(2009) Endokrinoji ve Metabolizma
advertisement
Clinical Chemistry 55:9, 1672–1679 (2009) Endokrinoji ve Metabolizma Prokalsitoninin Amino Terminal Variyantlarının Selektif Ölçüm Yöntemi Method for the Selective Measurement of Amino-Terminal Variants of Procalcitonin Joachim Struck,1* Martina Strebelow,2 Sonja Tietz,2 Christine Alonso,1 Nils G. Morgenthaler,1 Johannes G. van der Hoeven,3 Peter Pickkers3 ve Andreas Bergmann1 GĠRĠġ: Prokalsitonin (PCT) bakteriyel enfeksiyonların tanısı ve izleminde kullanılan klasik bir belirteçtir. Total PCT [116 amino asitten oluşan Prokalsitonin (PCT1116)] kesilerek des-Ala-Pro-PCT (des-Alanin-ProlinProkalsitonin; PCT3-116) oluşturulabilinir. Güncel PCT immün analizleri (“total PCT”) içsel epitoplara yönlendirilmiş antikorları kullanmakta olup PCT‟nin amino terminal variyantlarını ayırt edemez. Burada PCT1-116 ve PCT3-116‟nın amino terminallerini tanıyan monoklonal antikorların geliştirilmesi ve bu PCT türlerinin selektif ölçümlerindeki kullanımlarından söz edeceğiz. YÖNTEMLER: PCT1-116 ve PCT3-116 amino terminallerine karşı yeni geliştirilen monoklonal antikorlar ve PCT‟nin katakalsin bileşenine karşı antikoru kullanarak 2 PCT peptidi için immünoluminometrik analizler geliştirdik ve tanımladık. Bir insan endotoksemi modelinde karşılaştırmalı olarak PCT variyantlarının kinetiğini değerlendirdik. BULGULAR : PCT1-116 ve PCT3-116 amino terminal bölgelerine karşı oluşan monoklonal antikorlar diğer PCT ile ilişkili peptitlerle % 1‟den düşük çaprazreaksiyon göstermiştir. PCT1-116 ve PCT3-116 için sandviç ölçümlerin fonksiyonel ölçüm duyarlılıkları sırasıyla 5 ve 1,2 pmol/L olup beklenen değerlerin %20‟si kapsamında geri kazanımlar sergilemiştir. Plazma PCT1116 22oC‟de 6 saat ve 4oC‟de 24 saat stabildi. PCT3-116 ise her iki ısı derecesinde en az 24 saat stabildi. Sağlıklı kişilerde deneysel endotoksemi sırasında hem PCT1-116 hem de PCT3-116 erken dönemde total PCT ile birlikte artmış, daha sonra PCT1-116‟daki artışlar PCT3-116 (P = 0.0049) ve total PCT‟ye (P = 0.0024) göre anlamlı derecede yavaşlamıştır. SONUÇLAR: Yeni analizler selektif olarak PCT1-116 1 Research Department, BRAHMS Aktiengesellschaft, Hennigsdorf/ Berlin, Germany; 2 Unicus Karlsburg OHG, Karlsburg, Germany; 3 Department of Intensive Care Medicine, Radboud University Nijmegen Medical Centre, Nijmegen, The Netherlands. * Address correspondence to this author at: Research Department, BRAHMS AG,Neuendorfstraβe 25, D-16761 Hennigsdorf bei Berlin, Germany. Fax +49- (0)3302-883-621; e-mail [email protected]. Received December 22, 2008; accepted June 4, 2009. ve PCT3-116‟yı ölçmektedir. Her 2 PCT türü de endotokseminin erken evresinde artmasına karşın daha sonra kinetikleri farklılaşmaktadır. Farklı in vivo kinetikli PCT türlerinin selektif ölçümü PCT-kılavuzlu tedavileri iyileştirmede yararlı olabilir. © 2009 American Association for Clinical Chemistry Birkaç yıldan beri prokalsitoninin (PCT)4 sepsis gibi lokal ve sistemik bakteriyel enfeksiyonların varlığı ve şiddet derecesini yansıtan bir biyolojik belirteç olduğu bilinmektedir (1–10). Var olan analiz teknolojileriyle (4, 11,12), PCT‟nin bakteriyel enfeksiyonlarla ilişkili olmayan majör cerrahi ve travma gibi durumlarda da arttığı bulunmuş ve bu nonspesifikliğin analiz sonuçlarının tanısal yararlılığını kısıtlamış olduğu saptanmıştır. İmmün nötralizasyon deneylerinden elde edilen kanıtlar PCT‟nin bir proinflamatuar hormokin olarak işlev gördüğünü düşündürmektedir (13–15). Etki mekanizmasının temeli olarak son zamanlarda PCT‟nin bir CGRP (kalsitonin geniyle ilişkili peptit) reseptör antagonisti olduğu ileri sürülmüştür (16) . PCT, septik koşullar altında pek çok dokudan eksprese edilen CALCA geninden türemiştir (17,18). CALCA‟ nın birincil çevrim ürünü olan preprokalsitonin başlangıçta sinyal peptidazıyla bölünerek prokalsitonini (PCT1–116) oluşturan 116 amino asidi meydana getirir. İleride, PCT1-116‟nın ilk iki N-terminal amino asidi dipeptidil peptidaz IV (DPPIV) tarafından bölünerek des-Ala-Pro-PCT (ilk iki amino terminal amino asitlerden yoksun (des-AlaninProlin-Prokalsitonin; PCT3–116) oluşumuna yol açar (19, 20). PCT1–116 ve PCT3–116, in vivo olarak farklı fonksiyonel özelliklere ve farklı yarılanma ömürlerine sahip olabilirler. Bu da halihazır PCT analizlerine göre daha üstün tanısal uygulamaların oluşmasını sağlayabilir. Ancak, bu PCT türlerini seçicilikle ölçen hiçbir analiz Previously published online at DOI:10.1373/clinchem 2008.123018 4 Nonstandard abbreviations: PCT, procalcitonin; CGRP, calcitonin gene–related peptide; PCT 1–116, 116 amino acids that make up procalcitonin; DPPIV, dipeptidyl peptidase IV; PCT 3–116, des-AlaPro-PCT (des-Alanin-Prolin-Procalcitonin), which lacks the first 2 amino-terminal amino acids; MBS, m-maleimidobenzoyl-Nhydroxysuccinimid ester; NHS, N-hydroxysuccimimide; RLU, relative light units;TNF-, tumor necrosis factor-; ICU, intensive care unit; SIRS, systemic inflammatory response syndrome. Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1672 Prokalsitoninin Amino Terminal Varyantları mevcut değildir. Burada böyle selektif ölçümleri sağlayan sandviç tipi immün analizlerin gelişiminden söz etmekteyiz. Yeni testler sırasıyla PCT1-116 ve PCT3-116‟nin amino terminallerini yüksek bir özgüllük derecesiyle tanıyan yeni monoklonal antikorlardan yararlanmaktadır. Burada deneysel insan endotoksemileri sırasında kullanımlarını göstermekteyiz. Gereçler ve Yöntemler PEPTĠTLER PCT ile ilişkili 9 peptit kimyasal yöntemle JPT GmbH kullanılarak sentez edilmiş ve saflaştırılmıştır (% 95) (peptidin adı, dizini, PCT‟nin konumları): PAS10, APFRSALES + C-terminal sistein, 1-9; PFP10, FRSALESSP + C-terminal sistein, 3-11; PAD20, APFRSALESSPADPATLSED, 1-20; PPD19, PFRSALESSPADPATLSED, 2-20; PFD18, FRSALE SSPADPATLSED, 3-20; PRD17, RSALESSPADPA TLSED, 4-20; PSD16, SALESSPADPATLSED, 5-20; PAN40, APFRSALESSPADPATLSEDMSSDLERDHR PHVSMPQNAN, 1-19 artı 96-116 ve PFN38, FRSALESSPADPATLSEDMSSDLERDHRPHVSMPQ NAN, 3-19 artı 96-116. In Vivo GmbH‟den rekombinan PCT2-116 elde ettik, kalsitonin ve katakalsini Bachem‟den satın aldık. ANTĠKORLAR PAS10 ve PFP10 peptitlerinin N terminallerine yönlendirilmiş monoklonal antikorlar standart prosedürler kullanılarak üretilmiştir (21, 22). Kısaca, peptitler, sulfo-MBS (m-maleimido-benzoil-N-hidroksi süksinimit ester) kullanılarak BSA‟a konjüge edilmiştir. Balb/c fareleri bu konjügatlarla bağışıklandırılmış ve pekiştirilmiştir. Dalak hücreleri SP2/0 miyelom hücreleriyle kombine edilip hibridoma hücre dizileri oluşturulmuştur. Hücre dizilerini hareketsizleştirilmiş peptit PAD20‟ye tam fakat PPD19‟a ihmal edilebilir düzeyde (immünojen olarak PAS10), ve PFD18‟e tam fakat PPD19 ya da PRD17‟e (immünojen olarak PFP10) ihmal edilebilir düzeyde bağlanacak antikorları salgılama yetilerine göre taradık. Bu yaklaşımla 295/3H12 (PCT1-116‟nin N-terminaline karşı ) ve 282/2E3 (PCT3-116‟nın N-terminaline karşı) monoklonal antikorları salgılayan hücre dizileri oluşturduk. Antikorların çapraz reaksiyonlarını aşağıdaki gibi kantitatif olarak değerlendirdik. Saflaştırılmış antikorlar (1g/L), oda sıcaklığında 30 dakika 1:5 mol/L oranında MACNakridinium-NHS(N-hidroksisüksimimit)-ester (1 g/L; InVent GmbH) ile inkübe edilerek işaretlenmiştir. Oda sıcaklığında 10 dakika 1/10 hacim oranında 1 mol/L Tris ilave edilerek reaksiyonlar sonlandırılmıştır. İşaretlenmiş antikorları işaretlenmemiş olanlardan, HPLC‟de, boyut dışlama kromatografisi ile bir NAP-5 kolonu (GE Healthcare) üzerinde ve bir Bio-Silect® SEC 400-5 (Bio-Rad) kolonu üzerinde ayırdık. Polistiren tüpler (Greiner) PAD20, PPD19, PFD18, PRD17, PSD16, PFN38, PAN40, kalsitonin ve katakalsin peptitleri ile aşağıdaki gibi kaplanmıştır. Peptitler 20 mmol/L Na-fosfat, pH 7.4, 50 mmol/L NaCl içinde nihai 7 mg/L konsantrasyona kadar seyreltilmiş ve 300 µg/L‟si pipetle tüplere dağıtılmıştır. Dört santigrat derecede 20 saat inkübasyondan sonra çözeltiler aspire edilmiş ve 300 µL 10 mmol/L Na-phosphate, 3% Karion FP, %0,5 BSA, pH 6,5 eklenip 22oC‟de 2 saat daha bekletilmiştir. Çözelti aspire edilmiştir. Kemilüminesansla işaretlenmiş 295/3H12 ve 282/2E3 antikorları analizin tampon çözeltisi (100 mmol/L Nafosfat , 150 mmol/L NaCl, %0,5 BSA, 1 g/L spesifik olmayan fare ve sığır IgG‟si, %0,1 Na-azit, pH 7,4) içinde 0,9 X 106 bağıl ışık ünitesi (RLU)/200 juL konsantrasyona kadar seyreltilmiştir.. Her bir peptit tübünde bu işaretlenmiş çözeltilerden 200 µL ilave edilmiş, 22oC‟de 2 saat inkübe edilmiştir. Daha sonra tüpleri 4 kez 1 ml BRAHMS yıkama çözeltisiyle (BRAHMS AG) yıkadık, bir LB952T luminometresiyle (Berthold).her tüp için 1 saniyede bağlı kemilüminesansı ölçtük. ĠMMÜN ANALĠZLER Kaplanmış tüp formatında aşağıdaki gibi 2 kemilüminesans sandviç immün analiz gerçekleştirdik. Saflaştırılmış 295/3H12 ve 282/2E3 (1 g/L) antikorları yukarıdaki gibi işaretledik. İşaretlenmiş antikorlar