CLART® ENTHERPEX
advertisement
CLART® ENTHERPEX İN VİTRO DİAGNOSTİK İÇİN GENOMİK TANIMLAMA YOLUYLA HERPES VE İNSAN ENTEROVIRUS TİPLEMESİ VE TESPİTİ CLART®ENTHERPEX Ekstraksiyon-Saflaştırma 24 test Ref: AT-0908-24 48 test Ref: AT-0908-48 CLART®ENTHERPEX Amplifikasyon 24 test Ref: AT-1008-24-MT 48 test Ref: AT-1008-48-MT Ref: AT-1008-48-PL 96 test Ref: AT-1008-96-PL CLART®ENTHERPEX Genotipleme 24 test Ref: AT-1108-24 48 test Ref: AT-1108-48 Ref: AS-1108-48 96 test Ref: AS-1108-96 CE-IVD Versiyon 1 Aralık 2008 CMV DIAGNOSTIK NB TARAFINDAN ONAYLI DEĞİLDİR BUNDAN DOLAYI SADECE ARAŞTIRMA KULLANIMI OLARAK KABUL EDİLMELİDİR. İÇERİK TABLOSU: 1. TERİMLERİN AÇIKLAMASI 2. GİRİŞ 3. CLART® ENTHERPEX KIT AÇIKLAMASI 4. KIT BİLEŞENLERİ VE SAKLANMASI 4.1. Ekstraksiyon, Saflaştırma ve Amplifikasyon reaktifleri 4.2. Görüntüleme Reaktifleri 4.3. Diğer Bileşenler 5. GEREKLİ FAKAT SAĞLANMAYAN MATERYALLER 5.1. Reaktif ve Materyaller 5.2. Ekipmanlar 6. İŞLEMLERİN YAPILMASI VE ÖNERİLER 6.1. Genel Öneriler 6.2. Görüntüleme Önlemleri 7. NUMUNE ALMA 7.1. Swablar 7.2. Serum, Plazma 7.3. Beyin Omurilik Sıvısı 7.4. Formol yada Etanolde Parafin Gömülü doku 8. ÇALIŞMA PROTOKOLÜ 8.1. Çeşitli Numunelerden Alınan DNA/RNA Ekstraksiyonu 8.1.1. Swablar 8.1.2. Serum,Plazma 8.1.3.Beyin Omurilik Sıvısı 8.1.4.Formal yada Etanolde Parafin Gömülü Doku 8.2. Otomatik Ekstraksiyon - Swablar -Serum,Plazma,Beyin Omurilik Sıvısı -Tam Kan 8.3. Amplifikasyon Reaksiyonu 8.4. Amplifiye ürünlerin görüntülenmesi 8.4.1. Array Tüplerde (AT) görüntüleme 8.4.2.Array Striplerde (AS) görüntüleme 9. SONUÇLARIN OKUNMASI 10. SONUÇLARIN YORUMLANMASI 11. TEKNİK VE ÇALIŞMA ÖZELLİKLERİ 12. BİBLİYOGRAFYA 1. SEMBOLLERİN AÇIKLAMASI Son kullanım tarihi In vitro diagnostik cihaz Sadece in vitro diagnostik kullanımın validasyonu için Lot numarası 25ºC Oda sıcaklığında saklayınız 20ºC 8ºC 4 oC ve 8 oC arasında saklayınız 4ºC -18ºC -30 oC ve -18 oC arasında saklayınız - 30ºC 2. GİRİŞ Günümüzde herpes virüsler olarak bilenen virüslerin 100'den fazla farklı türleri bulunur, fakat bu virüslerin sadece sekiz tanesi sadece insana bulaşır, bunlar: Herpes Simplex Virus tip 1 ve 2 (HSV-1 and HSV-2), Varicella Zoster Virus (VZV), Epstein-Barr Virus (EBV), Human Cytomegalovirus (CMV), ve Human Herpes Virus 6, 7 y 8 (HHV6, HHV7 y HHV8). Virüs B olarak da bilinen primat bir herpes virüsü, ayrıca nadiren insana bulaşabilir. Herpesviridae ailesinden gelen virüslerin epidemiyolojik çalışmaları bu virüslerin fazlasıyla her yerde bulunduğunu ve genel nüfus arasında yaygın olarak yayıldığını göstermektedir. Az da olsa her yerde bulunan virüsler HSV-2 ve HHV-8 dir ve kısmen de olsa birincil iletim yolu cinsel ilişkidir. Yüksek oranda yayılmasına rağmen genel nüfusta enfeksiyonların çoğu asemptomatiktir. Asemptomatik olmayanlar klinik olarak tehlikesiz enfeksiyonlar olarak sınıflandırılır ve hasta sağlığı veya hayatı için ciddi bir risk oluşturmaktadır. Özellikle mevcut bulgular ve klinik belirtiler dikkate alındığında, sonrakiler ile ilgili diagnostik laboratuarlarda özellikle tetiklenir. Farklı alt gruplara ait bazı virüsler olmasına rağmen, birincil enfeksiyonlarda spesifik doku veya hücrelerde saklı kalan herpes virüsün bu benzersiz özelliğini tüm virüsler paylaşır. Bu saklı dönem bittiğinde, virüs genom ya kendini kopyalayabilir yada DNA konakta entegre olabilir veya olmayabilir. Bu gereksinimler geç reaktivasyonun tehlikesini gösterir ve bu tehlike stres, immunodepresyon (AIDS ve nakledilen hastalar…), yaşlılık, hormonal değişiklikler (adet kanamaları ve gebelik), güneş ışığına maruz kalma vb. gibi belli faktörlerden yarar sağlar. Bu gibi durumlarda, sendromların çeşitli tipleri ensefalit, poliradikulitis veya periferik nöropati gibi nörolojik olanlarda özellikle görünebilir. Amerika Birleşik Devletleri'nde Enterovirüs yıllık 10 ile 30 milyon insan arasında oluşan enfeksiyonlardan sorumludur, miyokardit veya neonatal sepsisin diğer tipleri ve ateşten menenjite kadar pediatrik enfeksiyonların en önemli ve en bilenen nedenidir. Enterovirus ailesi arasında klinik açıdan en uygun insan virüsleri poliovirus, Coxsackivirus ve Echovirus dir. Her 100 çocuktan 4'ünde felce neden olma dışında Poliovirus, şu anda aşılar piyasada bulunduğundan dolayı daha az önemli bir virüstür. Bu patolojilerin mikrobiyolojik tanısı özellikle, herpes virüs veya Enterovirus’den kaynaklanan ensefalit gibi en ciddi olanlar biridir. Birçok patoloji, büyük bir önem taşıyan ayırıcı bir tanı yürüttüğünden dolayı viral ve bakteriyel faktörlerden kaynaklanan patojenler gibi aynı klinik belirtilere sahiptir. Geçmişte, bu yöntemin prosedürünün uzun sürmesi (1-2 hafta), çok hassas olmamasına, zahmetli ve laboratuarın günlük uygulamalarına zor entegre olmasına rağmen Herpesvirus ve Enterovirus’ün mikrobiyolojik tanısı için kendi laboratuvar kültürünün doğruluğuna güveniliyor. Ayrıca, klinik numunelerin (BOS) bazı türlerinde kullanılamaz. CLART®ENTHERPEX kiti hastalığa (Herpes veya Enterovirus için) neden olan faktörlerin hızlı bir şekilde belirlenmesini ve böylece her durumda en etkili klinik tedavi yapılmasını sağlar. ® İnsan Herpesvirus ve Enterovirus genotipleme için CLART ENTHERPEX kiti, çoklu RT-PCR yoluyla viral genom-spesifik parça amplifikasyonuna ve mikroorganizmaspesifik bağlayıcı probe arrayları ile hibridizasyonu yoluyla virüsün sonraki tespitine dayalıdır. Avantajları şunlardır: 1 DNA’nın az miktarda tespitini sağlayan yüksek duyarlılığı. Sınırlı viral moleküllerin miktarları klinik numuneler açısından büyük avantajı da beraberinde getirmektedir. 2 Tek bir numunede bulunan çoklu virüslerin eş zamanlı tespiti. 3 İnsan herpes ve enterovirüs türleri için spesifik bağlayıcı problar ve viral genom içinde oldukça korunmuş bir bölgeye uyumlu bir sıra kullanıldığında yüksek özgüllük sağlar. 4 Hastane laboratuarlarında standardize edilmesi kolaydır. 