Sarımsakta (Allium sativum L.) Gen İfade Profili (mRNA) Analizi ve

Sarımsakta (Allium sativum L.) Gen İfade Profili (mRNA) Analizi
ve Çiçeklenmeyi Kontrol Eden Aday Genlerin Belirlenmesi
Proje No: 105O551
Doç.Dr. Meryem İPEK
Yrd.Doç.Dr. Ahmet İPEK
Doç.Dr. Murat ŞEKER
Özlem GÜNAYDIN
Nisan 2011
BURSA
1
ÖNSÖZ
Son yıllarda birçok bitki ve diğer canlı türlerinin genomlarının nükleotid dizilimleri ve
bu nükleotid dizilimlerdeki genleri kodlayan bölgeler belirlenmiştir. Genlerin nükleotid
dizilimleri bilinmesine rağmen birçok genin hangi karakteri kontrol ettiği ve hangi
biyokimyasal yolda, hangi gelişme döneminde görev yaptığı henüz bilinmemektedir.
Bitkilerde önemli karakterleri kodlayan genleri izole etmek ve bunların biyokimyasal yollarını
belirlemek
için
farklı
gen
ifadesi,
gen
haritalaması,
T-DNA
gibi
tekniklerden
yararlanılmaktadır. Bu proje kapsamında kullanılan cDNA-AFLP tekniği de bu amaçla
geliştirilen ve kullanılan tekniklerden biridir. Bu teknik kullanılarak sarımsakta gen ifade
profili ve çiçeklenme biyolojisi ile ilgili aday genler belirlenmeye çalışılmıştır. Bu proje
kapsamında elde edilen sonuçların bundan sonra yapılacak çalışmalara katkıda bulunması
temenni edilmektedir. Bu projeyi destekleyen TÜBİTAK-TOVAG grubu, Wisconsin
Üniversitesi-Madison, A.B.D. Bahçe Bitkileri Bölümü öğretim üyesi Prof. Dr. Philipp W.
Simon ve Uludağ Üniversitesi, Bahçe Bitkileri Bölümüne’e teşekkür ederiz.
Doç. Dr. Meryem İPEK
Proje Yürütücüsü
2
İÇİNDEKİLER
Sayfa
no
Çizelge listesi...………………….…………….…………....………………………………………..
5
Şekil listesi…..………………………............................…....……………………………................
6
Özet…………………………………………...……………………………………..………………
8
Abstract……………………………………………………………………………………………..
9
1. GİRİŞ…...……………………………………………………….....………..................................
10
2. GENEL BİLGİLER…………………………………………………………………...................
13
3. GEREÇ VE YÖNTEM………………………………………………………………………….
19
3.1. Bitki Materyali ve Yetiştirilmesi………………………………………………………
19
3.2. Toplam RNA İzolasyonu İçin Örneklerin Alınması …………………………..
20
3.3. Büyütme Kabininde Yetiştirilen Bitkilerde Yapılan Ölçümler………………………..
21
3.4. Toplam RNA İzolasyonu………………………………………………………………
23
3.5. mRNA İzolasyonu…………………………………………………………………...
24
3.6. Birinci ve İkinci Sarmal cDNA Sentezi………………………………………………..
24
3.7. cDNA-AFLP Analizleri………………………………………………………………..
25
3.7.1. cDNA’ların Restriksiyon Enzimleri ile Kesilmesi……………………….
27
3.7.2. Adaptörlerin Bağlanması…………………………………………………
27
3.7.3. Ön Seçici PCR Çoğaltması……………………………………………….
27
3.7.4. Seçici PCR Çoğaltması……………………………………………………..
28
3.7.5. PCR Ürünlerinin Poliakrilamid Jellerindeki Analizleri…………………….
29
3.8. cDNA-AFLP Bantların Poliakrilamid Jellerden Kesilmesi ve İzole edilmesi………..
30
3.9. Poliakrilamid Jelden İzole Edilmiş cDNA-AFLP Bantların Agaroz Jelden İzole
Edilmesi………………………………………………………………………………..
30
3.10. cDNA-AFLP Bantlarının Dizi Analizi İçin PCR Aşaması………………………….
31
3.11. PCR Ürünün Saflaştırılması ve DNA Dizi Analizi………………………………….
32
3.12. cDNA-AFLP DNA Dizilerin Analizi ve NCBI (National Center for Biotechnology
Information) DNA Dizi Bankasındaki Diziler ile Karşılaştırılması…………………..
32
3.13. Morfolojik Ölçümlerin İstatiksel Analizleri………………………………………….
32
4. BULGULAR
4.1. Depolama Sıcaklığı Uygulamasının Morfolojik Gelişme Üzerine Etkisi………………….
4.1.1. Yaprak sayısı…………………………………………………………………………..
33
33
38
3
4.1.2. Yalancı gövde uzunluğu ……………………………………………………………..
40
4.1.3. Yalancı gövde çapı…………………………………………………………………..
41
4.2. cDNA-AFLP Analizleri……………………………………………………………………
43
5. TARTIŞMA ve SONUÇ…………………………………………………………………………
67
6. KAYNAKLAR….…………………………..………………………….………………………...
72
4
ÇİZELGE LİSTESİ
SAYFA NO
Çizelge 3.1. 2007, 2008 ve 2009 yıllarında cDNA-AFLP analizleri için sarımsak genotiplerinin
farklı gelişme dönemlerinde yapılan örnekleme zamanları, genotiplerin gelişme aşamaları ve
örnek alınan doku tipleri……………………………………………………………………….
22
Çizelge 3.2. 2009-2010 yıllında cDNA-AFLP analizleri için sarımsak genotiplerinin farklı gelişme
dönemlerinde yapılan örnekleme zamanları, genotiplerin gelişme aşamaları ve örnek alınan
doku tipleri…………………………………………………………………………………….
23
Çizelge 3.3. cDNA-AFLP analizlerinde seçici çoğaltmada kullanılan primer kombinasyonları…..
29
Çizelge 4.1. Dikim tarihinden itibaren sarımsak dişlerinin sürme tarihleri …………………………..
33
Çizelge 4.2. Dikimden 115 ve 120 gün sonra G1, G2, G3 ve G4’te her iki sıcaklık uygulaması için
bitkiler arasındaki karşılaştırma……………………………………………………………….
37
Çizelge 4.3. Dikimden 45 gün ve dikimden 90 gün sonra 4oC’de ve 20oC’de depolanan dişlerden
elde edilen bitkilerde yaprak sayımındaki farklılıklar……………………………...................
39
Çizelge 4.4. Dikimden 45 gün sonra ve dikimden 90 gün sonra 4oC’de ve 20oC’de depolanan
dişlerden elde edilen bitkilerde yalancı gövde uzunluğundaki (cm) farklılıklar……………..
41
Çizelge 4.5. Dikimden 45 gün ve dikimden 90 gün sonra 4oC’de ve 20oC’de depolanan dişlerden
elde edilen bitkilerde yalancı gövde çapındaki (mm) farklılıklar…………………………….
42
Çizelge 4.6. Farklı gen ifadesi için cDNA-AFLP analizinde kullanılan örnekler................................
44
Çizlege 4.7. cDNA-AFLP analizinde kullanılan 39 primer kombinasyonundan elde edilen toplam
bant sayısı, polimorfik bant sayısı ve agaroz jellerden izole edilen bant sayısı………………
45
Çizelge 4.8. 2007 ve 2008 yıllarında elde edilen 31 örnek için cDNA-AFLP analizlerinde
kullanılan 19 primer kombinasyonunda sadece yaprakta, meristemde, çiçek sürgününde ve
meristem veya yaprakta bant koyuluğu farklılığı şeklinde farklı ifade olan anlamlı bantlar.
54
Çizelge 4.9. Otuz bir + 44 örnek için cDNA-AFLP analizlerinde kullanılan 20 primer
kombinasyonunda sadece yaprakta, meristemde, çiçek sürgününde, meristem veya yaprakta
bant koyuluğu farklılığı şeklinde ve iki farklı depolama sıcaklığı uygulamasında farklı ifade
olan anlamlı bantlar…………………………………………………………………………...
55
Çizelge.4.10. cDNA-AFLP analizlerinin tümünde çiçeklenme ile ilişkili bulunan 35 banda ait EST
nükleotid dizilerinin NCBI gen bankasındaki BLAST analizleri sonuçları………………….
63
Çizelge.4.11. cDNA-AFLP analizlerinin tümünde çiçeklenmeyen genotiplerin yaprak örneklerinde
farklı şekilde ifade olan yedi banda ait EST DNA dizilerinin NCBI gen bankasındaki
BLAST analizleri sonuçları…………………………………………………………………...
66
Çizelge.4.12. cDNA-AFLP analizlerinde depolama sıcaklığının gen ifadesi üzerine etkisi ile ilişkili
iki banda ait EST DNA dizilerinin NCBI gen bankasındaki BLAST analizleri sonuçları….
66
5
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil 3.1. Araştırmada kullanılan çiçeklenen ve çiçeklenmeyen iki sarımsak klonu. Üsteki resim
çiçeklenen G2 genotipi alttaki resim ise çiçeklenmeyen G4 genotipidir…………………
SAYFA NO
20
Şekil 3.2. AFLP tekniğinin önemli aşamaları (Invitrogen AFLP System I’den adapte edilmiştir)…
26
Şekil 4.1. Dikimden 23 gün sonra G3 genotipi için; 20oC'de depolanan dişler henüz sürmemişken,
4oC depolanan dişlerden elde edilen bitki iki yaprak aşamasındadır……...........................
34
Şekil 4.2. G2 (A), G3 (B) ve G4 (C) genotiplerinde her iki depolama sıcaklığı uygulaması için
görülen gelişimsel farklılıklar……………………………………………………………..
34
Şekil 4.3. G1 genotipinin 4oC ve 20oC'de depolanan dişlerinden gelişen bitkiler …………………
35
Şekil 4.4. G1 (A), G2 (B), G3 (C) ve G4 (D) genotipleri için 4oC ve 20oC depolanan dişlerden elde
edilen bitkiler arasında gelişme yönünden farklılıklar……………………………………..
35
Şekil 4.5. A) G4 genotipi, sökülen 4oC ve 20oC depolama sıcaklığı uygulanmış dişlerden gelişen
bitkiler B) 4oC depolama sıcaklığı uygulaması C) 20oC depolama sıcaklığı
uygulaması………………....................................................................................................
36
Şekil 4.6. A) G1 genotipinde her iki sıcaklık uygulaması için baş oluşumunu karşılaştırma B)
20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitki C) 4oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkide
baş oluşumu ……………………………………………………………………………….
37
Şekil 4.7. G1 (A), G2 (B), G3 (C) ve G4 (D) için 4oC (soldaki bitkiler) ve 20oC (sağdaki bitkiler)
depolanan dişlerden elde edilen bitkiler arasında kök gelişimi yönünden farklılıklar …...
38
Şekil 4.8. Dikim öncesi depolama sıcaklığına bağlı olarak, dikimden 45 gün (06 Ocak 2010) ve
dikimden 90 gün sonra (22 Şubat 2010) sarımsak genotiplerinin ürettiği yaprak
sayılarının karşılaştırılması……………………………………………………………….
Şekil 4.9. Dikim öncesi depolama sıcaklığına bağlı olarak, dikimden 45 gün (06 Ocak 2010) ve
dikimden 90 gün (22 Ocak 2010) sonra sarımsak genotiplerinde meydana gelen yalancı
gövde uzunluklarının karşılaştırılması…………………………………………………....
Şekil 4.10. Dikim öncesi depolama sıcaklığına bağlı olarak, dikimden 45 gün (06 Ocak 2010) ve
dikimden 90 gün sonra (22 Şubat 2010) sarımsak genotiplerindeki yalancı gövde
çaplarının (mm) karşılaştırılması………………………………………………………….
Şekil 4.11. XCA-MCTC ve XCT-MCTG primer kombinasyonları ile elde edilmiş cDNA-AFLP
band profilinin bantlar kesildikten sonraki görünümü……………………………………
Şekil 4.12. XTA-MCTG primer kombinasyonun poliakrilamid jelden kesilen bantların PCR
reaksiyonundan sonra agaroz jeldeki görüntüsü…………………………………………..
Şekil 4.13. BLAST analizlerine göre 629 EST dizisinin dağılımı. Soldan ikinci bar benzerlik
göstermeyen dizilerin toplamını en sağdaki bar ise toplam EST sayısını, geri kalan
barlar ise benzerlik gösteren EST dizilerinin dağılımını göstermektedir…………………
Şekil 4.14. Blast2GO programında BLAST analizinde benzer bulunan 284 sarımsak cDNA-AFLP
EST nükleotid dizilerinin en yüksek düzeyde benzerlik gösterdiği türlere göre dağılımı.
39
40
42
47
48
48
49
6
Şekil 4.15. Gen ontolojisi analizlerinde 284 EST’nin moleküler görevine göre sınıflandırılması
(her grupta beş ve üzeri sayıdaki EST içeren gruplar gösterilmiştir)……………………..
51
Şekil 4.16. Gen ontolojisi analizlerinde 284 EST’nin biyolojik sürece göre sınıflandırılması ( her
grupta beş ve üzeri sayıdaki EST içeren gruplar gösterilmiştir).
52
Şekil 4.17. Gen ontolojisi analizlerinde 284 EST’nin görev aldığı hücre organeline göre
sınıflandırılması ( her grupta beş ve üzeri sayıdaki EST içeren gruplar gösterilmiştir)…..
53
Şekil 4.18. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnekte XCT-MCA primer
kombinasyonunda G1 genotipinin yaprak örneklerinde ifade olan XCT-MCA-14 kodlu
bandın (okla işaretli bant) poliakrilamid jelindeki profili…………………………………
Şekil 4.19. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnekte XTG-MCTG
primer kombinasyonunda G2 genotipinin yaprak örneklerinde ifade olan XTG-MCTG18 kodlu bandın (okla işaretli bant) poliakrilamid jelindeki profili……………………….
Şekil 4.20. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnekte XTC-MCCG
primer kombinasyonunda G3 genotipinin yaprak örneklerinde ifade olan XTC-MCCG14 kodlu bandın (okla işaretli bant) poliakrilamid jelindeki profili………………………
Şekil 4.21. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnekte XTC-MGC primer
kombinasyonunda çiçeklenen G1 ve G2 genotiplerinin yaprak örneklerinde ortak ifade
olan XTC-MGC-17 kodlu bandın (üsteki okla işaretli) poliakrilamid jelindeki profili.
Altta okla işaretli bant sadece meristem örneklerinde ifade olan bandı göstermektedir...
56
57
57
57
Şekil 4.22. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnekte XCT-MCA primer
kombinasyonunda G3 genotipinin çiçek sürgününde farklı ifade olan XTC-MCA-45
kodlu bandın (okla işaretli bant) poliakrilamid jelindeki profili………………………….
58
Şekil 4.23. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnek ile yapılan XTCMGC primer kombinasyonunda G2 genotipinin meristem örneklerinde farklı ifade olan
XTC-MGC-13 kodlu bandın (okla işaretli bant ) poliakrilamid jelindeki profili…………
58
Şekil 4.24. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnek ile yapılan XCCMTC primer kombinasyonunda tüm genotipler yönünden sadece yaprakta ifade olan
XCC-MTC-18 kodlu bandın (okla işaretli bant ) poliakrilamid jelindeki profili…………
59
Şekil 4. 25. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnek ile yapılan XTAMGT primer kombinasyonunda tüm genotipler yönünden yaprak örneklerinde daha
fazla ifade olan XTA-MGT-18 kodlu bandın (okla işaretli bant ) poliakrilamid jelindeki
profili……………………………………………………………………………………...
59
Şekil 4. 26. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnek ile yapılan XCTMCTG primer kombinasyonunda tüm genotipler yönünden meristem örneklerinde daha
fazla ifade olan XCT-MCTG-12 kodlu bandın (okla işaretli bant ) poliakrilamid
jelindeki profili……………………………………………………………………………
59
Şekil 4.27. 4oC’de ve 20oC’de depolanan sarımsak genotiplerinde depolamaya bağlı olarak
depolama süresi sonunda alınan meristem örneklerinde farklı ifade olan gen. A, C, E ve
G 20oC’de depolanan sırasıyla G4, G3, G2 ve G1 sarımsak genotipleri. B, D, F ve H
4oC’de depolanan sırasıyla G4, G3, G2 ve G1 sarımsak genotipleridir…………………..
61
7
ÖZET
Günümüzde kültürü yapılan sarımsak klonları genelde çiçeklenmemekte çiçeklenen
sarımsak klonları ise çok az veya hiç tohum üretmemektedir. Bu nedenle sarımsak vegetatif
yollarla üretilen bir kültür bitkisidir. Sarımsakta çiçeklenme biyolojisini kontrol eden
genlerin belirlenmesi ve biyokimyasal yollarının ortaya konulması bu önemli kültür
bitkisindeki çiçeklenme problemlerinin çözülmesine katkıda bulunacaktır. Bu proje
çalışmasında, genetik olarak birbirinden farklı sarımsak genotiplerinin farklı gelişme
aşamalarında ve farklı bitki dokularında farklı şekilde ifade olan gen ifade profili ve
çiçeklenme ile ilgili aday genler cDNA-AFLP tekniği kullanılarak belirlenmiştir. Çalışmada
ayrıca, dikim öncesi sarımsak dişlerinin iki farklı sıcaklıkta (4oC ve 20oC) 12 hafta süreyle
depolanmasının gen ifadesi ve bitki gelişimi üzerine etkileri incelenmiştir. Çiçeklenen G1
ve G2 ve çiçeklenmeyen G3 ve G4 olarak adlandırılan sarımsak genotipleri materyal olarak
kullanılmıştır. Bitki örnekleri olarak dişlerin ortasındaki büyüme meristemi, yaprak, çiçek
sürgünü ve çiçek sapı dokuları kullanılmıştır. Örnek alımları başların hasadından sonra
büyüme meristemi, araziye dikimden önce büyüme meristemi, dikimden sonra bitkilerin 2-3
yaprak, 3-4 yaprak, 4-5 yaprak, 6-9 yaprak ve çiçek sapı/çiçek sürgünü görüldüğü
aşamalarda gerçekleştirilmiştir. Toplam RNA 2007 ve 2008 yıllarında arazide yetiştirilen
bitkilerden elde edilen 31 örnek ile 2009-2010 yılında depolama sıcaklığı uygulanan
dişlerin dikildiği iklim kontrollü büyütme kabinindeki bitkilerden elde edilen 44 örnekten
izole edilmiştir. Otuz dokuz primer kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilen cDNAAFLP analizlerinde genotipler arasında, farklı bitki gelişimi aşamalarında ve farklı bitki
dokularında farklı şekilde ifade olan genlere ait 629 tane EST dizisi belirlenmiştir.
Çiçeklenme ile ilişkili 35 aday gen belirlenmiş ve bunlardan 12 tanesi NCBI gen
bankasındaki genlerle benzerlik göstermiştir. Farklı depolama sıcaklığı denemesinde,
4oC’de depolanan sarımsak dişlerinin 20oC’de depolanan sarımsak dişlerine göre daha önce
sürdüğü belirlenmiştir. Ayrıca, 4oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde baş
oluşumunun ve çiçeklenmenin daha erken başladığı tespit edilmiştir. 4oC’de depolanan
sarımsak genotiplerinin dişlerinden elde edilen meristem örneklerinde ve bitki
yapraklarında 20oC’de depolananlara göre farklı ifade olan iki gen belirlenmiştir. 4oC’de
depolanan tüm sarımsak genotiplerinin dişlerinden elde edilen meristem örneklerinde farklı
ifade olan bir gen thiamin biyosentezinde görev alan ThiaminC geni ile benzerlik
göstermiştir. Bu sonuç, yüksek sıcaklıkta depolanan dişlerin geç sürmesine ve bu dişlerden
oluşan bitkilerin gelişiminin yavaş olmasına, karbonhidrat katabolizmasındaki bazı
enzimlerin kofaktörü olan thiaminin eksikliğinin neden olduğuna işaret etmektedir. Sonuç
olarak, bu projenin tamamlanması ile sarımsağın transkriptom profili cDNA-AFLP tekniği
kullanılarak ilk defa yapılmış ve çiçeklenme ile ilgili 35 aday gen belirlenmiştir. Bundan
sonraki çalışmalarda bu genlerin farklı teknikler kullanılarak doğrulanması bu genlerin
çiçeklenme ile olan ilişkisini kanıtlayacaktır.
Anahtar Sözcükler: Sarımsak, Allium sativum L, cDNA-AFLP, farklı gen ifadesi,
çiçeklenme.