analiz tampon çözeltisi ([300 mmol/L K-fosfat; 100 mmol/L NaCl; 10 mmol/L sodyum EDTA; %0,5 Triton X-100; 5 g/L proteazdan yoksun BSA (Sigma); her bir nonspesifik koyun, sığır ve fare IgG‟sinden 1 g/L; 0,9 g/L Na-azit; pH 7,0].) içinde seyreltilerek işaretliyici maddeler oluşturulmuştur. Polistiren tüpler (Greiner) bir gece 22oC‟de bekletilerek bir monoklonal anti-katakalsin antikorla (her tüp için 300 µL of 10 mmol/L Tris, 10 mmol/L NaCl, pH 7,8 içinde 2 µg antikor) (23) kaplanmıştır. Tüpler daha sonra %3 Karion FP (Merck) ve %0,5 proteazdan yoksun ve liyofilize BSA içeren 10 mmol/L Na-fosfat (pH 6,5) ile bloke edilmiştir. Normal at serumu (Sigma) içinde peptit PAN40 dilüsyonları PCT1–116 ve yine normal at serumu içinde peptit PFN38 dilüsyonları da PCT 3-116.için birer kalibratör görevi üstlenmiştir. Kaplanmış tüpler içinde 100 µL numuneler/kalibratörler ve 200 µl izleyici çözeltiyi inkübe ederek 22oC‟de 3 saat boyunca çalkalayıp immün analizleri gerçekleştirilir. Tüpleri 4 kez 1 mL BRAHMS yıkama çözeltisiyle yıkayıp bir LB952T luminometreyle (Berthold) her tüp için 1 saniye bağlı kemolüminesansı ölçtük. Analiz tasarımları Şekil 1‟de şematize edilmiştir. BRAHMS PCT-duyarlı lüminesans immün analiz ile (BRAHMS AG) (23) total PCT ölçülmüş ve analiz üreticinin kullanma talimatına göre yürütülmüştür. Yöntemlerin karşılaştırmaları için kullanma talimatına göre BRAHMS PCT-duyarlı Kryptoru kullandık. Tanımlandığı gibi tümör nekroz faktör-alfa‟yı (TNF-α) ölçtük (24). Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1673 ) terkip edildikten sonra vorteksle en azından 5 dakika kaırştırılmıştır. Bir dakika boyunca 2ng/kg dozda tek bir intravenöz bolus enjeksiyonu şeklinde endotoksin çözeltisi verdik. Bu Ec-5 endotoksin dozu pirojenik olup önceki çalışmalarda sağlıklı, tolere edemeyen erkek gönüllülerde sübjektif yan etkilere neden olmuştu. Başlangıçta (t=0)ve endotoksin testinden 15, 30 dakika, 1,2,3,4,6 ve 22 saat sonra plazma numuneleri aldık ve ilerde kullanana kadar – 80oC‟de muhafaza ettik. ĠSTATĠSTĠKSEL ANALĠZ İstatistiksel analizler için GraphPad Prism 5,00 programı kulandık. Parametrik olmayan Friedman testiyle eşleştirilmiş veri setlerini karşılaştırdık. P <0,05‟in anlamlı olduğu düşünülmüştür. Bulgular ġekil 1. PCT1-116 ve PCT3-116 analizlerinin ilkesi (A) PCT şematize edilmiş ve ilgilenilen bölgeler işaretlenmiştir. Sayılar PCT1-116‟daki amino asit pozisyonlarını göstermektedir. Üst: PAN40 kalibratörünün PCT1-116‟sına karşıt gelen amino asit dizileri ve pozisyonları. Alt: İşaretçi antikor ve katı faz antikoru. (B) PCT şematize edilmiş ve ilgilenilen bölgeler işaretlenmiştir. Sayılar PCT3-116‟daki amino asit pozisyonlarını göstermektedir. Üst: PFN38 kalibratörünün PCT3-116‟sına karşıt gelen amino asit dizileri ve pozisyonları Alt: İşaretçi antikor ve katı faz antikoru HASTALARDAN ALINAN NUMUNELER Etik yönergelere uyarak yoğun bakım ünitelerinden (YBÜ) ve sağlıklı gönüllülerden analizlerin teknik tanımlanması için kullanılan serum ve EDTA plazma numuneleri alınmış, daha sonra kullanılmak üzere 80oC‟de muhafaza edilmiştir. Sağlıklı gönüllülere aşağıda belirtildiği gibi endotoksin verdik. Çalışmanın protokolü Radboud Üniversitesi Njmegen Tıp Merkezi Etik Kurulu tarafından onaylanmış olup güncel revizyonlar dahil Helsinki Bildirgesi ve Avrupa İyi Klinik Uygulama kılavuzlarıyla uyumludur Çalışma katılımcılarını hepsinden yazılı bilgilendirilmiş onamları alınmıştır. Deneye başlamadan önce gönüllülerin fizik muayeneleri, elektrokardiyografileri ve rutin laboratuvar test sonuçları normaldi. Gönüllüler herhangi bir reçeteye tabi ilaç almadığı gibi hepatit B yüzey antijeni negatif olup HIV enfeksiyonu saptanmamıştı. Bu çalışmada ABD referansı E.coli endotoksini (lot Ec-5, Center for Biologics Evaluation and Research, Food and Drug Administration [Biyolojik Maddeler Değerlendirme ve Araştırma Merkezi, Besin ve İlaç Dairesi], Bethesda, MD) kullandık Ec-5 endotoksini liyofilize toz şeklinde tedarik edilmiş, 5 mL % 0,9‟luk enjeksiyonluk salinle MONOKLONAL ANTĠKORLAR Birkaç PCT ile ilişkili peptide afinitelerinin kantitatif analizleri yoluyla yeni geliştirilmiş iki monoklonal antikorun (her ikisi de IgG1κ türünde 295/3H12 ve 282/2E3) epitop için özgüllük derecesini inceledik (Tablo 1). Antikorlardan biri (295/3H12) aynen PCT1-116‟nin N- ucunu temsil eden peptide maksimal afinite göstermiştir. İlk N- terminal amino asidi eksik olduğunda bağlanma oranı maksimal