5 Hızı: sonuçları 8 saatte analiz eder. ® 3. CLART ENTHERPEX KITİNİN AÇIKLAMASI ® CLART ENTHERPEX klinik numunelerde (swablar, serum, plazma, omurilik sıvısı ve biopsiler) HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV, HHV-6, HHV-7 ve HHV-8 olan 8 insan herpelerinin varlığını ve Poliovirus, Echovirus ve Coxsackievirus olan Enterovirus ailesine ait üç en ilgili insan virüslerinin varlığını tespit eder. Tespit, her bir virüs türü için yeterli olmasına rağmen son derece korunmuş sıra olan 106-328 bp arasında bulunan fragmentlerin amplifikasyonu ile gerçekleşir. Bu yolla, tespitin özgüllüğü garantilidir. Virüslerin farklı tiplerinin amplifikasyonu RT-PCR (ters transkriptaz PCR) tüplerin iki farklı tipinde yapılır. MIX 1 tüpleri, HSV-1, HSV-2 ve VZV’in sonraki tespiti ve amplifikasyon için kullanılan şeffaf tüplerdir. MIX 2 tüpleri, CMV, EBV, HHV-6, HHV-7, HHV-8 ve Enterovirus (Echovirus, Poliovirus ve Coxsackivirus) virüslerinin tespiti ve amplifikasyonu için kullanılan renkli tüplerdir. RT-PCR güçlendirilmiş ürünlerin tespiti, düşük- yoğunluklu mikro-arraylara dayalı yeni bir teknoloji platformunu olan CLART® (Clinical Array Technology) kullanımı sayesinde gerçekleşir. AT platformu, klasik 2ml tüplerin alt kısmında bulunan düşük yoğunluğa sahip mikroarray içeren oldukça basit ve yeterli bir prensibe dayanır (Şekil 3). Bu tüp önemli ölçüde hibridizasyon ve görselleştirme işlemleri kolaylaştırır. ® Şekil 1: CLART Platform diagramı * ArrayTube sistemi, CLONDIAG Chip Technologies GmbH tarafından lisanslıdır. Teknolojinin bu tipi elde edilen sonuçların güvenilirliğini garanti altına almak için gerekli kontrollerin ve tanı kullanımının aynı anda tespitini sağlar. ® CLART ENTHERPEX tespit sistemi spesifik problar tarafından güçlendirilmiş ürünlerin hibridizasyonunda mikro-arrayın belli bölgesinde üretilen çözünmez ürünlerin çökeltisine dayanmaktadır. RT-PCR süresince, güçlendirilmiş ürünler biotin ile işaretlenir. Amplifikasyonun ardından, streptavidin-peroxidase konjugat ile inkübe edildikten sonra mikro-arrayın immobilize olmuş bilenen bölgelerinde ilgili spesifik problar ile hibridize olurlar. Konjugat, o-Dianisidin varlığında amplifiye ürünlerde bulunan biotinli streptavidine bağlanır ve konjugatın peroksidaz aktivitesi mikro-arrayın hibridizasyon kısımlarına çöken çözünmez ürünlerin görünmesine neden olur(Şekil 2). Şekil 2: Görüntüleme yöntem diagramı. Yüzey üzerine immobilize olan problar tamamlayıcı biotinişaretli amplifiye ürünleri yakalar. Biotin yardımıyla bu streptavidin-HRP (HorseRadish Peroxidase) durumunda konjugat bağlanır. o-Dianisidine ile HRP etkileşimi, hibridizasyon alanında bir çökelti üretir. Mikro-arrayda görüntüleme ile genomik amplifikasyonu birleştirilerek elde edilen CLART®ENTHERPEX duyarlılığı çok yüksektir ve bu nedenle çift amplifikasyon gerçekleştirmeye gerek yoktur böylece oluşabilecek herhangi bir kontaminasyon riski önlenir. Genomik amplifikasyon ile tespitin ana eksikliklerinden biri virüs tespitini gerçekleştirecek bu numunelerde enzim karışımının (RT ve DNA polimeraz) inhibitorlerinin varlığından dolayı hatalı negatif olmasıdır (hemoglobin, tuzlar vb). CLART®ENTHERPEX kiti, amplifikasyon tüplerde amplifikasyon reaksiyonu verimliliğini bir iç kontrol eklemesi sayesinde hatalı negatifleri ortadan kaldırır. Böylece, hatalı pozitif sonuçlar üreten ekstraksiyon, amplifikasyon ve görüntüleme işlemleri süresince kontamine olmamış numuneleri doğrulamak için negatif bir kontrol de içermelidir. 4. KİT BİLEŞENLERİ VE SAKLANMASI CLART®ENTHERPEX kit 24, 48 ya da 96 klinik numuneden alınan DNA/RNA’ın analiz ve ekstraksiyonu için yeterli reaktifler içerir. Kit içeren reaktifler farklı paketlerde gruplandırılmıştır ve sıcaklığa bağlı olarak saklanmalıdır. Saklama koşulları gözlendiğinde, bütün reaktifler kit son kullanım tarihine kadar stabil kalır. 4.1.Ekstraksiyon-saflaştırma reaktifleri Ekstraksiyon-saflaştırma CLART®ENTHERPEX kit -20ºC’de taşınır ve kullanıma kadar bu sıcaklıkta saklanmalıdır. Bu kit aşağıdaki materyalleri içerir: •SEML (ekstraksiyon solüsyonu). Bir kez çözündürün, 4ºC’de saklanmalıdır ve 8 gün içinde kullanılmalıdır. • SD (Dilüsyon solüsyonu). -20ºC yada 4ºC’de saklayınız. • IP (Isopropanol). -20ºC’de saklayınız. • DE (Etanol 70%). -20ºC’de saklayınız. • DB (Dijesyon solüsyonu 5X). Bir kez çözündürün, 4ºC’de saklayın. • PK (Proteinase K 10X). Bir kez çözündürün, buzun üzerinde tutulmalı ve 4ºC’de saklanmalıdır. 4.2. Amplifikasyon reaktifleri -20ºC’de taşınmalı ve saklanmalıdır. • Amplifikasyon tüpleri Amplifikasyon tüplerinin iki tipi: • HSV-1, HSV-2 ve VZV’in amplifikasyonu için renksiz tüp (multiplex-RT-PCR 1). 43 μL reaksiyon karışımı içerirler. • CMV, EBV, HHV-6, HHV-7, HHV-8 ve Enterovirus (Echovirus, Poliovirus ve Coxsackivirus)’in amplifikasyonu için yeşil tüp (multiplex-RT-PCR 2). 43 μL reaksiyon karışımı içerirler. UYARI! Her amplifikatörlü tüplerin (renksiz ve yeşil) içine ekstre edilmiş genetik materyal eklenmeden önce 2 μL enzim karışımı eklenmelidir. •Enzime karışımı: bu RT (retrotranscriptase) enzim ve DNA Polimeraz karışımıdır. Kullanıma hazır. -20ºC’de saklayınız. NOT: Kit paketi kendinden yapışkanlı ve değiştirilmez sıcaklık göstergesi içerir; görüntüleme penceresinde kırmızımsı bir renk görünürse, ürün depolama sıcaklığının -20oC’yi aştığını gösterir ve kullanılmamalıdır. 4.3. Görüntüleme Reaktifleri Bu reaktifler 4ºC’de taşınır. Bunlar: • Mikro-arrays: AT tüpleri (spesifik probları içerir). Tüpler termal bir kapalı zarf içinde verilir. Her zaman oda sıcaklığında direk güneş ışığından uzakta kapatılarak saklanmalıdır. • SH (hibridizasyon solüsyonu). 4ºC’de saklayınız. • DC (Konjugat Diluent). 4ºC’de saklayınız. • CJ (Konjugat). 4ºC’de saklayınız. Kullanım öncesi bir kez sentrifüjleyin. • RE (Geliştirme Solüsyonu) .4º C’de saklayınız. • TL (Yıkama bufferı). 