3. HAFTA Mikrobiyal Gelişme ve Üreme
advertisement
Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. 3. HAFTA Mikrobiyal Gelişme ve Üreme 1 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Üreme Stratejileri • Ökaryot mikroplarda üreme stratejileri – Eşeysiz ve eşeyli, haploid veya diploid • Bakteria ve Arkea – Sadece haploid, eşeysiz- binary füzyon, tomurcuklanma, ipliksi (filamentus) – Hepsinde bölünebilmeleri için replikasyon (eşleşme) ve segregasyon(ayrışma) olmak zorunda 2 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Bakteri üremesi 3 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Figure 3.2 4 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Bakteri Hücre Döngüsü • Hücre döngüsü, yeni bir hücre oluşumundan bir sonraki hücre bölünmesine kadar geçen olaylar dizisidir – Çoğu bakteri binari füzyon ile bölünür • Hücre döngüsünde 2 temel olay – DNA replikasyonu ve ayrışması – Sitokinez (Sitoplazma bölünmesi) 5 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Kromozom replikasyonu ve bölünmesi • Çoğu bakteri kromozomları daireseldir • Replikasyonun başladığı bölgeye Replikasyon orijini denir • terminus – bölge, replikasyonun sona erdiği yerdir • replizom – DNA sentezi için ihtiyaç duyulan proteinler makinası 6 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Figure 7.3 7 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Replizom Replizom , DNA replikasyonunu yapan kompleks bir makinadır. 8 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Plazmid • Bakteri içerisindeki bağımsız gen yapılarına plazmid denir. Kendilerini çoğaltmak için gerekli proteinleri üzerlerinde taşırlar. • Örnek: Antibiyotik direnç genleri plazmidler üzerindedir. 9 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Plazmid çoğalması Şekil 3.5 10 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Büyüme • Hücre bileşenlerinin artmasının sonucu olarak: – Hücre sayısı artar – Hücre boyutu artar • Büyüme, popülasyonun büyümesinden ziyade bireysel hücrelerin büyümesi anlamına gelir 11 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Büyüme Eğrisi • Büyüme eğrisi, mikroorganizmaların kültür ortamında koloni oluşturacak şekilde yetiştirildiğinde gözlemlenir – kapalı bir kapta tek bir hücrenin uygun besi ortamında inkübasyonu yapılır • Genellikle hücre sayısının logaritmik ifadesiyle zaman garifiğinin çizilmesid • 4 farklı faz vardır – Lag fazı, logaritmik üreme fazı, durgun faz ve ölüm fazı 12 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Şekil 3.11 13 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Lag Fazı • Hücre yeni bileşenler sentezler – Örn: harcanan materyalleri takviye eder – Örn: yeni besin ortamına veya yeni şartlara adapte olur • Uzunluğu değişebilir – Bazı durumlarda çok kısa veya hiç olmayabilir 14 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Logaritmik Üreme Fazı • Log fazı olarak da ifade edilir • Büyüme oranı ve bölünme sabit ve maksimumdur • Bu faz sürecinde, popülasyon fiziksel ve kimyasal özellikler açısından en dengeli şekildedir 15 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Dengeli Büyüme • Log fazında hücreler dengeli bir büyüme segiler – Hücresel bileşenler birbirine oranla sabit olarak üretilir 16 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Dengeli olmayan Büyüme • Hücresel bileşenler birbirine oranla sabit olarak üretilmez • Çeşitli şartlar altında gerçekleşir – besin seviyelerindeki değişim • artiş (fakir besiyerinden zengin besiyerine) • azalış (zengin besiyerinden zayıf besiyerine) – Çevresel şartlarda değişme 17 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Durgun Faz • Kapalı sistemlerde popülasyon büyümesi durur, toplam canlı hücre sayısı sabit kalır – Aktif hücrelerde üreme durur veya üreme oranı ile ölüm oranı dengelenir 18 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Durgun Fazın Muhtemel Sebepleri • • • • 19 Besin sınırlanması Sınırlı oksijen kullanılabilirliği Toksin atıkların birikmesi Popülasyon yoğunluğunun kritik noktaya ulaşması Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Durgun Faz ve Açlık Tepkisi • açlık ve diğer stresli koşullar, durgun faza girilmesine sebep olur ve hayatta kalma stratejilerini aktifleştirir – Morfolojik değişmeler • Örn: endospor oluşumu – Boyutta küçülme, protoplazma kaybı ve nükleoidin yoğunlaşması 20 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Ölüm