Hücre Proliferasyonu ve Testleri
advertisement
HücreProliferasyonuveTestleri 1 NormalHücreÇoğalması • Normal dokularda, hücre bölünmesi ve çoğalması organizmanındevamlılığıiçinbirgereklilik;r. • Hücreçoğalmasınınolmasıgerekendenfarklıolmasıpatolojik durumlarayolaçar. – Örneğin,kanser;hücrelerinkontrolsüzbirşekildehızlıbölünmesi 2 HücreDöngüsü • Bir hücrenin bölünmeye başlamasından i;baren onu takip eden diğer hücre bölünmesine kadar geçen zaman aralığına hücredöngüsüdenir. 3 HücreDöngüsü • Hücreye bölünmesi (replikasyonu) dış uyarılar sonucu biyokimyasal olarak başlaIlan bir seri işlem ne;cesindegerçekleşir. • Hücreye bölünmesi hem dış hem de iç büyüme faktörleri taraJndan düzenlenir. • Hücredöngüsüneözgüproteinler hücredöngüsüboyunca senkronizebirşekildeak;fleş;rilir veardındaninak;fleş;rilirler. 4 HücreDöngüsü a. G0fazında(is;rahatfazı),hücrelergenelliklespesifikbirişlevi görmeküzereprogramlanırlar. b. G1fazında(arafaz,interfaz),spesifikhücrefonksiyonlarıiçin gereken proteinler ve RNA sentezlenir. Geç G1 fazında bol miktarda RNA sentezlenir. Ayrıca, DNA sentezi için gereken birçokenzimüre;lir. c. S fazında (DNA sentezi fazı) hücre içindeki DNA’nın miktarı ikiyekatlanır. d. G2fazındaDNAsentezidurur,proteinveRNAsentezidevam eder. e. Mfazında(mitoz)proteinveRNAsentezhızıanidenyavaşlar, gene;k materyal oluşan iki yeni hücreye dağılır. Mitozisi takibenoluşanyenihücreleryaG0yadaG1fazınagirerler. 5 HücreDöngüsüKontrolNoktaları (“checkpoints”) • Çoğalma kapasitesine sahip hücreler normal olarak belli kontrolnoktalarındadururlar. • Bunlarınenönemlileri,ilkiDNAsentezindenhemenönce(G1/ S)veikincisimitozdanhemenöncedir(G2/M). • Bu geçiş dönemlerinde (kontrol noktalarında), varsa gene;k defektler düzel;lir. Sonuç olarak, hücre siklus boyunca ilerlerkenikikontrolnoktasındadururvekontroledilmişolur. 6 HücreProliferasyonuveCanlılık • Canlıhücresayısınınvehücreçoğalmasınındoğruvehızlıbir şekildedeğerlendirilmesibirçokdeneyselyaklaşımda önemlidir. – – – – – – – – 8 Büyümefaktörlerininanalizi Genlerinfonksiyonelanalizleri İlaçdenemeleri Sitotoksisiteçalışmaları Biyouyumluluk İmplantlar Kozme;k Toksikajanlarınbelirlenmesi HücreProliferasyonuveCanlılık 9 HücreProliferasyonuveCanlılık • HücreCanlılığı(CellViability);Örnektekicanlıhücresayısı. – Hemositometreilesayım – Metaboliktestlerleölçüm(MTT,XTT,WST1) • HücreProliferasyonu(CellProlifera;on);Örnektebölünmekte olanhücresayısı – DNAsenteziölçümü 10 HücreCanlılığı • Hücrelerhemositometre ilesayılarakcanlıhücre sayısıbelirlenir. • Tripanblueboyaması yapılarakcanlıhücreoranı belirlenir. • Hücresayımıhücrenin büyümesinintakipedilmesi içinkullanılır. 11 HücreCanlılığı 12 HücreCanlılığı–MetabolikAkQvite • Ölmekteolanhücreler;hücrecanlılığınındevamlılığıiçinve hücrefonksiyonuvebüyümesiiçingereklienerjiyi sağlayamaz. • Ölenhücrelerdemitokondrienzimleriak;vitesinikaybeder. • MitokondrienzimlerininsubstraIolanmaddelerhücrelere verilerekkolorimetrikanalizyapılır. 