CYTODEX-1 MĐKROTAŞIYICILAR ÜZERĐNDE

CYTODEX-1 MĐKROTAŞIYICILAR ÜZERĐNDE KÜLTÜRE EDĐLEN
PRĐMER FETAL KONDROSĐTLERĐN TRĐPSĐN, PRONAZ ve
KOLLAJENAZ KULLANILARAK GERĐ KAZANILMASI
Gaye Çetinkaya1, Menemşe Gümüşderelioğlu2, Mehmet Ali Onur3, Sezen Arat1*, Şakir Sekmen1
1 TÜBĐTAK
MAM Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Enstitüsü (GMBE), Gebze/Kocaeli.
2 Hacettepe Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, Ankara.
3 Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, Ankara.
GĐRĐŞ
MATERYAL METOD
Mikrotaşıyıcılı sistemler, hücre ve hücresel ürünlerin eldesinde başarıyla kullanılmaktadır.
Mikrotaşıyıcı denilen polimerik küreler birim hacimdeki yüzey alanını arttırarak daha fazla
sayıda hücre üretilmesine ve buna bağlı olarak daha çok hücresel ürün eldesine olanak
sağlarlar. Mikrotaşıyıcılı sistemlerdeki başlıca sorunlardan biri, fiziksel veya fizyolojik harabiyet
verilmeden hücrelerin polimerik kürelerden kaldırılmalarıdır.
Hücre bankacılığı gibi hücre sayısının çoğaltımasının hedeflendiği çalışmalarda üretilen
hücrelerin mikrotaşıyıcılardan geri kazanılamaması bir dezavantajdır. Mikrotaşıyıcılardan
hücrelerin geri kazanılması için önerilen yöntem 15 dakika boyunca 37ºC’de tripsinle
çalkalayarak inkübe etmektir.
Hücre bankacılığında saklanacak hücrelerin sağlıklı ve fonksiyonel olmaları, tüm fizyolojik
görevlerini tam anlamıyla yerine getirebilmeleri vazgeçilmez bir esastır. Bu çalışmada üç farklı
enzimin mikrotaşıyıcılardan hücre kaldırmadaki başarısı karşılaştırılmış ve 15 dakika süren
şiddetli enzim muamelesinin hücrelerde yaratabileceği olası fizyolojik harabiyet incelenmiştir.
Mikrotaşıyıcılı hücre kültür sistemlerinin hücre bankacılığı için uygulanabilirliği test edilmiştir.
Fetal sığır kıkırdak hücreleri, 3 aylık sığır fetusunun kıkırdak dokusundan eksplant ekim
yöntemiyle geliştirilmiştir. Pasaj 5 fetal kıkırdak hücreleri 4 saat boyunca PBS ile şişirilen ve
sonrasında otoklavlanan 200 mgr Cytodex-1’in üzerine uygulanmıştır. Mikrotaşıyıcılar ve
hücreler 100 ml hacimdeki BellCo karıştırıcılı şişelerde 50 ml %10 FBS içeren besiyeriyle 20
rpm hızda karıştırılarak kültüre edilmişlerdir. 12 gün boyunca kültüre olan hücrelerin sayısı
MTT testi ile tayin edilmiştir. 1 ml hücre polimer karışımının üzerinde 100 µl MTT (5 mgr/ml)
uygulanarak 5 saat %5 CO2’li 37 ºC inkübatörde inkübe edildikten sonra 40 mM HCl içeren
isopropanol solusyonuyla formazan kristalleri çözülmüştür. Örnekler 590 nm’de Biorad ELISA
okuyucu ile ölçülmüştür.
Đmmünfloresan boyama için hücreler lamellerin üzerine %4 paraformaldehitle fikse edilip,
Kollajen tip 2 monoklonal antibadisiyle (NeoMarkers) gece boyu +4ºC’de bekletilmiştir. Ertesi
gün fare IgG-FITC sekonder antibadisi ve ardından DAPI boyası uygulanmıştır. Hücreler
Leica DMI 4000B invert mikroskop ile görüntülenmiştir.
SONUÇLAR
B
A
A
100.000 cell / ml inoculation
10.000 cell / ml inoculation
B
6
1,5x10
Şekil 1. Fetal kıkırdak hücrelerinin karakterizasyonu
6
Cell / ml
Pasaj 5 ve pasaj 12 sığır fetal kondrositleri Kollajen tip 2 ile karakterize edildiler. (A) Fetal kondrositlerin Kollajen tip
2 monoklonal antibadisi ile immünfloresan boyaması (x200) (B) Fetal kondrositlerin kollajen tip 2 monoklonal
antibadisi ve DAPI ile immünfloresan boyaması (x100)
1,0x10
5
5,1x10
4
1,0x10
2
4
6
Day
8
10
12
C
Şekil 2. Fetal kondrositlerin Cytodex-1
mikrotaşıyıcıları üzerinde kültürasyonu
Şekil 3. Fetal kondrositlerin
mikrotaşıyıcılardan kaldırılması
enzimatik
yöntemle
Cytodex-1
Mikrotaşıyıcılar üzerindeki toplam hücre konsantrasyonu MTT ile analiz edilmiştir. Hücre taşıyan mikrotaşıyıcılar, Ca+2
and Mg+2 içermeyen 0,02 % EDTA’lı PBS (pH 8) ile iki kere yıkandıktan sonra birinci grupta 100 µg/ml pronaz ile;
ikinci grupta 0,25 % tripsin-EDTA (pH 8) ile; üçüncü grupta 500 µg/ml kollajenaz ile 15 dakika boyunca 37 ºC’de
aralıklarla çalkalanarak inkübe edilmiştir. Kaldırılan hücreler trypan blue ile boyandıktan sonra hemositometrik olarak
sayılmıştır. Pronaz ile %67,2; tripsin ile % 39,5; kollajenaz ile % 14,1 oranında canlı hücre geri kazanılmıştır. Bu
çalışmada pronazın primer fetal sığır kıkırdaklarının mikrotaşıyıcılardan kaldırılabilmesi için en uygun enzim olduğu
gösterilmiştir.
