Sevim GÖNEN

Dr. Sevim GÖNEN
Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi
Doku Tipleme Laboratuvarı
Panel Reaktif Antikor Düzeyleri??
 Reddedilmiş böbrek nakli ve kan transfüzyonları
sonrasında veya kadınlarda gebelik döneminde gelişebilen
Panel reaktif antikor düzeyleri çeşitli yöntemlerle
belirlenebilmektedir.
DOKU ANTİJENLERİNE KARŞI ANTİKORLAR NASIL SAPTANIYOR?
40 Yıllık Gelişim…
Hücresel antikor saptama testleri:
 CDC (Kompleman Bağımlı Sitotoksisite)
 Akım sitometrisi (1983)
Solid faz antikor saptama testleri (SPADS):
Rekombinant HLA Sınıf I ve II molekülleriyle kaplanmış solid bir
matriks/mikropartiküller ve optik okuma yöntemi kullanılmaktadır.
 – ELISA
 – Luminex
Transplantation 2008;86: 384–390, Human Immunology
2009; 70:610-617 ,Curr Opin Organ Transplant 2009;14:392397
Teknolojinin İlerleyişi…
 Böbrek bekleme listelerinde bekleyen hastaların
serumlarındaki antikorları tespit etmede kullanılan en eski
ve en klasik yöntem CDC…
 Fakat antikor özgüllüklerini tayin etmede düşük duyarlılık
ve düşük çözünürlüğe sahip olmasından dolayı yeni
arayışlar…
Teknolojinin İlerleyişi…
 1990’lı yıllarda ELISA teknolojisinin gelişmesiyle
lenfositlerin yerine HLA molekülleri kullanılmaya
başlanıyor…
 CDC ve ELISA’dan daha fazla hassasiyete sahip olduğu
için Luminex teknolojisi son 10 yıldır yaygın şekilde doku
tipleme laboratuvarlarında yerini alıyor.
PRA tespitinin duyarlılığının ve özgüllüğünün arttırılması
için kullanılan hücresel ve solid faz temeline dayalı testler:
Hedef
lenfositler
Kompleman bağımlı sitotoksisite
Akım sitometrisi
HLA-A1
HLA-A2
HLA-A3
HLA
molekülleri
HLA-B7
ELISA
Luminex
6
Kompleman Bağımlı Sitotoksisite (CDC)
 Tamamen canlı hücreye dayanır.
Lenfosit izolasyonu
Kompleman ilavesi
Boya
Mikroskobik değerlendirme
Dezavantajları
 Düşük düzeydeki Sınıf I ve Sınıf II antijenlerine özgül
antikorlar belirlenememektedir.
 Sadece aktivasyonu komplemana bağlı olan antikorlar
(IgG1,IgG3) saptanabilmektedir.
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA)
 Antijen- antikor ilişkisini, antikora bağlanmış bir enzimin
aktivitesini araştırmak temeline dayanan kantitatif ölçüm
yöntemidir.
Kuyular yıkama solüsyonu ile rehidrate edilir.
Dilüe edilmiş hasta serumu, kontroller ve enzim
işaretli anti-IgG antikoru eklenir.
Enzime uygun bir kromojen substrat ortama konulur.
Sisteme bağlanmış enzim bu substratı parçaladığında ortaya
çıkan renk, yapılacak kolorimetrik yöntemlerle ölçülerek
bağlanmış olan enzim dolayısıyla bağlanmış olan antikor
hakkında fikir verecektir.
Flow PRA Tarama Testi
 İnsan serumundaki PRA’nın akış sitometrisi ile hızlı bir
şekilde saptanması için önceden kalibre edilmiş reaktifler
bulunmaktadır.
 FlowPRA boncuklarının her birinin reaktivitesi, insan
alloserumları ve spesifik HLA monoklonal antikorlar
kullanılarak akış sitometrisi ile teyit edilmiştir.
Serumda anti-HLA antikoru varsa Flow-PRA boncuklarına bağlanır. Floresan
işaretli anti-human IgG antikoru ile boyanmadan sonra, anti-HLA IgG pozitif
serumu, negatif seruma kıyasla bir floresan kanal geçişi gösterir.
 Flow PRA Tarama: Test serumunda bulunan HLA
antikorlarının yüzde miktarını verir.
FlowPRA I boncuklarının FSC-SSC nokta alanı
FlowPRA II boncuklarının FSC-SSC nokta alanı
Flow PRA Spesifik Testleri:Antikorların hangi HLA
antijenine spesifik olduğunu belirler.
Luminex : Cihaz, iki lazer içeren mini dijital akım
analiz sisteminden oluşmaktadır.
Sıvı lazerden geçtiğinde ilk geçişte boncuklar HLA
tipine göre sınıflandırılır.
İkinci geçişte PE işaretli anti human IgG bağlı HLA
moleküllerine göre boncuklar taranır.
MFI NEDİR?
 PRA pozitifliğini saptamak için boncuğun median
fluorescent intensity (MFI) değeri: Üç negatif kontrol
boncuğunun MFI değerine bölünür ve elde edilen
değerden arka plandaki ayarlama etkeni çıkarılarak üç
farklı ayarlanmış oran elde edilir.
Pozitif nedir?