bağlanmanın % 1‟inden aşağısına düşmüştü. Bu tespit daha sonra PCT3-116 analizinde kullanılacak kalibratör peptit PFN38 için de geçerliydi. PCT3-116‟nın N-terminal bölgesini temsil eden peptide, 82/2E3 antikorunun bağlanması son derece spesifik bir olguydu. Ancak ilk N-terminal amino asidi eksikse veya peptit ilaveten 1 veya 2 amino asit daha içeriyorsa bağlanma, maksimal bağlanma oranının % 1‟inden aşağı düşmüştü. Daha sonra PCT1-116 analizinde kullanılmış olan PAN40 kalibratör peptidi için de bu tespit geçerliydi. Her iki antikorun kalsitonin ve katakalsine bağlanması maksimal bağlanma oranının % 1‟inden daha düşüktü (gösterilmemiş veriler). PCT1-116 VE PCT3-116 ANALĠZLERĠNĠN TEKNĠK ÖZELLĠKLERĠ Kesinlik ve değer aralıklarının ölçümü. Kalibratörler olarak analizlerde kullanılan antikorların epitoplarını örten kimyasal olarak sentezlenmiş peptitlerden yararlandık. Tipik standart eğriler Şekil 2‟de gösterilmiştir. At serumu kullanılarak saptanan alt belirleme sınırı (10 kez ölçümün ortalama bağıl alt sınırı artı 2 SS) 2 pmol/L , PCT1-116 ve PCT3116 analizleri için sırasıyla 2 pmol/L ve 1,16 pmol/L şeklindeydi. Her iki analiz için analitin 20.000 pmol/L üstü konsantrasyonlarında bir yüksek doz kanca etkisi gözlenmiştir (gösterilmemiş veriler ). Her iki analizde doğal PCT peptitleri içeren 12 eşleştirilmiş insan örneğinde analizin toplam belirsizlik derecesini tespit ettik. Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1674 Prokalsitoninin Amino Terminal Varyantları Tablo 1. Monoklonal antikorların epitop özgüllüğü (mAbs).a PCT1–116’deki pozisyonu (B – NSB)/Bmax, % mAb mAb 295/3H12 282/2 E3 APFRSALESSPADPATLSED PAD20 1–20 100 0,58 PFRSALESSPADPATLSED PPD19 2–20 0,33 0,06 FRSALESSPADPATLSED PFD18 3–20 0,10 100 RSALESSPADPATLSED PRD17 4–20 0,01 0,00 SALESSPADPATLSED PSD16 5–20 0,01 0,01 a İşaretli antikorların belirtilen peptitlerle kaplanmış tüplere bağlanması (B) incelenmiştir. Bir peptitle kaplanmamış kontrol tüpleri üzerine nonspesifik bağlanma (NSB) değerlendirilmiştir. Peptit Amino asit dizisi CLSI‟nın önerdiği EP-5A2 protokolüne göre 1 lot ve 2 luminometreyle 8 farklı uygulayıcı 12 analiz gerçekleştirerek bu veriler oluşturulmuştur. PCT1 116 konsantrasyonu 5 pmol/L (Şekil 2C) ve PT3116 konsantrasyonu 5 pmol/L‟den (Şekil 2C) yüksek olan numuneler için değişkenlik katsayısı % 20‟den d, PCT1-116 konsantrasyonu 9 pmol/L (Şekil 2C) ve PCT3-116 konsantrasyonu 3,5 pmol/L‟den yüksek olan numuneler için %10‟dan düşüktü (Şekil 2D). DOĞRULUK DERECESĠ Yoğun bakım ünitesi hastalarından elde edilen ve PCT içeren 6 plazma numunesi, saptanabilir miktarda PCT içermeyen normal EDTA‟lı plazma ile 1:32 dilüsyona kadar seri halinde seyreltilmiştir (Şekil 3). ġekil 2. Analizlerin ölçüm aralığı ve kesinliği PCT1–116 (A) ve PCT3–116 (B) analizlerinin temsili kalibrasyon eğrileri gösterilmiştir. Bağlı izleyicinin sinyalleri bağıl ışık birimleri (RLU) cinsinden ifade edilmiştir. PCT1–116 (C) ve PCT3–116 (D) analizlerinin kesinlik profilleri gösterilmiştir. On iki analizde, doğal PCT analitleri içeren ve 12 insandan elde edilen benzer ikişer numunenin 8 farklı kişi tarafından incelenmesiyle analizin toplam belirsizlik oranı tespit edilmiştir. Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1675 ) ġekil 3. PCT1–116 (A) ve PCT3–116 (B) analizlerinin doğrusalllık ve doğruluk dereceleri Altı doğal PCT içeren numunenin 1:32 dilüsyona kadar seri halinde seyreltilmesiyle elde edilen sonuçlar gösterilmiştir Ölçülen konsantrasyonlar dilüsyon faktörüyle çarpılmış ve seyreltilmemiş numunelerden elde edilen değerlerle karşılaştırılmıştır. Test edilen tüm dilüsyonlarda 6 numunenin hiçbiri ilk değere göre % 20‟yi aşkın sapma göstermemiştir.PCT1-116 konsantrasyonları (0-157 pmol/L) düşük 8 farklı plazma numunesiyle, PCT1-116 konsantrasyonları yüksek (76-735 pmol/L) 8 farklı plazma numunesinin eşit volümlerinin bir araya toplanması sonucu ölçülen ortalama konsantrasyon, beklenen konsantrasyon aralığının (% 87,3-105,5) % 97,4 (SS: % 6,7) ‟üne ulaşmıştır (gösterilmemiş veriler).. PCT3-116 konsantrasyonları (2,95-270 pmol/L) düşük 8 farklı plazma numunesiyle, PCT3-116 konsantrasyonları yüksek (99-725 pmol/L) 6 farklı plazma numunesinin eşit volümlerinin bir araya toplanması sonucu ölçülen ortalama konsantrasyon, beklenen konsantrasyon aralığının (% 94,0-108,2) % 100,6 (SS: % 5,4) ‟sına ulaşmıştır (gösterilmemiş veriler). ÇAPRAZ REAKTĠVĠTE Her bir analizde tanınması gerekmeyen 2 