cell line, HT1080, by Nigella sativa oil. Phytomedicine. 2005 Jan;12(1-2):100-7. 285. Yi T, Cho SG, Yi Z, Pang X, Rodriguez M, Wang Y, Sethi G, Aggarwal BB, Liu M. Thymoquinone inhibits tumor angiogenesis and tumor growth through suppressing AKT and extracellular signalregulated kinase signal patways. Mol Cancer Ther. 2008; 7: 1789-96. 117 286. Li F, Rajendran D and Sethi G. Thymoquinone inhibits proliferation induces apoptosis and chemosensitizes human multiple myelome cells through suppression of signal transducerand activator of transcription 2 activation patway. Br J Pharmacol. 2010, 161(3): 54154. 287. Yu X, Zhu J, Mi M, Chen W, Ran Q, Wei M. Anti-angiogenic genistein inhibits VEGF-induced endothelial cell activation by decreasing PTK activity and MAPK activation. Med Oncol. 2012; 29(1): 349-57. 288. Trompozinski S, Danis A, Schmilt D and Viac J. Comparative effects of polypherols from gree tea (EGCG) and soybean (genistein) human keratinocytes stimulated with the proinflammatory cytokine TNFa. Archivesof Dermatological Res. 2003; 295(3): 112-16. 289. Guo Y, Wang S, Hoot DR, Clinta SK. Suppression of VEGFmediated autocrine and paracrine interactions between prostate cancer cells and vascular endothelial cells by soy isoflavones. J Nutritional Biochemistry. 2007; 18(6): 408-17. 290. Shao ZM, Wu J, Shen ZZ, et al. Genistein exerts multiple suppressive effects on human breast carcinoma cells. Cancer Res. 1998; 58: 4851-57. 291. Alhasan SA, Aranho O and Sarkar FH. Genistein elicits pleiotropic molecular effects on head and neck cancer cells. Clin Cancer Res. 2001; 7: 4174-81. 292. Ravindia J, Nair HB, Sung B, Prasad S, Tekmal RR, Aggarval BB. Thymoquinone poly (lactide-glycdide) nanoparticles exhibit enhanced anti-proliferative, anti-inflammatory and chemosensitization potential. Biochemical Pharmacology. 2010; 79(11): 1640-47. 118 293. Su SJ, Yoh TM, Chuang WJ, Ho LL, Chang KL, Chang HL,et al. The novel targets for anti-angiogenesis of genistein on human cancer cells. Biochemical Pharmacolog. 2005; 69(2): 307-18. 294. Li Y and Sarkar FH. Down-regulation of invasion and angiogenesisrelated genes identified by cDNA microarray analysis of PC-3 prostate cancer cells treated with genistein. Cancer Lett. 2002; 186(2): 157-64. 295. Bektic J, Guggenberger R, Eder IE, Pelzer AE, Berger AP, Bartsch G,et al. Molrcular effects of the isoflavonoid genistein in prostate cancer. Clin Prostate Cancer. 2005; 4(2): 124-129. 296. Wang Y, Hou D, Yu H, Wang W, Ji M, Zhao S,et al. High prevalence and mutual exclusivity of genetic alterations in the phosphatidylinositol-3-kinase/Akt patway in thyroid tumors. J Clin Endocrinol Metab. 2007; 92(6): 2387-90. 297. Dave B, Easen RR, Till Sr, Geng Y, Velardr MC, Badger TM and Simmen RCM. The soy isoflavone genistein promotes apoptosis in mammary epithelial cells by inducing the tumor suppressor PTEN. Carcinogenesis. 2005; 26(10): 1793-1803. 298. Warr A, Saarinen NM, Makelas and Hilakivi-Clarke. The role early life genistein exposures in modifying breast cancer risk. Br J Cancer. 2008; 98: 485-93. 299. Kikura N, Shiira A, Urakani S, Kwamoto K, Hirata H, Tanaka Y,et al. Genistein mediated histone acetylation and demethylation activates tumor suppressor genes in prostate cancer cells. Int J Cancer. 2008; 123: 552-560. 119 300. Arafa ESA, Zhu Q, Shah ZI, Wani G, Barakat BM, Racome I, et al. Thymoquinone up-regulation PTEN expression and induces apoptosis in doxorubicin-resistant human breast cancer cells. Mutat Res. 2011; 706(1-2): 28-35. 301. Li Y, Upadhyay S, Bhuiyan M and Sarkar FH. Induction of apoptosis in breast cancer cells MDA-MB-231 by genistein. Oncogene. 