8
ABSTRACT
Cultivated garlic clones usually do not produce flower stalks and the flowering garlic
clones are mainly seed sterile or produce little amount of seeds. Therefore, garlic is a
vegetatively propagated crop. Identification of genes controlling flowering in garlic and
revealing their biochemical pathways will contribute to understanding of flowering in
garlic. In this study, differentially expressed genes profile of genetically different garlic
clones at different developmental stages and plant tissues and candidate genes related with
flowering were determined using cDNA-AFLP technique. Effects of two different storage
temperatures (at 4oC and 20oC for 12 weeks) on gene expression profile and plant
development in garlic were also investigated. Flowering garlic clones called as G1 and G2
and non-flowering clones called as G3 and G4 were used as plant materials. Plant samples
were collected from apical meristem, leaf, and flower stalk and umbel tissues. Sampling
stages were apical meristem of cloves after harvest and before planting, 2-3 leaf stage, 3-4
leaf stage, 4-5 leaf stage, 6-9 leaf stage and visible flower stalk production stage. Total
RNA were extracted from 31 samples of plants in field in 2007 and 2008 growing seasons.
Total RNA were also extracted from another 44 samples of plants developed from cloves
stored at two different storage temperatures and planted in growth chamber. cDNA-AFLP
analyses were carried out using 39 primer combinations and 629 EST sequences that belong
differentially expressed genes at different developmental stages and tissues were
determined. Thirty-five flowering related candidate genes were identified and 12 of them
had significant similarity to genes at NCBI GenBank. In different storage temperature
experiment, cloves stored at 4oC sprouted faster than cloves stored at 20oC. In addition,
plants developed from cloves stored at 4oC started to form bulbs and flower earlier than the
plants developed from cloves stored at 20oC. Two differentially expressed genes determined
in apical of meristem of cloves and leaves of the plants that developed from cloves stored at
4oC but not in the cloves stored at 20oC. The gene expressed differentially in the apical
meristem of the cloves stored at 4oC had significant similarity to the gene, ThiaminC, in
thiamine biosynthesis. This result indicated that thiamin deficiency, used as a co-factor of
enzymes that have function in carbohydrates’ catabolism result in late sprouting of cloves
stored at 20oC and slow growth of plants developed from these cloves. In conclusion,
transcritom profile of garlic clones using cDNA-AFLP technique was accomplished for the
first time with completion of this project and 35 candidate genes related with flowering
were determined. Future studies on these genes using different verifications techniques will
prove their relationship with flowering.
Key Words: Garlic, Allium sativum L, cDNA-AFLP, differentially gene expression,
flowering
9
1. GİRİŞ
Sarımsak (Allium sativum L.) yüzyıllardan beri insan sağlığı açısından önemli kültür
bitkilerinden biri olmuş ve birçok hastalığın tedavisinde doğal ilaç olarak kullanılmıştır. Son
yıllarda sarımsağın anti mikrobik, antioksidan ve anti kanserojen özelliklerinin bilimsel
çalışmalarla ortaya konulmasıyla bu ürünün tüketimi artmıştır. Özellikle, Avrupa ve diğer
gelişmiş ülkelerde işlenmiş sarımsak ürünlerinin (sarımsak tabletleri, sarımsak yağı ve diğer
sarımsak özütleri) kullanımında önemli artışlar olmuştur. Sarımsağın artan talebine paralel
olarak üretimi de dünyada hızlı bir şekilde artmıştır. 1983 yılı FAO verilerine göre dünya
sarımsak üretimi yaklaşık 5 milyon ton civarında iken 2009 yılında bu rakam 16,5 milyon
tonun üzerine çıkmıştır. (www.fao.org). Türkiye sarımsak üretimi ise yaklaşık 105 bin tondur.
Sarımsak ülkemizin bütün bölgelerinde yetiştirilebilen bir sebze türüdür. Sarımsak üretiminin
yoğunlaştığı illerimiz başta Kastamonu olmak üzere Hatay, Balıkesir, Kahramanmaraş ve
Gaziantep’tir. Bu illerin toplam üretimi Türkiye üretiminin yaklaşık %54’nü oluşturmaktadır
(TÜİK, 2009).
Kültürü yapılan sarımsak genotipleri genelde çiçeklenmemekte ancak çiçeklenen
genotipler de bulunmaktadır. Çiçeklenebilen ve kültürü yapılan sarımsak klonlarında tohum
üretimi ise bulunmamaktadır. Bu nedenle geçmişten günümüze kadar sarımsak vegetatif
olarak (dişlerle) üretilmiştir. Sarımsakta klonal üretim, sarımsak klonlarının başta virüs olmak
üzere üretim materyali ile taşınabilen birçok hastalık ve zararlı ile bulaşık olmasına ve
dolayısıyla verim ve kalitenin düşmesine neden olmaktadır. Dişlerle üretim, aynı zamanda
sarımsakta üretim ve tohumluk depolama maliyetlerini de arttırmaktadır. Ülkemizde son
yıllarda nematotlarla bulaşık üretim materyalinin kullanılmasından dolayı sarımsak ekim
alanları bu zararlı ile bulaşık hale gelmiştir. Nematotla bulaşık arazilerde yapılan
yetiştiricilikte sarımsak verimi düşmekte ve zararlı daha çok yayılmaktadır. Üretim materyali
ile taşınan patojenlerle mücadelede en etkin yol temiz üretim materyali kullanmaktır. Ancak
meristem kültürü ile elde edilen temiz üretim materyali sarımsakta vegetatif üretimden dolayı
yüksek olan üretim maliyetini daha çok artırmaktadır. Tohumla üretim ise daha pratik ve
ekonomik bir çözüm olarak görünmektedir. Bu nedenle son yıllarda sarımsağın anavatanında
bulunan ve tohum üretebilen sarımsak klonlarında ıslah çalışmaları yoğunlaşmıştır. Bu tohum
üretebilen sarımsak klonlarından soğan ve pırasa türlerinde olduğu gibi tohum üretimi yeterli
düzeyde olan çeşitlerin geliştirilmesi sarımsak üretiminin daha ekonomik ve pratik olmasını
sağlayacaktır.
10
Sarımsak vegetatif olarak üretilmesine rağmen günümüzde kültürü yapılan ve gen
bankası koleksiyonlarında bulunan sarımsak klonları arasında geniş bir genetik ve morfolojik
çeşitlilik görülmektedir. Sarımsak klonlarındaki genetik çeşitlilik rastgele çoğaltılmış
polimofik DNA (RAPD), çoğaltılmış parça uzunluğu farklılığı (AFLP) ve izoenzim moleküler
markırlar kullanılarak karakterize edilmiştir (Pooler ve Simon, 1993; Maass ve Klaas, 1995;
İpek ve ark., 2003). Ancak DNA düzeyinde belirlenen genetik çeşitlilik sarımsak bitkisinde
bulanan protein ve enzimleri kodlayan genlerin DNA dizilimlerindeki farklılıklardan
kaynaklanabileceği gibi protein üretmeyen (non-coding) DNA dizilimlerindeki farklılıklardan
da kaynaklanabilir. Sarımsak genomu, içerdiği DNA miktarı açısından kültür bitkileri
arasında genomu en büyük olan bitki türlerinden biridir ve bunun nedeni olarak da daha çok
protein üretmeyen DNA dizilimlerindeki tekrarlanmalardan kaynaklandığı varsayılmaktadır.
Dolayısıyla sarımsakta elde edilen bu polimorfik markırların büyük kısmı genomdaki protein
üretmeyen DNA bölgelerinden kaynaklanmış olabilir. Ancak morfolojik olarak farklı
özelliklere sahip sarımsak genotiplerinde bu özellikleri kodlayan genler yönünden de
farklılıklar olması beklenmektedir. Bu güne kadar sarımsak genotiplerinde farklı gelişme
dönmelerinde
farklı
gerçekleştirilmemiştir.
ifade
olan
Özellikle
genlerin
çiçeklenen
belirlenmesine
yönelik
bir
çalışma
sarımsak genotiplerinde hangi
genlerin
çiçeklenmede görev aldığı konusunda çok fazla çalışma yoktur.
Bu proje kapsamında yürütülen çalışmanın amacı sarımsak genotiplerinde farklı
gelişme dönemlerinde farklı şekilde ifade olan genlerin ve bu genlerden çiçeklenme ile ilişkili
aday genlerin belirlenmesidir.
Son yıllarda Arabidopsis ve çeltik gibi bazı bitkilerin DNA dizilimleri ve ilgili genler
tam olarak
ortaya çıkarılmış,
ancak bu
genlerin
birçoğunun fonksiyonu henüz
bilinmemektedir. Bilim adamları önemli karakterleri kontrol eden genleri klonlamak ve
bunların fonksiyonlarını belirlemek için çeşitli moleküler tekniklerden faydalanmaktadırlar.
Bu tekniklerden biri de haritalama populasyonu ya da ön DNA dizilimi bilgisi gerektirmemesi
nedenleriyle çok yaygın olarak kullanılan ve pratikte uygulanabilirliği fazla olan cDNAAFLP yöntemidir. cDNA-AFLP bitkilerde farklı şekilde ifade olan genleri tespit etmede etkin
bir şekilde kullanılmaktadır (Bachem ve ark., 1996). Bu yöntemle bitkilerin değişik gelişme
dönemlerinde, farklı çevre koşullarında ya da genotipler arasında farklı şekilde ifade olan
genler belirlenmektedir. Genomunun çok büyük olması ve çok yaygın olarak genotiplerinde
kısırlık probleminin görülmesi nedenleriyle sarımsak bitkisinin genomu hakkında ayrıntılı
genetik bilgi birikimi bulunmamaktadır. Buna ek olarak sarımsağın DNA dizilimi hakkında
11
gen bankalarında fazla bilgi birikimi de yoktur. Bu nedenle sarımsakta en uygun transkript
(mRNA) profili analizi olan cDNA-AFLP tekniği kullanılmıştır. Bu yöntemle sarımsak
genotiplerinde farklı gelişme dönemlerinde farklı ifade olan genler belirlenmeye çalışılmıştır.
Farklı şekilde ifade olan genlerden bazıları çiçeklenme, depolama sıcaklığı ve yaprak veya
meristem dokusu ile ilişkili bulunmuştur.
12
2. GENEL BİLGİLER
Sarımsak Alliaceae familyası altında Allium cinsi içinde sınıflandırılmaktadır
(Takhtajan 1997). Allium cinsi içinde yaklaşık 750 tür bulunmaktadır. Bu türlerden yaklaşık
25 türün tüketimi ve yedi türünde yoğun olarak üretimi yapılmaktadır (Fritsch ve Friesen,
2002). Sarımsak, Allium türleri içinde soğandan sonra dünyada ikinci ülkemizde ise üçüncü
önemli kültür bitkisidir. Regel (1875) ve Vvedensky (1944) tarafından tanımlanan Allium
longicuspis türü sarımsağın atası olarak ileri sürülmektedir. Ancak moleküler düzeyde yapılan
bazı çalışmalar A. longicuspis ve A. sativum türlerine ait klonların aynı gruplara düştüğü ve
dolaysıyla genetik olarak aynı tür olduklarını ileri sürmektedir (Pooler ve Simon, 1993,
Maass ve Klaas, 1996, Ipek ve ark., 2003). A. longicuspis ve A. sativum türlerine ait klonlar
arasında yapılan melezlemeler başarılı olmuş ve bu iki türün karyotiplerinin çok benzer
olduğu belirlenmiştir (Simon ve Jenderek, 2002). Ülkemizde Tunceli ve yakın bölgelerinde
yetişen A. tuncelianum türünün morfolojik olarak sarımsağa benzemesi ve sarımsak özgü
kokusundan dolayı sarımsağın atası olarak ileri sürülen başka bir türdür. Bu türün ITS
(internal transcribed region) DNA bölgesi dizilerini sarımsak ve diğer Allium türleri ile
karşılaştırılmasında sarımsağa pırasalardan daha uzak bir akraba olduğu belirtilmiştir (Ipek ve
ark., 2008).
Sarımsak 2n= 16 kromozoma sahip diploid bir bitkidir. Genom büyüklüğü 3 x 1010 baz
çifti (30 milyar baz çifti)’dir. Sarımsağın bu büyük genomu ve tohum üretmemesi genetik ve
moleküler çalışmaları sınırlamıştır. Sarımsak, içerdiği DNA miktarı açısından kültür bitkileri
arasında genomu en büyük olan türlerden biridir. Buna neden olarak da daha çok protein
üretmeyen DNA dizilimlerindeki tekrarlanmalar gösterilmektedir (İpek ve ark., 2005a).
Sarımsağın anavatanı Tien-Shan dağlarının batısı, Özbekistan, Tacikistan, ve
Afganistanı içine alan orta Asya olarak kabul edilmektedir. Bu bölgede doğada kendiliğinden
yetişen
sarımsak
formları
bulunmakta
ve
bunlar
doğadan
toplanarak
tüketimde
kullanılmaktadır. İkinci derecede gen merkezi ise Anadolu’yu kapsayan Akdeniz bölgesi
kabul görmektedir (Vavilov ve Dorofeyev, 1935). Sarımsağın, anavatanı orta Asya’dan
doğuda Çin’e, güneyde Hindistana ve batıda Anadolu’ya ve Mısır’a daha sonrada Avrupa’ya
yayıldığı düşünülmektedir (England, 1991). Tarihte Orta Asya’da göçebe hayatı yaşayan
insanların sarımsağı doğadan toplayıp ve yerleştikleri yerlere götürüp yetiştirdikleri
sanılmaktadır. Sarımsağın kültüre alınması oldukça uzun geçmişe dayanmaktadır. Bu konuda
en eski deliller milattan önce 3750 yılına ait Mısır mezarlarında bulunan kilden yapılmış
13
sarımsak başı benzeri kalıntılar (Woodward, 1996) ve milattan önce 1500 yılına ait sarımsak
başları kalıntılarıdır (Mathew, 1996).
Sarımsak baş bağlama ve çiçeklenme yönünden uzun gün bitkisi olup ılıman ve
subtropik iklim kuşaklarında sorunsuz yetişir. Optimum gelişme sıcaklığı 15-25°C ve nem %
60-80 civarındadır (Vural ve ark., 2000). Sıcaklık 25oC'yi geçtiğinde ise gelişme yavaşlar ve
baş oluşumu olumsuz yönde etkilenir. Kısa gün koşullarında vegetatif aksam gelişimi artar ve
baş oluşumu geç olur.
Sarımsak uzun yıllardan beri zorunlu apomiktik (sadece vegetatif yollarla çoğalan) bir
bitki türü olarak tanımlanmıştır (Koul ve ark., 1979). Sarımsak ıslahı da daha çok doğadaki
mevcut klonların adaptasyonu ve bunların klonal seleksiyonla geliştirilmesi ile yapılmıştır.
Ancak, son yıllarda sarımsağın anavatanı olarak kabul edilen orta Asya’da verimli (tohum
üreten) sarımsak tipleri bulunmuş ve bunlar Avrupa, Asya ve Amerika Birleşik
Devletleri’ndeki koleksiyonlara getirilerek koruma altına alınmıştır. Bu klonların bulunması
ile sarımsakta melezleme ıslahına ve genetik çalışmalara ağırlık verilmeye başlanmıştır (Etoh
ve Simon, 2002; Simon ve Jenderek, 2003; İpek ve ark., 2005b). Melezleme ıslahı ile
biyotik ve abiyotik streslere dayanıklı, kalite ve verimi yüksek yeni sarımsak klonları ve hibrit
çeşitlerinin yakın gelecekte geliştirilmesi beklenmektedir. Zira başka bir Allium türü olan ve
ekonomik bir değere sahip olan soğanda (A. cepa L.) hibrit tohum başarılı bir şekilde
üretilmekte ve kullanılmaktadır.
Sarımsak klonları çiçeklenme özelliğine göre genellikle iki gruba ayrılmaktadır: ‘çiçek
sapı üretenler’ (bolting/hardneck) ve ‘çiçek sapı üretmeyenler’ (non-bolting/softneck) (Jones
ve Mann, 1963). Çiçek sapı üreten sarımsak klonları, (sapa kalkan/düzenli çiçeklenen) uygun
ekolojik koşullar sağlandığında güçlü bir çiçek sapı oluşturmaktadır. Çiçeklenme için üretim
materyali olan dişlerin belli bir süre soğuklama ihtiyacının karşılanması gerekir. Gerekli iklim
koşulları sağlandığında dişten gelişen bitkilerde aynı yıl içinde çiçeklenme görülür.
Tohumdan gelişen bitkilerde ise genelde ilk yıl baş gelişimi ve ikinci yıl ise çiçek gelişimi
görülür. Dikimin geç yapıldığı ve soğuklama ihtiyacının karşılanamadığı durumlarda
çiçeklenme görülmemekte veya zayıf bir çiçek sapı gelişimi olmaktadır. Çiçek sapı
oluşturmayan sarımsak klonlarında (sapa kalkmayan/çiçeklenmeyen) ise ekolojik koşullar
sağlansa bile genelde çiçeklenme görülmemekte veya nadiren görülmektedir.
Çiçeklenen genotiplerde her bitki bir tane çiçek sapı ve çiçek sürgünü meydana getirir.
Sarımsakta çiçek sürgünü diğer Allium türlerinde olduğu gibi şemsiye çiçek yapısındadır.
14
Başlangıçta çiçek sürgünündeki çiçekler bir zar içindedir. Çiçeklenmenin ilerlemesiyle bu zar
yırtılarak çiçekler görülür. Çiçek sapı üzerinde genotipe bağlı 10-200 tane çiçek meydana
gelebilir. Bir çiçekte altı çanak yaprak, altı taç yaprak, altı erkek organ ve üç karpelli bir dişi
organ bulunur. Çiçekler pembe veya açık mor renklidir. Çiçeklerde yabancı döllenme
hakimdir ve döllenme arı, sinek ve diğer böceklerle gerçekleşmektedir. Çiçek sürgününde
diğer Allium türlerinden farklı olarak çiçeklerin arasında vegetatif küçük dişlerde meydana
gelmektedir. Çiçek sürgünü gelişmesi sırasında çiçek taslakları arasındaki bazı hücreler çiçek
taslakları yerine vegetatif dişlere farklılaşmaktadır. Gelişen bu dişlerin sayısı ve büyüklüğü
yönünden genotipler arasında büyük farklılıklar vardır. Çiçek sürgününde meydan gelen bu
dişler çiçeklerin besin maddelerine ortak olarak onların gelişmesini engellemekte ve
sarımsakta meydana gelen kısırlık nedenlerinden biri olarak düşünülmektedir. Nitekim bu
dişlerin çiçek sürgünü gelişiminin ilk aşamalarında uzaklaştırılmasıyla bazı sarımsak
tiplerinde tohum üretiminin arttığı görülmüştür (İpek, 2008). Bu çiçeklenen klonlar içinde
tohum üretimi açısından da geniş bir çeşitlilik bulunmaktadır. Bazı araştırıcılar üçüncü bir
grubu sınıflandırmaya dâhil etmektedir (Takagi, 1990). Düzenli olarak çiçeklenmemesi ve
ekolojik koşullara bağlı olarak klon içinde çiçek sapı üretimi ve uzunluğunda bir varyasyon
göstermesi nedeniyle bu üçüncü gruptaki klonlar ‘kısmen çiçeklenen’ klonlar olarak
tanımlanmıştır. Morfolojik olarak ‘kısmen çiçeklenen’ klonları bazen düzenli çiçek sapı
üreten klonlardan ayırt etmek mümkün olamamaktadır. Ancak moleküler markırlar
kullanılarak genetik olarak birbirlerinden kolayca ayırt edilmekte ve genetik olarak
çiçeklenmeyen klonlara daha yakın olduğu görülmektedir (İpek ve ark., 2003, İpek, 2003).
İpek ve ark., (2003) 48 sarımsak klonunda genetik çeşitliliği, AFLP, RAPD ve
izoenzim markırlar kullanarak karakterize etmişler ve her bir markır sistemiyle elde edilen
dendrogramları karşılaştırmışlardır. Sarımsak klonlarında oldukça fazla ve polimorfik
düzeyde bulunan AFLP markırlarının sarımsak klonlarının detaylı ve doğru olarak karakterize
edilmesinde diğer markır sistemlerine göre daha etkili bir markır tekniği olduğunu
bildirmişlerdir. Araştırmacılar AFLP analizi sonucu 48 sarımsak klonunu %60 benzerlik
düzeyinde 10 genetik gruba ayırmış ve çiçeklenen ve çiçeklenmeyen sarımsak klonlarının
genetik olarak belirgin bir şekilde farklı gruplara düştüklerini belirlemişlerdir.