Fetal kondrositler mililitrede 10.000 ve mililitrede 100.000 hücre
olmak üzere iki farklı konsantrasyonda Cytodex-1 (4 mgr/ ml)
mikrotaşıyıcıların üzerine ekildikten sonra %5 CO2’li ortamda 20
rpm’de karıştırılarak 12 gün boyunca kültüre edilmiştir. 12 günün
sonunda hücrelerin sayısı 100.000 hücre/ml grubunda 72.533.000;
10.000 hücre/ml grubunda 21.726.600 olarak tespit edilmiştir. Bu
çalışma ile primer sığır fetal kondrositleri Cytodex-1 mikrotaşıyıcıları
üzerinde başarıyla kültüre edilmiştir.
Şekil 4. Mikrotaşıyıcıların üzerinden kaldırılan hücrelerin populasyon
katlanma süresi analizleri ve MTT testi.
100
80
Pronaz
Saat
(a)Fetal kondrositlerin 12. gün sonunda mikrotaşıyıcıların üzerindeki
görüntüsü (x200); (b) (x400) (c) fetal kondrositlerin Cytodex-1
mikrotaşıyıcıları üzerindeki üreme eğrisi.
60
Tripsin
Kollajenaz
40
Kontrol
Polimerden enzimatik yöntemle kaldırılan hücrelerin populasyon katlanma sayıları petri kaplarında 3 defa pasajlanarak
hesaplanmıştır. Kaldırılan hücreler trypan blue ile boyandıktan sonra hemositometrik olarak sayılmışlardır. [Populasyon katlanma
sayısı = Log (kaldırılan hücre/ekilen hücre) x 3,33]. Populasyon katlanma süresi, iki pasaj arasında geçen sürenin katlanma
sayısına bölünmesiyle elde edilmiştir. Polimerden enzimatik yöntemle kaldırılan hücrelerin populasyon katlanma süreleri petriden
pasajlanan kontrol grubu hücrelerine göre daha uzun olduğu tespit edilse de aradaki anlamlı değildir.
20
Polimerden ve petriden kaldırılan hücreler mililitrede 20.000 hücre olacak şekilde 96 gözlü petrilere ekilmiş ve 48 saat boyunca
%10 FBS’li ortamda kültüre edilmiştir. 10 µl MTT uygulandıktan sonra hücreler 2 saat daha inkübe edilmiştir. 40 mM HCl içeren
isopropanol ile formazan kristalleri çözülmüş ve petriler 590 nm’de analiz edilmiştir.
0
Populasyon Katlanma Süresi
Mikrotaşıyıcılardan pronaz, kollajenaz ve tripsinle kaldırılan hücrelerin absorbansı, petri kaplarından 5 dakika tripsin
uygulamasıyla kaldırılan kontrol hücre grubunun absorbansından düşüktür. MTT testinde polimerden kaldırılan hücrelerin
proliferasyon kabiliyetleri biraz azalmış gözükse de kontrol grubuyla aralarındaki fark büyük değildir.
0,14
0,12
OD (nm)
0,1
Pronaz
0,08
Tripsin
0,06
Kollajenaz
Kontrol
0,04
0,02
0
MTT testi
Sonuç olarak,
bu çalışmada primer fetal kıkırdak hücreleri başarıyla elde edilmiş çoğaltılmış ve mikrotaşıyıcılı sisteme adapte edilmiştir. Pronaz
kullanılarak kaldırılan hücrelerin sayısı tripsin ve kollajenaz uygulanarak kaldırılan hücrelerin sayısından fazladır. 15 dakika
süren şiddetli enzim reaksiyonu hücrelerin proliferasyon kabiliyetini az da olsa etkilemiştir. Bu çalışma ile mikrotaşıyıcılı kültür
sistemlerinin hücre bankacılığı için kullanılabileceği ancak hücre eldesinde kullanılan enzimatik yöntemlerin optimize edilmesi
gerektiği gösterilmiştir.
Bu çalışma Türkhaygen-1 isimli Tübitak projesi kapsamında gerçekleştirilmiştir. (KAMAG 106G005):
www.turkhaygen.gov.tr