ANTİ HLA ANTİKORLARI ve TAYİN YÖNTEMLERİ

ANTİ HLA ANTİKORLARI
ve TAYİN YÖNTEMLERİ
Yrd. Doç.Dr. Hilmi Tozkır
Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi
KONULAR ve AKIŞ PLANI
NEDİR?
NASIL OLUŞUR?
NELERE NEDEN OLUR?
CEVAP ARANAN SORULAR?
NELER YAPILABİLİR?
NASIL TESPİT EDERİZ?
ANTİ-HLA ANTİKORU NEDİR?
İNSAN LÖKOSİT ANTİJENLERİNE
(Human leucocyte Antigens – HLA) KARŞI
OLUŞMUŞ OLAN ANTİKORLARA ANTİ-HLA
ANTİKORU veya PANEL REAKTİF ANTİKOR (PRA)
DENİR.
Panel Reaktif Antikor (PRA) oluşması
nedenleri
Kan Transfüzyonu
Gebelik (Özellikle Multiparlarda)
Doku veya organ transplantasyonları
(2. veya 3. transplantasyona
hazırlanan hastalar)
** PRA duyarlılığının nedeni bilinmeyen bir hasta
grubunun da varlığı, diğer olası faktörlerin
araştırılmasına yol açmıştır.
Yüksek PRA oluşumu ve nedenleri(1)
PRA %85’ in üzerinde olan hastalara” high immune”
hastalar denilmektedir.
Bu hastalarda organ bulma şansları diğer hastalara
göre düşüktür. Çünkü birçok antijene karşı antikor
taşıdığı için cross-match testi pozitif çıkmaktadır.
Yüksek PRA oluşumu ve nedenleri(2)
Bazı hastalar geniş spektrumda antikor üretmeye
meyillidir. Bu hastalar özellikle nadir doku grupları
(A29, A33, B37, B70, CW3) taşıyan hastalardır.
BW4 ve BW6 homozigot hastalar
Kan transfüzyonuna bağlı anti-HLA
antikorları oluşma nedenleri(I)
Transplantasyon öncesi renal yetmezlikli
hastalarda sıklıkla hemoglobin %6-8 mg,
hematokrit ise %20-25 dolayındadır.
Eritropoetin sentez ve serbestleşmesinin
bozulması ile hastalarda anemi
gelişmektedir.
Kan transfüzyonuna bağlı anti-HLA
antikorları oluşum nedenleri (2)
Yapılan Kan transfüzyonlarında HLA uyumu olmadığı
için bu hastalarda HLA antijenlerine karşı
antikorlar oluşmaktadır. Bu antikorlar da olası
organ transplantasyonuna engel
oluşturabilmektedir.
Son yıllarda rekombinant insan eritropoetinin
kullanımı ile hastaların anemileri tedavi edilmekte
ancak çok mecbur kalındığı durumlarda kan
transfüsyonlarına baş vurulmaktadır.
Multipar Kadınlarda Antikor Oluşma
Nedenleri
Antikoru oluşturan neden çocuğa babadan geçen HLA
antijenleridir.
Fetus normalde anne için immunojeniktir. Çünkü
babadan gelen antijenler anne için yabancı sayılır.
Birinci gebelikte bu antijenlere karşı IgM antikorları
gelişirken, ikinci ve
sonraki gebeliklerde IgG
antikorları bol miktarda yapılır.
Böbrek bekleme listesindeki hastalarda
oranı ülkeden ülkeye değişmekle birlikte
ortalama %10-25 arasında presensitize (PRA
pozitif) hasta vardır.
Yüksek panel reaktif antikor (PRA) düzeyi olan
hastalar, transplantasyon bekleme listelerinde
giderek artmaktadır. Bu nedenle PRA
sensitizasyonunu etkileyen faktörler üzerinde
durulmaktadır.