Bazı çiçeklenen genotiplerde morfolojik olarak çiçekler tam gelişmesine rağmen
tohum üretimi ya çok düşük düzeyde (1-50 adet) veya hiç bulunmamaktadır. Çiçekler
incelendiğinde anterlerde mikrosprogenesin gerçekleştiği ancak mikrosporların tetrat
15
aşamasında veya daha sonraki aşamalarda dejenere oldukları görülmektedir (Simon and
Jenderek, 2003). Çiçeklerde oluşan vegetatif dişlerin sarımsakta görülen kısırlığın sonucumu
yoksa kısırlığın bir sebebimi olduğu konusunda kesin bir görüş bulunmamaktadır. Bazı
genotiplerde çiçeklenme sırasında bu dişlerin uzaklaştırılması ile tohum üretimi artarken
bazılarında tohum miktarına etkisinin olmadığı belirtilmiştir (İpek, 2008).
Shemesh ve ark., (2008) çeşitlilik gösteren bir sarımsak popülasyonu içindeki
olgunlaşmış başları dikim öncesi 4oC veya 20oC’de depolamıştır. Bu başlar depolamadan
sonra aynı iklim koşullarında yetiştirilmişlerdir. Filizlenme, dikimden 7-14 gün sonra
gerçekleşmiştir ve bir yaprağın oluşması için geçen zamanı 8-9 gün olarak belirlemişlerdir.
Depolama uygulamasının filizlenme zamanı, yaprak büyüme oranı ve dikimden sonra ikincil
büyümenin ilk gözlendiği zaman üzerinde farklı bir etkisinin olmadığını; fakat baş oluşturma
ve yanal tomurcukların ikincil filizlenmelerinin depolama sıcaklığı ile yakından ilgili
olduğunu tespit etmişlerdir. 4oC’de depolananlarda yaklaşık on beşinci yaprak aşamasından
sonra; 20oC’de depolananlarda ise yaklaşık yirmi ikinci yaprak aşamasından sonra baş
oluşumunu gözlemlemişlerdir. Ayrıca büyümekte olan bitkilerin vejetatif aşamadan generatif
aşamaya geçişleri dikim öncesi depolama sıcaklıklarından etkilendiğini saptamışlardır.
4°C’de depolanan başların %60’ında, 20°C’de depolanan başların ise %7’sinde çiçek sapı
oluşumu gözlenmiştir.
Kamenetsky ve Rabinowitch (2001) sarımsak klonlarının vegetatif ve çiçeklenme
aşamalarındaki değişimleri elektron mikroskop (SEM) ile incelemişler ve apikal meristemin
vegetatif gelişim evresinden generatif gelişim evresine sarımsak klonları 6-7 yaprak
aşamasındayken olduğunu gözlemlemişlerdir. Bu geçiş sırasında diğer Allium türlerinin
aksine çiçek taslakları farklılaşmadan önce çiçek sapı oluşumu gerçekleşmektedir.
Kamenetsky ve ark. (2004) yaptıkları diğer bir çalışmada ise, gün uzunluğunun çiçek
sürgünü ucunda hem çiçeklerin hem de dişciklerin (topset ya da bulbil) oluşmasına ve
gelişmesine etkisinin fazla oluğunu belirtmişlerdir. Yazarlar vegetatif meristemin düşük
sıcaklıkta generatif meristeme dönüştüğünü ve uzun günde de çiçek sapının uzadığını
gözlemlemişlerdir. Çiçek sürgününde çiçeklerin farklılaşabilmesi için ise kısa güne ihtiyaçları
olduğunu vurgulamışlardır.
Rotem ve ark. (2007) birisi kısmen çiçeklenip tohum üretmeyen ve diğeri normal
çiçeklenip tohum üreten iki farklı sarımsak genotipinde yaptıkları bir çalışmada düşük
sıcaklığın apikal meristemin farklılaşmasını ve çiçek sapı uzamasını teşvik ettiğini fakat çiçek
16
sürgününün morfolojisi üzerine bir etkisinin olmadığını bildirmişlerdir. Araştırıcılar aynı
çalışmada sarımsakta LEAFY/FLO benzeri sarımsak gaLFY genini belirlemişlerdir. Bu genin
uzun ve kısa olmak üzere iki farklı mRNA’sını olduğunu ve kısa mRNA’nın her iki sarımsak
genotipinin tüm aşamalarında ifade olurken uzun mRNA’nın sadece normal çiçeklenen
genotipte çiçeklenme sırasında ifade olduğunu saptamışlardır. Araştırıcılar sarımsakta
çiçeklenme yönünden görülen bu farklılığın mRNA olgunlaşması sırasında meydana gelen
alternatif modifikasyonların (alternative splicing) etkinliği ile ilişkili olabileceğini ileri
sürmektedirler.
cDNA-AFLP tekniği Bachem ve ark. (1996) tarafından geliştirilmiştir. Bu tekniği
kullanarak patateste yumru gelişimi dönemindeki transkript profilini analiz etmişler ve iki gen
belirlemişlerdir. Genlerden birinin patates depo proteini olan ‘patatini’ kodladığı diğer genin
ise nişasta biyosentezinde önemli bir enzim olan ADP-glucose pyrophosphorylase olduğu
tespit edilmiştir. cDNA-AFLP ile elde edilen gen ifade profilinin klasik ‘Northern Blot’
analizi ile karşılaştırıldığında benzer sonuçlar verdiği belirlenmiştir. Bu bildiriden sonra
yöntemin kullanılmasıyla bitkilerde ve diğer canlılarda önemli karakterleri kontrol eden
genlerin ve önemli biyosentezlerde rol alan birçok enzimin ifade analizi yapılmıştır.
Cnudde ve ark. (2003) cDNA-AFLP transkript profili yöntemi ile Petunia hybrida
bitkisinin çiçek gelişiminde ifade olan genleri analiz etmişlerdir. Çiçek organları beş farklı
gelişim aşamasında analiz edilmiş ve gen ifade profilleri karşılaştırılmıştır. Bu şekilde
anterlerdeki mikrosporogenesis ve yumurtalıktaki makrosporogenesis gelişimleri sırasında
ifade olan genleri belirlemeye çalışmışlardır. Barcaccia ve ark. (2001) ise cDNA-AFLP
transkript analizi tekniğini kullanılarak yonca (Medicago sativa L.) bitkisinin 2n yumurta
oluşturan apomayotik mutant genotiplerinde apomayosiste etkili olan aday genleri
belirlemişler ve klonlamışlardır. Normal ve mutant bitkilerde farklı şekilde ifade olan βtubulin geni ile Mob1-benzeri geni hücre bölünmesindeki olası fonksiyonlarından dolayı
apomiksiste rol oynayan aday genler olarak tespit edilmiştir. Breyne ve ark (2002) tütün
bitkisinde hücre bölünmesinin değişik aşamalarında aktif olan 1340 geni cDNA-AFLP
transkriptom analiziyle belirlemeyi başarmışlardır. Son yıllarda cDNA-AFLP yönteminin
diğer bir uygulama alanı ise bu teknikle elde edilen polimorfik transkriptom markırların
haritalama populasyonlarında genlerin doğrudan haritalanması amacıyla da kullanılmasıdır
(Brugmans ve ark., 2002).
17
Shindo ve Sasakuma (2002) farklılık gösterim tekniği ile ekmeklik buğdayda,
genotipe özgü olan vernalizasyonla ilişkili gen anlatımını araştırmışlardır. Bitki materyali
olarak bir yazlık, bir de kışlık ekmeklik buğday hattı kullanmışlardır. Değişik gelişim
dönemlerindeki farklı süreli vernalizasyon uygulamalarından sonra, farklılık gösterim
tekniğinden yararlanarak yüz on cDNA parçası izole etmişlerdir. Yedi tane genin
vernalizasyonla ilişkili olarak anlatım yaptığını ve bu genlerin genotipe özgü olduğunu
bildirmişlerdir. Ayrıca yaptıkları istatistiksel analiz sonucunda, çalışılan iki buğday hattında
dört genin de başaklanma faktörüyle önemli ölçüde ilişkili olduğunu belirtmişlerdir.
Bu projede, farklı sarımsak genotiplerinin belirli gelişme dönemlerinde ifade olan gen
profillerinin cDNA-AFLP tekniğini kullanılarak belirlenmesi ve elde edilen gen profillerinde
çiçeklenen ve çiçeklenmeyen sarımsak klonları arasında farklı şekilde ifade olan aday
genlerin belirlenmesi amaçlanmıştır. Son yıllarda bitkilerde farklı gelişme dönemlerinde ve
çevre koşullarında ifade olan genlerin başarılı bir şekilde analiz edilmesini sağlayan cDNAAFLP tekniği sarımsakta ilk kez kullanılarak sarımsakta farklı ifade olan genlerin analiz
edilmesi sarımsakta gerçekleştirilmiştir.
18
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1 Bitki Materyali ve Yetiştirilmesi
Araştırmada, İpek ve ark. (2003) tarafından yapılan çalışmada genetik olarak
birbirinden farklı olduğu belirlenen dört adet sarımsak klonu materyal olarak kullanılmıştır.
Sarımsak genotipleri Pulman Batı Bölgesel Bitki Gen Bankası (WRPIS-Western Regional
Plant Introduction Station, Washington, ABD)’ndan sağlanmıştır. Klonlar çiçeklenme
özelliğine göre seçilmiştir. Bu klonların çiçeklenme özellikleri 6 yıl süreyle gözlemlenmiştir.
iki klon (G1 ve G2 genotipleri) uygun cevre koşularında düzenli olarak çiçek sapı
oluştururken 2 klon (G3 ve G4 genotipleri) çiçek sapı oluşturmamaktadır. Şekil 3.1
çiçeklenen ve çiçeklenmeyen sarımsak tiplerine örnek verilmiştir. Sarımsak genotipleri 2007,
2008 ve 2009 yıllarında Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Uygulama ve Araştırma
Arazisinde bitki örneği için yetiştirilmiştir. Sarımsak genotiplerinin yıllar itibariyle araziye
dikim tarihleri 2007 yılı için 02 Aralık 2006, 2008 yılı için 05 Aralık 2007 ve 2009 yılı için
05 Aralık 2008’dir. Her üç yılda da genotiplere ait başlar hasattan dikime kadar düşük
sıcaklıklarda muhafaza edilmiştir. Ayrıca dikimin Aralık ayında gerçekleştirilmesiyle iyi bir
gelişme ve çiçeklenme için gerekli olan soğuklama ihtiyacının karşılanması sağlanmıştır.
Arazide yetiştirme süresince gerekli kültürel ve bakım işlemleri yapılmıştır. Yetiştirme
poriyodu sonunda başlar bir sonraki yılın materyali için hasat edilerek düşük sıcaklıkta
muhafaza edilmiştir.
Ayrıca çiçeklenen (G1 ve G2 genotipleri) ve çiçeklenmeyen (G3 ve G4 genotipleri)
sarımsak genotipleri 2009-2010 yıllarında ışık, sıcaklık ve nem kontrollü büyütme kabininde
depolama sıcaklığının bitki gelişimi, çiçeklenme ve gen ifadesi üzerine etkilerini belirlemek
amacıyla yetiştirilmiştir. Çalışmanın bu aşaması için sarımsak genotiplerine ait başlar 4oC ve
20oC sıcaklıklarda on iki hafta süre ile depolanmıştır. Depolamadan sonra her iki uygulamaya
ait dişler elenmiş bahçe toprağı, kaba kum ve torf karışımı harç (2:1:1) ile doldurulmuş olan
16x13 cm çapındaki dezenfekte edilmiş saksılara, her saksıda üç bitki olacak şekilde üç
tekerrürlü olarak 23.11.2009 tarihinde dikilmiştir. Dikim yapılan saksılar 8oC gece/19oC
gündüz sıcaklığı, 10 saat ışıklanma (150 μmol m-2S-1) ve %65 nem içeren büyütme kabinine
(Sanyo Electric Co Ltd. Japan) yerleştirilmiştir. Dikimden altmış gün sonra, bitkilerin
generatif döneme geçmelerini teşvik etmek için büyütme kabininde uzun gün programına
geçilmiştir. Uzun gün programındaki bitki büyütme kabininin koşulları 16 saat aydınlık/8 saat
karanlık; 20oC gündüz/10,5oC gece sıcaklığıdır. Nem ise %65 oransal nemde sabit
tutulmuştur. İklim dolabının sıcaklık değerleri ayrıca minimum-maksimum termometre ile
19
kontrol edilmiştir. Bitkiler düzenli olarak sulanmış ve gerektiğinde Actagro Seven (7:7:7)
(Actagro LLC, Biola, CA, USA) ticari gübresi verilmiştir.
Şekil 3.1. Araştırmada kullanılan çiçeklenen ve çiçeklenmeyen iki sarımsak klonu. Üsteki
resim çiçeklenen G2 genotipi alttaki resim ise çiçeklenmeyen G4 genotipidir.
3.2 Toplam RNA İzolasyonu İçin Örneklerin Alınması
2007, 2008 ve 2009 yıllarında araziye dikilen bitkilerden alınan örneklerin alım
tarihleri, genotiplerin gelişme aşamaları ve örnek alınan doku tipleri Çizelge 3.1’de
özetlenmiştir. Örnekler yaprak, büyüme meristemi, çiçek sapı ve çiçek sürgünü olmak üzere
dört farklı dokudan alınmıştır. Örnek alımları başların düşük sıcaklıkta depolanmasından önce
büyüme meristemi, depolamadan sonra büyüme meristemi, dikimden sonra bitkilerin 2-3
yaprak, 3-4 yaprak, 4-5 yaprak, 6-9 yaprak ve çiçek sapı/çiçek sürgünü görüldüğü aşamalarda
gerçekleştirilmiştir. Düşük sıcaklık depolaması öncesi ve depolamadan hemen sonraki
büyüme meristemi için dişlerin depo yaprakları kesilerek uzaklaştırılmış ve en ortadaki
vegetatif tomurcuk alınmıştır. Bitkiler vegetatif gelişme aşamasında iken büyüme meristemi
örneği için bitkiler araziden sökülerek buz içinde taşınmış ve laboratuvarda kökler yıkanarak
temizlendikten sonra yaprak kınlarının en ortadaki büyüme tomurcuğu alınmıştır. Sökülen bu
20
bitkilerden ayrıca yaprak örnekleri de alınmıştır. Bitkiler çiçeklenmeye başladığı aşamalarda
ise çiçeklenen genotiplerde büyüme meristemi çiçek sapına farklılaştığı için bu bitkilerde
yaprak örnekleri ile birlikte büyüme meristemi örnekleri yerine çiçek sapı ve çiçek sürgünü
örnekleri alınmıştır. Çiçeklenmeyen genotiplerde ise bütün aşamalarda yaprak ve büyüme
meristemi örnekleri alınmıştır. Bu şekilde mRNA profili analizleri için arazide yetiştirilen
sarımsak klonlarından 4 defa 2007 yılı büyüme periyodu, 2 defa 2007 yılı hasadından sonra, 4
defa 2008 yılı büyüme periyodunda, 2 defa 2008 yılı hasadından sonra ve 5 defa 2009 yılı
olmak üzere toplam 17 farklı gelişme aşamasında örnekleme yapılmıştır. Bitki örnekleri
alındıktan sonra sıvı azot veya buz içinde taşınmış ve laboratuvarda -80oC’de toplam RNA
izolasyonu yapılıncaya kadar muhafaza edilmiştir.
Depolama sıcaklılığının bitki gelişmesi, çiçeklenme ve gen ifadesi üzerine etkilerini
belirmek amacıyla 2009-2010 yılında yapılan denemedeki örneklerin alım tarihleri,
genotiplerin gelişme aşamaları ve örnek alınan doku tipleri Çizelge 3.2’de özetlenmiştir. Bu
denemede sarımsak genotiplerine ait başlardan 4oC ve 20oC sıcaklıklarda depolamadan önce
büyüme meristemleri yukarıda belirtildiği gibi alınmıştır. Depolamadan sonra fakat dikimden
önce bir kez daha dişlerden büyüme meristemi örneği alınmıştır. Dişler saksılara dikildikten
sonra ilk örnekler bitkiler 3-4 yaprak aşamasında ve ikinci örnekler bitkiler 6-9 yaprak
aşamasında iken alınmıştır. Bu şekilde toplam 4 farklı aşamadan örnek elde edilmiştir.
Yaprak, büyüme meristemi, çiçek sürgünü ve çiçek sapı örnekleri yine yukarıda belirtildiği
gibi alınmıştır. Ancak bitkiler örneklemeden önce yalancı gövde boyu, yaprak sayısı ve diğer
morfolojik özelliklere ait veriler kaydedilmiştir.
3.3 Büyütme Kabininde Yetiştirilen Bitkilerde Yapılan Ölçümler
Sarımsak dişlerinin dikimden önce düşük sıcaklıkta depolanmasının dikimden sonraki
sarımsak bitkisinin gelişimi üzerine etkisini tespit etmek için, dikimden 45 gün sonra
(06.01.2010) her bitkinin yaprak sayısı, yalancı gövde boyu (cm) ve yalancı gövde çapı (mm)
değerleri belirlenmiştir. Dikimden 90 gün sonra (26.02.2010) tekrar aynı ölçümler yapılmıştır.
21
Çizelge 3.1. 2007, 2008 ve 2009 yıllarında cDNA-AFLP analizleri için sarımsak
genotiplerinin farklı gelişme dönemlerinde yapılan örnekleme zamanları, genotiplerin gelişme
aşamaları ve örnek alınan doku tipleri.
Örnekleme Örnekleme Genotiplerin Gelişme
numarası
tarihi
Aşaması
1
10.03. 2007 Bitkiler 2-3 yaprak
aşamasında
2
04.04.2007 Bitkiler 3-4 yaprak
aşamasında
3
20.04.2007 Bitkiler 4-5 yaprak
aşamasında
4
13.05.2007 Çiçeklenen genotiplerde
çiçek sapının görüldüğü
aşamada
5
15.09.2007 Depolamadan önce
6
04.12.2007
Depolama sonunda
dikimden hemen önce
7
12.03.2008
8
28.03.2008
9
17.04.2008
10
12.05.2008
11
22.05.2008
12
15.09.2008
Bitkiler 3 yaprak
aşamasında
Bitkiler 4 yaprak
aşamasında
Bitkiler 5 yaprak
aşamasında yaprak
örneği
Çiçeklenen genotiplerde
çiçek sapının görüldüğü
aşamada
Çiçeklenen genotiplerde
çiçek sapının görüldüğü
aşamada
Depolamadan önce
13
01.03.12.20 Depolama sonunda
08
dikimden hemen önce
14
17.03.2009
15
10.04.2009
16
15.05.2009
17
06.06.2009
Bitkiler 3-4 yaprak
aşamasında
Bitkiler 4-5 yaprak
aşamasında
Bitkiler 6-9 yaprak
aşamasında
Bitkiler 6-9 yaprak
aşamasında
Örnek Alınan Doku
Yaprak
Yaprak
Yaprak
Yaprak
Çiçek sapı üreten ve üretmeyen
genotiplerin başlarından elde edilen
dişlerin ortasındaki büyüme meristemi
Çiçek sapı üreten ve üretmeyen
genotiplerin başlarından elde edilen
dişlerin ortasındaki büyüme meristemi
Yaprak
Yaprak
Yaprak
Yaprak
Çiçek sürgünü
Çiçek sapı üreten ve üretmeyen
genotiplerin başlarından elde edilen
dişlerin ortasındaki büyüme meristemi
Çiçek sapı üreten ve üretmeyen
genotiplerin başlarından elde edilen
dişlerin ortasındaki büyüme meristemi
Yaprak
Yaprak ve büyüme meristemi
Yaprak, büyüme meristemi, çiçek
sürgünü ve çiçek sapı
Yaprak, çiçek sürgünü ve çiçek sapı
22
Çizelge 3.2. 2009-2010 yılında cDNA-AFLP analizleri için sarımsak genotiplerinin farklı
gelişme dönemlerinde yapılan örnekleme zamanları, genotiplerin gelişme aşamaları ve örnek
alınan doku tipleri.