Negatif nedir?
MFI 2000
MFI değerleri icin konsensus yok!!!:
DSA için değişik yorumlamalar : evet/hayır
Luminex PRA Tarama
LuminexPRA Tanım II
Tek Antijen (Single Antigen) Boncuk Çalışması ile
Donöre Özgü Antikorların Saptanması
 Tek HLA molekülleri ile kaplanmış [single antigen bead
(SAB)] solid faz çalışmaları, hastanın HLA antikor
spesifisitelerini, donörün HLA tiplemesi ile sanal olarak
karşılaştırarak donöre özgü HLA antikorlarının
saptanmasına imkan sağlar.
 Özel bir test olan SAB ile saptanan donöre özgü antikor
(DSA)'ların klinik ile ilişkisinin belirlenmesi son derece
önemlidir.
HLA Antikor özgüllüğünü tanımlamak için Luminex tek antijen boncuk çalışması mükemmel bir
araçtır
MFI ( mean fluorescence intensity)
Boncuklar bireysel HLA
antijenleriyle kaplıdır…
27
Önceden başarısız bir böbrek transplantasyonu geçiren hastanın
serumundan 3 farklı teknik kullanılarak (CDC-PRA,ELISA-PRA
ve L-SAB) donör HLA’sına karşı uyumsuzluk gösteren HLA B27
antijenine karşı DSA tespit edilmiştir.
CDC-PRA: B27+Extras
ELISA-PRA: A23,A24,B7,B27,B60,B61+Extras
L-SAB:
A23,A24,A25,A29,A32,A33,A66,A74,B7,B13,B18,B27,B35,B37,B38,B39,B42,B44,B47,B48,
B53,B54,B56,B57,B58,B59,B60,B61,B63,B67,B73,B76,B81
Sensitize Hastada Transplantasyon Öncesi
İmmunolojik Risk Değerlendirilmesi
Human Immunology 70 (2009) 563–568
PRA TAYININDE KULLANILAN YÖNTEMLER /DUYARLILIK
 Method
Pozitif (n)/Toplam(n)
%
 CDC
12
/ 66
18
 ELISA
32
/ 66
48
 FLOW
48
/ 66
73
 Analysis of HLA Presensitization (PRA) W.E. Herczyk 2003
3 Farklı test tekniği karşılaştırılmıştır:
 CDC ,ELISA ve Akım Sitometrisi:
 Solid faz testlerinin duyarlılığı, hücre temelli testlere göre
daha yüksektir.
 Ancak serumdaki birçok bileşen etkileyebilir.
 Bu nedenle standartizasyon dikkatli bir şekilde yapılmalı
ve tayinlerin klinik olarak eşik değerleri önemlidir.
 2009’dan itibaren ABD’de kullanılmaktadır. 2003-2005
yılları arasında 12000 kadavra donörün HLA’ları
kullanılmış.
 Merkezler her hastası için “kabul edilemez MM” leri
sisteme girdiğinde sistem bir PRA tahmini yapmaktadır.
 Gerçek PRA ölçümleriyle korelasyonu oldukça iyi
bulunmuştur.
PRA HESAPLANMASI
 Eurotransplantta, benzer bir uygulama olan “Virtual PRA”
uygulamasını başlatmıştır.
Human Immunology 70 (2009) 636–639
Received date: 16-Mar-2015
Accepted date: 20-Mar-2015
Virtual PRA replaces traditional
PRA: small change but
significantly more justice for
sensitized patients
Caner Süsal and Christian Morath
Departments of Transplantation
Immunology and Nephrology, University
of Heidelberg,Germany
SONUÇ 1
CDC
Avantaj: Ucuza mal edilir.
Dezavantaj: Canlı hücre gerektirir.
Duyarlılığı düşüktür.
HLA için spesifik değildir.
SONUÇ 2
AKIM SİTOMETRİSİ
Avantaj: Duyarlılığı CDC’den fazladır.
Farklı hücre tiplerini ve Ig G sınıfı/alt tiplerini
ayırabilir.
Dezavantaj: Reaktif ve donanımları pahalıdır.
HLA için spesifik değildir.
SONUÇ 3
SOLİD FAZ TEKNİKLER
Avantaj:Yüksek duyarlılık ve özgüllük sağlar.
Canlı hücreye gerek duyulmaz.
Az serum ile çalışılabilir.
Dezavantaj: Birçok serum faktöründen etkilenebilir.
SONUÇ 4
Tek Antijen Boncuk
(SİNGLE ANTİGEN)
Avantaj: Mevcut bütün antikorları saptar.
Epitop veya allel spesifik antikorları
tanımlayabilir.
Cw,DP ve DQ’ya karşı antikorları tayin edebilir.
Dezavantaj:Tek boncukla temsil edilen antijen, degişik
miktardaki antijen ve bozulmuş molekülleri
kaçırılabilir.
Multipl antikorların toplam düzeyini
vermeyebilir.
 ELISA, Flow-PRA veya Luminex gibi yöntemlerle
saptanmış sitotoksik olmayan antikorlar transplantasyonda
risk faktörü,
 CDC ile saptanmış antikorlar kontrendikasyon olarak
görülmelidir.
Am J Transplant 2003;3:1488–500
Teşekkürler…