Renal transplantasyon hikayesine ek olarak HD
süresinin PRA sensitizasyonunda etkili
bir faktör olduğu gösterilmiştir.
Bu bulgu, HD süresi uzadıkça, hastanın PRA
sensitizasyonuna yol açacak kan, kan ürünleri,
ilaçlar, bio uyumsuz membranlar gibi eksternal
antijenlerle karşılaşmış olma riskinin artmasıyla
açıklanabilir.
CEVAP ARANAN SORULAR?
On üniteden fazla kan transfüzyonu almış
olmasına rağmen PRA titresinin negatif veya
2 ünite kan transfüzyonu olan bireylerde PRA
pozitifliği
Hiç transfüzyon, hamilelik veya
transplantasyon hikayesi olmadan PRA
titresinin yüksek olduğu bir hasta grubunun
saptanması,
İnsan lökosit antijen (HLA) gen dağılımı ve PRA
duyarlılığı arasındaki ilişki halen araştırılan bir
konudur.
Rekombinan human eritropoetin (r-HuEPO)
tedavisinin, kan transfüzyon ihtiyacını azaltarak PRA
pozitiflik oranını düşürebilir.
Hepatitis C virus (HCV) enfeksiyonuna sekonder
olarak gelişen pek çok immünolojik bozukluk
bildirilmiştir. Bu nedenle,HCV enfeksiyonu ve PRA
pozitifliği arasında bir ilişki olabileceği öne
sürülebilir.
Hayatlarında hiç kan transfüzyonu yapılmamış veya organ
nakli olmamış sağlıklı erkeklerin serumlarında
anti-HLA antikorlarının varlığı bulunmuştur.
Bu HLA antikorları mikroorganizmalarda ve allerjenlerde
Bulunan cross-reaktif epitoplara karşı oluştuğu
düşünülmektedir.
Örnek olarak HLA-B27’nin Klebsiella pneumoniae,
Shigella ve Yersinia ile cross-reaktivitesi rapor edilmiştir.
Presensitize hastanın dezavantajları
Daha az organ bulma şansı, çünkü:
-
pozitif Cross-Match
Daha kötü greft sağkalımı, çünkü:
Genel olarak daha yüksek alloreaktivite
- Donor-spesifik antikorların çok görülmesi
PRA düzeyinin akut rejeksiyon atağı
riskinin ve transplantasyon sonrası HD
ihtiyacının belirlenmesinde, graft sürvisi
uzunluğu ile ilgili prediktif değeri vardır
Anti-HLA antikorlarına sahip diyaliz
hastalarında bu antikorların seviyesini
azaltmak veya ortadan kaldırmak
önemlidir.
Bunun için bugün başvurulan metodlar; 1.
Plazmaferez,
2. Protein A immunoadsorpsiyon,
3. İntrovenöz immunoglobulin,
4. B-Hücre spesifik ajanlar ile
İmmünosüpressiyon
5. Kombinasyonlar.
Plazmaferez ve düşük doz introvenöz
immunuglobulin (100mg/vucut ağırlığı,
her bir doz için) en yaygın ve etkili
metoddur.
Plazmaferez ile birlikte düşük doz
intravenöz immunoglobulin dönörü olan
hastalar için (living dönor) en sık
başvurulan yöntemdir.Yüksek doz
intravenöz immunoglobulin kadavradan
yapılacak Tx da önemlidir
Bu tanımlanan anti-HLA antikorlarının seviyesini
azaltıcı veya ortadan kaldıran metodlar, morbitide
ve mortaliteye de sebebiyet verdiği bilinmektedir.
Bunlara ilave olarak Tx dan sonra humoral
rejeksiyon oranının da yüksek olduğu rapor
edilmiştir [9,10].
Vericiye özgü antikor (donor specifik antibodyDSA) saptanırsa; bunların IgG mi yoksa IgM mi
olduğu, hangi hedef hücreye (T, B) mi özgü
olduğunun bilinmesi önemlidir.