Örnekleme
No
1
Örnekleme
tarihi
4.08.2009
Genotiplerin Gelişme
Aşaması
Oda sıcaklığı ve düşük
sıcaklık depolamasından
önce
2
24.11.2009
Depolama sonunda
dikimden hemen önce
3
08.01.201018.01.2010
19.03.201026.03.2010
Bitkiler 3-4 yaprak
aşamasında
Bitkiler 7-9 yaprak
aşamasında
4
Örnek Alınan Doku
Çiçek sapı üreten ve üretmeyen
genotiplerin başlarından elde edilen
dişlerin ortasındaki büyüme
meristemi
Oda sıcaklığı ve düşük sıcaklık
depolaması uygulamasındaki çiçek
sapı üreten ve üretmeyen sarımsak
genotiplerin başlarında ki dişlerin
büyüme meristemi
Yaprak ve büyüme meristemi
Yaprak, meristem, çiçek sürgünü ve
çiçek sapı
3.4. Toplam RNA İzolasyonu
Farklı gelişme dönemlerinde alınan yaprak, meristem, çiçek sapı, çiçek sürgünü
örnekleri toplam RNA izolasyonu yapılıncaya kadar -80 ºC’de saklanmışlardır. Elde edilen
toplam RNA’dan ise cDNA-AFLP yönteminde kalıp molekül olarak kullanılacak olan cDNA
eldesi için mRNA izolasyonu yapılmıştır. RNA moleküllerinin ribonükleaz (RNaz) enzimi
tarafından parçalanmasını engellemek için denemede kullanılan bütün plastik ve cam
malzemeler RNaz aktivitesini engelleyen % 0.1 oranında dietilpirokarbonat (DEPC) (Sigma)
eklenmiş ve otoklav edilmiş saf su ile muamele edilmiştir. RNA izolasyonu, Trizol kimyasalı
(Invitrogen, Carlsbad, A.B.D.) kullanılarak üretici firmanın tanımladığı yönteme göre
yapılmıştır. Yönteme göre -80oC de saklanan 150-200 mg örnekler havanlar içindeki 1.250 ml
TRIZOL içerisinde öğütüldükten sonra RNase ve DNase içermeyen steril 2 ml mikrosantrifüj
tüplerine aktarılmıştır. Oda sıcaklığında 10 dakika bekletildikten sonra üzerine 0,75 ml
kloroform eklenmiş ve iyice karıştırılmışlardır. Yine oda sıcaklığında 10 dakika bekletildikten
sonra 12.000 g ile 4oC de 15 dakika santrifüj edilmişlerdir. Santrifüjden sonra en üstteki
renksiz faz yeni RNase ve DNase içermeyen steril 2ml mikrosantrifüj tüplerine
aktarılmışlardır. RNA’ların çökeltilmesi için tüplere 1 ml isopropil alkol eklenmiş ve oda
sıcaklığında 10 dakika bekletilmişlerdir. Çöken RNA örnekleri 12.000 g ile 10 dakika süre ile
4oC’de santrifüj edilmiştir. Üstteki sıvı kısım dökülmüş fakat çökeltinin kayıp edilmemesine
dikkat edilmiştir. Yıkamak için çökelti üzerine 1 ml %75 oranındaki alkol eklenmiş ve vortex
23
kullanılarak karıştırılmıştır. Örnekler daha sonra 7.500 g ile 4oC’de 5 dakika süre ile santrifüj
edilmişlerdir. Sıvı kısım döküldükten sonra örnekler kısa bir süre kurutulmuş ve RNA’lar 500
ul RNAse içermeyen saf su içerisinde çözülmüşlerdir. Çözelti içerisindeki RNA
konsantrasyonu florometre ile ölçülmüştür.
3.5. mRNA İzolasyonu
Toplam RNA dan mRNA izolasyonu PolyA Tract mRNA Isolation System kiti
(Promega, WI, A.B.D.) kullanılarak üretici firmanın tanımladığı yönteme göre yapılmıştır. Bu
yönteme göre 2.0 ml mikrosantrifüj tüpü içerisindeki 500 µl toplam RNA 56oC 10 dakika
tutulduktan sonra içerisine 3 µl Biotinylated-Oligo(dT) probu ve 13 µl 20X SSC eklenip
karıştırılmış ve oda sıcaklığında 10 dakika soğumaya bırakılmıştır. Bu işlemden sonra
içerisinde 100 µl SA-SMP bulunan 1.5 ml tüplere aktarılmış ve her 1-2 dakika da bir
karıştırılarak 10 dakika oda sıcaklığında tutulmuştur. SA-SMP mıknatısla tutulduktan sonra
sıvı kısım pipet yardımı ile boşaltılmış ve 300 µl 0.1x SSC ile 4 defa yıkanmıştır. Yıkamadan
sonra mıknatısla tutulan SA-SMP mRNA komplekslerinin üzerine 100 µl RNAse içermeyen
saf su eklenmiştir. Bu işlemle mRNA’lar SA-SMP ayrılıp su içerisinde çözülmesi
sağlanmıştır. SA-SMP’ler mıknatısla tutulmuş mRNA’ları içeren 100 µl su yeni 1.5 ml
tüplere aktarılmıştır. SA-SMP tüpleri üzerine tekrar 150 µl RNAse içermeyen saf su
eklenmiştir. SA-SMPler tekrar mıknatısla tutulmuş kalan mRNA’ları içeren 150 µl daha önce
elde edilen 100 µl mRNA örnekleri üzerine eklemiştir. Böylece her örnekten 250 µl mRNA
elde edilmiştir. Örneklerin mRNA konsantrasyonları florometre ile belirlenmiştir.
3.6. Birinci ve İkinci Sarmal cDNA Sentezi
Birinci ve ikinci sarmal cDNA sentezi RevertAidTM H minus First Strand cDNA
Synthesis Kiti (Fermentas) kullanılarak üretici firmanın tanımladığı yönteme göre yapılmıştır.
Bu yönteme göre 10 μl mRNA ile 1μl oligo(dT)18 primer (0,5μg/μl) buz üzerinde pipetle
karıştırılarak hazırlanmıştır. Pipetle karıştırılmış reaksiyonları toplamak için 3-5 saniye
santrifüj edilmişlerdir. Reaksiyonlar 70°C’de 5 dakika bekletildikten sonra buz üzerinde
soğutulmuştur. Damlaları toplamak için yine 3–5 saniye santrifüj edildikten sonra tekrar buz
üzerine konulmuştur. Hazırlanan karışım üzerine sırasıyla 4 μl 5x reaksiyon tamponu, 1μl
RiboLock™ Ribonuclease Inhibitor (20 u/μl) ve 2 μl 10 mM dNTP karışımı eklenip
karıştırıldıktan sonra reaksiyonlar 3-5 saniye santrifüj ile tekrar toplanmıştır. Reaksiyonlar
42°C’de 5 dakika tutulduktan sonra üzerlerine 2 μl M-MuLV reverse-transcriptaz enzimi (20
u/μl) eklenmiştir. Reaksiyonlar 42°C’de 60 dakika daha tutulduktan sonra reaksiyonlar
24
70°C’de 10 dakika daha tutularak reaksiyonlar durdurulmuştur. Böylece cDNA’nın
sentezlenmesi tamamlanmış ve DNA’nın ikinci sarmalının sentezlenmesi için hazır hale
gelmiştir. İkinci sarmal cDNA sentezi için 20 μl birinci sarmal cDNA üzerine şağıdaki
enzimler, su ve tampon eklenmiştir.
10X DNA Polymerase I reaksiyon tamponu
8 μl
Su
68.8 μl
RNase H (E.coli)
0.2 μl (1 u)
DNA Polymerase I (E.coli)
3 μl (30 u)
Yavaşça vorteksle karıştırıldıktan sonra 15°C’de 2 saat tutulmuştur. Reaksiyonlar 5 μl
0.5 M EDTA (pH 8.0) eklenerek durdurulmuştur. Bu şekilde cDNA-AFLP analizleri için
gerekli olan iki sarmallı cDNA’lar elde edilmiştir. Daha sonra cDNA’lar etanol ile çökeltilmiş
ve 20 ul su içerisinde çözülerek cDNA-AFLP analizinde kullanılabilecek konsantrasyon ve
saflık elde edilmiştir. Elde edilen cDNA’ ların konsantrasyonu cDNA-AFLP analizi için
uygun konsantrasyona (30 ng/ul)) ayarlanmıştır.
3.7. cDNA-AFLP Analizleri
cDNA-AFLP analizleri arazide yetiştirilen G1, G2 ve G3 sarımsak genotiplerinden
elde edilen 31 cDNA örneği ile depolama sıcaklık uygulaması için 2009-2010 yılında
büyütme kabininde yetiştirilen G1, G2, G3 ve G4 genotiplerinden elde edilen 44 cDNA
örneği olarak toplam 75 örnekte gerçekleştirilmiştir.
cDNA-AFLP analizleri Bachem ve ark. (1996) ve Breyne ve ark. (2002) göre
yapılmıştır. cDNA-AFLP yöntemi AFLP yönteminde (Vos ve ark. 1995; Şekil 3.2) olduğu
gibi farklı aşamalardan oluşmaktadır. Ancak cDNA-AFLP analizlerinde kalıp DNA olarak
cDNA kullanılmaktadır. Bunun için cDNA-AFLP protokolünün bazı aşamalarında AFLP
System I kiti (Invitrogen) kullanılmıştır.
cDNA-AFLP analizleri cDNA’ların restriksiyon enzimleri ile kesilmesi, adaptörlerin
bağlanması, seçici ön PCR çoğaltması, seçici PCR çoğaltması ve PCR ürünlerinin
poliakrilamid jellerde ayrıştırılması aşamalarından oluşmaktadır.
25
Şekil 3.2. AFLP tekniğinin önemli aşamaları (Invitrogen AFLP System I’den adapte
edilmiştir).
26
3.7.1. cDNA’ların Restriksiyon Enzimleri ile Kesilmesi
cDNA’lar XapI ve MseI (New England Biolabs, ABD) restriksiyon endonükleazları ile
aşağıda verilen reaksiyon bileşenleri ile hazırlanarak kesilmiştir. cDNA’ların kesilmesi için
reaksiyonlar PCR cihazında 37oC sabit sıcaklıkta 3 saat süre ile bekletilmişlerdir. Daha sonra
70oC de 15 dakika tutularak restriksiyon enzimleri inaktif edilmişlerdir.
Reaksiyon Bileşenleri
5x reaksiyon tamponu
Xap I (10 U/µl)
Mse I (10 U/µl)
Su
DNA (30 ng/µl)
Toplam
Miktar (µl)
5.0
0.25
0.25
7.5
12.0
25.0
3.7.2. Adaptörlerin Bağlanması
Adaptörler ikili sarmal olarak hazırlanan ve DNA dizilimleri bilinen yapay
oligonükleotidler olup XapI ve MseI enzimlerin kesim sekanslarını içermektedir. Kesilen
DNA parçacıklarına aşağıda DNA dizileri verilen adaptörler aşağıda belirtilen formüle göre
PCR cihazında 20oC de 3 saat sürede bağlanmışlardır. Adaptör bağlama işleminden sonra her
bir reaksiyon 1/5 oranında TE (Tris-EDTA) tamponu ile seyreltilmiştir.
Adaptörler
MseI-adap-top:5’– GAC GAT GAG TCC TGA G – 3’
MseI-adap-bot:5’– TAC TCA GGA CTC AT– 3’
XapI-adap-top:5’– CTC GTA GAC TGC GTA CC – 3’
XapI-adap-bot:5’– AAT TGG TAC GCA GTC TAC – 3
Reaksiyon Bileşenleri
Adaptör bağlama solüsyonu
(0.5 µM XapI ve 5 µM MseI adaptör)
T4 DNA ligase (10 U/µl)
Kesilmiş cDNA parçaları
Toplam
Miktar (µl)
24.0
1.0
25.0
50.0
3.7.3. Ön Seçici PCR Çoğaltması
Adaptörlere bağlanan DNA parçacıkları aşağıda verilen primerler ve PCR protokolüne
göre PCR cihazında çoğaltılmışlardır
27
Primerler
P1: 5’– CTC GTA GAC TGC GTA CCA ATT – 3’
P2: 5’– GAC GAT GAG TCC TGA GTA A – 3’
Reaksiyon Bileşenleri
Primer karışımı
10x PCR tamponu
Taq DNA polimeraz (5u/µl)
Su
Kesilmiş ve adaptör eklenmiş genomik DNA
Toplam
Miktar
(µl)
20.00
2.50
0.20
1.05
1.25
25.00
PCR Döngüsü
1. 94˚C 2.0 dak.
2. 94˚C 30 sn
3. 56˚C 30 sn (2-4 sıcaklık döngüsü 20 defa tekrarlanmıştır)
4. 72˚C 1.0 dak
5.72˚C 5.0 dak
6. 4˚C sonsuz
3.7.4. Seçici PCR Çoğaltması
Ön seçici çoğaltmada elde edilen PCR ürünleri 1/50 oranında TE (Tris-EDTA)
tamponu içerisinde seyreltildikten sonra tekrar PCR cihazında seçici çoğaltma işlemlerine tabi
tutulmuştur. Bu aşamada XapI primerlerine 2 seçici nükleotid (XapI+2) ve MseI primerlerine
ise 2 veya 3 seçici nükleotid (MseI+2 veya MseI+3) eklenmiş primerlerden oluşan 39 primer
kombinasyonu kullanılmıştır (Çizelge 3.3). Seçici çoğaltmada kullanılan PCR reaksiyonu
bileşenleri, primer kombinasyonları ve PCR döngü protokolleri aşağıda verilmiştir.
Reaksiyon Bileşenleri
Su
10X PCR Tamponu
dNTP karışımı (2.5mM)
Taq DNA Polimeraz (5 u/µl)
EcoR I primeri (5uM)
Mse I primeri (5uM)
Ön seçici olarak çoğaltılmış PCR ürünü
Toplam
Miktar
(µl)
3.60
1.25
1.50
0.15
1.00
2.50
2.50
12.50
28
Çizelge 3.3. cDNA-AFLP analizlerinde seçici çoğaltmada kullanılan primer kombinasyonları.
Primer Kombinasyonu
Primer Kombinasyonu
1-XCT-MCTG
2-XCA-MCTC
3-XCA-MCG
4-XCT-MCA
5-XCA-MGA
6-XCA-MGC
7-XCA-MCCG
8-XTA-MCG
9-XTA-MCCG
10-XTA-MGT
11-XTA-MCTG
12-XTC-MGC
13-XTC-MCG
14-XTC-MCCG
15-XTG-MGA
16-XTG-MCA
17-XTG-MCTG
18-XCC-MTC
19-XTT-MGT
20-XTT-MGC
21-XCC-MCAT
22-XCC-MCTG
23-XCT-MCCT
24-XCT-MCTA
25-XCG-MCAT
26-XCG-MCTA
27-XCT-MGT
28-XCT-MGC
29-XTT-MCAC
30-XTT-MCTG
31-XTT-MCCT
32-XTC-MGT
33-XCC-MGT
34-XCC-MCGT
35-XTC-MAGC
36-XTA-MAGC
37-XCA-MAGC
38-XCG-MGA
39-XTG-MCG
PCR Döngüsü
1. 94 oC 2.0 dak
2. 94 oC 30 sn
3 65oC 30 sn
4. 72oC 1.0 dak
5. 94 oC 30 sn
6. 56 oC 30 sn
7. 72 oC 1.0 dak
(her döngüde sıcaklık 1oC azaltılarak 2-4 sıcaklık döngüsü 10 kez
tekrarlanmıştır)
(5-7 sıcaklık döngüsü 20 defa tekrarlanmıştır)
8. 72 oC 5.0 dak
9. 4 oC sonsuz
3.7.5. PCR Ürünlerinin Poliakrilamid Jellerindeki Analizleri
Seçici olarak çoğaltılan PCR ürünleri 12,5 µl yükleme tamponu (10ml Formamid,
10mg bromofenelmavisi, 200µl 0.5 M EDTA) ile karıştırılmıştır. PCR ürünleri 90 oC de 4
dakika tutularak DNA parçacıkları denature edilmiş ve hemen buz üzerinde soğutulmuştur.
29
Denature edilen ve soğutulan PCR ürünlerinden 5 µl alıp 30 dakika ön ısıtma yapılan %6’lık
poliakrilamid jelinde 60W güçle 2 saat 30 dakika süre ile ayrıştırılmıştır. Poliakrilamid jelleri
gümüş nitrat (AgNO3) ile Silver Sequence DNA Sequencing System protokolüne (Promega)
göre boyanmış ve fotoğraflanmıştır.
3.8. cDNA-AFLP Bantların Poliakrilamid Jellerden Kesilmesi ve İzole edilmesi
Jeller anlamlı bantlar için analiz edilmiş ve anlamlı bulunan polimorfik bantlar dizi
analizleri için poliakrilamid jellerden keskin bir bisturi yardımıyla kesilmiştir. Kesme işlemi
beyaz ışık veren negateskop cihazı üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bantlar büyükten küçüğe
doğru kodlanmıştır. Ayrıca kesilen bantların kaçıncı örnek ve hangi primer kombinasyonu
olduğu kodlamada belirtilmiştir. Kesilen bantlar içinde 75 µl TE (Tris-EDTA) çözeltisi
bulunan 1,5 ml tüpler içinde bir gece buzdolabında 4 oC de bekletilmiştir. Bekleme
işleminden sonra kesilen cDNA-AFLP bantları pipet uçları ile iyice parçalanmıştır. Daha
sonra tüpler mikrosantrifüj cihazında 1 dakika kadar döndürülerek jel parçalarının ve diğer
kimyasalların tüp dibinde çökelmesi ve DNA’nın ise çözelti içinde kalması sağlanmıştır. Elde
edilen örnekler daha sonraki aşamalar için -20 oC’de muhafaza edilmiştir.
3.9. Poliakrilamid Jelden İzole Edilmiş cDNA-AFLP Bantların Agaroz Jelden İzole
Edilmesi
Poliakrilamid jelinden izole edilen cDNA-AFLP bantları PCR ile çoğaltılmıştır. PCR
cihazında çoğaltılan bantlar %2 konsantrasyonundaki agaroz jelde ayrıştırılmıştır. Agaroz
jellerden bantlar keskin bir bisturi ile kesilmiştir. Kesilen bantların agaroz jelden
izolasyonunda EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction kiti (BioBasic, Kanada)
kullanılmıştır. Bu şekilde cDNA- AFLP bantları dizi analizleri için saflaştırılmıştır. cDNAAFLP bantların çoğaltılması için kullanılan PCR reaksiyonu bileşenleri ve PCR döngüsü
aşağıdaki gibidir.
Reaksiyon Bileşenleri
Akrilamid Jelden İzole Edilen DNA
10X PCR tamponu
dNTPs (2mM)
XapI-seçici primeri (5 µM/µl)
MseI-seçici primeri (5 µM/µl)
Taq DNA polimeraz (5U/µl)
Su
Toplam
Miktar
(µl)
2.0
2.0
2.0
0.8
0.8
0.16
12.24
20.0
30
PCR Döngüsü
1. 94 oC 2.0 dak
2. 94 oC 45 sn
3. 56 oC 1.0 dak
4. 72 oC 1.30 dak
(2-4 sıcaklık döngüsü 28 defa tekrarlanmıştır)
5. 72 oC 5.0 dak
6. 4 oC sonsuz
3.10. cDNA-AFLP Bantlarının Dizi Analizi İçin PCR Aşaması
Dizi analizi için PCR aşaması ve bundan sonraki diğer aşamalar bu projeye destek
veren Amerika Birleşik Devletleri-Wisconsin Üniversitesi’ndeki Prof. Dr. P. W. Simon’un
laboratuvarında
gerçekleştirilmiştir.
Dizi
analizleri
bantların
klonlama
vektörüne
klonlanmadan doğrudan PCR aşamasında kullanılması şeklinde yapılmıştır. Dizi analizi için
PCR reaksiyonları her bant için iki taraflı olarak (geri ve ileri primerleri için ayrı
reaksiyonlar) yapılmıştır. Bu şekilde her bant için iki defa dizi analizi yapılmıştır. Doğrudan
dizi analizi yöntemiyle çalışmayan bazı bantlar ise pGEM-T Vector System kiti (Promega)
kullanılarak üretici firmanın verdiği yönteme göre klonlanıp dizi analizleri tekrar
gerçekleştirilmiştir.
Dizi analizi için yapılan PCR bileşenleri ve döngüsü aşağıdaki gibidir.
Reaksiyon Bileşenleri
Agoroz Jelden İzole Edilen DNA
2.5 X PCR tamponu
XapI veya MseI primeri (5 µM/µl)
Big Dye Terminator v3.1 karışımı
H2 O
Toplam
Miktar
(µl)
1.0
0.75
1.0
0.5
1.75
5.0
PCR Döngüsü
1. 94oC 15 sn
2. 50 oC 15 sn
3. 60 oC 2.30 dak
4. 4 oC sonsuz
(1-3 sıcaklık döngüsü 28 defa tekrarlanmıştır)
31
3.11. PCR Ürünün Saflaştırılması ve DNA Dizi Analizi
Dizi analizi için elde edilen PCR ürünleri Biyoteknoliji Merkezine (Biotech Center,
Wisconsin Üniversitesi) verilmeden önce manyetik beadlerle (Agencort Clean-Seq) firmanın
protokolüne göre saflaştırılmıştır. DNA dizi belirmesi Biyoteknoliji Merkezinde Wisconsin
Üniversitesi’ndeki ortak çalıştığımız laboratuvar tarafından yaptırılmıştır.