peptidin geri kazanımlarını ölçtük. Biri rekombinan PCT2116, diğeri karşıt analizin kabratör peptidiydi Başka bir deyişle PFN38, PCT1-116, PAN40 ise PCT3-116 analizinde test edilmişti. Normal plazmadaki peptitlerin değişik dilüsyonları test edilmiştir. PCT1-116 analizinde PFN38 ve PCT2116‟nin çapraz reaktiviteleri sırasıyla %0,5 ve %0,8 iken PCT3-116 analizinde PAN40 ve PCT2116‟nın çapraz-reaktivite oranları sırasıyla %0,9 ve %0,4 idi (gösterilmemiş veriler). ANALĠTLERĠN STABĠLĠTESĠ On yoğun bakım ünitesi hastası/kritik hastadan yeni elde ettiğimiz EDTA plazma numuneleri içindeki doğal PCT1-116 ve PCT3-116 „nın immünoreaktivitesininin 22 °C ve 4 °C‟de ex vivo stabilitesini inceledik (Şekil 4). PCT1-116, 6 saat boyunca 22 °C‟de stabildi (immünoreaktivitede <10% kayıp) ve ortalama geri kazanım 24 saat sonra % 69,3‟e düşmüştü. PCT1116‟nın serum içindeki stabilitesi daha düşüktü (22oC‟de 6 saat sonra immünoreaktivitede ortalama kayıp % 12,7, SS % 11,6). Aksine, plazma PCT3116‟sı 24 saatlik gözlem boyunca hem 4oC hem de 22oC‟de stabildi. Yinelenen EDTA plazma numunelerinin (n=25) dondurma/ergitme döngülerinin doğal analitler üzerindeki etkisini araştırdık. PCT1-116 için geri kazanımlar 2, 3 ve 4 döngü sonrasında [ortalama (SS); erim] %100,3 (%5,2); %92,8–111,5; %97,1 (%4,3); %88,9-105 olup sırasıyla başlangıç değerlerin %94,7 (%4,6); %88,5-106,8‟sı düzeyindeydi. PCT3-116 için geri kazanımlar 2,3 ve 4 döngü sonrasında %98,4 (%8,1); %92,0-108,3; %98,3 (%10,5); %87,8-105,6 olup başlangıç değerlerin sırasıyla %97,8 (%13); %84,4-112,0‟si düzeyindeydi. DENEYSEL ENDOTOKSEMĠ SIRASINDA PCT VE TNF-a KINETĠKLERĠ Yirmi iki sağlıklı bireye bolus endotoksin enjeksiyonları yaparak akut sistemik enfeksiyonu tetikledik. Başlangıçta ve endotoksin infüzyonundan sonra değişik zaman noktalarında elde edilen plazma numunelerinde TNF-a, PCT1-116, PCT3-116 ve total PCT‟yi ölçtük. TNF-alfa‟nın enjeksiyondan 90 dakika sonra pik yapması [ortanca (aralık) 492 (1471718) pg/mL] beklendiği gibi sistemik enfeksiyonun varlığını göstermiştir. Enjeksiyondan sonraki 2. Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1676 Prokalsitoninin Amino Terminal Varyantları ġekil 4. Ex vivo stabilite On EDTA‟lı plazma numunesinde 22oC ve 4oC‟de doğal PCT1-116 (A) ve PCT3-116 (B)‟nın stabilitesi. Başlangıç değerlere göre PCT 1-116 ve PCT 3-116 ortalama konsantrasyonları gösterilmiştir. saate kadar PCT türlerinin hiçbiri saptanabilir düzeylerde değildi. Daha sonra tüm PCT türleri gözlem döneminin sonuna (22. saat) kadar yükselmiştir. (Şekil 5). Uyarıdan 4, 6. ve 22 saat sonra PCT1-116 / PCT3-116 ve PCT1-116 /total PCT oranlarını hesapladık (Şekil 5). Dördüncü ila 6. saat arasında PCT1-116 konsantrasyonu PCT3-116 ve total PCT‟ye benzer oranlarda artmış, 6. ila 22. saat arasında ise PCT1-116 „daki ortalama artış PCT3-116 ve total PCT‟ye göre sırasıyla % 16 ve % 15,6 daha düşük orandaydı. Bu son 3 zaman noktası boyunca PCT1-116‟deki artış oranı PCT3-116 (P = 0,004) ve total PCT‟deki (P = 0,0024).artış oranlarından anlamlı derecede farklıydı. KLĠNĠK ÖRNEKLERĠN ANALĠZĠ PCT1-116 ve PCT3-116 testleriyle 100 sağlıklı bireyin plazma örneklerini analiz ettik. Her iki analizde dört PCT3 -116 ölçümü (erim: 1,35– 5,7 pmol/L). dışında ölçülen konsantrasyonların tümü analizlerin fonksiyonel duyarlılık derecelerinden daha düşüktü (örn: PCT1-116 için <5 pmol/L; PCT3-116 için <1,3 pmol/L) Şimdilerde rutin olarak kullanılan ve sağlıklı deneklerde PCT analizlerinde ölçülen konsantrasyonlar da analizin fonksiyonel duyarlılık derecesinden düşüktü (25, 26). Bir ön analizde her iki testin performansını farklı hasta gruplarından [sepsis n = 35, sistemik inflamatuar yanıt sendromu (SIRS) n = 35, kalp cerrahisi n = 39] gelen örnekleri kullanarak modern PCT testiyle (BRAHMS PCT-duyarlı Kryptor) karşılaştırdık.. BRAHMS PCT-duyarlı Kryptor testiyle PCT1-116 testinin karşılaştırması sonucu grupların hepsinde Spearman korelasyon katsayıları (sepsis, r = 0,89; SIRS, r = 0,81; kalp cerrahisi, r = 0,88), PCT3-116 testiyle karşılaştırma sonuçlarına (sepsis, r = 0,98; SIRS, r = 0,97; kalp cerrahisi, r = 0,97).göre daha düşüktü. TartıĢma Bu çalışmada ilk kez PCT „nin amino terminallerindeki variyantlar (PCT1-116 ve PCT3- 116) için selektif, doğru duyarlı 2 yani sandviç immün analiz prosedürü tanımladık. Birkaç çok yakından ilişkili PCT türevli peptit için analizlerin çapraz reaktivitesi % 1‟den düşük, başka bir deyişle pratik olarak