Nakilden önce bu antikorların saptanması,
rejeksiyon riski olan nakillerin belirlenmesine
yardım eder. Çünkü lenfositler HLA antijenlerini
yüksek oranda eksprese eder ve DSA’ların
belirlenmesi için hedef hücre olarak seçilirler
Organ Transplantasyonlarında;
Cross-Match’in negatif olması akut
rejeksiyon için yeterli değildir.
Hastada daha önceden donöre karşı PRA
gelişip gelişmediği bilinmelidir.
PRA pozitifliğinin bilinmesinde
hastanın avantajları
PRA pozitifliği olan hastada anti-HLA antikoru
tanımlanırsa, bu HLA antijenini taşıyan
donörlerden organ transplantasyonu yapılmaz.
PRA pozitifliği olan hastaya Cross-Match negatif olan
donör bulunduğunda bu verici ile yapılacak
transplantasyon öncelik kazanır.
Hastada, donörün HLA antijenlerine karşı önceden
gelişmiş PRA pozitifliği var ise, transplantasyondan
vazgeçilir.
HLA antijenleri ile karışabilen oto
antikorların ayırt edilmesi
Teste DTT ilave edildiğinde, IgM antikorlarının
yapısı bozulur ve Cross-Match negatif olur.
Bu antikorlar transplante edilen organ için zarar
oluşturamazlar.
Özellikle viral enfeksiyonlarda ve Lupus
Eritematosus’ da görülürler.
Grafttaki uyumsuz HLA antijenlerine karşı
hümoral immün cevap farklı alloantikorların
üretilmesine sebep olabilir. Bu antikorların
bazıları sınıf I, bazıları ise sınıf II
antijenlerinin ortak veya özel yapılarına özgü
olabilir.
Bazı literatürlerde de, HLA sınıf I DSA’lar
erken graft yetmezliği ile ilişkili iken HLA sınıf
II DSA’ların ise uzun dönem graft
yetmezliği ile ilişkili olduğu açıklanmıştır.
Antikorlar doğrudan grafta bağlanarak
aktive olan verici endotel hücrelerinde
rejeksiyonu başlatabilir.
Antikorların üretiminin akut rejeksiyon
ataklarından çok organ fonksiyonu ve sağkalımı
üzerindeki etkisinin daha kötü olduğu
belirtilmektedir.
Kronik graft yetmezliğinin gelişiminde en önemli
risk faktörlerinden biri erken akut rejeksiyon
ataklarının ve DSA’ların oluşumudur
Böbrek nakli sonrasında DSA’ların
saptanması rejeksiyon tedavisine başlanması için
bir gösterge olabilmektedir.
NASIL TESPİT EDERİZ?
Böbrek Transplantasyonuna Aday olan
Hastalara PRA Testi bir kere yapılmaz.
Dializ Hastalarına:
Her kan transfüzyonunu takiben 3 hf. sonra
Yılda 4 kez büyük panel ile yapılmalı
Panel Reaktif Antikor (PRA) aranması
Screening Testi
Cross-Match’i pozitif olan veya olmayan
hastalarda, herhangi bir HLA antijeni veya
antijenlerine karşı antikor olup olmadığını
belirlemek için yapılır.
PRA Tayin Yöntemleri
CDC
ELİSA
Flow-cytometri
Luminex-Lifematch Fluroanalyser
CDC TESTİ
Tamamen canlı hücreye dayanır..
ELİSA ile PRA antikorlarının
saptanması
40 donor plateletlerinden elde edilen I. Sınıf HLA
glikoproteinler kuyular üzerine immobilize edilmiş
olarak kullanılır.
- Kuyular yıkama solusyonu ile rehidrate edilir
- Dilue edilmiş hasta serumu ve kontroller eklenir.
- Enzim işaretli anti-IgG antikoru eklenir
- Enzim aktivitesi kromojenik sustrat eklenerek
ölçülür.