3.12. cDNA-AFLP DNA Dizilerin Analizi ve NCBI (National Center for Biotechnology
Information) DNA Dizi Bankasındaki Diziler ile Karşılaştırılması
Sarımsak transkriptlerinden elde edilen cDNA-AFLP bantlarının DNA dizileri
belirlendikten sonra dizilerin adaptor, vektör ve düşük kaliteli dizilerinin kesilip çıkarılması
CodonCodeAlligner 3.7.1 (CodonCode Corparation, A.B.D.) programı kullanılarak
yapılmıştır.
Dizilerin
gruplandırılması
ve
eşleştirilmesi
yine
aynı
programla
gerçekleştirilmiştir. Tek ve benzer grup (contigs) diziler belirlendikten sonra bu dizilerin
NCBI’daki
(National
karşılaştırılması,
gen
Center
ontoloji
for
Biotechnology
analizleri,
genlerin
Information)
fonksiyonun
DNA
dizileri
ile
belirlenmesi
ve
gruplandırılması Blast2GO (http://www.blast2go.org/start_blast2go) programı kullanılarak
gerçekleştirilmiştir. Ayrıca NCBI gen bankasıdaki benzer nükleotid dizilerlerle karşılaştırmak
için BLASTN ve benzer protein dizileri ile karşılaştırmak için BLASTX algoritmaları
kullanılmıştır.
3.13. Morfolojik Ölçümlerin İstatiksel Analizleri
Depolama sıcaklığı uygulaması yapılan dişlerden gelişen bitkiler için iklim kontrollü
büyütme kabinindeki deneme, ‘Tesadüf Parselleri’ deneme desenine göre 3 tekrarlamalı
olarak yürütülmüştür. Verilerin analizi SPSS Statistics 17.0 (IBM) programı ile yapılmıştır.
Uygulamalar arasındaki farklılık ‘Duncan’ testi ile 0,05 önem seviyesinde ortaya
konulmuştur.
32
4. BULGULAR
4.1. Depolama Sıcaklığı Uygulamasının Morfolojik Gelişme Üzerine Etkisi
İki adet çiçeklenen (G1, G2) ve iki adet çiçeklenmeyen (G3, G4) dört farklı sarımsak
genotipi dikim öncesi depolama sıcaklıklarının bitki gelişimi üzerine etkisini belirlemek
amacıyla sıcaklık, ışık ve nem kontrollü büyütme kabinine 23.11.2009 tarihinde dikilmiştir.
Dikimden önce 4oC’de ve 20oC’de depolama uygulaması yapılan G1, G2, G3 ve G4 sarımsak
genotiplerinin dikimden sonra dişlerden gelişen bitkiler arasındaki morfolojik farklılıklar
gözlemlenmiştir. Bu bitkilere ait yaprak sayısı, yalancı gövde uzunluğu ve yalancı gövde çapı
dikimden 45 gün (6 Ocak 2010) ve dikimden 90 gün (22 Şubat 2010) sonra ölçülmüştür.
Yapılan gözlemlere göre, sarımsak dişleri saksılara dikildikten sonra, 4oC’de
depolanan sarımsak dişlerinin 20oC’de depolanan sarımsak dişlerine göre daha önce sürdüğü
tespit edilmiştir (Çizelge 4.1, Şekil 4.1). Dişlerin sürme süresi yönünden en az fark çiçeklenen
G1 genotipinde en fazla fark ise çiçeklenmeyen G3 genotipinde görülmüştür. Buna göre G1
genotipinde, 20oC’de depolanan dişler 4oC’de depolananlardan 7 gün sonra G3 genotipinde
ise, 20oC’de depolanan dişler 4oC’de depolananlardan 26 gün sonra sürmüştür.
Çizelge 4.1. Dikim tarihinden itibaren sarımsak dişlerinin sürme tarihleri.
Genotipler
G1
G2
G3
G4
Dişlerin dikim
zamanı
23.11.2009
23.11.2009
23.11.2009
23.11.2009
Dişlerin sürme zamanı
4oC
20oC
30.11.2009
07.12.2009
02.12.2009
06.12.2009
06.12.2009
01.01.2010
30.11.2009
05.12.2009
33
Şekil 4.1. Dikimden 23 gün sonra G3 genotipi için; 20oC'de depolanan dişler henüz
sürmemişken, 4oC depolanan dişlerden elde edilen bitki iki yaprak aşamasındadır.
Yine dikimden 23 gün sonra yapılan gözlemlere göre, 4oC’de depolanan sarımsak
genotiplerinin dişlerinden gelişen bitkiler, 20oC’dekilere göre çok daha hızlı ve sağlıklı bir
gelişim göstermiştir ( Şekil 4.2).
Şekil 4.2. G2 (A), G3 (B) ve G4 (C) genotiplerinde her iki depolama sıcaklığı uygulaması için
görülen gelişimsel farklılıklar.
Dikimden 27 gün sonra yapılan gözlemlerde 20oC’de depolanan sarımsak
genotiplerinin dişlerinden gelişen bitkilerde büyümenin ilk aşamalarında virüs semptomuna
benzeyen, düzgün olmayan yaprak gelişimi gözlenmiştir (Şekil 4.3) ve bu görünüm ilerleyen
safhalarda daha da belirgin hale gelmiştir (Şekil 4.4).
34
Şekil 4.3. G1 genotipinin 4oC ve 20oC'de depolanan dişlerinden gelişen bitkiler.
Şekil 4.4. G1 (A), G2 (B), G3 (C) ve G4 (D) genotipleri için 4oC ve 20oC depolanan dişlerden
elde edilen bitkiler arasında gelişme yönünden farklılıklar.
35
Dikimden 45 gün sonra, genotipe ve depolama uygulamasına göre değişmekle birlikte,
bitkiler ortalama üç dört yaprak aşamasına gelmiştir. Bu dönemde, yaprak ve meristem örneği
almak için sökülen bitkilerde üç yaprak aşamasından sonra 4oC depolama sıcaklığı
uygulanmış dişlerden gelişen bitkilerin dişteki besin maddelerinin tamamen tüketildiği
görülmüştür (Şekil 4.5).
Şekil 4.5. A) G4 genotipi, sökülen 4oC ve 20oC depolama sıcaklığı uygulanmış dişlerden
gelişen bitkiler B) 4oC depolama sıcaklığı uygulaması C) 20oC depolama sıcaklığı uygulaması
Dikimden 115 gün sonra, çiçeklenen bir genotip olan G1 ile çiçeklenmeyen bir
genotip olan G4’ten sökülen bitkilerde, 4oC’de ve 20oC’de depolanan sarımsak genotiplerinin
dişlerinden gelişen bitkiler arasındaki karşılaştırma ve sayısal veriler Çizelge 4.2’de
verilmiştir. Ayrıca dikimden 120 gün sonra, çiçeklenen bir genotip olan G2 ile çiçeklenmeyen
bir genotip olan G3’ten sökülen bitkilerde, 4oC’de ve 20oC’de depolanan sarımsak
genotiplerinin dişlerinden gelişen bitkiler arasındaki karşılaştırma ve sayısal veriler aynı
çizelgede yer almaktadır.
Çizelge 4.2’ deki bulgulara göre dikimdem 115 gün sonra G1 genotipi için, 4oC’de
depolanan dişlerden elde edilen sarımsak bitkilerinde çiçek sapı ve çiçek sürgününün
büyümeye başladığı gözlenirken 20oC'de depolanan dişlerden elde edilen bitkilerde henüz
başlamadığı saptanmıştır. Ayrıca düşük sıcaklıkta depolanan dişlerden elde edilen bitkilerde
dişlerin oluştuğu ve dolayısıyla baş oluşumunun başladığı tespit edilmiştir (Şekil 4.6).
20oC’de depolanan dişlerden elde edilen bitkilerde böyle bir durum gözlemlenmemiştir.
36
Dikimden 120 gün sonra, yapılan gözlemlere göre de G1 genotipine benzer şekilde G2
genotipinin 4oC'de depolanan dişlerinden gelişen bitkilerinde hem çiçek sapı gelişimi hem de
başta diş gelişiminin başladığı, 20oC'de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde ise henüz bu
özelliklerin gelişmeye başlamadığı gözlemlenmiştir. G3 ve G4 çiçeklenme özelliği olmayan
klonlar olduğu için bu genotiplerin her iki depo sıcaklığı uygulamasında da çiçeklenme
görülmemiş ancak bu genotiplerde diş oluşumunun sadece 4oC'de depolanan dişlerden gelişen
bitkilerde başladığı belirlenmiştir (Çizelge 4.2).
Çizelge 4.2. Dikimden 115 ve 120 gün sonra G1, G2, G3 ve G4’te her iki sıcaklık uygulaması
için bitkiler arasındaki karşılaştırma.
Yaprak aşaması
Baş çapı (cm)
Bitki boyu (cm)
Çiçek sapı boyu
(cm)
Çiçek sürgünü çapı
(mm)
Çiçek sürgünü boyu
(cm)
Diş oluşumu
Dikimden 115 gün sonra
G1
G1
G4
G4
4oC
20oC 4oC
20oC
8
6
8
5
2,1
0,85
2,1
1,2
16,5
7,5
13
8
Dikimden 120 gün sonra
G2
G2
G3
G3
4oC
20oC
4oC
20oC
10
6
10
5
1,9
0,8
1,5
0,7
16
7,5
11
4,5
1,5
Yok
-
-
1,5
Yok
-
-
3
Yok
-
-
2
Yok
-
-
1,2
Yok
-
-
2,5
Yok
-
-
Var
Yok
Var
Yok
Var
Yok
Var
Yok
Şekil 4.6. A) G1 genotipinde her iki sıcaklık uygulaması için baş oluşumunu karşılaştırma B)
20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitki C) 4oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkide baş
oluşumu.
37
4oC depolanan dişlerden gelişen bitkiler ile 20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkiler
arasında kök gelişimi bakımından da farklılık söz konusudur (Şekil 4.7). 4oC’de depolanan
dişlerden gelişen bitkilerde kök gelişiminin çok daha iyi olduğu görülmüştür.
Şekil 4.7. G1 (A), G2 (B), G3 (C) ve G4 (D) için 4oC (soldaki bitkiler) ve 20oC
(sağdaki bitkiler) depolanan dişlerden elde edilen bitkiler arasında kök gelişimi
yönünden farklılıklar.
4.1.1. Yaprak sayısı
Bütün genotiplerde; 4oC’de üç ay süre ile depolanan dişlerden gelişen bitkilerin
ortalama yaprak sayısı, 20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerin ortalama yaprak
sayısından daha fazla olduğu saptanmıştır. Genotipler arasındaki farklılık ‘Duncan’ testi ile
0,05 önem seviyesinde SPSS 17.0 bilgisayar programı kullanılarak ortaya konulmuştur.
Duncan testine göre yapılan analizlerde, dikimden 45 gün (6 Ocak 2010) ve dikimden 90 gün
38
(22 Şubat 2010) sonra yapılan yaprak sayımında, 4oC’de ve 20oC’de depolanan dişlerden
gelişen bitkilerde yaprak sayısı bakımından genotipler arasında istatistiki olarak fark
görülmüştür (Şekil 4.8, Çizelge 4.3).
Şekil 4.8. Dikim öncesi depolama sıcaklığına bağlı olarak, dikimden 45 gün (06 Ocak 2010)
ve dikimden 90 gün sonra (22 Şubat 2010) sarımsak genotiplerinin ürettiği yaprak sayılarının
karşılaştırılması.
Çizelge 4.3. Dikimden 45 gün ve dikimden 90 gün sonra 4oC’de ve 20oC’de depolanan
dişlerden elde edilen bitkilerde yaprak sayımındaki farklılıklar.
Dikimden 45 gün Dikimden 90 gün
sonra
sonra
Genotip
4°C
20°C
4°C
20°C
G1
4,44d
3,22c
7,11 c
5,78d
G2
3,33b
2,33b
5,89 b
4,61c
G3
2,78a
1,11a
4,33 a
3,00a
G4
3,89c
2,56b
5,83 b
4,17b
Dikimden 45 gün ve dikimden 90 gün sonraki ölçümlerde, 4oC’de depolanan dişlerden
gelişen bitkiler 20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerden en az bir adet fazla yaprak
ürettiği gözlemlenmiştir. Örneğin G4 genotipi için; dikimden 45 gün sonra yapılan ölçümde
39
4oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde ortalama yaprak sayısı 3,89 olurken aynı
genotipin 20oC’de depolanan dişlerinden gelişen bitkilerinde yaprak sayısı 2,56’da kalmıştır.
Dikimden 90 gün sonraki ölçümlerde ise 4oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde
ortalama yaprak sayısı 5,83 ve 20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde ise ortalama
yaprak sayısı 4,17 olmuştur (Çizelge 4.3).
4.1.2. Yalancı gövde uzunluğu
Bütün genotiplerde; 4oC’de üç ay süre ile depolanan dişlerden gelişen bitkilerin
ortalama yalancı gövde uzunluğu, 20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerin ortalama
yalancı gövde uzunluğundan daha fazla olduğu saptanmıştır. Genotipler arasındaki farklılık
‘Duncan’ testi ile 0,05 önem seviyesinde SPSS 17.0 bilgisayar programı kullanılarak ortaya
konulmuştur. Duncan testine göre yapılan analizlerde, hem dikimden 45 gün hem de
dikimden 90 gün sonra yapılan yalancı gövde uzunluğu ölçümünde, 4oC’de ve 20oC’de
depolanan dişlerden gelişen bitkilerde yalancı gövde uzunluğu bakımından genotipler
arasında istatistiki olarak fark görülmüştür (Şekil 4.9, Çizelge 4.4).
Şekil 4.9. Dikim öncesi depolama sıcaklığına bağlı olarak, dikimden 45 gün (06 Ocak 2010)
ve dikimden 90 gün (22 Şubat 2010) sonra sarımsak genotiplerinde meydana gelen yalancı
gövde uzunluklarının karşılaştırılması.
40
Çizelge 4.4. Dikimden 45 gün ve dikimden 90 gün sonra 4oC’de ve 20oC’de depolanan
dişlerden elde edilen bitkilerde yalancı gövde uzunluğundaki (cm) farklılıklar.
Dikimden 45 gün Dikimden 90 gün
sonra
sonra
Genotip
4°C
20°C
4°C
20°C
G1
G2
G3
G4
6,78c
3,39a
3,50a
4,56b
2,91c
1,66b
1,00a
1,11a
11,11d
7,55b
6,66a
9,08c
4,06b
2,56a
2,56a
2,31a
Dikimden 90 gün sonra yapılan ölçümlere bakıldığında 4oC’de depolanan dişlerden
elde edilen bitkilerin ortalama yalancı gövde uzunluklarının 20oC’de depolananlardan elde
edilenlere göre çok daha fazla olduğu gözlemlenmiştir. Örneğin G4 genotipi için; dikimden
45 gün sonra yapılan ölçümde 4oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde ortalama yalancı
gövde uzunluğu 4,56 cm iken, aynı genotipin 20oC’de depolanan dişlerinden gelişen
bitkilerinde 1,11 cm’de kalmıştır. Dikimden 90 gün sonra yapılan ölçümlerde ise 4oC’de
depolanan dişlerden gelişen bitkilerde ortalama yalancı gövde uzunluğu 9,08 cm iken,
20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde 2,31 cm’dir.
4.1.3. Yalancı gövde çapı
Ortalama yalancı gövde çapı bütün genotiplerde, 4oC’de üç ay süre ile depolama
yapılan dişlerden elde edilen bitkilerde 20oC'de depolama yapılan dişlerden elde edilen
bitkilere oranla daha fazladır. Genotipler arasındaki farklılık ‘Duncan’ testi ile 0,05 önem
seviyesinde SPSS 17.0 bilgisayar programı kullanılarak ortaya konulmuştur. Duncan testine
göre yapılan analizlerde, dikimden 45 gün ve dikimden 90 gün sonra ölçülen gövde çapında,
4oC’de ve 20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde gövde çapları bakımından
genotipler arasında istatistiki olarak fark görülmüştür (Şekil 4.10, Çizelge 4.5).
41
Şekil 4.10. Dikim öncesi depolama sıcaklığına bağlı olarak, dikimden 45 gün (06 Ocak 2010)
ve dikimden 90 gün sonra (22 Şubat 2010) sarımsak genotiplerindeki yalancı gövde çaplarının
(mm) karşılaştırılması.
Çizelge 4.5. Dikimden 45 gün ve dikimden 90 gün sonra 4oC’de ve 20oC’de depolanan
dişlerden elde edilen bitkilerde yalancı gövde çapındaki (mm) farklılıklar.
Dikimden 45 gün Dikimden 90 gün
sonra
sonra
Genotip
4°C
20°C
4°C
20°C
G1
G2
G3
G4
4,83c
3,17b
2,44a
4,50c
3,86d
2,78b
1,61a
3,28c
6,56c
5,08b
3,33a
5,86c
4,78c
3,92b
2,33a
5,36c
Dikimden 45 beş ve dikimden 90 gün sonra yapılan ölçümlere bakıldığında 4oC’de
depolanan dişlerden elde edilen bitkilerin ortalama yalancı gövde çaplarının 20oC’de
42
depolananlardan elde edilen bitkilere oranla daha fazla olduğu gözlemlenmektedir. Örneğin;
G4 genotipi için dikimden 45 gün sonraki ölçümde 4oC’de depolanan dişlerden elde edilen
bitkilerde ortalama yalancı gövde çapı 4,50 mm olarak belirlenmiştir. Fakat 20oC’de
depolanan dişlerden elde edilen bitkilerde 3,28 mm’de kalmıştır. Aynı genotip için dikimden
90 gün sonra yapılan ölçümlerde, 4oC’de depolanan dişlerden elde edilen bitkilerde ortalama
yalancı gövde çapı 5,86 mm iken 20oC’de depolanan dişlerden elde edilen bitkilerde 5,36
mm’dir.
4.2. cDNA-AFLP Analizleri
Sarımsakta farklı gelişme zamanlarında farklı ifade olan, çiçeklenen ve çiçeklenmeyen
sarımsak klonları arasında faklı ifade olan ve dişlerin depolama sıcaklığına göre farklı ifade
olan genlerin belirlenmesi için cDNA-AFLP yöntemi kullanılmıştır. cDNA-AFLP analizleri
2007 ve 2008 yıllarında arazide yetiştirilen çiçeklenen G1, G2 ve çiçeklenmeyen G3 sarımsak
genotiplerinden elde edilen 31 örnek ve 2009-2010 yıllarında büyütme kabininde yetiştirilen
çiçeklenen G1, G2 ve çiçeklenmeyen G3, G4 sarımsak genotiplerinden elde edilen 44 örnek
olmak üzere toplam 75 örnekte gerçekleştirilmiştir. Çizelge 4.6’da cDNA-AFLP analizi
gerçekleştirilen örnekler verilmiştir.
Gen ifade analizi ilk olarak arazide yetiştirilen bitkilerden elde edilen 31 örnek için 19
cDNA-AFLP primer kombinasyonu denenerek gerçekleştirilmiştir. Daha sonra bu 31 örnek
ile birlikte 44 örnekte 20 yeni primer kombinasyonu daha kullanılmıştır (Çizelge 3.3). Toplam
39 primer kombinasyonundan poliakrilamid jeller üzerinde 970 bant değerlendirilmiştir
(Çizelge 4.7). Değerlendirilebilen bant sayısı en fazla XTG-MGA primer kombinasyonundan
(45 bant) elde edilmiş en az bant ise XTT-MCCT primer kombinasyonundan (11 bant)
değerlendirilmiştir. Değerlendirilebilen 970 banttan 788 tanesi genotipler arasında veya farklı
gelişme dönemlerinde farklılık göstermiştir (Çizelge 4.7). Farklılık gösteren anlamlı bantlar
ve bazı monomorfik bantlar poliakrilamid jellerden kesilerek izole edilmiştir (Şekil 4.11).
İzole edilen bantlar tekrar PCR cihazında ön seçici çoğaltmada kullanılan primerler
kullanılarak çoğaltılmış ve PCR ürünleri agaroz jellerinde ayrıştırıldıktan sonra ilgili bantlar
kesilerek izole edilmiştir (Şekil 4.12). Agaroz jellerden toplam 1253 bant izole edilmiştir
(Çizelge 4.7). Farklılık gösteren bantlardan bazılarında aynı bant birden fazla genotipten veya
farklı aşamadan izole edildiği için agaroz jellerden izole edilen bant sayısı polimorfik bant
sayısından daha fazla olmuştur.
43
Çizelge 4.6. Farklı gen ifadesi için cDNA-AFLP analizinde kullanılan örnekler.