Fazı • 2 alternatif hipotez – Hücreler Canlı Fakat Kültürlenemez (Viable But Not Culturable (VBNC)) • Canlı hücreler fakat uyku halinde, uygun şartlarda yeniden üreyebilir.. • Programlanmış hücre ölümü • Popülasyon genetik olarak ölmeye programlanmış (intihar) 21 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Logaritmik Üremenin Matematiği • Hücre sayısının Katlanma Zamanı – Popülasyondaki hücre sayısının katlanması için geçen süre – Mikroorganizmaların türlerine ve çevresel şartlara göre değişir – Bazı bakteriler için 10 dakika, bazı ökaryotlar için ise birkaç gün olabilir 22 23 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Popülasyon Büyüme Grafiği • Popülasyon, her üremede katlanarak büyür 24 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Table 7.3 25 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Mikrobiyal Üremenin Ölçülmesi • Popülasyondaki hücre sayısındaki değişim ile ölçülebilir • Popülasyonun kütlesindeki değişimin ölçülmesi ile hesaplanabilir 26 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Hücre Sayısının Doğrudan Ölçülmesi • Toplam Hücre Sayımı – Sıvı örnekte sayım Özel Sayım Bölmeleri kullanılır – Lam üzerinde kurutulmuş örnekte 27 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Özel Sayım Bölmeleri • • • • 28 Kolay, ucuz ve hızlı Prokaryot ve ökaryotların sayımı için kullanışlı Ancak, ölü ve canlı hücreler ayırt edilemez Petroff-hausser Kamarası Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Doğrudan Sayım, Zar Filtresi Üzerinde Sayım • Hücre sayısının az olduğu durumlarda – Hücreler özel zardan süzülür, siyah bir zemin üzerinde gözlemlenir – Hücreler florasan bir boya ile boyanır – Bakteri sayımı için kullanışlıdır • Belirgin boyalar kullanılarak ölü ve canlı hücreler ayırt edilebilir 29 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. 30 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. 31 Doğrudan Sayımın Kısıtlamaları • • • • Canlı, ölü hücreler ayırt edilemez Çok küçük hücreler görülemez Kesin bir değere ulaşılamaz Örnek boyanmaz ise faz-kontrast mikroskobu kullanılmalı • Düşük hücre yoğunluklarında uygun değil • Hareketli hücreler sabitlenmeli 32 Canlı Hücre Sayım Metodları • Yayma plak ve Dökme plak yöntemleri Bu yöntemlerde canlı hücrelerin bölünerek koloni oluşturmalarından yararlanılır 33 – Seyreltilmiş bakteri örneği katı bir besiyeri üzerine yayılır veya agar ile karıştırılarak petri kabına dökülür – Uygun sıcaklıkta üremeye bırakılır (inkübasyon), üreme sonrası oluşan koloniler sayılır ve seyreltme faktörü ile çarpılır – Dökme plak yönteminde bakteri agar sıcaklığına dayanabilmeli Ekim Öncesi Hücre süspansiyonlarının Seyreltilmesi 34 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Yayma Plak Yöntemi 35 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Dökme Plak Yöntemi 36 Mikrobiyal Üremenin Dolaylı Ölçülmesi: Bulanıklık • Hızlı, kolay ve hassastır. Sıvıdaki bulanıklığı belirler • 540 nm - yeşil • 600 nm – turuncu • 660 nm – kırmızı ışıklar kullanılır 37 Sürekli Kültür: kemostat • Açık sistemde bakteri üremesi – Kullanılan besinin sürekli takviye edilmesi – Atıkların sürekli ortamdan uzaklaştırılması • Hücrelerin logaritmik fazda bulunmalarını sağlanır, uzun zaman aralığında biyokütle sabit kalır • Sabit hacimli sürekli bir kültür sistemi kullanılarak sağlanır 38 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Importance of Continuous Culture Methods • constant supply of cells in exponential phase growing at a known rate • study of microbial growth at very low nutrient concentrations, close to those present in natural environment • study of interactions of microbes under conditions resembling those in aquatic environments • food and industrial microbiology 39 Kemostat • Sürekli kültür düzeneğidir. Üreme hızı ve popülasyon yoğunluğu kontrol edilir • Gerekli besinler ihtiyaç miktarında tutulur • Hedeflenen bir enzim veya proteinin üretimi 40 Çevresel Faktörlerin Üreme Üzerine Etkisi • Dört önemli etmen: – Sıcaklık – pH – Suyun varlığı – Oksijen • Çoğu organizma oldukça ılımlı çevresel şartlarda yetişir • Bazıları da sıra dışı ortamlara yaşar, diğer organizmaları öldürür 41 Sıcaklık • Kardinal Sıcaklıklar – Her organizma için; minimum, optimum ve maksimum gelişme sıcaklıkları vardır • Farklı organizmalar için farklı kardinal sıcaklıklar vardır 42 Sıcaklık Sınıflandırması • • • • 43 Psikrofil Mezoil Termofil Hipertermofil Ekstremofil Organizmalar • Çok düşük veya çok yüksek sıcaklıklarda yaşayabilen türler – Okyanuslar (5ºC), Derin denizler (1-3ºC), Kutuplar – Sürekli güneş alan yerler, Besin veya gübre depolanan silolar, sıcak su kaynakları(Yüzey veya okyanus dibi) • Psikrotolerant bakteriler – Optimum sıcaklıkları 0-20ºC olmasına rağmen 30-40ºC’ de yaşabilen 44 pH, Ozmolarite ve Oksijen • Minimum, optimum ve maksimum ifadeleri geçerlidir • pH: Bir çözeltinin asidik veya bazik oluşunu ifade eder – pH: Hidrojen iyonlarının logaritmik ifadesidir. pH’ da bir derece değişim 10 kat iyonların değiştiğini ifade eder.. – 1-------Asit----7(Nötr)--------Baz----14 45 pH • Genelde pH 5-9 aralığındadırlar • Daha düşük ve daha yüksek pH da yaşayabilenler vardır. • Funguslar, bakterilere göre aside daha töleranslıdır. pH 5’ in altında çoğu fungus yaşar • pH 2 altında ve pH 10 üzerinde birkaç mikroorganizma yaşayabilir 46 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. pH • asidofiller – Optimum pH 0 - 5.5 aralığı • nötrofiller – Optimum pH 5.5 – 7 aralığı • alkalofiller – Optimum pH 8.5 – 11.5 aralığı 47 pH: Asidofiler, Alkalifiller -Bazı organizmalar çok düşük veya çok yüksek pH ortamında yaşayabilseler de hücre içi pH nötraliteye yakındır. -Hücre içi pH 6-8 Nötrofiller denir -Tampon çözeltiler: pH’ı dengelemek için kullanılan çözeltiler 48 Su Aktivitesi ve Çözünen Maddeler • Çevredeki madde konsantrasyonundaki değişim mikrobiyal hücreleri etkiler – Hipotonik çözelti (düşük madde konsantrasyonu) • Su hücreye girer • Hücre şişer ve patlar – Hipertonik çözelti (Yüksek madde yoğunluğu) • Su hücreden ayrılır • Hücre zarı büzülür (plazmoliz) 49 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Madde Yoğunluğu Değişimlerinde Hücre Adaptasyonları • Hipotonik çözeltilerde, sitoplazmadaki hücre yoğunluğunu azaltır – Hücre zarındaki özel kanallar çözünmüş maddenin dışarı çıkışına izin verir • Hipertonik çözltilerde, çözünen maddelerle uyumlu maddelerin hücre içi yoğunluğu artırırin – Çözünen uyumlu maddeler metabolizmada kullanılır ve büyüme olur 50 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Ekstrem Adapte Mikroplar • halofiller – 0.2 M ve daha yoğun NaCl veya başka tuz çözeltilerinde üreyebilirler • Ekstrem halofiller – 2M ve 6.2M aralığında tuz çözeltisine gereksinim duyarlar – Aşırı yüksek konsantrasyonda potasyuma ihtiyaç – Hücre duvarı, proteinler ve hücre zarının aktivitesini sağlamak için yüksek tuza gereksinim duyarlar 51 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Mikrobiyal Üreme Üzerine NaCl Etkisi • halofiller – Optimal >0.2 M • ekstrem halofiller – gereklilik >2 M 52 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Oksijen Konsantrasyonu • Metabolik olaylar için gerekli enerjinin korunması, elektron taşıma sistemi (ETS) ve uç elektron tutucu olarak kullanılır 53 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Oksijen ve Bakteriyal Üreme • Aeroblar – Zorunlu Aeroblar: Oksijene ihtiyaç duyarlar(O2). Yokluğunda üreyemezler – Fakültatif aeroblar: O2 gerekli değil. Varlığında daha iyi ürerler – Mikroaerofiller: O2 gerekli, ancak atmosferik değil, daha az miktarda yeterli 54 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Oksijen ve Bakteriyal Üreme • Anaeroblar – Aerotolerantlar: O2 gerekli değil, oksijen varlığında daha yavaş ürerler. – Zorunlu anaeroblar: O2 varlığında genellikle ölürler 55 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. 56 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. a- Zorunlu aerob b- Zorunlu anaerob c- Fakültatif aerob d- Mikroaerofil e- Aerotolerant 57 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Toksik Oksijen Formları • Oksijen kolayca toksik formlara indirgenebilir – Hidrojen peroksit – Hikroksil radikalleri • Aeroblar koruyucu enzimler üretirler – Katalaz – peroksidaz 58 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Kesinlikle Zorunlu Anaerob Mikroplar • Bütün zorunlu anaerob mikroorganizmalarda hiç olmayan veya çok az bulunan; – Toksik oksijen bileşiklerini parçalayan enzimler.. Örn: katalaz gibi • Oksijeni tolere edemezler • Oksijensiz ortamda üretilebilirler – gaspak anaerobik oksijensiz inkübatör sistemi 59 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. 60 Copyright © McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Oksijensiz Kavanoz 61