4ºC’de saklayınız. UYARILAR! Bir kez açıldıktan sonra, sıcaklığında saklanmalıdır. mikroarraylar ve RE solüsyonları oda 4.4. Diğer Bileşenler. Teknik, tamamen otomatik bir şekilde numune başına bir rapor göndererek mikro-array den elde edilen görüntüyü işlemek ve tutmak için bir cihaz gerektirir. Aşağıdaki tabloda GENOMICA tarafından pazarlanan sistemin özellikleri gösterilir. Spesifik bir CLART®ENTHERPEX software sahiptir, GENOMICA tarafından tasarlanmış ve valide edilmiştir. -CAR okuyucu: bu platform sadece Genomica kitleri için özellikle üretilmiştir. - Yazılım: CLART®ENTHERPEX için spesifiktir, GENOMICA tarafından tasarlanmış ve valide edilmiştir. Yüklemeye ve kullanıma hazırdır. 5. GEREKLİ FAKAT SAĞLANMAYAN MATERYALLER Gerekli fakat sağlanmayan materyallerin tümü aşağıdaki listede bulunur. 5.1. Reaktifler ve materyal • Distile su • Saline solüsyonu • Tek kullanımlık eldiven • Pozitif-ayarlanabilir veya filtrelenmiş pipet uçları • Ufalanmış bir kase buz • 1.5 mL Otoklav Eppendorf tüpleri. •1.5 ml tüpler için tüplük • 0.5 ml/0.2 ml tüplük 5.2. Ekipmanlar • Mikrosentrifüj • Thermocycler (Isı Düzenleyici) • Ekstraksiyon laboratuarı için biogüvenlik odası. • Ekstraksiyon laboratuarı için üç faklı hacimde ayarlanabilir mikropipetler (1-20 μl, 20-200 μl and 200-1000 μl). • Amplifikasyon tüplerine genetik materyaller eklemek ve renkli amplifkasyon tüpüne enzim karışımı eklemek için 1-20 μL aralığında ayarlanabilir bir mikropipet. • Görüntüleme laboratuarı için üç faklı hacimde ayarlanabilir mikropipetler (1-20 μl, 20 200 μl and 200-1000 μl) • Eppendorf tüpleri ile ve 8 kuyu stripi ile uyumlu, 25ºC, 30ºC, 50ºC ve 53ºC’de ayarlanabilir çalkalamalı ısı bloğu. • Vorteks • Vakum sistem (opsiyonel) 6. İŞLEMLERİN YAPILMASI VE ÖNERİLER Kontaminasyonu önlemek için çok önemli! Lütfen herhangi bir çalışmaya başlamadan önce bu bölümü dikkatlice okuyun. 6.1. Genel öneriler. 1. Bu daha önce amplifiye olmuş ürünler ile numunelerin kontaminasyonunu önlemek için bu test fiziksel olarak iki ayrı alanda yapılmalıdır. Ayrılmış çalışma materyalleri (pipetler, pipet uçları, tüpler, raflar eldiven vb.) her bir alanda bulunmalıdır ve bu alanlar dışında kullanılmalıdır. 1. Pre-PCR alanı: Bu alanda, DNA/RNA ekstraksiyonu yapılır, enzim karışımı amplifikasyon tüplerine eklenir ve DNA/RNA amplifikasyon tüplerine eklenir. Laminar bir akıcı çeker ocak kullanılmalıdır. 2. Post-PCR alanı: Bu alanda amplifiye ürünlerin amplifikasyon ve görüntülemesi gerçekleşir. Bu alanın materyali ekstraksiyon alanının materyaller ile temas edilmemelidir. Görüntüleme alanındaki çalışmadan sonra pre-PCR alanına dönülmemelidir. 2. Her zaman eldiven kullanın. Yukarıda bahsedilen alanlarda çalışırken sık sık eldiven değiştirilmelidir. Yeni eldivenler amplifikasyon tüplerini hazırlarken ve DNA/RNA tüplere eklerken kullanılmalıdır. 3. Her numune prosesi izlenerek 10% dilüe edilmiş dezenfektan ile çalışma alanlarını (laboratuar tezgahları, çeker ocak, pipetler, thermocycler) iyice temizleyin; kontaminasyon durumunda tüm çalışma alanları dezenfekte edilmelidir. Çalışmaya başlamadan önce her zaman yeni filtre kağıdı kullanın. Termocycler ve ısı bloğunu 10% dilü edilmiş arındırıcı ile temizlenmelidir. 4. Mikropipet kullanıldığından dolayı kontaminasyonu önlemek için her zaman filtre uçlu veya pozitif-ayarlı pipetleri kullanın. Her alan için farklı pipet ayarları kullanılmalıdır. 5. Tek kullanımlık ve otoklav laboratuar materyalleri kullanın. 6. Aynı lot numaralarına sahip olsalar bile asla iki farkı tüpü karıştırmayın. 7. Kullanımdan sonra kontaminasyonu önlemek için reaktif tüplerini hemen kapatın. 8. Kullanım sonrası mikropipetleri atın. 9. Taşıma sırasında her zaman tüpleri ayrı tutun, ekstraksiyon sırasında özellikle dikkatle tutun. 10. GENOMICA bu manuelde kullanım talimatı izlenmeden elde edilen sonuçlar için herhangi bir sorumluluk kabul etmez. 6.2. Görüntüleme önlemleri. 1.Tüpün altındakilere vakum sisteminin veya pipet ucunun şişeye değmesini engelleyin çünkü bu alta sabitlenmiş mikro-arraye zarar verebilir. 2. AT’in yan duvarlarından akıtarak tüm solüsyonu ekleyin; asla alta direkt olarak eklemeyin. 3. Denaturize PCR ürünleri eklenene kadar hibridizasyon solüsyonunu eklemeyin. 4. SH solüsyonu komtaminasyonu önlemek için aspirte edildiğinde her bir numune için farklı uçlar kullanın. 5. CJ solüsyonu ile inkübasyonu ardından, kalıntıları önlemek için tüp iyice kapatılmalı ve AT yıkanmalıdır çünkü bu kalıntılar RE solüsyonu ile reaksiyon verebilir ve sonuçların yanlış yorumlanmasına neden olan spesifik olmayan çökeltiler oluşturabilir. 6. Görüntüleme reaktifleri eklenmeden önce her yıkama sonrası tüm TL solüsyonları alın. 7. Herhangi bir solüsyon eklendiğinde, mikroarray yüzeyinde kabarcık oluşturmaktan kaçının. 8. Sonuçlar okunuyorken, olası engellerden kaçmak için AT altını temizleyin. 9. Okuyucuda görüntü görüntülendiğinde, bu pozisyondaki görünen işaretleri doğrulayın ve orada okumayı engelleyici spotlar veya kabarcıklar bulunmamalıdır. Eğer gerekirse, tüpün altını selüloz kağıt ile silin, hafifçe vurun yada mikropipet ile kabarcıkları alın. 7. NUMUNE ALMA 7.1. Swablar Tercihen üretral tipi kuru, pamuk veya alginat bir swab ile numuneler alınmalıdır (vajianal swablar için bile). Kanamaya neden olacak şekilde mekanizmayı kullanmayın. Kendi tüpü içine swabı koyun. Eğer yedi gün içinde işlem yapılmazsa ya da -20ºC’de eğer işlem sonra gerçekleştirilecekse, 4 º C’de swabı muhafaza edin. 7.2. Serum ve plazma Kan numunelerinden ekstre edilecek plazma, antikoagulant olarak EDTA veya sitrat içeren tüplerde toplanmalıdır (heparin kullanılmaz). Ekstrat serum için, 30 dakika boyunca kan numunelerini pıhtılaşması için bırakın ve sonra 20 dakika süresince 1500 g’da santrifüjleyin. Bazı durumlarda, bu tip örnekleme ardından hücresel kısmını izole etmek ve DNA/RNA ekstraksiyonuna devam etmek mümkündür. Eğer numune 12 saat içinde işlenirse, 4º C’de saklanmalıdır. Eğer analiz daha sonra yapılacaksa, numune 70º C’de saklanmalıdır ve işleme devam etmeden önce çözündürülmelidir. Tekrar dondurma-çözündürme önlenmelidir. 