Örnekleme Genotiplerin Gelişme
tarihi
Aşaması
10.03. 2007 Bitkiler 2-3 yaprak
aşamasında
04.04.2007 Bitkiler 3-4 yaprak
aşamasında
20.04.2007 Bitkiler 4-5 yaprak
aşamasında
13.05.2007 Çiçeklenen genotiplerde
çiçek sapının görüldüğü
aşamada
15.09.2007 Depolamadan önce
04.12.2007 Depolama sonunda
dikimden hemen önce
12.03.2008 Bitkiler 3 yaprak
aşamasında
28.03.2008 Bitkiler 4 yaprak
aşamasında
17.04.2008 Bitkiler 5 yaprak
aşamasında yaprak
örneği
12.05.2008 Çiçeklenen genotiplerde
çiçek sapının görüldüğü
aşamada
22.05.2008 Çiçeklenen genotiplerde
çiçek sapının görüldüğü
aşamada
Oda sıcaklığı ve düşük
4.08.2009
sıcaklık depolamasından
önce
24.11.2009 Depolama sonunda
dikimden hemen önce
08.01.2010 Bitkiler 3-4 yaprak
18.01.2010 aşamasında
19.03.2010 Bitkiler 7-9 yaprak
26.03.2010 aşamasında
Toplam
Örnek Alınan Doku
Yaprak
Sarımsak
Genotipleri
G1,G2,G3
Örnek
Sayısı
3
Yaprak
G1,G2,G3
3
yaprak
G1,G2,G3
3
Yaprak
G1,G2,G3
3
Büyüme meristemi
Büyüme meristemi
G1,G2,G3
G1,G2,G3
3
3
Yaprak
G1,G2,G3
3
Yaprak
G1,G2,G3
3
Yaprak
G1,G2,G3
3
Yaprak
G1,G2,G3
3
Çiçek sürgünü
G1
1
Büyüme meristemi
G1,G2,G3,G4
4
Büyüme meristemi
G1,G2,G3,G4
(4oC ve 20oC)
G1,G2,G3,G4
(4oC ve 20oC)
G1,G2,G3,G4
(4oC ve 20oC)
8
Yaprak ve büyüme
meristemi
Yaprak, büyüme
meristemi, çiçek
sürgünü ve çiçek sapı
16
16
75
44
Çizlege 4.7. cDNA-AFLP analizinde kullanılan 39 primer kombinasyonundan elde edilen
toplam bant sayısı, polimorfik bant sayısı ve agaroz jellerden izole edilen bant sayısı.
Primer Kombinasyonu
Toplam
Sayısı
1-XCT-MCTG
2-XCA-MCTC
3-XCA-MCG
4-XCT-MCA
5-XCA-MGA
6-XCA-MGC
7-XCA-MCCG
8-XTA-MCG
9-XTA-MCCG
10-XTA-MGT
11-XTA-MCTG
12-XTC-MGC
13-XTC-MCG
14-XTC-MCCG
15-XTG-MGA
16-XTG-MCA
17-XTG-MCTG
18-XCC-MTC
19-XTT-MGT
20-XTT-MGC
21-XCC-MCAT
22-XCC-MCTG
23-XCT-MCCT
24-XCT-MCTA
25-XCG-MCAT
26-XCG-MCTA
27-XCT-MGT
28-XCT-MGC
29-XTT-MCAC
30-XTT-MCTG
31-XTT-MCCT
32-XTC-MGT
33-XCC-MGT
34-XCC-MCGT
35-XTC-MAGC
36-XTA-MAGC
37-XCA-MAGC
38-XCG-MGA
39-XTG-MCG
Toplam
30
21
31
35
30
15
30
36
21
27
36
30
24
16
45
27
25
20
37
19
33
39
24
27
12
14
31
27
15
12
11
26
26
19
21
14
23
13
28
970
Bant Polimorfik
Bant Sayısı
22
16
28
29
25
15
23
30
17
24
33
29
20
15
37
23
24
18
29
11
23
36
15
19
9
8
17
18
9
9
7
23
24
13
18
10
15
11
25
788
Agaroz Jelden
İzole
Edilen
Bant Sayısı
42
35
40
51
32
15
43
53
43
39
48
38
37
8
58
35
36
19
28
12
38
62
25
40
16
15
42
33
23
12
5
30
41
18
32
17
27
18
47
1253
45
Agaroz jellerden izole edilen bantların DNA dizileri belirlenmiştir. DNA dizileri
belirlenen bantların Codon Code programı ile analizleri sonucu 240 tane tek ve 389 tane
konting (benzer diziler grubu) olmak üzere toplam 629 tane farklı EST (expressed sequence
tag) dizisi elde edilmiştir. Üç yüz seksen dokuz kontingden 359 konting içindeki benzer DNA
dizileri aynı bandın iki yönlü dizilerini, aynı bandın farklı klonlardan veya farklı aşamalardaki
örneklerden kesilmiş bantların dizilerini veya aynı primer kombinasyonundaki farklı bantların
dizilerini içermektedir. Geriye kalan 30 konting ise farklı primer kombinasyonlarından elde
edilen bantların dizilerinden oluşmaktadır.
Altı yüz yirmi dokuz EST dizisinin NCBI gen bankasındaki benzer nükleotid dizilerle
karşılaştırılması BLASTN ve benzer aminoasit dizileri ile karşılaştırılması ise BLASTX
arama algoritmaları kullanılarak Blast2GO programı ile gerçekleştirilmiştir. BLAST analizleri
sonucunda 345 (%55) EST dizisinin herhangi bir nükleotid dizisi ile benzerlik göstermediği
284 (%45) EST dizisinin ise ortalama ≥%49 benzerlik seviyesinde benzer olduğu
belirlenmiştir (Şekil 4.13). Bu sonuçlar sarımsak genomundan elde edilen ve farklı ifade olan
genlerin yarıdan fazlasının daha önceden belirlenen nükleotid dizileri ile bir benzerliği
olmadığı ve bunların ilk defa sarımsak genomundan belirlendiğini göstermektedir.
Benzerlik gösteren 284 EST nükleotid dizilerinden en fazla sayıda EST (42 tane) Vitis
vinifera (üzüm) türünün genlerine ait nükleotid dizileri ile en yüksek düzeyde (top hit)
benzerlik gösterirken 28 tane EST dizisi ile ikinci sırada Populus trichocarpa türünün genleri
ile benzer bulunmuştur. Bununla birlikte 284 EST’den sadece iki tanesi sarımsak (Allium
sativum) ve iki tanesi de soğan (Allium cepa) nükleotid dizileri ile benzerlik göstermiştir
(Şekil 4.14). Benzerlik gösteren nükleotid dizileri içinde bazı virüs genomlarına ait nükleotid
dizileri de bulunmaktadır. Virus dizilerine benzerlik gösteren EST dizilerinden 20 tanesi
sarımsak virüsüne, 4 tanesi soğan sarı virüsüne ve iki tanesi sarımsak latent virüsüne en
yüksek düzeyde benzerlik göstermiştir. Virüs nükleotid dizileri sarımsak bitkilerin virüs
hastalıkları ile bulaşık olduğunu göstermektedir. Araştırmada kullandığımız sarımsak
genotipleri vegetatif dişlerle çoğaltıldığı için virüs hastalıkları ile bulaşık olması
beklenmektedir. Bu sonuçlar bu genotiplerin hangi virüs etmenleri ile bulaşık olduğu
konusunda da bilgi vermektedir.
46
Şekil 4.11. XCA-MCTC ve XCT-MCTG primer kombinasyonları ile elde edilmiş cDNAAFLP band profilinin bantlar kesildikten sonraki görünümü.
47
Şekil 4.12. XTA-MCTG primer kombinasyonun poliakrilamid jelden kesilen bantların PCR
reaksiyonundan sonra agaroz jeldeki görüntüsü.
Şekil 4.13. BLAST analizlerine göre 629 EST dizisinin dağılımı. Soldan ikinci bar benzerlik
göstermeyen dizilerin toplamını en sağdaki bar ise toplam EST sayısını, geri kalan barlar ise
benzerlik gösteren EST dizilerinin dağılımını göstermektedir.
48
Şekil 4.14. Blast2GO programında BLAST analizinde benzer bulunan 284 sarımsak cDNA-AFLP EST nükleotid dizilerinin en yüksek düzeyde
benzerlik gösterdiği türlere göre dağılımı.
49
Blast2GO programı ile yapılan gen ontolojisi analizlerinde benzerlik gösteren ve
cDNA-AFLP analizlerinde farklı şekilde ifade olan 284 EST dizisi moleküler görev, biyolojik
süreç ve görev aldığı hücre organeli yönünden sınıflandırılmıştır. cDNA-AFLP analizlerinde
farklı şekilde ifade olan genler moleküler görev yönünden 29 gruba ayrılmış ve en fazla gen
‘ATP binding’ (48 EST) görevinde sınıflandırılmıştır (Şekil 4.15). Biyolojik süreç yönünden
284 EST 60 gruba ayrılmış ve en fazla gen oksin biyosentez sürecinde (26 EST)
gruplandırılmıştır (Şekil 4.16). Görev yaptığı hücre organeli yönünden ise farklı ifade olan
genler 20 gruba ayrılmış ve en fazla geni içeren grubun hücre zarında (27 EST) görev yapan
genler olduğu saptanmıştır (Şekil 4.17).
Otuz bir örnekte kullanılan 19 primer kombinasyonunda (Çizelge 4.8) ve 31 + 44
örnekte kullanılan 20 primer kombinasyonunda (Çizelge 4.9) farklılık gösteren anlamlı
bantlardan bazıları yaprakta, büyüme meristeminde, yaprak veya meristemde farklı miktarda
(bant koyuluğu farkı), çiçek sürgününde ve depolama sıcaklığına göre farklı ifade olanlar
şeklinde farklı gruplara ayrılmıştır. Yaprakta ifade olan bantlarda kendi içinde sadece G1, G2,
G3, G4 genotipleri, çiçeklenen (G1 + G2) , çiçeklenmeyen (G3 + G4) ve tüm genotiplerin
yaprağında ifade olan şeklinde alt kategorilere ayrılmıştır. Aynı şekilde sadece meristemde
ifade olan bantlarda kendi içinde alt kategorilere ayrılmıştır. Hem yaprakta hem de
meristemde ifade olan genlere ait fakat farklı koyulukta olan batlar ise yaprakta koyu ve
meristemde koyu şeklinde iki alt kategoriye ayrılmıştır. Depo sıcaklığı uygulaması ile ilgili
bantlar ise sadece 4oC veya sadece 20oC uygulamasında ifade olanlar şeklinde ayrılmıştır
(Çizelge 4.8, Çizelge 4.9).
Çizelge 4.8’de görüldüğü gibi 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen
31 örnekte 19 primer kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilen cDNA-AFLP analizlerinde
hem genotipler arasında hem de örnek dokuları ve bitki gelişme aşamaları yönünden farklı
şekilde ifade olan bantlar belirlenmiştir. Yaprak örneklerinde ancak genotipe özel olarak
değerlendirildiğinde çiçeklenen G1 genotipinin farklı yaprak aşamalarından elde edilen
yaprak örneklerinde ifade olan ancak diğer genotiplerin hiçbir aşamasında ifade olmayan
sekiz bant belirlenmiştir. Şekil 4.18’de G1 genotipinin farklı gelişme zamanlarından elde
edilen yaprak örneklerinde ifade olan bir bant örnek olarak gösterilmektedir. Aynı gelişme
dönemlerinden elde edilen yaprak örneklerinde çiçeklenen G2 genotipinde diğer
genotiplerden farklı şekilde ifade olan genlere ait altı bant belirlenmiştir (Çizelge 4.8).
50
Şekil 4.15. Gen ontolojisi analizlerinde 284 EST’nin moleküler görevine göre sınıflandırılması (her grupta beş ve üzeri sayıdaki EST içeren
gruplar gösterilmiştir).
51
Şekil 4.16. Gen ontolojisi analizlerinde 284 EST’nin biyolojik sürece göre sınıflandırılması ( her grupta beş ve üzeri sayıdaki EST içeren gruplar
gösterilmiştir).
52
Şekil 4.17. Gen ontolojisi analizlerinde 284 EST’nin görev aldığı hücre organeline göre sınıflandırılması ( her grupta beş ve üzeri sayıdaki EST
içeren gruplar gösterilmiştir).
53
Çizelge 4.8. 2007 ve 2008 yıllarında elde edilen 31 örnek için cDNA-AFLP analizlerinde kullanılan 19 primer kombinasyonunda sadece
yaprakta, meristemde, çiçek sürgününde ve meristem veya yaprakta bant koyuluğu farklılığı şeklinde farklı ifade olan anlamlı bantlar.
Farklı İfade Olan Bantlar
Primer
Kombinasyonu
(31 örnekte)
XCT-MCTG
XCA-MCTC
XCA-MCG
XCT-MCA
XCA-MGA
XCA-MGC
XCA-MCCG
XTA-MCG
XTA-MCCG
XTA-MGT
XTA-MCTG
XTC-MGC
XTC-MCG
XTC-MCCG
XTG-MCA
XTG-MCTG
XCC-MTC
XTT-MGT
XTT-MGC
Toplam
Yaprak
G1
G2
1
1
Çiçeklenen
(G1+G2)
Çiçeklenmeyen
(G3)
1
2
2
1
1
1
1
1
1
1
2
1
8
1
6
Tüm
genotiplerin
yaprağında
ifade olan
3
3
2
5
3
2
2
G1
G2
Çiçeklenen
(G1+G2)
Çiçeklenmeyen
(G3)
4
4
1
1
2
2
2
4
6
1
5
4
3
51
Tüm
genotiplerin
meristeminde
ifade olan
Yaprakta Koyu
Meristemde
Koyu
2
1
2
2
2
1
2
2
3
1
3
1
5
1
1
3
2
5
1
4
2
4
6
4
3
4
1
2
2
1
1
4
1
Çiçek
Sürgünü
1
1
1
1
1
Bant Koyuluğu
Farklılığı
Meristem
3
2
2
1
2
1
1
0
3
0
0
2
1
22
2
31
40
1
54
Çizelge 4.9. Otuz bir + 44 örnek için cDNA-AFLP analizlerinde kullanılan 20 primer kombinasyonunda sadece yaprakta, meristemde, çiçek
sürgününde, meristem veya yaprakta bant koyuluğu farklılığı şeklinde ve iki farklı depolama sıcaklığı uygulamasında farklı ifade olan anlamlı
bantlar.
Farklı İfade Olan Bantlar
Primer
Kombinasyonu
(31 + 44
Örnekte)
XCT-MGT
XTG-MCG
XCA-MAGC
XTC-MAGC
XCG-MGA
XCC-MCGT
XCC-MCAT
XTG-MGA
XTT-MCAC
XCG-MCAT
XTC-MGT
XCT-MGC
XCC-MGT
XTT-MCCT
XCT-MCTA
XTT-MCTG
XTA-MAGC
XCC-MCTG
XCG-MCTA
XCT-MCCT
Toplam
Yaprak
G1
G2
1
1
G3
G4
Çiçeklenen
(G1+G2)
Bant Koyuluğu
Farklılığı
Meristem
Çiçeklenmeyen
(G3+G4)
1
1
Tüm
genotiplerin
yaprağında
ifade olan
3
1
1
G1
G2
G3
G4
Çiçeklenen
(G1+G2)
Çiçeklenmeyen
(G3+G4)
Tüm
genotiplerin
meristeminde
ifade olan
1
Yaprakta
Koyu
Meristemde
Koyu
1
1
1
1
1
2
2
1
2
Çiçek
Sürgünü
Depolama
Sıcaklığı
4°C
20°C
1
1
1
1
2
1
2
1
2
1
1
2
1
2
2
1
1
1
1
4
2
1
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
2
3
1
4
3
1
1
16
16
2
1
5
5
3
0
4
0
1
24
1
1
0
0
0
4
2
0
55
Bu bantlardan XTG-MCTG primer kombinasyonunda belirlenen G2 genotipine spesik bir
bant Şekil 4.19’da gösterilmiştir. 2007 ve 2008 yıllarında çiçeklenmeyen G3 genotipinin
farklı aşamalarından elde edilmiş yaprak örneklerinde ise farklı ifade olan dört bant
belirlenmiştir. Bu dört banttan XTC-MCCG primer kombinasyonunda belirlenen G3 genotipi
spesik bant Şekil 4.20.’de görülmektedir. Ondokuz primer kombinasyonu ile yapılan
analizlerde yine çiçeklenen G1 ve G2 genotiplerin her ikisinde ortak olarak yaprak
örneklerinde ifade olan dört bant belirlenmiştir. Bu bantlardan XTC-MGC primer
kombinasyonunda G1+G2 genotiplerinin yaprak örneklerinde ifade olan bant Şekil 4.21’de
gösterilmiştir. Sadece G1 genotipinin çiçek sürgünü örneğinde farklı ifade olan bir bant elde
edilmiştir. Bu bandın poliakrilamid jelindeki profili Şekil 4.22’de gösterilmiştir. Sarımsakta
büyüme meristeminde yapılan elektron mikroskobu ile yapılan çalışmalarda apikal
meristemin vegetatif aşamadan generatif faza geçme aşamasının bitkiler 6-7 yaprak
aşamasındayken olduğu saptanmıştır (Kamenetsky ve Rabinowitch, 2001). Bu nedenle
çiçeklenme ilgili bantların çiçeklenen sarımsak genotiplerin yaprak aşamalarından elde edilen
örneklerde
belirlenmesi
beklenmektedir.
Bu
varsayıma
göre
on
dokuz
primer
kombinasyonundan çiçeklenme ile ilişkili sekiz G1 genotipinden, altı G2 genotipinden, dört
G1+G2 genotiplerinden ve bir G1 çiçek sürgününden olmak üzere toplam 19 bant elde
edilmiştir.
Şekil 4.18. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnekte XCT-MCA
primer kombinasyonunda G1 genotipinin yaprak örneklerinde ifade olan XCT-MCA-14 kodlu
bandın (okla işaretli bant) poliakrilamid jelindeki profili.
56
Şekil 4.19. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnekte XTG-MCTG
primer kombinasyonunda G2 genotipinin yaprak örneklerinde ifade olan XTG-MCTG-18
kodlu bandın (okla işaretli bant) poliakrilamid jelindeki profili.
Şekil 4.20. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnekte XTC-MCCG
primer kombinasyonunda G3 genotipinin yaprak örneklerinde ifade olan XTC-MCCG-14
kodlu bandın (okla işaretli bant) poliakrilamid jelindeki profili.
Şekil 4.21. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnekte XTC-MGC
primer kombinasyonunda çiçeklenen G1 ve G2 genotiplerinin yaprak örneklerinde ortak ifade
olan XTC-MGC-17 kodlu bandın (üsteki okla işaretli) poliakrilamid jelindeki profili. Altta
okla işaretli bant sadece meristem örneklerinde ifade olan bandı göstermektedir.
57
Şekil 4.22. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnekte XCT-MCA
primer kombinasyonunda G3 genotipinin çiçek sürgününde farklı ifade olan XTC-MCA-45
kodlu bandın (okla işaretli bant) poliakrilamid jelindeki profili.
On dokuz primer kombinasyonundan elde sonuçlara göre meristem örneklerinde
çiçeklenen G2 genotipinde üç tane farklı şekilde ifade olan genlere ait bantlar belirlenmiştir
(Çizelge 4.8). Şekil 4.23’te XTC-MGC primer kombinasyonunda G2 genotipinin sadece
büyüme meristemi dokularından alınan örneklerde farklı şekilde ifade olan bant
görülmektedir. On dokuz primer kombinasyonu ile 31 örnekte tüm genotipler yönünden
sadece yaprak örneklerinde ifade olan fakat meristem örneklerinde ifade olmayan 51 bant
belirlenmiştir (Şekil 4.24). Buna karşılık tüm genotipler yönünden sadece meristem
örneklerinde fakat yaprak örneklerinde ifade olmayan 22 bant saptanmıştır (Şekil 4.21). Hem
yaprak hem de meristem örneklerinde ifade olan ancak yaprak örneklerinde daha fazla ifade
olan (daha koyu bant) 31 bant belirlenirken (Şekil 4.25) meristem örneklerinde daha fazla
ifade olan 40 bant elde edilmiştir (Şekil 4.26), Çizelge 4.8).
Şekil 4.23. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnek ile yapılan
XTC-MGC primer kombinasyonunda G2 genotipinin meristem örneklerinde farklı ifade olan
XTC-MGC-13 kodlu bandın (okla işaretli bant ) poliakrilamid jelindeki profili.
58
Şekil 4.24. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnek ile yapılan
XCC-MTC primer kombinasyonunda tüm genotipler yönünden sadece yaprakta ifade olan
XCC-MTC-18 kodlu bandın (okla işaretli bant ) poliakrilamid jelindeki profili.