FLOW-PRA
HLA Sınıf I ve Sınıf II antijenleri ile kaplı
mikroboncuk ( bead ) havuzu kullanılarak HLA
antikorlarının Flow Sitometri aracılığıyla
taranmasıdır.
FLOW-PRA’nın ÖZELLİKLERİ
Düşük yoğunluktaki HLA Sınıf I
antikorlarının ve Sınıf II antikorlarının
saptanmasını sağlar.
Aktivasyonu komplemana bağlı olan
antikorların (IgG1, IgG3) yanısıra,
aktivasyonu komplemana bağlı olmayan
antikorların (IgG2,IgG4) tesbit
edilmesinde rol oynar.
FLOW-PRA TESTLERİ
Flow-PRA screening
Test serumunda bulunan HLA antikorlarının
yüzde miktarını verir.
Flow-PRA spesifik
Bu antikorların hangi HLA antijenine spesifik
olduğunu belirler.
FLOW-PRA SCREENİNG TESTİ
Flow -PRA Sınıf I Screening Testi
Flow -PRA Sınıf II Screening Testi
Flow -PRA Sınıf I ve Sınıf II Screening
Testi
KONTROLLER
Negatif Kontrol
Sınıf I Pozitif Kontrol
Sınıf II Pozitif Kontrol
FLOW-SİTOMETRİ YÖNTEMİ İLE
ANTİ-HLA ANTİKORLARIN TESPİTİ
FlowPRA I boncuklarının FSC-SSC nokta alanı
FlowPRA II boncuklarının FSC-SSC nokta alanı
FLOW-SİTOMETRİ YÖNTEMİ İLE
ANTİ-HLA ANTİKORLARIN TESPİTİ
Sınıf I ve Sınıf II boncuklarının ayırt edildiği FL2 histogramı
FLOW-SİTOMETRİ YÖNTEMİ İLE
ANTİ-HLA ANTİKORLARIN TANIMLANMASI
FLOW-SİTOMETRİ YÖNTEMİ İLE
ANTİ-HLA ANTİKORLARIN TANIMLANMASI
FLUOROANALİZÖR YÖNTEMİ İLE
ANTİ-HLA ANTİKORLARIN
TESPİTİ VE TANIMLANMASI
LUMINEX TECHNOLOGY
Amplicon labeled with Biotin during PCR is mixed with the bead mix and it will
bind to a complementary probe during hybridization.
Allele DRB 1 *0101
*
Allele DRB 1 *07
Allele DRB 1 *07
*
Allele DRB 1 *0101
*
*
Allele DRB 1 *07
Allele DRB 1 *0101
*
Allele DRB 1 *07
*
*
Allele DRB 1 *0101
*
LUMINEX TECHNOLOGY
Sample will be taken up by the instrument and will pass the lasers.
Detection of Signal
*
Red Laser
determines
bead set
*
*
Green laser
quantify
Captured
amplicon
*
*
*
*
*
*
Two different
lasers are
directed on the
flow cell
*
*
Flow
DSA?
Özet olarak
Yüksek Oranlı PRA olan hastalar için öneriler
Iyi bir HLA uyumu
Hassas cross-match
Spesifik peri-operatif uygulamalar
Plazmaferez/Immun-adsorbsiyon
± IvIg
± Rituximab
Soğuk iskemi zamanı
HLA Uyumu
PRA
Alıcı Yaşı
İmmunsupresyon
Graft Sağkalım
Gecikmiş graft
fonksiyonu
Akut rejeksiyon
Verici yaşı
Sonuç olarak solid organ nakillerinde, özellikle en
sık yapıldığı için renal Tx’da greft sağ kalımı ve
greft ömrü göz önüne alındığında
cross matchlerin kesin negatif ve anti-HLA
antikorlarınında olmaması Tx’un başarısında en
önemli faktörlerden birisidir.