7.3.Beyin omurilik sıvısı (Cerebrospinal fluid) Eğer numune 12 saat içinde işlenirse, 4º C’de saklanmalıdır. Eğer analiz daha sonra yapılacaksa, numune -70º C’de saklanmalıdır ve işleme devam etmeden önce çözündürülmelidir. Tekrar dondurma-çözündürme önlenmelidir. 7.4. Formol veya etanolde sabitlenmiş parafin-gömülü biyopsiler DNA/RNA bozunmasını önlemek için en kısa sürede mümkün olması için buffer formol içine numuneler sabitlenir (24 saatten fazla olamaz). 24 saatten daha uzun olan fiksasyon veya bufferlanmamış formolun kullanımı hatalı negatif sonuçlara neden olabilir. Numune bıçak ile kesilmeden önce ve sonra ksilen ile dikkatlice temizlenmelidir. Bu temizleme işlemi numune kesilirken kontaminasyonu önlemeye yardımcı olur. Başka bir bıçak ile numuneden aşırı balmumunu uzaklaştırılmalıdır. İki ya da üç 5 μm kesitler yapmak için mikrotom kullanın ve bir 1,5 ml steril tüp içinde bu kesitleri saklayın. 8. ÇALIŞMA PROTOKOLÜ 8.1. Çeşitli numunelerden elde edilen DNA/RNA ekstraksiyonu Ekstraksiyona başlamadan önce spesifik öneriler: • Pre-PCR ekstraksiyon alanında çalışmada, her zaman çeker ocak kullanın ve bölüm 6.1.’de bahsedilen önerileri izleyin. •Sonunda ve başlamadan önce çeker ocağı 10% dilüe edilmiş dezanfektan ile dikkatlice temizleyin. • Pipetleri kullandıktan önce ve sonra 10% dilüe edilmiş dezanfektan ile her zaman temizleyin. • Numuneleri buzun üzerinde tutun. • 1.5 mL temiz Eppendorf tüpleri kullanın. Kontaminasyonu önlemek için ekstraksiyon sırasında gridler üzerinde mümkün olduğunca tutun. DNA/RNA ekstraksiyonu 8.1.1. Swablar Numunelerin her dizisinin sonu 1.5mL saline solüsyondan oluşan negatif bir kontrol içerir ve numunelerin geri kalanı işleme tabi tutulur. 1. Swab içeren tüpe 1.5 mL saline solüsyonu (0.9% sodyum klorür) ekleyin ve 1 dakika vorteksleyin. 2.Otoklov içinde bir 1.5 mL Eppendorf tüpünden supernatantı boşaltın ve 10 dakika maksimum hızda mikrosantrifüjde santrifüjleyin. 3. Hücre çökeltisini süpürmeden dikkatli bir şekilde pipet kullanarak süpernatantı alın. 4. BD 5X (Dijesyon Solüsyonu 5X)’in bir tüpünü , PK 10X (Proteinase K 10X)’in bir tüpünü ve SD (Dilüsyon Solüsyonu)’in bir tüpünü eritin. Proteinaz K kullanılıyorken buz üzerinde muhafaza edilmelidir ve sonra 4ºC’de saklanmalıdır, sadece 7 gün için stabildir; bir kez eritildikten sonra tekrar dondurulmaz. Her bir numune için aşağıdaki miktarlar karıştırılarak dijesyon karışımı hazırlama: 70 x (tüp no. + 1) = __ μL SD (Dilüsyon Solüsyonu) 20 x (tüp no. + 1) = __ μL BD5X (Dijesyon Solüsyonu 5X). 10 x (tüp no. + 1) = __ μL PK 10X (Proteinaz K 10X). 5. Her bir numuneye100 μL dijesyon karışımı ekleyin. Mikropipet kullanarak hücre çökeltisini yavaşça tekrar süspense edin. 6. 2 saat boyunca 55-60ºC’de inkübe edin. 7. Aktive olmayan K proteinazı 10 dakika kaynatın. Eğer tüpün ağzı yeterince sıkı değilse, 100 º C’de inkübasyon sırasında açılanları korumak için iğne ile kapakları delin. Açık kalan yerlerden su girmesini önleyin. Banyonun kapağını kapatmayın. 8. 10 dakika yüksek hızda mikrosantrifüjde santrifüjleyin. Bir temiz tüpe süpernatantı hemen aktarın ve ampifikasyon reaksiyonu yapmak için bir 5 μL sıvı kalanı alın. 20ºC’de kalanı saklayın. 8.1.2. Serum veya plazma Amplifikasyon ve görüntüleme reaksiyonunun negatif bir kontrolü olarak çalışan 100 μL saline solüsyonundan oluşan bir numune bu prosesi gerçekleştirmek için gereklidir. 1. Buz üzerinde numuneleri tutun ve çözün. 2. 1.5 mL Eppendorf tüp içine 100 μL klinik numuneleri koyun. 3. 400 μL SEML (sıvı numune ekstraksiyon solüsyonu) ekleyin. Kullanım öncesi solüsyon eritilene ve tamamen dönene kadar bekleyin. Tüpleri birkaç kez ters düz ederek karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 4. 500 μL izopropanol (-20ºC’de saklayın) ekleyin ve kullanana kadar buz üzerinde tutun. Tüpleri birkaç kez ters düz ederek karıştırın ve tercihen 4ºC’de 13000 rpm, 20 dakika boyunca santifüjleyin. 5. Mikropipet kullanarak süpernatantı pipetleyin. 1000 μL bir mikropipet süpernatantı almak için kullanılabilir, en küçük mikropipet örneğin 20 μL sonunda tüpün altında kalan kalıntıları almak için kullanılır. 6. 500 μL 70% Etanol ekleyin (-20ºC’de saklayın) ve kullanana kadar buz üzerinde tutun. Altta çökeltiyi temizlemek için yavaşça çalkalayın ve 13000 rpm’de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. 7. Step 5’i izleyerek dikkatlice süpernatantı alın. Çeker ocak altında açık tüpler ile 15 veya 20 dakika boyunca kurutun. Numune tekrar süspanse edilmeden önce, etanol kalıntısını olup olmadığı kontrol edin. 8. 25 μL Dilüsyon solüsyonunu tekrar süspense edin. Ekstre edilmiş DNA/RNA analiz için direk olarak kullanılabilir, -20º C’de saklayın yada amplifikasyon tüpleri içine ekleyene kadar buz üzerinde tutun. 8.1.3. Beyin Omurilik sıvısı (Cerebrospinal fluid) Amplifikasyon ve görüntüleme reaksiyonunun negatif bir kontrolü olarak çalışan 100 μL saline solüsyonundan oluşan bir numune bu prosesi gerçekleştirmek için gereklidir. 1. Buzun üzerinde çözün. 2. 1.5 mL Eppendorf tüp içine 50 μL klinik numuneleri koyun. 3. 200 μL SEML (sıvı numune ekstraksiyon solüsyonu) ekleyin. Kullanım öncesi solüsyon eritilene ve tamamen dönene kadar bekleyin. Tüpleri birkaç kez ters düz ederek karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 4. 250 μL izopropanol (-20ºC’de saklayın) ekleyin ve kullanana kadar buz üzerinde tutun. Tüpleri birkaç kez ters düz ederek karıştırın ve tercihen 4ºC’de 13000 rpm, 20 dakika boyunca santifüjleyin. 5. Mikropipet kullanarak süpernatantı pipetleyin. 1000 μL bir mikropipet süpernatantı almak için kullanılabilir, en küçük mikropipet örneğin 20 μL sonunda tüpün altında kalan kalıntıları almak için kullanılır. 6. 500 μL 70% Etanol ekleyin (-20ºC’de saklayın) ve kullanana kadar buz üzerinde tutun. Altta çökeltiyi temizlemek için yavaşça çalkalayın ve 13000 rpm’de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. 7. Step 5’i izleyerek dikkatlice süpernatantı alın. Çeker ocak altında açık tüpler ile 15 veya 20 dakika boyunca kurutun. Numune tekrar süspanse edilmeden önce, etanol kalıntısını olup olmadığı kontrol edin. 8. 