Şekil 4. 25. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnek ile yapılan
XTA-MGT primer kombinasyonunda tüm genotipler yönünden yaprak örneklerinde daha
fazla ifade olan XTA-MGT-18 kodlu bandın (okla işaretli bant ) poliakrilamid jelindeki
profili.
Şekil 4. 26. 2007 yılı ve 2008 yılı büyüme periyodundan elde edilen 31 örnek ile yapılan
XCT-MCTG primer kombinasyonunda tüm genotipler yönünden meristem örneklerinde daha
fazla ifade olan XCT-MCTG-12 kodlu bandın (okla işaretli bant ) poliakrilamid jelindeki
profili.
Sarımsak genotiplerinin vegetatif gelişmesi, çiçeklenmesi ve gen ifadesi üzerine dikim
öncesi depolama sıcaklığının etkilerinin belirlenmesi amacıyla yapılan denemeden elde edilen
44 mRNA örnekleri ile daha önceki çalışmalarda kullanılan 31 örnekte 20 yeni primer
kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilen cDNA-AFLP analizlerinde de genotipler, örnek
dokuları ve gelişme aşamaları yönünden farklı ifade olan genler belirlenmiştir (Çizelge 4.9).
59
Araştırmanın bu aşamasında sadece çiçeklenen G1 genotipinin farklı aşamalardan elde
edilmiş yaprak örneklerinde ifade olan beş bant belirlenmiştir. Çiçeklenen G2 genotipinde de
farklılık gösteren beş bant elde edilmiş buna karşılık çiçeklenmeyen G3 genotipinde üç bant
belirlenirken çiçeklenmeyem G4 genotipinde ise farklı şekilde ifade olan bir bant
belirlenmemiştir. Yine çiçeklenen her iki genotipte (G1 ve G2) ortak olarak farklı şekilde
ifade olan 4 gen belirlenirken çiçeklemeyen genotiplerde ise farklı ifade olan ortak bir bant
bulunmamıştır. Çiçek sürgününde farklı bulunan bant sayısı ise iki olmuştur. Yaprakta
çiçeklenen ve çiçeklenmeyen genotipler arasında farklı şekilde ifade olan bantlar çiçeklenme
ile igli olarak değerlendirilmiştir. Bu durumda, çalışmanın depo sıcaklığı uygulaması
yapıldığı bu aşamada 5 tanesi çiçeklenen G1 genotipinden, 5 tanesi çiçeklenen G2
genotipinde, 4 tanesi çiçeklenen G1 ve G2 genotiplerinde ortak ve iki tanesi çiçek sürgününde
olmak üzere toplam 16 tane bandın çiçeklenme ile korelayon gösterdiği bulunmuştur.
Meristem örneklerinde farklılık gösteren bantlar yönünden değerlendirildiğinde G1 ve
G3 genotiplerinde birer bant farklı olmuştur. Meristem örneklerinde hem çiçeklenen hem de
çiçeklenmeyen genotiplerde ortak olarak farklı bir bant elde edilmemiştir. Tüm genotipler
yönünden sadece yaprak örneklerinde ifade olan 24 bant belirlenirken sadece meristem
örneklerinde
ifade
olan
4
bant
saptanmıştır.
Yaprak
ve
meristem
örneklerinin
karşılaştırılmasında yaprak örneklerinde daha koyu ifade olan bant sayısı ve meristemde daha
koyu ifade olan bant sayısı 16 tane olmuştur (Çizelge 4.9).
Sarımsak dişlerinin dikim öncesi 12 hafta süre ile 4oC ve 20oC’de depolanmasının gen
ifadesi üzerine etkisi ile ilgili iki bant belirlenmiştir (Çizelge 4.9). Bu bantlardan XCCMCAT-9 kodlu bant dişleri 4oC’de depolanan bütün genotiplerin depolama süresi sonunda
dikimden hemen önce alınan meristem örneklerinde ifade olurken aynı genotiplerin 20oC’de
depolanmış dişlerden elde edilen meristemlerde görülmemiştir (Şekil 4.27). Depolama
sıcaklığı ile ilişkili farklı şekilde ifade olan ve XCT-MCTA-6 kodlu diğer bant ise bitkiler 3-4
yaprak aşamasındayken alınan yaprak örneklerinde belirlenmiştir. Bu bant yine 4oC depolama
uygulaması yapılan dişlerden gelişen dört sarımsak genotipinin 3-4 yaprak aşamasındaki
yaprak örneklerinde görülürken 20oC uygulaması yapılan dişlerden gelişen tüm genotiplerin
yaprak örneklerinde görülmemiştir.
Bu proje araştırması kapsamında toplam 39 primer ile yapılan cDNA-AFLP
analizlerinde çiçeklenme ile korelasyonu olan toplam 35 bant elde edilmiştir. Çiçeklenen G1
ve G2 genotiplerinin yaprak ve çiçek sürgünlerinde farklı şekilde ifade olan bu bantlara ait
60
EST DNA dizilerinin NCBI gen bankasındaki BLAST analizleri sonuçları Çizelge 4.10’da
verilmiştir.
Şekil 4.27. 4oC’de ve 20oC’de depolanan sarımsak genotiplerinde depolamaya bağlı olarak
depolama süresi sonunda alınan meristem örneklerinde farklı ifade olan gen. A, C, E ve G
20oC’de depolanan sırasıyla G4, G3, G2 ve G1 sarımsak genotipleri. B, D, F ve H 4oC’de
depolanan sırasıyla G4, G3, G2 ve G1 sarımsak genotipleridir.
Bu analiz sonuçlarına göre 12 bant %41 ile %96 arasındaki benzerlik seviyesiyle diğer
bitki türlerinden elde edilen dizilerle benzer bulunmuştur. Geri kalan 23 bant ise NCBI gen
bankasındaki nükleotid veya protein dizileri ile önemli düzeyde benzerlik göstermemiştir. Bu
sonuç bu dizilerin ilk kez sarımsak genomundan elde edildiğini ya da sarımsak genomuna
spesik genler olduğunu göstermektedir.
Gerçekleştirilen cDNA-AFLP analizlerinin tümünde çiçeklenmeyen G3 genotipinin
yaprak örneklerinde farklı şekilde ifade olan yedi banda ait EST nükleotid dizilerinin NCBI
gen bankasındaki BLAST analizleri sonuçları Çizelge 4.11’de verilmiştir. BLAST analizleri
sonucunda yedi banda ait EST dizilerinden beşi %41-97 arasındaki benzerlik seviyesinde
başka bitki türlerine ait gen dizilerine benzerlik göstermiş diğer iki dizi ise benzer
bulunmamıştır.
Dikim öncesi dişlerin depolama sıcaklığının gen ifadesine etkisi ile ilişkili iki bandın
DNA dizisinin NCBI gen bankasında BLAST analizleri yapılmış ve sonuçları Çizelge 4.12’de
sunulmuştur. Bu bantlardan biri olan XCC-MCAT-9 kodlu bandın thiamin biyosentezinde
görev alan bir protein olduğu belirlenmiştir. Bu bant depolama uygulamasından hemen sonra
61
4oC sıcaklık uygulamasındaki bütün sarımsak genotiplerinin dişlerinden elde edilen meristem
örneklerinde belirlenmiş aynı genotiplerin 20oC depolama uygulaması yapılan dişlerden elde
edilen meristemlerde belirlenmemiştir (Şekil 4.27). Depolama sıcaklığı ile ilişkili diğer XCTMCTA-6 kodlu bant ise fonksiyonu belirlenmemiş bir proteinle %97 seviyesinde benzerlik
göstermiştir.
62
Çizelge.4.10. cDNA-AFLP analizlerinin tümünde çiçeklenme ile ilişkili bulunan 35 banda ait EST nükleotid dizilerinin NCBI gen bankasındaki
BLAST analizleri sonuçları.
EST
XCT-MGT-7
Büyüklüğü Farklı İfade
(bç)
Sınıfı
204
G1+G2-yaprak
XTG-MCG-13
195
G1+G2-yaprak
XTG-MGA-28
XCT-MCTA-4
131
209
G1+G2-yaprak
G1+G2-yaprak
XCA-MCCG-21
XTA-MCG-31
XTC-MGC-17
XTT-MGT-18
XTG-MCG-4-89
XTG-MGA-10
119
52
139
91
257
257
G1+G2-yaprak
G1+G2-yaprak
G1+G2-yaprak
G1+G2-yaprak
G1-yaprak
G1-yaprak
XCT-MGC-6
225
G1-yaprak
XCT-MCTA-5
XCT-MCTG-22
210
193
G1-yaprak
G1-yaprak
NCBI Gen Bankasındaki Sonuç
Fonksiyonu
E-Değeri
hypothetical
protein,
SORBIDRAFT, Sorghum bicolor,
(XP_002446653.1)
early
light-inducable
protein
(ELIP1) Arabidopsis lyrata subsp.
lyrata, (XM_002885480.1)
Benzerlik yok
Predicted protein, oxidoreductase
protein, Hordeum vulgare subsp.
Vulgare, (BAK05235.1)
Benzerlik yok
Benzerlik yok
Benzerlik yok
Benzerlik yok
Benzerlik yok
PREDICTED:
hypothetical
protein,heat shock protein (DnaJ-Cdomain),Vitis
vinifera,
(XP_002275221.1)
putative SHOOT1 protein, putative
tyrosine phosphatase, Oryza sativa
Japonica Group,
Benzerlik yok
Predicted
protein,Protein
phosphatase 2C, , Vitis vinifera,
XP_002276645.1
protein kinase 7e-04
activity
Benzerlik
(%)
41
Chlorophyll A- 2e-20
B binding
89
oxidoreductase
activity
2e-26
79
protein
translation,
folding,
unfolding
protein folding
2e-24
84
2e-26
81
Serine/threonin 7e-15
e phosphatase
activity
62
63
Çizelge.4.10. Devamı
EST
XCA-MCG-22
XCA-MCCG-18
XTA-MCG-15
XTC-MCG-4
Büyüklüğü
(bç)
102
153
250
210
Farklı İfade
Sınıfı
G1-yaprak
G1-yaprak
G1-yaprak
G1-yaprak
XCG-MCTA-8-117
XCT-MCA-14
XCT-MCA-31-30
XTC-MGC-25-2
XTC-MCG-14
183
318
138
65
106
G1-yaprak
G1-yaprak
G1-yaprak
G1-yaprak
G2-yaprak
XCT-MCTG-21
XTG-MCTG-11
XTG-MCTG-18
XTT-MGC-8
111
117
65
142
G2-yaprak
G2-yaprak
G2-yaprak
G2-yaprak
XTG-MCG-14
XTC-MAGC-10
XCC-MCAT-22
113
154
187
G2-yaprak
G2-yaprak
G2-yaprak
NCBI Gen Bankasındaki Sonuç
Fonksiyonu
E-Değeri
Benzerlik yok
Benzerlik yok
Benzerlik yok
PREDICTED:hypothetical protein,
leucine-rich repeat receptor-like
protein kinase Vitis vinifera,
(XM_002273609.1)
Benzerlik yok
Benzerlik yok
Benzerlik yok
Benzerlik yok
hypothetical
protein,
Putative
methyltransferase,
Populus
trichocarpa,
(XM_002315767.1)
Benzerlik yok
Benzerlik yok
Benzerlik yok
Peptidase M48 family protein,
Oryza sativa Japonica Group
(BAD87359.1)
Benzerlik yok
Benzerlik yok
Histone
deacetylase,
Populus
trichocarpa, (XP_002307035.1)
Protein kinase
activity
8e-14
Benzerlik
(%)
66
Transferase
activity
2e-11
76
Proteolysis
6e-17
89
Histone
deacetylase
activity
2e-11
73
64
Çizelge.4.10. Devamı
EST
Büyüklüğü
(bç)
XCC-MCAT-18
106
XCC-MCTG-31
114
XTA-MCG-32-25 55
Farklı Ifade
Sınıfı
G2-yaprak
G2-yaprak
G2-yaprak
XCT-MCA-45
XCC-MCTG-5
MCT-MGT-3
Çiçek sürgünü
Çiçek sürgünü
Çiçek sürgünü
110
255
NCBI Gen Bankasındaki sonuç
Fonksiyonu
E-Değeri
Benzerlik yok
Benzerlik yok
Unkown protein, Oryza sativa
JaponicaGroup,(NM_001188097.1)
Benzerlik yok
Benzerlik yok
Predicted protein, lipoxygenase
protein, Populus trichocarpa
(XP_002311617.1)
Bilinmiyor
9.4
Benzerlik
(%)
82
Lipoxygenase
activity
7e-08
96
65
Çizelge.4.11. cDNA-AFLP analizlerinin tümünde çiçeklenmeyen genotiplerin yaprak örneklerinde farklı şekilde ifade olan yedi banda ait EST
DNA dizilerinin NCBI gen bankasındaki BLAST analizleri sonuçları.
EST
XTG-MGA-13
Büyüklüğü
(bç)
242
Farklı İfade
Sınıfı
G3-yaprak
XTT-MCTG-2
XCA-MGA-14-31
139
214
G3-yaprak
G3-yaprak
XCA-MGA-10-27
327
G3-yaprak
XTG-MGA-3-27
285
G3-yaprak
XTC-MCCG-14-13
XTA-MCTG-14
50
157
G3-yaprak
G3-yaprak
NCBI Gen Bankasındaki Sonuç
Fonksiyonu
E-Değeri
Methionine sulfoxide reductase A,
Populus trichocarpa,(
AAS46231.1)
Benzerlik yok
Putative, cytochrome P450 family
protein, Sorghum bicolor,
(XP_002465889.1)
Reductase
activity
9e-28
Benzerlik
(%)
67
Electron
carrier activity
7e-18
69
Protein transporter, Arabidopsis
lyrata subsp. lyrata,
(XP_002885203.1)
Transcription factor, Lycoris
longituba, (ADG57935.1)
Benzerlik yok
Peroxisomal malate dehydrogenase
precursor ,Glycine max,
(BAG09381.1)
Protein
involved in
nuclear import
Regulation of
transcription
1e-07
41
3e-09
50
2e-08
97
Malate
dehydrogenase
activity
Çizelge.4.12. cDNA-AFLP analizlerinde depolama sıcaklığının gen ifadesi üzerine etkisi ile ilişkili iki banda ait EST DNA dizilerinin NCBI gen
bankasındaki BLAST analizleri sonuçları.
EST
Büyüklüğü Farklı İfade
NCBI Gen Bankasındaki Sonuç
Fonksiyonu
E-Değeri Benzerlik
(bç)
Sınıfı
(%)
XCC-MCAT-9 200
4oC-Depolama Thiamine biosynthesis protein THIC, Thiamin
6e-33
100
Zea mays, (NP_001151805.1)
biosynthetic process
XCT-MCTA-6 202
4oC-Depolama ORF 143 ,Glycine max,
Bilinmiyor
4e-11
97
66
5. TARTIŞMA ve SONUÇ
4oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkiler 20oC’de depolanan dişlerden gelişen
bitkilere göre hem daha çok yaprak hem de daha büyük bitkiler oluşturmuşlardır. Bunun
nedeni olarak 4oC’de depolanan dişlerin daha önce sürdüğü söylenebilir. Ancak 4oC’de
depolanan dişlerden gelişen bitkilerin aksine 20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerin
görünümünün zayıf olması ayrıca yaprakların virüs hastalıklarının semptomlarına benzeyen
bir fenotipe sahip olması 20oC’de depolanan dişlerden gelişen küçük bitkilerin oluşmasının
sadece geç sürmeyle açıklanamayacağını göstermektedir (bkz. Şekil 4.6). Bu da dişler
sürdükten sonra da dişlerin dikim öncesi farklı sıcaklıklarda depolanmasının etkisinin bitki
düzeyinde de devam ettiğini göstermektedir.
Shemesh ve ark. (2008), çeşitlilik gösteren bir sarımsak popülasyonu içindeki
olgunlaşmış başları dikim öncesi 4oC veya 20oC’de depolamıştır. Araştırıcılar, yaptıkları
çalışmada 4oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerin 20oC’de depolanan dişlerden gelişen
bitkilerden daha erken diş oluşturmaya başladıklarını belirtmişlerdir. Shemesh ve ark.
(2008)’nın yaptığı çalışmaya benzer olarak bu çalışmada da 4oC’ de depolanan dişlerden
gelişen bitkiler 20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerden daha önce diş oluşturmaya
başladığı gözlemlenmiştir. Örneğin G1 genotipinin 4oC’de depolanan dişlerinden gelişen
bitkilerde dikimden 115 gün sonra sekiz yaprak aşamasında diş oluşumu gözlemlenmişken
aynı genotipin 20oC’de depolanan dişlerinden gelişen bitkilerde diş oluşumu görülmemektedir
(bkz. Şekil 4.6). Bu bulgu sarımsak dişlerinin dikim öncesi düşük sıcaklıkta depolanmasının
bitkilerin daha erken diş oluşumunu teşvik ettiğini göstermektedir.
Yaptığımız çalışmadan elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde, bütün genotiplerde
o
4 C’de depolanan dişlerin 20oC’de depolanan dişlerden daha önce sürdüğü saptanmıştır. Bu
bulgu dişlerin dikim öncesi 4oC’de depolanmasının sürmeyi hızlandırdığını göstermektedir.
Ancak Shemesh ve ark. (2008) sarımsak dişlerinin dikim öncesi düşük sıcaklıkta
depolanmasının sarımsak genotiplerinin dikim sonrası sürmelerini etkilemediğini rapor
etmişlerdir. Ayrıca Shemesh ve ark. (2008), büyümekte olan bitkilerin vegetatif aşamadan
generatif aşamaya geçişleri dikim öncesi depolama sıcaklıklarından etkilendiğini ifade
etmişlerdir. Yaptığımız bu çalışmada da generatif faza geçişin 4oC’de depolanan dişlerden
gelişen bitkilerde 20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerden daha erken olduğu
saptanmıştır. Çiçeklenen G1 ve G2 genotiplerinde görülebilir çiçek sapı sekiz-on yaprak
67
aşamasında gözlemlenmiştir. Benzer olarak Kamenetsky ve Rabinowitch (2002) 4oC’de
depolanan dişlerden gelişen bitkilerin ortalama yedi-dokuz yaprak aşamasında iken görülebilir
çiçek sapı oluşturuken 20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerde bu on bir-on dört
yaprak aşamasına kadar uzadığını rapor etmişlerdir. Shemesh ve ark. (2008)’da 4oC’de sekiz
hafta depolanan dişlerden gelişen bitkilerin 20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerden
daha erken çiçek sapı oluşturduğunu gözlemlemişlerdir. Takagi (1990) ile Kamenetsky ve
Rabinowitch (2001)’te dikim öncesi dişlerin düşük sıcaklıkta depolanmasının (-2oC’den
9oC’ye) ve dikim sonrası bitkileri 17-23oC gündüz ve 9-15oC gece sıcaklık rejiminde
büyütülmesi erken çiçek sapı oluşumunu ve uzamasını teşvik ettiğini bildirmişlerdir.
Dikim öncesi sarımsak dişlerinin düşük sıcaklıkta depolanması bitki boyunun üzerine
etkili olduğu belirlenmiştir. Yaptığımız çalışmada 4oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkiler
20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilere nazaran daha uzun bitki boyuna sahip olduğu
saptanmıştır (bkz. Şekil 4.9, Çizelge 4.4). Benzer sonuç Kamenetsky ve Rabinowitch (2004)
tarafından da rapor edilmiştir. Araştırıcılar düşük sıcaklıkta depolanan dişlerden gelişen
bitkiler 20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerden daha uzun olduğunu belirtmişlerdir.
Gerçekleştirilen bu çalışma, dikim öncesi sarımsak dişlerinin düşük sıcaklıkta
depolanmasının dikimden sonra büyüyen bitkilerin gen ifade profilini etkilediğini
göstermektedir. Bu nedenle 4oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkiler ve 20oC’de depolanan
dişlerden gelişen bitkiler arasındaki gen ifade farklılığını belirlemek için yaptığımız cDNAAFLP analizinde iki adet farklı ifade olan DNA parçası belirlenmiştir. Bu bantlardan XCCMCAT-9 kodlu bandın EST dizisinin NCBI gen bankasında yapılan BLAST analizinde
thiamin biyosentezinde görev yapan ThiaminC (ADP-ribosepyrophosphohydrolase/ catalytic/
iron-sulfur cluster binding protein) proteini olduğu görülmüştür. Thiamin kükürt içeren
renksiz bir maddedir ve kimyasal formülü C12H17N4OS şeklindedir. Bitkiler tarafından
sentezlenebilen thiamin B1 vitamini olarak ta bilinmekte ve thiaminin fosfat türevleri birçok
biyokimyasal
yollarda
görev
almaktadır.