13 HücreCanlılığı–MetabolikAkQvite • Tetrazoliumtuzlarısubstratolarakkullanılır. • WST-1,XTTveMTTsolüsyonlarınıncanlıveyaapoptozun erkenevresindekihücrelerinmitokondrileriaracılığıylaile oluşturduğureaksiyonda,solüsyonlardabulunantetrazolium halkasıhücremitokondrilerindebulunandehidrogenaz enzimlerinceparçalanarakrenkliformazankristalleri oluşturur. • WST-1,XTTveMTTyöntemi,sağlamhücrelerde mitokondrininMTTboyasınıntetrazoliumhalkasını parçalayabilmesiilkesinedayanmaktadır. 14 HücreCanlılığı–MetabolikAkQvite 15 HücreCanlılığı–MetabolikAkQvite • Tetrazolium halkasının parçalanması sonucu soluk sarı renkli M T T b o y a s ı k o y u m a v i - m o r f o r m a z a n ü r ü n ü n e dönüşmektedir. • Sonuç olarak canlı ve mitokondri fonksiyonu bozulmamış hücreler mor renkte boyanmakta, ölü ya da mitokondri fonksiyonubozulmuşhücrelerboyanmamaktadır. 16 HücreCanlılığı–MetabolikAkQvite 17 HücreCanlılığı–MetabolikAkQvite • MTT(570nm) • XTT(450-490nm) • WST-1(420-480nm) 18 HücreCanlılığı–MetabolikAkQvite 19 HücreCanlılığı–MetabolikAkQvite • Bölünen hücreler bölünmeyen hücrelere göre metabolik olarak daha ak;f oldukları için WST-1, XTT ve MTT testleri hücreproliferasyonunundeğerlendirilmesiiçindeuygundur. 20 HücreProliferasyonu • KlonogenikTest(SoVAgar) – Bir hücrenin bölünüp çoğalması ile bir koloni oluşturabilme kabiliye;nintestedildiğibiryöntemdir. 21 HücreProliferasyonu • D N A s e n t e z i n i n ö l ç ü l m e s i ( H - t h y m i d i n e v e y a Bromodeoxyuridine) – Radyoizotoplarla işaretlenmiş H-thymidine veya Bromodeoxyuridine hücrelerinbüyüdüğüortamaeklenir, – Bromodeoxyuridine;minanalogudur. – Bu nukleo;t analogları bölünen hücrelerde kendini eşleyen DNA’nın yapısınakaIlır. – Sonrasında ne kadar radyoizotop işaretli nükleo;tlerden gelen ışıma hesaplanır. – Kendini eşleyen DNA’nın yapısına kaIlan nükleo;t analog miktarı hücreproliferasyonuiledoğruoranIlıdır. 22 InVitroHücreCanlılıkve ProliferasyonTestlerininAvantajları • Kısazamandaveekonomikolarakçoksayıdanumune değerlendirilebilmesi, • Kan;ta;fvekarşılaşIrılabilirsonuçlaraulaşılabilmesi, • Testyöntemlerininstandardizeedilebilmesi, • Hassasiyetlerindendolayı,toksikmateryalinhayvandeneylerine geçmedenelimineedilmesineimkântanımaları, • Hayvanvekullanımtestlerinegöredahagenişkullanımalanına sahipolmalarıdır. 23 InVitroHücreCanlılıkveProliferasyon TestlerininDezavantajları • Kültürhücrelerininkonakhücrelerindenfarklıolması, • Invitroortamınorganizmadabulunanimmünsistem, inflematuarsistemvedolaşımsistemigibikarmaşık koordinasyonmekanizmalarınasahipolamamasıdolayısıilein vitrotestsonuçlarınıninvivoşartlarlauyumluluğunu tarIşmalıhalege;rmektedir. 24