ihmal edilebilir düzeydeydi. Yüksek bir seçicilik derecesinin gerçekleştirilmesinde anahtar öğe spesifik epitopları hedefleyen yeni monoklonal antikorların geliştirilmesi ve seçilmesi olmuştur. Analizlerin kesinlik ve tekrarlanabilirlik derecesi diğer PCT analizlerine denk düzeydedir (23,25,26). Yeni PCT testlerinin analitik duyarlılığının klinik kullanım için yeterli olup olmadığı sorusu ancak geniş örneklem kohortlarında yapılan ölçümlerden sonra tam olarak yanıtlanabilir. Ancak insanlarda yürütülen endotoksemi deneylerinde PCT1-116 ve PCT3-116 „nin belirlenebilirliğine ilişkin erken dönem verileri güncel modern PCT analizleriyle değerlendirilebilen endikasyonların tümü olmasa bile çoğu için bu testlerin duyarlılık derecesinin tatminkâr olduğunu göstermektedir Bakteri enfeksiyonların bir belirteci olarak PCT giderek artan oranda kullanılmasına rağmen bakteriyel enfeksiyona reaksiyon olarak kan dolaşımıyla dolanan PCT ve PCT türevli fragmanlar hakkında pek bilgimiz yoktur. Boyut dışlama kromatografisi kullanılarak gerçekleştirilen ilk analizler sepsis hastalarında dolanımdaki PCT‟nin teorik olarak beklendiği gibi 116 amino asitten ibaret olduğunu göstermiş (1) olmasına karşın parçalanma ürünlerinin varlığına ilişkin göstergeler de mevcuttur. Sepsis hastalarının serum PCT‟lerinin saflaştırılmış formlarına afinitenin daha ayrıntılı bilgi veren kütle spektrometrisiyle analizi, dolanımdaki başlıca PCT türü (19) olarak N ucu kesik bir molekülü tanımlamış, DPPIV‟nin PCT1-116‟yi PCT3-116 dönüştüren bir proteaz olduğunu saptamıştır (20). Şimdiye kadar bu analizin kompleks prosedürü örneklerin geniş ölçekli ve rutin ölçümünü engellemiştir. Bu nedenle PCT‟nin biyokimyasal yolağını, fonksiyonel önemini ve belirli zaman noktalarında tanısal amaçlı PCT uygulamalarını anlamamıza yarayacak sorular yanıtsız kalmıştır.. Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1677 ) ġekil 5. Endotoksinle uyarı sonrası PCT kinetiği Yirmi iki sağlıklı ve gönüllü insana bir E.coli endotoksin enjeksiyonu yapıldıktan sonra belirtilen zamanlarda plazma numuneleri alınmıştır. Burada total PCT (A), PCT1–116 (B) ve PCT3–116 (C) ölçümlerinin ortanca değerleri (box-whisker noktaları) gösterilmiştir. PCT1–116/PCT3–116 (D) ve PCT1–116/total PCT (E) oranları hesaplanmış ve ortanca oranları gösterilmiştir. NS, anlamlı değil PCT1-116 hızla “budanarak” PCT3-116‟ya dönüştüğüne göre belli ortamlarda PCT1-116‟nın spesifik ölçümleri klinik açıdan bir avantaj sağlayacak mı? Yeni geliştirilmiş testlerle artık bu sorular yanıtlanabilmektedir. İlk adım olarak bakteriyel uyarıya cevaben farklı PCT türlerinin plazma kinetiklerini, değerlendirme amacıyla tanımlanmış bir model sistemini seçtik (27). İlkönce özellikle uyarı sonrası PCT3–116 „nin dolaşımdaki PCT‟nin başlıca formu olduğunu doğrulayabildik. Açıkça, bu ortamda hatırı sayılır konsantrasyonda PCT1–116 „da saptadık. PCT3–116 veya toplam ölçümlenebilir PCT‟ye göre PCT1-116 konsantrasyonları endotoksin uyarısından sonra erken evrede en yüksek düzeye ulaşmıştı. PCT‟nin saptanabildiği en erken zaman noktasında (tüm PCT türleri için uyarıdan 4 saat sonra) başlangıçta sentezlenmiş PCT1-116‟nın kısmen PCT3-116‟ya dönüşmüş olması PCT1-116‟nın sentezinden hemen sonra N-terminalinin “budandığını” göstermektedir. Uyarıdan 4 ila 6 saat sonra yeniden PCT sentezi ve proteolitik serokonversiyonü açıkça denk oranlarda gerçekleşmekte PCT1–116/PCT3– 116. orantısının değişmemesine yol açmaktadır. Ancak sistemik inflamasyon azaldıkça serokonversiyon hızı sentezlenme hızını aşmakta PCT1–116 konsantrasyonları PCT3–116 veya total PCT konsantrasyonlarına göre daha yavaş yükselmektedir. Pek mümkün olmamakla birlikte PCT1–116‟nin serokonversiyon dışında başka spesifik ek mekanizmayla ortamdan uzaklaştırılma olasılığı da ekarte edilemez. Sonuçlarımız bir bakteriyel enfeksiyonun seyri sırasında şimdiye kadar ticari kitlerin tümüyle ölçülen PCT1–116‟nın total PCT‟ye göre daha dinamik bir kinetik profile sahip olduğunu göstermektedir. Aynı şekilde çeşitli klinik örneklerde PCT1–116 total PCT ile mükemmel olmasa bile iyi bir korelasyon göstermiştir. Açıkça N-terminalinin “budanma” oranını etkileyen değişkenleri ayrıntılı tanımlamak ve klinik anlamını göstermek için için ileri çalışmalara gerek duyulacaktır. Her halde hastalarda bu serokonversiyon hatırı sayılır oranda oluştuğunda, yalnız başına veya PCT3–116 ya da total PCT ile birlikte PCT1–116 ölçümünün yalnızca