Örneğin
thiamin
pyrophosphate
(TPP)
karbohidratların ve amino asitlerin katalize edilmesinde görev alan enzimlerin kofaktörleridir.
Sarımsakta dişlerin sürmesi ve bitkilerin ilk gelişme evrelerinde gerekli olan enerji dişlerde
bulunan depo besin maddelerinin tüketilmesi ile sağlanmaktadır. Depo sıcaklığı uygulaması
çalışması sonunda elde edilen bu sonuç düşük sıcaklıkta depolamanın thiamin biyosentez
yolundaki enzimlerin aktif hale gelmesini sağladığını ileri sürmektedir. Depo sıcaklığı
uygulaması sonunda 4oC ve 20oC’de depolanan dişlerden gelişen bitkilerin arasında gelişme
68
yönünden büyük morfolojik farklılıklar görülmüştür (Bakınız Şekiller 4.1, 4.2, 4.3 ve 4.4). Bu
bitkileri 3-4 yaprak aşamasında söktüğümüzde 4oC ‘de depolama uygulamasındaki bitkinin
dişteki depo besin maddesinin büyük bir kısmını tükettiği halde 20oC’de depolama
uygulaması yapılan bitkinin ise çok az tükettiği görülmüştür (Şekil 4.5). Buda 20oC’de
depolama uygulaması yapılan bitkilerin karbonhidrat depo besin maddelerini çok yavaş
kullandığını göstermektedir. Bu çalışmadan elde edilen bulgulara göre sarımsakta thiamin
sentezinin yetersiz olması bitkinin karbonhidrat katabolizmasını çok yavaşlattığı bunun
sonucunda da vegetative gelişimini büyük ölçüde azalttığını ileri sürmektedir. Bu sonucun
daha sonra yapılacak çalışmalarla daha kapsamlı olarak araştırılması gerekmektedir. Farklı
depolama sıcaklığının faklı gen ifadesi üzerine etkisi konusunda sarımsakta ve diğer bitki
türlerinde daha önce yapılmış bir çalışmaya literatürde rastlanmamıştır. Bu nedenle bu
çalışma bu konuda yapılan ilk çalışma özelliğini taşımaktadır.
Bu çalışma ile sarımsak genotiplerinde, sarımsağın farklı gelişme dönemlerinde ve
farklı sıcaklıkta depolanan dişlerden gelişen bitkiler arasında farklı ifade olan genler cDNAAFLP yöntemi ile analiz edilmiştir. Toplamda 629 adet polimorfik cDNA-AFLP DNA
parçası belirlenmiş ve bunların nükleotid dizileri NCBI gen bankasında karşılaştırılmıştır.
cDNA-AFLP analizleri gerçekleştirilen sarımsak genotipleri arasında hem yaprak hem de
meristem örneklerinde farklı ifade olan genler belirlenmiştir. Aynı genotiplerle yapılan AFLP
ve RAPD DNA moleküler markırlarla yapılan genetik çeşitlilik çalışmalarında G1, G2, G3 ve
G4 genotipleri birbirlerinden oldukça farklı bulunmuş ve farklı gruplara sınıflandırılmıştır
(İpek ve ark. 2003). cDNA-AFLP analizleri sonuçlarına göre de bu genotipler gen ifade
düzeyinde de farklılıklar göstermektedir. Her genotipe özel farklı ifade olan genler
belirlendiği gibi ikili ya da üçlü kombinasyonlarda ortak ifade olan genler belirlenmiştir.
Çizelge 4.8 ve Çizelge 4.9’da bu çalışma amacına uygun olan yaprak ve meristemde genotipe
özel farklı şekilde ifade olan bantlar ile çiçeklenen ve çiçeklenmeyen genotiplerde ortak ifade
olan bantlar verilmiştir. Diğer ikili ve üçlü ortak ifade olan kombinasyonlar (G1+G3, G2+G3,
G1+G2+G3 v.b) ile ilgili polimorfik bantlar bu araştırma amacına göre anlamlı olmadığı için
çizelgelerde gösterilmemiştir. Ayrıca çizelgelerde genotipe özel ya da genotipler arasında
ortak olan fakat tüm aşamalardaki örneklerde ifade olan bantlar da belirlenmiş ancak
çizelgelerde gösterilmemiştir. Tüm bu farklı ifade olan bantlar değerlendirildiğinde
sarımsakta genotipler arasında gen ifade yönünden oldukça farklılıklar olduğu görülmektedir.
69
Çalışmada cDNA-AFLP profiline göre çiçeklenme ilişkili 35 aday bant belirlenmiş
ancak bu bantların NCBI gen bankasındaki nükleotid dizileri ile yapılan karşılaştırmalar
sonucunda 12 bandın nükleotid dizisi başka bitki türlerine ait dizilerle benzerlik göstermiştir.
Benzer bulanan diziler arasında çiçeklenme biyolojisi ile ilgili daha önce başka türlerde
belirlenen bir gene ait dizi bulunmamaktadır. Arabidopsis ve başka bitki türlerinde
çiçeklenme sürecinde aktif olan LEAFY, APETALA-1 ve CAULIFLOWER v.b. ‘floral
meristem-identy’ genleri ile APETALA-2, APETALA-3, PISTILLATA ve AGAMOUS v.b.
‘floral organ-identity’ genleri belirlenmiştir (Davies, 2006; Krizek, 2006). Rotem ve ark.
(2007) birisi kısmen çiçeklenip tohum üretmeyen ve diğeri normal çiçeklenip tohum üreten
iki farklı sarımsak genotipinde yaptıkları bir çalışmada LEAFY/FLO benzeri sarımsak gaLFY
genini belirlemişlerdir. Bu genin uzun ve kısa olmak üzere iki farklı mRNA’sını olduğunu ve
kısa mRNA’nın her iki sarımsak genotipinin tüm aşamalarında ifade olurken uzun mRNA’nın
sadece normal çiçeklenen genotipte çiçeklenme sırasında ifade olduğunu saptamışlardır.
Araştırıcılar sarımsakta çiçeklenme yönünden görülen bu farklılığın mRNA olgunlaşması
sırasında meydana gelen alternatif modifikasyonların (alternative splicing) etkinliği ile ilişkili
olabileceğini ileri sürmektedirler. Bizim elde ettiğimiz genlerden hiç biri bu genle bir
benzerlik göstermemiştir. Bu nedenle bu sonuçlar sarımsakta çiçeklenme sürecinde farklı bir
çok genin karmaşık bir yolla görev aldığına işaret etmektedir.
Çiçeklenme ile ilgili 35 aday banttan 23 tanesi ise NCBI gen bankasındaki nükleotid
ya da protein dizileri ile önemli derecede bir benzerlik göstermemiştir. Benzerlik göstermeyen
bantlardan bazılarının uzunluğu 150 baz çifti (bç)’den daha azdır (Çizelge 4.10). Bazı
bantların nükleotid dizisinin kısa olmasından dolayı benzerlik bulunmamış olabilir. Bu
nedenle daha sonraki çalışmalarda bu batların önce Real-Time PCR analizleri gen ifadeleri
düzeylerine bakılıp, bu analizlerde çiçeklenme ile ilişkili olanların tam cDNA dizileri
belirlenip, NCBI gen bankasındaki dizilerle tekrar karşılaştırılması yapılmalıdır.
Çalışmada meristem ve yaprak örnekleri arasında gen ifadesi yönünden farklılıklara da
bakılmış ve meristemde ya da yaprak örneklerinde farklı ifade olan genler yönünden oldukça
büyük farklılıklar bulunmuştur (Çizelgeler 4.8 ve 4.9). NCBI gen bankasındaki BLAST
analizlerine göre sadece yaprakta ifade olan bantların genelde kloroplastta görev alan genlere
ait olduğu görülmüştür (sonuçlar verilmemiştir).
Sonuç olarak, sarımsakta ilk kez cDNA-AFLP analiz yöntemi kullanılarak farklı ifade
olan genlerin belirlendiği bu çalışmada; sarımsak genomunda ifade olan genler yönünden
oldukça fazla polimorfizm olduğu belirlenmiştir. Bu çalışmada çiçeklenme ile ilgili bulunan
70
aday genler sarımsakta daha sonra yapılacak moleküler ve genetik çalışmalara temel
oluşturacaktır. Araştırmada ayrıca dikim öncesi iki farklı sıcaklık depolaması uygulamasının
bitki gelişimi ve gen ifadesi üzerine etkilerinin belirlenmesi üzerine yapılan aşaması bir
yüksek lisans öğrencisi tezi olarak yürütülmüş ve tamamlanmıştır. Bu anlamda bu proje
araştırması bir yüksek lisans öğrencisinin eğitilmesine katkıda bulunmuştur. Depolama
sıcaklığı uygulamasının gen ifadesine etkisini belirlenmesi çalışması literatüre göre ilk kez
yapılmış bir çalışma olmaktadır ve gelecekte sarımsak ile ilgili yapılacak moleküler biyolojik
çalışmalara ışık tutabilecektir.
71
6. KAYNAKLAR
ANONİM, Production FAO Statistics, Table 59 Vol: 40, FAO, Rome, (1986). Pp. 146.
ANONİM, Food And Agricultural Organization of United Nations (FAO), Economic and
Social Department: The Statistical Division, (www.fao.org), (2009).
ANONİM, Türkiye İstatistik Kurumu Bitkisel Üretim İstatistikleri Veri Tabanı,(2009).
BACHEM C.W., van der Hoeven R.S., de Bruijn S.M., Vreugdenhil D., Zabeau M., Visser
R.G., Visualization of Differential Gene Expression Using a Novel Method of RNA
Fingerprinting Based on AFLP: Analysis of Gene Expression During Potato Tuber
Development, Plant J., 9,745–753, (1996).
BARCACCİA G., Meneghetti S., Albertini E., Triest L., Lucchin M., Linkage Mapping in
Tetraploid Willows: Segregation of Molecular Markers and Estimation of Linkage Phases
Support an Allotetraploid Structure for Salix alba x Salix fragilis Interspecific Hybrids,
Heredity, 90, 169–180, (2001).
BREYNE P., Dreesen R., Vandepoele K., De Veylder L., Van Breusegem F., Callewaert L.,
Rombauts S., Raes J., Cannoot B., Engler G., Inze´ D., Zabeau M., Analysis of the
Transcriptome During Cell Division in Plants, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 14825–14830,
(2002).
BRUGMANS B., del Carmen A.F., Bachem C.W.B., van Os H., van Eck H.J., Visser R.G.F.,
2002. A Novel Method for the Construction of Genome Wide Transcriptome Maps. Plant J.,
31, 2, 211-222.
CNUDDE F., Moretti C., Porceddu A., Pezzotti M., Gerats T., Transcript Profiling on
Developing Petunia hybrida Floral Organs, Sexual Plant Reproduction, 16, 77-85, (2003).
DAVİES B., Floral Meristem Idendity Genes, The Molecular Biology and Biotechnology of
Flowering, Ed: Jordan RB, 2’nd Edition, CAB International, Wallingford, UK, (2006). Pp
404.
ETOH T., Simon P.W., Diversity, Fertility and Seed Production of Garlic, Allium Crop
Sciences: Recent Advances, Ed: Rabinowitch H.D., Currah L., CABI International;
Wallingford, UK:, (2002), 101-118.
ENGELAND R.L., Growing Great Garlic: The Definitive Guide for Organic Gardeners and
Small Farmers. Filaree Productions, Okanogan, WA, (1991).
FRİTSCH R.M., Friesen N., Evolution, Domestication and Taxonomy, Allium Crop Sciences:
Recent Advances, Ed: Rabinowitch H.D., Currah L., CABI International, Wallingford, UK.,
(2002). Pp:5-30.
IPEK M., Ipek A., Simon PW., Comparison of AFLPs, RAPD Markers, and Isozymes for
Diversity Assessment of Garlic and Detection of Putative Duplicates in Germplasm
Collections, Journal of American Society for Horticultural Sciences, 128, 246-252, (2003) .
72
IPEK, M., Comparative Analysis of Genetic Diversity in Garlic (Allium sativum L.) Using
AFLP, RAPD, and Isozyme Markers and Characterization of a Cytoplasmic Marker
Associated with the Bolting Phenotype, PhD Thesis, University of Wisconsin- Madison,
(2003).
IPEK, M., Ipek A., Simon P.W., Sarımsak Genomu Organizasyonunun PZR’a Dayalı Gen
Spesifik Markırlarla Belirlenmesi. 14. Biyoteknoloji Kongresi Bildiri ve Poster Kitabı,
Eskişehir, (2005) pp.60-63.
IPEK, M., Ipek, A., Almquist, S.G., Simon, P.W., Demonstration of Linkage and
Development of The First Low-Density Genetic Map of Garlic Based on AFLP Markers,
Theor. Appl. Genet. 110, 228–236, (2005).
IPEK, Sarımsakta (Allium sativum) Tohum Üretimi, VII. Sebze Tarımı Sempozyumu, Yalova,
(2008) pp: 210-212.
IPEK, M., Ipek, A., Simon, P.W., Genetic Characterization of Allium Tuncelianum: An
Endemic Edible Allium Species With Garlic Odor, Scientia Horticulturae, 115, 409- 415,
(2008)
JONES, H.A., Mann, L.K., Onions and Their Allies, Leonard Hill Books, London, (1963).
KAMENETSKY R., Rabinowitch H.D., Floral Development in Bolting Garlic, Sexual Plant
Reproduction, 13, 235–241, (2001).
KAMENETSKY, R., London Shafir, I., Zemah, H., Barzilay, A., Rabinowitch, H. D.,
Environmental Control of Garlic Growth and Florogenesis., Journal of the American Society
for Horticultural Science, 129, 144-151, (2004)
KAMENETSKY, R., Rabinowitch, H.D., Florogenesis, Allium Crop Sciences: Recent
Advances, Ed: Rabinowitch H.D. and Currah L., CABI International, Wallingford, UK,
(2002), Pp. 31-58.
KOUL, A.K., Gohil R.N., Langer, A., Prospects of Breeding Improved Garlic in the Light of
Its Genetic and Breeding Systems, Euphytica, 28 , pp. 457–464. (1979).
KRIZEK, B., Molecular Biology of Floral Organogenesis, The Molecular Biology and
Biotechnology of Flowering, Ed: Jordan RB, 2’nd Edition, CAB International, Wallingford,
UK, (2006). Pp 404.
MAASS, H.I., Klaas, M., Infraspecific Differentiation of Garlic (Allium sativum L.) by
Isozyme and RAPD Markers, Theoretical and Applied Genetics, 91, 89-97, (1995).
MATHEW, B., A Review of Allium Section Allium, Whitstable Litho Ltd., Great Britain,
(1996)
POOLER, M.R., Simon, P.W., Characterization and Classification of Isozyme and
Morphological Variation in a Diverse Collection of Garlic Clones, Euphytica, 68, 121-130,
(1993).
73
ROTEM, N., Shemesh, E., Peretz, Y., Akad, F., Edelbaum, O., Rabinowitch, H.D., Sela, I.,
Kamenetsky, R., Reproductive Development and Phenotypic Differences in Garlic are
Associated with Expressionand Splicing of LEAFY Homologue gaLFY, J. Exp. Bot., 58,
1133–1141, (2007).
REGEL, E., Alliorum Adhuc Cognitorum Monographia, Acta Hortic. Petrop., 3, 266, (1875).
SHEMESH, E., Scholten, O., Rabinowitch, H.D., Kamenetsky, R., Unlocking variability:
Inherent Variation and Developmental Traits of Garlic Plants Originated From Sexual
Reproduction, Planta, 227 , 1013–1024, (2008).
SHINDO, C., Sasakuma, T., Genes Responding to Vernalization in Hexaploid Wheat.
Theoretical and Applied Genetics, 104, 6-7, 1003-1010, (2002).
SIMON, P.W., Jenderek, M.M., Flowering, Seed Production and The Genesis of Garlic
Breeding, Ed: J. Janick, Plant Breeding Rewiews, John Wiley& Sons Inc., New York,
(2003), Pp: 211-243.
TAKAGI, H., Garlic Allium sativum L., Biochemistry, Food Science and Minor Crops:
Onions and Allied Crops, Eds: Brewster, J.L., Rabinowitch, H.D., vol.III,. CRC Press Inc,
Boca Raton, Florida, (1990), Pp. 109–146.
TAKHTAJAN, A., Diversity and Classification of Flowering Plants. Colombia University
Press, New York, (1997), Pp: 643.
VAVILOV, N. I. , Dorofeev, V. F, The Phyto-geographical Basis for Plant Breeding [first
published in Russian, translated by Love D. (1992)], Ed: V. F. Dorofeyev, Origin and
Geography of Cultivated Plants (English edn). University Press, Cambridge, (1935).
VOS, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., Lee, T.V., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J.,
Peleman, J., Kupier, M., Zabeau, M., AFLP: A New Technique for DNA Fingerprinting,
Nucleic Acid Research, 23, 4407-4414, (1995).
WOODWARD, P., Garlic and Friends: The History, Growth and Use of Edible Alliums,
Hyland House, South Melbourne, Victoria Australia, (1996).
VVEDENSKY, A., The Genus Allium in The USSR, Herbertia, 11, 65-218, (1944).
VURAL, H., Eşiyok, D., Duman, İ., Kültür Sebzeleri (Sebze Yetiştirme), Ege Üniversitesi,
Ziraat Fakültesi, Bornova, İzmir, (2000), Pp: 440.
74
TÜBİTAK
PROJE ÖZET BİLGİ FORMU
Proje No: TOVAG-105 O 551
Proje Başlığı: Sarımsakta (Allium sativum L.) Gen İfade Profili (mRNA) Analizi ve Çiçeklenmeyi
Kontrol Eden Aday Genlerin Belirlenmesi
Proje Yürütücüsü ve Araştırmacılar: Doç.Dr. Meryem İPEK, Yrd. Doç. Dr. Ahmet İPEK, Doç.
Dr. Murat ŞEKER, Özlem GÜNAYDIN
Projenin Yürütüldüğü Kuruluş ve Adresi: Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri
Bölümü Görükle, 16059 Bursa
Destekleyen Kuruluş(ların) Adı ve Adresi: Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma KurumuAnkara, Wisconsin Üniversitesi- Bahçe Bitkileri Bölümü-Madison, A.B.D., Uludağ ÜniversitesiBursa
Projenin Başlangıç ve Bitiş Tarihleri:01.03.2007-01.03.2011
Öz (en çok 70 kelime)
Çiçeklenen ve çiçeklenmyen sarımsak genotipleri arasındaki farklı gen ifadesin karşılaştırıldığı bu
çalışmada toplam RNA farklı gelişme aşamalarındaki farklı doku örneklerinden elde edilen 75
örnekten izole edilmiştir. Otuz dokuz primer kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilen cDNAAFLP analizlerinde genotipler arasında, farklı bitki gelişimi aşamalarında ve farklı bitki dokularında
farklı şekilde ifade olan genlere ait 629 tane EST dizisi belirlenmiştir. Çiçeklenme ile ilişkili 35
aday gen belirlenmiş ve bunlardan 12 tanesi NCBI gen bankasındaki çiçeklenme ile ilgili olmayan
genlerle benzerlik göstermiştir. Geriye kalan 23 aday gen ise NCBI gen bankasındaki genlerle
benzerlik göstermemiştir.
Anahtar Kelimeler: Sarımsak, Allium sativum L, cDNA-AFLP, farklı gen ifadesi, çiçeklenme.
Fikri Ürün Bildirim Formu Sunuldu mu?
Evet
Gerekli Değil
Fikri Ürün Bildirim Formu’nun tesliminden sonra 3 ay içerisinde patent başvurusu yapılmalıdır.
Projeden Yapılan Yayınlar:
İpek M., İpek A., Günaydın Ö., Simon P.W. 2009. Sarımsakta Farklı İfade Olan Genlerin Analizi.
XVI. Ulusal Biyoteknoloji Kongresi, 13-16 Aralık, Antalya, s 136-138. (Sözlü sunum-tam metin
bildiri)
İpek M, A. İpek, Günaydın Ö., Aydoğan Ç. 2010. Sarımsakta Farklı Gelişme Dönemlerinde
Transkript Profilininin cDNA-AFLP Yöntemi ile Belirlenmesi,I. Ulusal Moleküler Biyoloji ve
Biyoteknoloji Kongresi, 26-29 Ekim, Antalya,.s.33. (Sözlü sunum-özet bildiri)
Günaydın Ö. 2011. Sarımsakta (Allium sativum L.) Düşük Sıcaklıkta Depolama
Uygulanmasından Farklı Etkilen Aday Genlerin cDNA-AFLP Yöntemi İle Belirlenmesi. Yüksek
Lisans Tezi. Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Görükle, 16059 Bursa
75