Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi ECZ 344 9. ders/03.06.2013
advertisement
Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi ECZ 344 6. ders/25.04.2014 PROF.DR. DİLEK AK ECZACILIK FAKÜLTESİ ANALİTİK KİMYA ANABİLİM DALI 1 2 Diğer Biyolojik Örnekler Klinik ve adli uygulamalarda ilaç analizi için kullanılan biyolojik matrisler Sıvı ve gaz biyolojik matrisler • Kan: Tüm kan, plazma ve serum • İdrar • Salgı ve itrah: tükrük, gözyaşı, ter, süt, beyin omurilik sıvısı, mide sıvısı, safra, semen, amniyon sıvısı • Nefes Katı ve yarı katı biyolojik matrisler • Feçes • Keratinli dokular: Saç, deri, tırnak • Organlar ve diğer dokular: Beyin, akciğer, karaciğer, kas, yağ, kemik • Mide içeriği 3 Saç Saç, ilaç analizi için cazip bir hedeftir, zira non-invaziv yolla toplanır, ilaç afinitesi değişkenliklerine bağlı olarak saç tipine göre değişkenlikler olsa bile maruziyetin tarihsel bir kaydını sağlar. İlaç testleri için biyolojik örnek olarak idrar ve kandan sonra saç üçüncü sırada bulunan bir materyaldir. Analiz için bir matris olarak saçın ilave üstünlüğü oldukça nonpolar olmasıdır ve bu yüzden metabolitlere göre daha az polar olan ana ilaç molekülünü adsorplama eğilimindedir. Bundan dolayı analitlerin non-polar ekstraksiyon fazları için ideal bir matrisdir, özellikle ana ilacın büyük ölçüde metabolizmaya uğradığı ve diğer dokularda tayin edilemediği durumlarda önemlidir. Saç telinde üç farklı tabaka vardır: kütikül, korteks ve medulla. Kütikül dış tabakadaki koruyucu bölümdür ve birbirinin üzerini örten kiremite benzer hücrelerin oluşturduğu birçok tabakadan oluşur. Saçın büyük bir bölümünü korteks oluşturur. Korteks orta, medulla ise iç tabakadır. Saçın büyük kısmı bir protein olan keratin yapısından oluşur. Proteinlerin sarmal şekilde katı değişik bağlar yardımı ile bağlanması sonucu saç korteksi oluşur. Bu sarmal yapı sayesinde saç teli kırılmadan bir miktar esneme özelliğine sahip olur. Resim için adres: http://www.dogatek.com.tr 4 Saç Saç numunesi almak için en uygun yer posterior vertex denilen başın arka kısmıdır. Bu alan saç büyüme hızında daha az değişkenliğe sahiptir. Erkeklerde saç uzaması 0.44 mm/gün, kadınlarda 0.45 mm/gün’dür. En az 200-250 mg örnek alınmalıdır. İlaç suiistimali (narkotiklerin incelenmesi, şartlı salıverilme, detoksifikasyon tedavisi sırasında ilaçtan kaçınma vb) dışında adli bilimlerde ilaçlar için saçların incelenmesi genellikle ölmüş kişiler üzerinde yapılır. Dış bulaşma ilaç suiistimali için önemli bir konudur, çünkü kişiler tozlu veya dumanlı ortama maruz kalabilir. Diğer önemli konu saçın kozmetik işlem görmesi ile ilaç derişiminde meydana gelen değişikliktir. 5 Saç Çeşitli çözücüler ile ekstraksiyon işlemleri uygulanabilir: metanolik sonikasyon, 0.1 M NaOH, 0.1 M HCl, su, tamponlar, 1 M NaOH, % 0.1 sodyum dodesil sülfat, aseton, pronase, performik asit-pronaz, metanol, 5 M HCl, proteinaz K, ditiyotreitol, pH 7.4 fosfat tamponu, ß-glukuronidazarilsulfataz ve süperkritik akışkan ekstraksiyonu (SFE). Metanolik sonikasyon ve SFE dışında yapılan ekstraksiyonlarda analitik işlem öncesinde ilave temizleme işlemleri gerekir. Sıvı-sıvı ekstraksiyon en basiti, çok basamaklı eser zenginleştirme işlemleri ise en zor ve karmaşık olanlarıdır. 6 Saç Saç analizleri en çok adli toksikoloji ve ilaç suiistimali alanlarında ve daha seyrek olarak klinik toksikoloji ve klinik kimya alanlarında uygulanır. Kokain, amfetamin ve opiatlar ile ilgili saç analizlerini içeren pek çok makale vardır. Son zamanlardaki makaleler klenbutarol gibi doping ajanları, benzodiazepin, metadon ve karbamazepin gibi terapötik ilaçlarla ilgilidir. 7 Ter Ter ilaç atılma ile ilgili mekanizmaların aydınlatılmasında alternatif bir hedeftir ve terdeki ilaç bileşimi saçtaki gözlemlere kısmen katkı sağlayabilir. Ter, eccrine ve apocrine glandlardan salgılanır ve deri sulu ve sebaceous salgıyı özellikle yüz ve alında salgılar. Sebaceous sekresyon temel olarak yağlardan oluşur ve bir çok ilacı taşır ve absorplayabilir. Sebum diğer vücut bölgelerine göre enseden ve alından daha fazla salgılanır. Vücudun farklı bölgelerinden numune alınmasına bağlı olarak farklı derişimler beklenmelidir, çünkü yağda çözünür ilaçlar sebumdan atılır. Terleme egzersiz ile uyarılabilir ve bir kaç ml ter numunesi alınabilir. 