25 μL Dilüsyon solüsyonunu tekrar süspense edin. Ekstre edilmiş DNA/RNA analiz için direk olarak kullanılabilir, -20º C’de saklayın yada amplifikasyon tüpleri içine ekleyene kadar buz üzerinde tutun. 8.1.4. Formol veya etanole sabitlenmiş parafin balmumu-gömülü biyopsiler 1.a. Sabitlenmiş parafin: 5 μm uzunluğunda iki bölümde kesmek için mikrotom kullanın ve otoklov içine bir 1.5 mL Eppendorf tüplere koyun. Numuneyi kestikten sonra ve kesmeden önce önceki kesilmiş numuneden gelen kalıntıları önlemek için ksilen ile dikkatlice temizleyin. 1.b. Formol veya etanol içine sabitlenmiş: Temiz bir slayt üzerinde temiz bir bıçak ile 2-3 mL’lik bir numune parçası şeklinde kesin/kırın ve 1.5 mL temiz bir tüp içine koyun. Pipet ucu ile dokuyu ezin ve parçalamayı kolaylaştırmak için vortekste karıştırın. 2. Oda sıcaklığında DB 5X (Digestion Solüsyonu 5X)’in bir tüpünü, PK 10X (Proteinaz K 10X)’in bir tüpünü ve SD (Dilution Solüsyonu)’in bir tüpünü eritin. Proteinaz K kullanılıyorken buz üzerinde muhafaza edilmelidir ve sonra 4ºC’de saklanmalıdır; bir kez eritildikten sonra tekrar dondurulmaz. Her numunenin prosesinde aşağıdaki miktarlar karıştırılarak dijesyon karışımı hazırlayınız: 70 x (tüp no. + 1) = __ μL SD (Dilüsyon Solüsyonu). 20 x (tüp no. + 1) = __ μL DB 5X (Digestion Solüsyonu 5X). 10 x (tüp no. + 1) = __ μL PK 10X (Proteinaz K 10X). Her bir numuneye 100 μL dijesyon karışımı ekleyin. Mikropipet ucu ile kesilen bölümü itin böylece dijesyon karışımı ile tamamen kaplanmıştır. Negatif bir kontrol ve görüntüleme kontrolü olarak işlem görecek vakumlu 1.5 mL tüpe 100 μL karışımı ekleyin. 3. Bir ısı bloğunda yada banyo içinde 56ºC’de 3 saat boyunca inkübe edin. 4. Aktive olmayan K proteinazı 10 dakika kaynatın. Eğer tüpün ağzı yeterince sıkı değilse, 100 º C’de inkübasyon sırasında açılanları korumak için iğne ile kapakları delin. 5. 10 dakika mikrosantrifüjde hemen santrifüjleyin. Katılaşmış parafin üst tabakası bir micropipette tamamlayarak temiz bir 1.5 mL tüp içine süpernatantı toplayın. Ekstre edilmiş DNA ya direk ya da –20ºC’de saklanarak analiz edilebilir. 8.2. Otomatik ekstraksiyon NucliSENSTM Biomérieux easyMAG cihaz Aşağıdaki yöntem önerilmektedir: 1. İnternal lizis için numune hazırlama (sistemin içinde gerçekleşir) Swablar: - Swab içeren tüpe 1.5 mL saline solüsyonu (0.9% sodyum klorür) ekleyin ve 1 dakika vorteksleyin. - Bir 1.5 mL Eppendorf tüpüne supernatantı boşaltın ve kuyu tepsisine 1 mL aktarın. Serum/plazma/cerebroespinal fluid(beyin omirilik sıvısı) - Bir kuyu tepsisine 100 μL numuneyi aktarın. * Tam kan numunesi: - Bir kuyu tepsisine 100 μL numuneyi aktarın. - Çeker ocak altında ekstraktörün kuyu tepsine numuneyi aktarın. 2.DNA/RNA internal liziz ve ekstraksiyon: standart program için sistemin kullanıcı kılavuzunu izleyin. Bu programda, elüsyon hacmi swablar için 100 μL ve serum, plazma ve beyin omurilik sıvısı için 25 μLdir ve bu numuneler için Generic programın kullanılması gerekir. Kan numunelerinde, spesifik B programı 70 μL elüsyon hacmi ile kullanılmalıdır. 3. Ekstraksiyon bittiğinde, elüat DNA/RNA bir pipet ile alınır ve 1.5 mL Eppendorf tüpe konulur. Ekstraksiyon DNA ya direk yada –20ºC’de saklanarak analiz edilir. 8.3. Amplifikasyon reaksiyonu. 8.3.1 Amplifikasyon-spesifik öneriler: • Pre-PCR alanında çalışırken her zaman bir çeker ocak kullanın ve bölüm 6.1 bahsedilen önerileri izleyin. • PCR tüplerine enzim karışımı eklerken dikkat edin, çünkü karışım yüksek yüzdeli gliserol içerir. Eğer pipet ucunu çok derine getirirseniz, karışım gerektiğinden daha büyük bir miktarda reaksiyon tüpüne eklenirse karışım duvarlara yapışır ve diğer taraftan, kitin amplifikasyon tüplerinden geri kalanı ürün kaybına neden olabilir. •Pre-PCR alanında DNA/RNA eklerken bir çeker ocak kullanın ve bölüm 6.1 bahsedilen önerileri izleyin. İşlem süresince, tüpleri kapatın, ayırın ve buzun üzerinde tutun. 8.3.2 Amplifikasyon reaksiyon protokolu: 1. Her numune işlemi için, buz üzerinde iki Amplifikasyon tüpü ( renksiz ve yeşil) eritin. Eritirken 37ºC ‘den yukarı sıcaklığı kullanmayın. 2. Tüpün altındaki tüm sıvılar karışana kadar bir kaç dakika mikrosantrifujde santrifujleyin. Bu durumda mikrosantrifüj adaptörleri uygun değilse, kapaklar kesildikten sonra yerine daha büyük tüpler kullanın. 3. Amplifikasyon tüpleri içine 2 μL enzim karışımı ekleyin (multiplex RTPCR 1 & 2). İşlem süresince, buz üzerinde enzim karışımı tutun. 4. Reaksiyon tüplerinin her birine numuneden gelen 5 μL ekstre edilen RNA/DNA ekleyin ve mikropipet ile birkaç kez tekrar süspanse edin. Tüpleri buz üzerinde tutun. 5. Multipleksin her iki tipi için termal döngüde aşağıdaki döngüler programlanmıştır: 1 döngü 45ºC 45 dakika 95ºC 15 dakika 45 döngü 95ºC 30 san. 56ºC 1:30 dk. 72ºC 1 dk. 1 döngü 72ºC 10 dk. Tüpler toplanana kadar devamlı 4ºC (opsiyonel) 6. Termal döngü içine Reaksiyon tüplerini koyun ve programı başlatın. Sisteme bağlı olarak değişebilmesine rağmen, amplifikasyon yaklaşık 5 saat sürer. 8.4. Amplifiye ürün görüntüleme. 8.4.1. Array Tüplerinde(AT) görüntüleme Görüntüleme başlamadan önce spesifik öneriler: •AŞAĞIDA AÇIKLANAN PROTOKOL POST-PCR ALANINDA HER ZAMAN KULLANILMALIDIR. ASLA PRE-PCR ALANINDAKİ AMPLİFE OLMUŞ ÜRÜNÜ KULLANMAYIN. •İşlem başladığında, AT tarayıcıyı açın; ekipmanların self-kalibrasyonu birkaç dakika sürebilir ve aşırılığa neden olan gereksiz zaman kaybını önlemek için okuma sırasında tüpler hazır olmalıdır. • HER TEST ÖNCESİ YIKAMA SOLÜSYONU HAZIRLAYIN; HAZIRLANMIŞ VEYA ARTIK SOLÜSYONLARI KULLANMAYIN. DAHA ÖNCE • Denatürasyon programı başlamadan önce, 10% ağartma solüsyonu ile thermocycler yıkayın. Bir swab kullanarak her bir kuyu dilüe ağartıcı ile temizlenmelidir. Denatürasyon işlemi süresince, 10 dakikadan fazla kalmayacak şekilde thermocycler içine ayırarak amplifikasyon tüplerini koyun. • Görüntüleme adımları sürecinde filtre uçlarına gerek yoktur, sadece AT de amplifiye olmuş ürünler eklendiğinde kullanılır. • Test bittikten sonra vakum pompası aspirasyonu için kullanılan Pasteur pipetlerini her zaman değiştirin ve hibridizasyon işleminin sonunda her zaman yeni bir numune için pipet alın. • Camdaki çökeltiler kaybolana ve oda sıcaklığına gelene kadar SH (Hybridization Solüsyon) bırakın. •AT konulmadan önce termal mikserlerin doğru sıcaklığa ulaştığından emin olun. • Okuma hatalı olduğunda, Assay ID olarak bertilen ArrayTube’de görünen numarayı elle girin. Görüntüleme 1. Denatürasyon: PCR ürünlerini denatüre etmek için termocycler kullanın. Bu adımda, termocycler içine ürün içeren tüpleri koyun ve 10 dakika boyunca 95ºC’de inkübe edin. Termocyclere 15 dakikaya programlayın böylece denatürasyondan sonra ürünler bu sıcaklıkta kalır. Tüpleri 95ºC inkübasyondan alın ve hemen buzlu kaba koyun. 