total PCT ölçümüne göre daha bilgilendirici olacağı sayısız durumlar göz önünde canlandırılabilir. Örneğin, PCT‟de hızlı bir düşüş antibiyotik tedavisi başarısının erken bir göstergesi olabilir (6, 9) Benzer şekilde majör cerrahi veya travmadan sonra sıklıkla görüldüğü gibi artmış PCT konsantrasyonlarında göreceli olarak daha hızlı bir düşüş (11, 12) komplike edici bakteri enfeksiyonların erkenden tanınması/dışlanmasına Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1678 Prokalsitoninin Amino Terminal Varyantları olanak tanıyabilir. Her iki durumda da bu yeni testler tedavi rejimlerinin daha fazla iyileşmesine yardımcı olabilmektedir. Sonuçta, PCT‟nin amino terminallerinin selektif ölçümü için geliştirilen analizler çeşitli klinik durumlarda kinetiklerinin daha ileri araştırılmasını sağlamaktadır. Bu araştırmalardan elde edilen bilgiler bakteriyel enfeksiyonlardan rahatsız veya bu enfeksiyonları olduğundan kuşkulanılan hastalarda PCT kılavuzlu tedavi kararları verme sürecini daha çok iyileştiren yeni olanaklara fırsat tanıyabilir. Yazarların Katkıları: Yazarların hepsi bu makalenin düşünsel içeriğine katkıda bulundukları ve şu üç gerekliliği karşıladıklarını doğrulamıştır: (a) verilerin kavram, tasarım, elde edilmesi, analiz ve yorumlanmasına önemli katkılar; (b) düşünsel içeriği için makalenin yazılması veya gözden geçirilmesi ve (c) yayınlanmış makalenin nihai onaylanması Yazarların Çıkar Çatışması Beyanları: yazının sunulmasıyla birlikte yazarların tümü Potansiyel Çıkar Çatışması formunu doldurmuştur. Potansiyel çıkar çatışmaları: Ġstihdam ve BaĢkanlık : J. Struck, BRAHMS AG; N.G. Morgenthaler, BRAHMS AG; A. Bergmann BRAHMS AG DanıĢman veya edilmemiştir ĠstiĢari Görev: Beyan Stok Mülkiyeti: A. Bergmann, BRAHMS AG. ÇalıĢma bursu : Beyan edilmemiştir AraĢtırma Fonu: Beyan edilmemiştir Uzman Tanıklığı : Beyan edilmemiştir Sponsorun Rolü: Fon sağlayan kuruluşlar çalışmanın tasarımı, çağrılan hastaların seçimi, verilerin gözden geçirilmesi ve yorumlanması, metnin hazırlanması veya onaylanmasında hiçbir rol oynamamıştır. TeĢekkürler: Yazarlar endotoksemi deneylerinde yardımları için hemşire Tijn Bouw‟a, teknik yardımları için Christina Fischer-Schulz, Detlef Hintzen, Dajana Tandler, Uwe Zingler, Marita Willnich ve Anne Schmiedel‟e istatistiklere ilişkin öneriler için Oliver Hartmann‟a teşekkür eder. Kaynaklar 1.Assicot M, Gendrel D, Carsin H, Raymond J, Guilbaud J, Bohuon C. High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection. Lancet 1993;341:515– 8. 2.Muller B, Becker KL, Schachinger H, Rickenbacher PR, Huber PR, Zimmerli W, Ritz R. Calcitoninprecursors are reliable markers of sepsis in a medical intensive care unit. Crit Care Med 2000; 28:977– 83. 3.Harbarth S, Holeckova K, Froidevaux C, Pittet D, Ricou B, Grau GE, et al. Diagnostic value of procalcitonin, interleukin-6, and interleukin-8 in critically ill patients admitted with suspected sepsis. Am J Respir Crit Care Med 2001;164:396–402. 4.Becker KL, Snider R, Nylen ES. Procalcitonin assay in systemic inflammation, infection, and sepsis: clinical utility and limitations. Crit Care Med 2008;36:941–52. 5.Becker KL, Nylen ES, White JC, Muller B, Snider RH Jr. Clinical review 167: Procalcitonin and the calcitonin gene family of peptides in inflammation, infection, and sepsis: a journey from calcitonin back to its precursors. J Clin Endocrinol Metab 2004;89:1512– 25. 6.Nobre V, Harbarth S, Graf JD, Rohner P, Pugin J. Use of procalcitonin to shorten antibiotic treatmentduration in septic patients: a randomized trial. Am J Respir Crit Care Med 2008;177:498– 505. 7.Christ-Crain M,Jaccard-Stolz D, Bingisser R, Gencay MM, Huber PR, Tamm M,Muller B.Effect of procalcitonin-guidedtreatment on antibiotic use and outcome in lower respiratory tract infections: clusterrandomised,single blinded interventiontrial.Lancet2004;363:600 –7. 8.Stolz D, Christ-Crain M, Bingisser R, Leuppi J, Miedinger D, Muller C, et al. Antibiotic treatment of exacerbations of COPD: a randomized, controlled trial comparing procalcitonin-guidance with standard therapy. Chest 2007;131:9 –19. 9.Christ-Crain M, Stolz D, Bingisser R, Muller C, Miedinger D, Huber PR, et al. Procalcitonin guidance of antibiotic therapy in community- acquired pneumonia: a randomized trial. Am J Respir Crit Care Med 2006;174:84 –93. 