1999; 18: 3166-72. 302. Wilson LC, Baek SJ, Call A, Eling TE. Nonsteroidal anti-inflammatory drug-activated gene (Nag-1) is induced by genistein through the expression of p53 in colorectal cancer cells. Int J Cancer. 2003; 103: 747-53. 303. Yu Z, Li W, Liu F. Inhibition of proliferation and induction of apoptosis by genistein in colon cancer HT-29 cells. Cancer Letters. 2004; 215(2): 159-166. 304. Rao A, Coan A, Welsh JE, et al. Vitamin D receptor and p21/WAF1 are targets of genistein and 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in human prostate cancer cells. Cancer Res. 2004; 64: 2143-47. 305. Shen JC, Klein RD, Wei Q, Guan Y, Cantois JH, Wang TTY, et al. Low-dose genistein induces cyclin-dependent kinase inhibitors and G1 cell-cycle arrest in human prostate cancer cells. Mol Carcinogenesis. 2000; 29(2): 92-102. 306. Casagrande F, Darbon JM. P21CIP1 is dispensable fort he G2 arrest caused by genistein in human melanoma cells. Exp Cell Res 2000; 258: 101-8. 307. Kuzumaki T, Kobayashi T, Ishikawa K. Genistein induces p21(Cip1/WAF1) expression and block the G1 to S phase transition 120 in Mouse fibroblast and melanoma cells. Biochem Biophys Res Commun. 1998; 251:291-95. 308. Sarkar FH and Li Y. Using chemopreventive agents to enhance the efficacy of cancer therapy. Cancer Res. 2006; 66: 3347-50. 309. Benerjee S, Kaseb AO, Wang Z, et al. Antitumor activity of gemcitabine and oxaliplatin is augmented by thymoquinone in pancreatic cancer. Cancer Res. 2009; 69: 5575-83. 310. Davis JN, Kucuk O, Sarkar FH. Genistein inhibits NF-kB activation in prostate cancer cells. Nutrition & Cancer. 1999; 35(2): 167-174. 311. Sethi G, Ahn KS, Aggarwal BB. Targeting nuclear-kappa B activation pathway by thymoquinone: role in suppression of antiapoptotic gene products and enhancement of apoptosis. Mol Cancer Rev. 2008; 6 (6): 1059-70. 312. Akiyama T, Ishida J, Nakagawa S, Ogawara H, Watanabe S, Itoh N, et al. Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinase. J Biol Chem. 1987; 262: 5592-95. 313. Cong Y and Shay JW. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Research. 2008; 18: 725-32. 314. Li S, Crothers J, Haqq CM, Blackburn EH. Cellular and gene expression responses involved the rapid growth inhibition of human cancer cells by RNA interference-mediated depletion of telomerase RNA. J Biol Chem. 2005; 280: 23709-17. 315. Park YP, Choi SC, Kim JH, et al. Up-regulation of Mac-2 binding protein by hTERT in gastric cancer. Int J Cancer. 2007; 120: 813820. 121 316. Xiang H, Wang J, Mao Y, et al. Human telomerase accelerates growth of lens epithelial cells through regulation of the genes mediating RB/E2F patway. Oncogene. 2002; 21: 3784-3791. 317. Lai SR, Cunningham AP, Huynh VQ, et al. Evidence of extratelomeric effects of hTERT and its regulation involving a feedback loop. Exp Cell Res. 2007; 313: 322-330. 318. Wang J, Xie LY, Allan S, Beach D, Nannon GJ. Myc activates telomerase. Genes Dev. 1998; 12: 1769-74. 319. Wang J, Hannon GI, Heach DH. Risky immortalization by telomerase. Nature. 2000; 405: 755-6: 320. Papaikolaou V, Athanassiou E, Dubos S, Dimou I, Papathanasiou I, Kitsiou-Izeli S, et al. Int J Radiotion Biol. 2011; 87(6): 609-21. 321. Santos JH, Meyer JN, Van Houten B. Mitochondial localization of telomerase as determinant for hydrogen peroxide-induced mitochondrial DNA damage and apoptosis. Hum Mol Genet. 2006; 15: 1757-68. 322. Haendeler J, Hoffmann J, Diehl JF, et al. Antioxidants inhibit nuclear export of telomerase reverse transcriptase and delay replicative senesence of endothelial cells. Circ Res. 2004; 94: 768-75. 