2. TL dilüe edilmiş Solüsyon hazırlama: • 12 numune için, 18 ml distile suya 2 ml TL Solüsyon ekleyin. • 24 numune için, 27 ml distile suya 3 ml TL Solüsyon ekleyin. • 48 numune için, 54 ml distile suya 6 ml TL Solüsyon ekleyin. 3. AT ön yıkama: Her AT’ye 300 μl TL dilüe edilmiş solüsyon ekleyin ve 10 ya da 15 kez ters düz edin. Bir mikropipet veya vakum sistemi ile bu solüsyonu alın. Bu yıkama adımını tekrar edin. Numune eklemeden önce, tüpler yıkanmalıdır. Bu tüp yıkama solüsyon kalıntısı içermez; bu nedenle kapaklar kurumaya izin vermelidir. Hiçbir koşul altında, tüpler tamamen kurutulmalıdır. Aşağıdaki solüsyonu hemen ekleyin. 4. Hibridizasyon: Kullanım öncesi SH solüsyonu oda sıcaklığında olmalıdır. PCR ürünleri denatüralize olduğunda, her bir AT tüp içine 100 μL SH solüsyonu ekleyin. AT tüpüne 5 μL denatüralize PCR ürünleri ekleyin. Cama dokunmadan hibridizasyon solüsyonu ile karışım olana kadar bir kaç kez tekrar suspense edin. 550 rpm’de çalkalanarak 1 saat boyunca 50ºC’de ısı bloğu içinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpleri çıkarın ve mikropipet yada vakum sistemi kullanarak SH solüsyonunu alın. Vakum sistemi kullanıldığında, HER TÜP İÇİN FARKLI PİPET UÇLARI YA DA FARKLI PASTEUR PİPET KULLANIN. Adım 6’da kullanmak için 30ºC’ye ısı bloğunu programlayın ve çalıştırın. Daha çabuk soğusun diye kapağını çıkarın. 5.Yıkama: Her bir AT’ye 300 μl TL dilue edilmiş solüsyon ekleyin ve 10- 15 kez ters düz edin. Bir pipet ve vakum sistemi kullanarak bu solüsyonu alın. Tüpler TL solüsyonu ile yıkanıyorken ısı bloğu 30ºC’ye ulaşana kadar bekleyin. 6. Konjugat ekleme ve bloklama: Hibridizasyon adımı bitmeden önce 15 dakika dilue edilmiş CJ solüsyonunu hazırlayın ve kullanana kadar buz üzerinde tutun. Kullanım öncesi 10 saniye CJ solüsyonunu santrifüjleyin. Sonra, dilüe CJ solüsyonu hazırlayın. Bu işlemi buz üzerinde gerçekleştirin. Bu amaçla, her bir AT için 100 μL DC solüsyonu ve 0.8 μL CJ solüsyonu bir tüpte karıştırın (pipet hatalarını önlemek için her on AT de, ekstra bir AT solüsyonu hazırlayın) 4ºC’de saklandığında, hazırlama sonrası dilüe CJ solüsyonu 4 saate kadar stabil kalır. Zamanı geçtikten sonra kullanmayın. Homogenizer için dilüe edilmiş CJ solüsyonunu karıştırın ve AT'e 100 μL CJ Solüsyonu ekleyin. 15 dakika boyunca 30ºC’da ve 550 rpm ajitasyonda tamamen* inkübe edin. Bu inkübasyonun ardından, pipet veya vakum sistemi kullanarak AT solüsyonunu hızlıca alın. Step 8’de kullanmak için 25ºC’ye ısı bloğunun sıcaklığını düşürün. *İnkübasyon süresi 13-18 dakika arasındadır. Bu aralığın dışında elde edilen sonuçlardan Genomica sorumlu değildir. 7. Yıkama: Her AT’ye 300 μl dilüe edilmiş TL solüsyonunu hızlıca ekleyin ve 10 ile 15 kez tüpleri test düz edin; sonra, vakum sistemi ya da bir pipet kullanarak solüsyonu alın. Eğer yıkama hızlıca yapılmazsa, okuma sırasında belirsiz bir sinyale neden olur. Camın kuru bırakıldığından emin olun. 8. Yıkama 2: Bu önemli bir yıkama adımıdır. Her AT’ye 300 μl dilüe edilmiş TL solüsyonunu ekleyin ve 10 ile 15 kez tüpleri test düz edin; sonra, vakum sistemi ya da bir pipet kullanarak solüsyonu alın. CJ solüsyonunda kalıntı bırakılmamalıdır, çünkü bu belirsiz bir sinyal üreten kalıntı RE solüsyonu ile reaksiyona girebilirler. Camlara dokunulmadığı için her tüp için uç değiştirmeye gerek yoktur. 9. RE Solüsyonu geliştirme: 12 lotlu AT çalışılmalıdır. RE solüsyonu kullanın ve buz üzerinde tutun. TL solüsyonunu alın ve miktarın bitmediğinden ve camın kuru olduğundan emin olun. AT’ye 100 μL RE solüsyonu ekleyin ve çalkalamasız ısı bloğu içinde 25ºC’de tam olarak* 10 dakika boyunca inkübe edin. *İnkübasyon süresi 10-15 dakika arasındadır. Bu aralığın dışında elde edilen sonuçlardan Genomica sorumlu değildir. ÖNEMLİ! Çalkalamasız ısı bloğu kullanın ve inkübasyondan sonra numuneleri hemen okuyun. 10. Otomatik olarak analiz etmek için numuneleri ‘’Seri analiz'‘ yoluyla okuyun. 9. SONUÇLARIN OKUNMASI Her analizde elde edilen verilerin işlemi tamamen otomatiktir. Okuma ve analiz sistemi sonuçlar ile ilgili bir rapor verecektir. Bu sistem ekran üzerinde, üç kolonlu bir tablo görüntüleyecektir: sol kolonda mikro-array’da virüs özelliklerini gösterir. Sağ kolon amplifikasyon kontrolu ile tespit edilmiş doğruluğu gösteriyorken merkez kolon her bir virüs için hem negatif hem de pozitif sonuç gösterir. 10. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Genotip amplifikasyon ile tespitin ana eksiklerinden biri analiz edilecek numunede DNA polimeraz inhibitörlerin ( örneğin, hemoglobin, parafin mumdan kalan, tuzlar vb) varlığıdır, bu nedenle genomik amplifikasyona engel olur ve hatalı negatif sonuçlanır. ® Bununla birlikte, CLART Entherpex aynı tüp içinde internal amplifikasyon kontrolün kullanımı ile yanlış negatif sonuç elimine edilir ve bu tüpte numune analiz edilir. Her amplifikasyon tüpü aşağıdaki oligonükleotitleri içerir: • Amplifikasyon tüpünde olan amplifiye bir modifiye plasmid oligonukleotidler çiftidir ve RT PCR reaksiyonun amplifiye kontrolü olarak kullanılır. • Oligospesifik herpes virüsü ve Enterovirus. RT-PCR tüp amplifikasyon kontrolü yerine virüslerin amplifikasyonunu kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. Bu yolla, belli koşullar altında (örneğin, numune aynı anda farklı virüsler ile ko-enfeksiyonlu olduğunda veya virüsün çok kopyası olduğunda) bazı kontroller amplifiye olmayabilir ve aşağıdaki okuma görüntülenir: VALİD (GEÇERLİDİR). Bu tasarımın nedeni internal amplifikasyon kontrolüdür ve bize DNA bulunmayan numune ve PCR reaksiyon inhibisyon durumunda ayırt etmeyi sağlar. Bu gözlemleri anlamak için, aşağıdaki sonuç yorumlarını dikkate alabilirsiniz: 1. Pozitif numuneler: 1.1. Pozitif amplifikasyon kontrolü ile Virüs Türler Sonuç Pozitif Kontrol Geçerli Kontrol İç kontrol Sinyal >0.150 Sonuç Geçerli Bu GEÇERLİ BİR SONUÇ olarak sayılır. Buna Doğru bir pozitif sonuç diyebiliriz. 1.2. Negatif amplifikasyon kontrolü ile Virüs Türler Sonuç Pozitif Kontrol Geçerli Kontrol İç kontrol Sinyal >0.150 Sonuç Sinyal yok Amplifikasyon kontrolü SİNYAL YOK gösterse bile, GEÇERLİ SONUÇ sayılır. Bu virüs rekabet etkisinden dolayıdır. Buna gerçek bir olumlu sonuç denilebilir. 2. Negatif numuneler. Virüs Türler Sonuç Negatif Kontrol Geçerli Kontrol İç kontrol Sinyal >0.150 Sonuç Geçerli Bu GEÇERLİ BİR SONUÇ dur. Buna Doğru bir negatif sonuç diyebiliriz. 3. Yetersiz, inhibe numuneler Virüs Türler Sonuç Negatif Kontrol İnhibe PCR Kontrol İç kontrol Sinyal >0.150 Sonuç Sinyal yok Bu GEÇERSİZ BİR SONUÇTUR. Bu durum DNA polimeraz enzim aktivitesi bloklandığında bazı maddelerin PCR reaksiyonu inhibe olmasından kaynaklanabilir. Genetik materyal ekstresi içinde ya da numunede bu tip numuneler olmadığından olabilir. Ekstraksiyon yenilenmeli ya da eğer mümkünse hekime sorularak hastadan yeni bir numune alınmalıdır. Etkisiz bir virüs sonucu aşağıdaki bu olasılıklardan birinden dolayı görünebilir: • Aynı probun üç kopyası kendi aralarında çok farklı olduğunda. • Tespit edilmiş virüsler ko-enfeksiyon olduğunda. 11. TEKNİK VE ÇALIŞMA ÖZELLİKLER Bilinen engellerin kontrolü: CLART®Entherpex kit kullanıldığında, belli maddeler engellenebilir. Esas olarak enzim karışımı engelleyici maddelerdir ve böylece amplifikasyon reaksiyonunu inhibe edebilirler. Çoğu engelleyiciler aşağıdadır: 1 DNA/RNA ekstraksiyon ardından hemoglobin veya parafinin varlığı. Hem tam kandan hem de diğer kan ürünlerinden paraffin-gömülü doku numunelerinden elde edilen gibi DNA ekstresi sırasıyla hemoglobin kalıntı ve paraffin kalıntısı içerir. Ekstraksiyon ardından DNA/RNA saflaştırarak bu sorun önlenebilir. 2 DNA/RNA da izopropanol kalıntısı. Serum, plazma ve CSF numunesinden alınan DNA/RNA ekstraksiyon işlemi sırasında, DNA/RNA izopropanol ile çökeltilir. Eğer çökelti doğru şekilde kurumamışsa, numunenin izopropanol varlığında amplifikasyon reaksiyonu inhibe olmaz. 3 Yetersiz numunenin kullanımı. CLART®Entherpex kitin klavuzda belirtilenden başka numune türlerinin kullanımı veya numunenin yanlış alınması, kesin olmayan sonuçlara neden olabilir. Örneğin, numune alma swabı başka bir ortama konulursa, PCR inhibe edilebilir ya da eğer numune uzun zaman formol içinde bırakılırsa, DNA bozulabilir. 4 Kalan proteinaz K aktivitesi. Proteinaz K 100ºC’de 10 dakika inkübasyon ile swab numuneleri ve biyopsileri için DNA ekstraksiyonu sırasında inaktive edilmelidir. Bu şartlar altında, inaktivasyon tamamlanır. Bu adım ihmal edilirse, ya da koşullara bağlı olunmazsa, biraz proteinaz K kalabilir ve PCR inhibasyonuna neden olduğundan dolayı DNA polimeraz bozulabilir. 5 Numunelerin yetersiz saklanması Eğer numune DNA’ın bozulmasına neden olan şartlar altında tutulursa, sonuçlar güvenilir olmayabilir. Teknik özellikler: 1. İşleme parametreleri: Analitik duyarlılık farklı HPV genotiplerin amplifikasyonu tarafından belirlenir. • Analitik duyarlılık . Tablo 1 ‘de bulunan virüs tiplerinin analitik duyarlılığı kit ile tespit edilmiş virüslerin her biri için rekombinant plazmidin DNA dilüsyonlarının serisinin amplifikasyonu ile belirlenmiştir. Virüslerden her biri ekli amplifiye ürünler içerir ( spesisfik-tespit probun tamamlayıcısı dahil). ViRÜS HHV-7 PCR reaksiyonu oluşan recombinant plasmid kopya sayısı 10 HSV-1 HSV-2 VZV CMV EBV HHV-6 HHV-8 Coxsackivirus Echovirus Poliovirus 100 1000 Tablo 1: Virüslerin her birinin tespitinde % 100 duyarlılık elde etmek için gerekli rekombinant plazmid kopya sayısı ilişkisi (virüs türü ile belirlenir). • Analitik özgüllük. Özgüllük deneyleri rekombinant plazmid ile yapılır. Sonuçlar Tablo 2 ‘de özetlenmiştir. VIRUS HSV-1 VZV CMV HHV-6 HHV-7 HHV-8 HSV-2 EBV Enterovirus ANALATİK ÖZGÜLLÜK 100% 99.4% 92.2% Tablo 2: Virüs tiplerinin analitik duyarlılığı • Teşhise yardımcı parameterler. Kitin diagnostik parametrelerini belirlemek için, iki tekniğin baş başa değerlendirilmesi aşağıdaki teknikler ile CLART® ENTHERPEX kit karşılaştırıcı çalışmaları yapılmalıdır: - Herplex®: HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV ve HHV-6 virüsler için - Quantitative PCR: bazı durumlarda, CMV ve EBV için - Real-time PCR: Enterovirus için - Self-developed PCR ve in-gel detection:HHV-7 ve HHV-8 virüsler için - Immunohistoquemistry HHV-8 için. Çalışılmış numunelerin analiz sonuçları aşağıdaki tabloda özetlenmiştir: VIRÜS HSV-1 HSV-2 VZV CMV Diagnostik duyarlılık 90.% 100% 100% 96.7% Diagnostik özgüllük 100% 100% 98.4% 100% EBV HHV-6 HHV-7 HHV-8 Enterovirus 97.5% 100% 100% 100% 80% 97.5% 99.5% 100% 100% 100% Tablo 3: CLART® ENTHERPEX teknikte kullanılan diagnostik parametreler 12. BİBLİYOGRAFYA Tsan-Chi Chen, Guang-Wu Chen, Chao Agnes Hsiung, Jyh-Yuan Yang, Shin-Ru Shih, Yiu- Kay Lai, Jyh-Lyh Juang: “Combining Multiplex Reverse Transcription-PCR and a Diagnostic Microarray to Detect and Differentiate Enterovirus 71 and Coxsackievirus A16”. Journal of Clinical Microbiology. 44(6), 2212-2219 (2006). Boriskin YS, Rice PS, Stabler RA, Hinds J, Al-Ghusein H, Vass K, Butcher PD.: “DNA microarrays for virus detection in cases of central nervous system infectiuon” . Journal of Clinical Microbiology. 