10.Briel M, Schuetz P, Mueller B, Young J, Schild U, Nusbaumer C, et al. Procalcitonin-guided antibiotic use vs a standard approach for acute respiratory tract infections in primary care. Arch Intern Med 2008;168:2000 –7, discussion 2007–8. 11.Sponholz C, Sakr Y, Reinhart K, Brunkhorst F. Diagnostic value and prognostic implications of serum procalcitonin after cardiac surgery: a systematic review of the literature. Crit Care 2006; 10:R145. 12.Uzzan B, Cohen R, Nicolas P, Cucherat M, Perret GY. Procalcitonin as a diagnostic test for sepsis in critically ill adults and after surgery or trauma: a systematic review and meta-analysis. Crit Care Med 2006;34:1996 –2003. 13.Wagner KE, Martinez JM, Vath SD, Snider RH, Nylen ES, Becker KL, et al. Early immunoneutralization of calcitonin precursors attenuates the adverse physiologic response to sepsis in pigs. Crit Care Med 2002;30:2313–21. 14.Nylen ES, Whang KT, Snider RH Jr, Steinwald PM, White JC, Becker KL. Mortality is increased by procalcitonin and decreased by an antiserum reactive to procalcitonin in experimental sepsis [see Comments]. Crit Care Med 1998;26: 1001– 6. 15.Becker KL, Nylen ES, Snider RH, Muller B, White JC. Immunoneutralization of procalcitonin as therapy of sepsis. J Endotoxin Res 2003;9: 367–74. 16.Sexton PM, Christopoulos G, Christopoulos A,Nylen ES, Snider RH, Jr., Becker KL. Procalcitonin has bioactivity at calcitonin receptor family complexes: potential mediator implications in sepsis. Crit Care Med 2008;36:1637– 40. 17.Muller B, White JC, Nylen ES, Snider RH, Becker KL, Habener JF. Ubiquitous expression of the calcitonin-I gene in multiple tissues in response to sepsis. J Clin Endocrinol Metab 2001;86:396– 404. 18.Morgenthaler NG, Struck J, Chancerelle Y, Weglohner W, Agay D, Bohuon C, et al. Production of procalcitonin (PCT) in non-thyroidal tissue after LPS injection. Horm Metab Res 2003;35:290 –5. 19.Weglohner W, Struck J, Fischer-Schulz C, Morgenthaler NG, Otto A, Bohuon C, Bergmann A. Isolation and characterization of serum procalcitonin from patients with sepsis. Peptides 2001; 22:2099 –103. 20. Wrenger S, Kahne T, Bohuon C, Weglohner W, Ansorge S, Reinhold D. Amino-terminal truncation of procalcitonin, a marker for systemic bacterial infections, by dipeptidyl peptidase IV (DP IV). FEBS Lett 2000;466:155–9. 21.Harlow E, Lane D. Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory; 1988. 22.Lane RD. A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas. J ImmunolMethods 1985;81:223– 8. 23.Morgenthaler NG, Struck J, Fischer-Schulz C, Bergmann A. Sensitive immunoluminometric assay for the detection of procalcitonin. Clin Chem 2002;48:788 –90. 24. Ramakers BP, de Goeij M, van der Hoeven JG, Peters WH, Pickkers P. Inflammation-induced hepatotoxicity in humans. Shock 2009;31: 151– 6. 25. Steinbach G, Rau B, Debard AL, Javourez JF, Bienvenu J, Ponzio A, et al. Multicenter evaluation of a new immunoassay for procalcitonin measurement on the Kryptor system. Clin Chem Lab Med 2004;42:440 –9. 26. de Wolf HK, Gunnewiek JK, Berk Y, van den Ouweland J, de Metz M. Comparison of a new procalcitonin assay from Roche with the established method on the Brahms Kryptor. Clin Chem 2009; 55:1043–4. 27. Dandona P, Nix D, Wilson MF, Aljada A, Love J, Assicot M, Bohuon C.Procalcitonin increase after endotoxin injection in normal subjects. J.Clin.Endocrinol.Metab 1994;79:1605– 8. Notice: This article has been translated with the permission of AACC. AACC is not responsible for the accuracy of the translation. Th e views presented are those of the authors and not necessarily those of the AACC or the Journal. Reprinted from Clin Chem, 2009;55:9 :1672-1679, by permission of the publisher. Original copyright © 2009 American Association for Clinical Chemistry, Inc. When citing this article, please refer to the original publication source in the journal, Clinical Chemistry. Not: Bu makale AACC(American Association for Clinical Chemistry)‟nin izni alınarak tercüme edilmiştir. Çevirinin doğruluğundan AACC sorumlu değildir. Sunulmuş görüntüler dergi veya AACC‟nın olmayıp tamamen tamamen yazarlara aitdir. Bu makale; yayımcının izni alınarak Clinical Chemistry dergisinin 2009;55:9 :1672-1679 no‟lu sayısından alınmıştır. Orjinal kopya © 2009 American Association for Clinical Chemistry, Inc‟aitdir. Bu makaleye atıf yapılacağı zaman lütfen Clinical Chemistry dergisindeki orijinal basım kaynağı gösterilmelidir Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1679 Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1685