8 Ter Ter numunesi alınırken 1-3 tabaka filtre kağıdı veya pamuk, tülbent, havludan üretilmiş pet kullanılır. Sweat patches bu amaçla özel olarak çeşitli şekillerde üretilmiş ve ticari olarak mevcuttur. Daha basit bir yol alkollü pamuk ile silerek teri almaktır. Analiz edilen sıvının tam içeriği bilenemez, çünkü hem sulu sekresyon (gerçek ter) hem de sebum toplanır. 9 Diğer matrisler Dokular Feçes Nefes 10 Dokular Doku örnekleri genellikle biyopside elde edilen, ameliyat sonrasında numune olarak veya adli konularla ilgili numunelerdir. Biyopsi numunelerinde histolojik fiksatiflere, diğerlerinde ise çürüme nedenli bozulmalardan kaynaklanan girişimlere dikkat edilmelidir. Homojenizasyon ve ardından enzim dijesyonu ve/veya protein çöktürme işlemleir ve santrifüjden sonra ekstraksiyon için numune hazır hale gelir. Bu şekilde böbrek, karaciğer, ve intestinal dokular çalışılabilir. Beyin dokusu yüksek yağ içeriğine sahiptir ve ekstraksiyon işlemlerinden önce lipaz ile muamele gerekir. 11 Dokular Doku için numune hazırlama işlemi: 1 gram beyin dokusu alınır. Üzerine 0.2 M Tris tamponu (pH 6.3) ve iç standart eklenir. 5 s homojenize edilir. Selüler materyalden süzüntü santrifüj ile ayrılır. Ekstraksiyon uygulanır. Perkloirk asitle homojenizasyon işlemi koşullara bağlı olarak uygulanabilir. 12 Feçes Feçes ile ilgili analizler pek tercih edilmez ancak bazen gerekli olabilir. Zamanlı örneklerin toplanması güçtür. Sıvı halde numune hazırlamak için iki şekilde çalışılır, ya kütle yakılır ve kalıntı uygun bir çözücüde çözülür veya daha yağın olarak fekal homojenat elde etmek için sıvının uygun bir hacminde homojenize edilir ve santrfüj ile çözünmeyen kısımlar ayrılır. Ardından diğer işlemler uygulanır. Başlangıçta çeker ocakta çalışmak tercih edilir. 13 Nefes Nefeste bileşiklerin analizi klinik analizlerde oldukça yeni bir alandır. Etanol ve aseton ve metabolik durum hakkında bir indikatör olan isopren analizleri için makaleler bulunur. Soluk alıp verme sırasında ağızda yerleştirilen adsorban tüpler nefes numunesi almak mevcuttur. Tedlar bag ise SPME fiber cihazına manuel yerleştirilmeye uygun bir araçtır. 14 Amniyon sıvısı Bebek bekleyen anneler için bebeğe ilacın geçişini teşhis etmek amacıyla uygulanabilir. Hamilelikte kokain kullanımı neonatal test gerektirebilir. İdrarda kokain yarı ömrü azdır ve idrar ile atılımda bireysel değişkenlikler sözkonusudur. Bu nedenle amniyon sıvısının analizi önerilmektedir. Amniyon sıvısı anneden fetusa sirkule eden, viskoz beyaza yakın renkli bir sıvıdır. 1 ml amniyon sıvısı 3 ml 0.025 M pH 4.0 fosfat tamponu ile seyreltilerek ekstraksiyon uygulanır. 15 Tırnak Adli tıpta uygulamalar fazladır. İlaç kullanımının zaman bağlı durumunun bilinmesi gerektiğinde tırnak yararlı bir matrikstir. İlacın miktar tayini çalışmalarında başlıca sınırlama tayin edilecek ilaç miktarın son derece az olmasıdır. Kokain, benzilekgonin, norkokain, morfin, 6-monoasetil morfin, kodein, hidrokodon için analiz yöntemleri bulunmaktadır. Numune hazırlanması sırasında 3-5 mm tırnak kesilir ve 100 mg kadarı numune olarak kullanılır. 3 ml metanol ile 2 defa yıkanarak kirliliklerden arındırılır. 60oC de 2 saat kurutulur. Daha küçük parçalara ayrılarak yeniden tartılır. 0.1 M 3 ml fosfat tamponuna (pH 5) alınır ve ultrasonik banyoda 1 saat tutulduktan sonra 72 saat fosfat tamponunda bekletilir. 16 İlaç analizi için numune hazırlama amaçları Analit tayini ile girişim yapabilecek makromoleküler kontaminantların (proteinler) uzaklaştırılması Kromatografik ve elektroforetik kolonun ayrım gücünün numunedeki tüm bileşenleri tamamen ayırmaya yeterli olmadığı durumlarda veya yeterince zaman olmadığında seçilmiş analit bileşenlerinin uzaklaştırılması Kromatografik veya elektroforetik ayırmayı ve tekrar edilebilirliği etkileyebilecek materyalin uzaklaştırılması Kromatografik sistemi bloke edebilecek materyalin uzaklaştırılması Kompleks halde bulunan analitin belirlenmesi Kromatografik sisteme verilecek analitlerin çözünür hale getirilmesi Çözücü kuvvetini azaltmak veya çözücü uyumsuzluğunu önlemek için seyreltme Analitik cihazın saptama sınırları içinde kalacak şekilde analitin derişik hale getirilmesi Duyarlılık ve seçiciliği artırmak için analitin türevlendirilmesi 17 Kaynaklar J. Pawliszyn, Comprehensive Analytical Chemistry. Sampling and Sample preparation for Field and Laboratory. Chapter 23. Elsevier, 2002 M.J, Telepchak, T.F. August ve G. Chaney, Forensic and clinical applications of solid phase extraction, Humana Press Inc. Totowa, NJ. Chapter 7, 129 18 İlginiz için teşekkür ederim.