42(12), 5811-5818 (2004). Jaaskelainen AJ, Piiparinen H, Lappalainen M, Koskiniemi M, Vaheri A.: “Multiplex-PCR and oligonucleotide microarray for detection of eigh different herpesviruses from clinical specimens”. Journal of Clinical Virology, 37(2), 83-90 (2006) Coiras MT, Aguilar JC, García ML, Casas I, Pérez-Breña P.: “Simultaneous detection of fourteen respiratory viruses in clinical specimens by two multiplex reverse transcription nested-PCR assays”. Journal Medical Virology , 72(3), 484-495 (2004). Zheng ZB, Wu YD, Yu XL, Shang SQ.: “DNA microarray technology for simultaneous detection and species identification of seven human herpes viruses”. Journal Medical Virology, 80(6), 1042-1050 (2008). Hudnall SD, Chen T, Allison P, Tyring SK, Heath A.: “Herpesvirus prevalence and viral load in healthy blood donors by quantitative real-time polymerase chain reaction. Trasnfusion, Apr 15 (2208). Afenjar A, Rodriguez D, Rozenberg F, Dorison N, Guët A, Mignot C, Doummar D, Billette de Villemeur T, Ponsot G.: “Human herpes virus type 6, etiology of an acute encephalitis in childhood: case report”. Arch Pediatric, 14(5), 472-475 (2007). Zambrano Y, Chiarello A, Soca A, Villalobos I, Marreno M, Soler M, Laferte J, Alvarez M.” Use of polymerase chain reaction for the diagnosis of central nervous system infections”. Invest Clin., 47(4),337-347 (2206). Huang C, Morse D, Slater B, Anand M, Tobin E, Smith P, Dupuis M, Hull R, Ferrera R, Rosen B, Grady L. ” Multiple-year experience in the diagnosis of viral central nervous system infections with a panel of polymerase chain reaction assays for detection of 11 viruses.”. Clin Infect Dis., 39(5), 630-635 (2004). Casas I, Pozo F, Trallero G, Echevarría JM, Tenorio A. “Viral diagnosis of neurological infection by RT multiplex PCR: a search for entero- and herpesviruses in a prospective study”. Journal Medical Virology 57(2), 145-151 (1999). Kanerva M, Jääskeläinen AJ, Suvela M, Piiparinen H, Vaheri A, Pitkäranta A. “Human herpesvirus-6 and -7 DNA in cerebrospinal fluid of facial palsy patients”. Acta Otolaryngol. 128(4), 460-464 (2008). Ginanneschi F, Donati D, Moschettini D, Dominici F, Cermelli C, Rossi A. “Encephaloradiculomyelitis associated to HHV-7 and CMV co-infection in immunocompetent host”. Clin. Neurol. Neurosurg., 109(3), 272276 (2007). Calvario A, Bozzi A, Scarasciulli M, Ventola C, Seccia R, Stomati D, Brancasi B.: “Herpes Consensus PCR test: a useful diagnostic approach to the screening of viral diseases of the central nervous system”. Journal Clinic Virology, 25(suppl.), S71-S78 (2002). Deback C, Agbalika F, Scieux C, Marcelin AG, Gautheret-Dejean A, Cherot J, Hermet L, Roger O, Agut H.: “Detection of human herpesviruses HHV-6, HHV-7 and HHV-8 in whole blood by real-time PCR using the new CMV, HHV-6, 7, 8 R-genetrade mark kit”. Journal Virology Methods, 149(2), 285-291 (2008). Hubacek P, Sedlacek P, Keslova P, Formankova R, Stary J, Kulich M, Cinek O.: “Incidence of HHV7 in donors and recipients of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation”. Pediatric Blood Cancer. 50(4), 935 (2008). Holden SR, Vas AL.: “Severe encephalitis in a haematopoietic stem cell transplant recipient caused by reactivation of human herpesvirus 6 and 7”. Journal Clinic Virology, 40(3), 245-247 (2007). Berger C, Hug M, Gysin C, Molinari L, Frei M, Bossart W, Nadal D.: “Distribution patterns of beta- and gammaherpesviruses within Waldeyer's ring organs”. Journal Med. Virology, 79(8), 1147-1152 (2007). Chen T, Hudnall SD.: “Anatomical mapping of human herpesvirus reservoirs of infection”. Mod. Pathol.,19(5), 726-737 (2006). Mendoza LP, Bronzoni RV, Takayanagui OM, Aquino VH, Figueiredo LT:: “Viral infections of the central nervous system in Brazil”. Journal Infect., 54(6), 589-596 (2007). Kaneko H, Kawana T, Ishioka K, Ohno S, Aoki K, Suzutani T. “Evaluation of mixed infection cases with both herpes simplex virus types 1 and 2”. Journal Med. Virology, 80(5), 883-7 (2008). Ulrich C, Hackethal M, meyer T, Geusau A, Nindl I, Ulrich M, Forschner T, Sterry W, Stockfleth E.: “Skin infections in organ transplant recipients”. Journal Dtsch Dermatol Ges., 6(2), 98- 105, (2008). Anne de Pagter PJ, Schuurman R, Visscher H, de Vos M, Bierings M, van Loon AM, Uiterwaal CS, van Baarle D, Sanders EA, Boelens J.: “Human herpes virus 6 plasma DNA positivity after hematopoietic stem cell transplantation in children: an important risk factor for clinical outcome”. Biol. Blood Marrow Trasplant, 14(7), 831-839 (2008). Kim DH, Messner H, Minden M, Gupta V, Kuruvilla J, Wright J, Lipton J.: “Factors influencing varicella zoster virus infection after allogeneic peripheral blood stem cell transplantation: low-dose acyclovir prophylaxis and pre-transplant diagnosis of lymphoproliferative disorders”. Transpl. Infect Dis., 10(2), 90-98 (2008). Dolcetti R.: “B lymphocytes and Epstein-Barr virus: the lesson of post-transplant lymphoproliferative disorders”. Autoimmun Rev., 7(2):96-101 (2007). Sugita S, Shimizu N, Watanabe K, Mizukami M, Morio T, Sugamoto Y, Mochizuki M.: “Use of multiplex PCR and real-time PCR to detect human herpes virus genome in ocular fluids of patients with uveitis”. Br. J. Ophthalmol., 11 (2008) Karatas H, Gurer G, Pinar A, Soylemezoglu F, Tezel GG, Hascelik G, Akalan N, Tuncer S, Ciger A, Saygi S.: “Investigation of HSV-1, HSV-2, CMV, HHV-6 and HHV-8 DNA by real-time PCR in surgical resection materials of epilepsy patients with mesial temporal lobe sclerosis”. J. Neurol Sci., 164(1-2); 151-6 (2008). Dierssen U, Rehren F, Henke-Gendo C, Harste G, Heim A.: “Rapid routine detection of enterovirus RNA in cerebrospinal fluid by a one-step real-time RT-PCR assay”. Journal Clin. Virology, 42(1): 58-64 (2008). Read SJ, Mitchell JL, Fink CG.: “LightCycler multiplex PCR for the laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system”. Journal Clin. Microbiology, 39(9): 3056- 3059 (2001).