323. Verdun RE, Karlseder J. The DNA damage machinery and homologous recombination pathway act consecutively to protect human telomerase. Cell. 2006; 127: 709-20. 324. Meier A, Fiegler H, Munoz P, et al. Spreading of mammalian DNAdamage response factors studied by ChIP-chip at damaged telomerase. EMBO J. 2007; 26: 2707-18. 122 325. Li Z, Li J, Mo B, Hu C, Liz H, Qi H,et al. Genistein induces cell apoptosis in MDA-MB-231 breast cancer cells via the mitogenactivated protein kinase pathway. Toxicology in vitro. 2008; 22 (7): 1749-53. 326. Trachootham D, Zhou Y, Zhang H, et al. Selective killing of oncogenicallytransformed cells through a ROS-mediated mechanism by beta-phenylethyl isothiocyanata. Cancer Cell. 2006; 10:241-52. 327. Schumacker PT. Reactive oxygen species in cancer cells: Live by the sword, die by the sword. Cancer Cell. 2006;10:175-6. 328. Waris G and Ahsan H. Reactive oxygen species: Role in the development of cancer and various chronic conditions. J Carcinog. 2006; 5:14. 329. El-Najjar N, Chatila M, Moukadem H, Vuorela H, Ocker M, Gandesiri M, et al. Reactive oxygen species mediate thymoquinone-induced apoptosis and activate Erk and Jnk signaling. Apoptpsis. 2010; 15: 183-195. 123 10. EKLER Tüm doktora eğitimim ve tez çalışmalarım süresince desteğini her zaman hissettiğim, mesleki bilgi ve tecrübelerinden yararlandığım ve yetişmemde kuşkusuz en büyük emeği olan danışman hocam Sayın Prof. Dr. Sevda MENEVŞE’ye; tez çalışmam süresince bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım, duyduğu ilim heyecanını bizlere de aşılayan ikinci danışman hocam Sayın Prof. Dr. Erdal KARAÖZ’e; doktora eğitimim süresince mesleki bilgi, tecrübeleri ve desteğinden yararlandığım ve ilmi asaletini her zaman örnek aldığım hocam Sayın Prof. Dr. Adnan MENEVŞE’ye; fikirleri ve daima yol göstericiliği ile mesleki bilgi ve tecrübelerinden yararlandığım Sayın hocam Prof. Dr. Abdullah EKMEKÇİ’ye; yine manen her zaman destek olan Sayın Doç. Dr. Ece KONAÇ’a yardımlarından dolayı en içten teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmamın tüm aşamalarında bilgi ve deneyimini benimle paylaşan, daima yapıcı tutumu ve dostluğunu benden esirgemeyen Sayın Yrd. Doç. Dr. Ebru ALP’e her türlü emeği ve yardımlarından dolayı; Sayın Uzm. Biyo. Atiye Seda YAR’a proje ve tezimin pratik çalışmalarındaki her türlü emeğinden dolayı; Sayın Öğr. Gör. Dr. H. İlke ÖNEN’e manevi desteği ve her türlü yardımlarından dolayı en içten teşekkürlerimi sunarım. Bu çalışmadaki deneysel süreçde, başta, bilgi ve deneyimlerini benimle paylaşarak daima destek olan Sayın Yrd. Doç Dr. Gökhan DURUKSU’ya, ayrıca Sayın Yrd. Doç. Dr. Gülçin GACAR’a; Sayın Uzm. Biyo. Ayça AKSOY’a ve Sayın Uzm Biyo. Gülay ERMAN’ a ve tüm KÖGEM labaratuvar ekibine en içten teşekkürlerimi sunarım. 124 Ve tüm hayatım boyunca sevgi ve destekleriyle hep yanımda olan, bütün eğitim süresi boyunca maddi, manevi yardımlarını benden esirgemeyerek bugünlere gelmemi sağlayan sevgili annem Bilge ÖZTÜRK’e ve sevgili babam Murat ÖZTÜRK’e gösterdikleri anlayış, özveri ve sabırlarından dolayı sonsuz şükranlarımı sunarım. 125 11. ÖZGEÇMİŞ Adı : Sibel Azizenur Soyadı : ÖZTÜRK Doğum Yeri ve Tarihi : Adapazarı, 01.01.1967 Eğitimi : 2001- 2012 Gazi Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı, Doktora Eğitimi 1986-1994 Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi, Lisans Eğitimi 1982-1985 Erdemli Lisesi, Lise Eğitimi 1979-1982 Çorlu Lisesi, Ortaokul Eğitimi 1974-1979 Donatım İlköğtetim Okulu, İlköğretim Yabancı Dili : İngilizce 126
