Bildiri Başlığı Kelimelerin Baş Harfleri Büyük Olacak Şekilde, 14

24. Ulusal Kimya Kongresi, Zonguldak Karaelmas Üniversitesi, 29 Haziran-2 Temmuz 2010, Zonguldak
His-Tag İçeren Rekombinant Proteinlerin Manyetik
Nanopartiküllerdeki Affinite Uygulamaları
Özge KOZGUŞb, Alper BABADOSTUa, Selin ECEa, Tayfun YILMAZb, Serap
EVRANa, Dilek ODACIa, Perihan ÜNAKb, Figen ZİHNİOĞLUa, Suna TİMURa
Ege Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyokimya Bölümü, 35100 Bornova/İzmir
Ege Üniversitesi, Nükleer Bilimler Enstitüsü, Nükleer Uygulamalar Bölümü, 35100
Bornova/İzmir
[email protected]
a
b
Alkol dehidrogenazlar, prokiral ketonlardan alkollerin (S) veya (R) enantiomerlerinin
sentezinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Farklı substrat spesifikliğine ve yüksek aktivite,
enantioselektiviteye sahip mikrobiyal kaynaklı alkol dehidrogenazların karakterizasyonu
önem kazanmıştır. Thermus thermophilus alkol dehidrogenaz (ADHTt) tetramer yapılıdır ve
kısa zincir dehidrogenaz/redüktaz süperailesinin bir üyesidir (Pennacchio et al., 2008).
Rekombinant proteinlerin saflaştırılmasında metal-şelat afinite kromotografisi yaygın olarak
kullanılmaktadır. Affinite kolonlarında matriks olarak Sefaroz 6’ya kovalent bağlı iminodiasetik
asit kullanılmaktadır [1].
Bu çalışmada, affinite kolonlarına alternatif olma potansiyeli bulunan manyetik-Fe 3 O 4
nanopartiküller(MNP) sentezlenerek, tetraetil-ortosilikat ve ardından amino silan ile kaplanarak
yüzeyde fonksiyonel amino grupları oluşturuldu. Oluşturulan fonksiyonel gruplar üzerinden amino asit
türevleri ve metal bağlanarak hazırlanan manyetik nanopartiküller C-terminalde His-tag içerecek
şekilde E.coli’de heterolog ekspresyonu gerçekleştirilen T.thermophilus alkol dehidrogenaz
enzimi kullanıldı. Genomik DNA’dan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yoluyla amplifiye
edilen alkol dehidrogenaz geni, pQE70 ekspresyon vektörüne klonlandı. pQE70/adh Tt ve
pDMI, 1 vektörlerinin elektrokompetent E.coli JMB9 hücrelerine transformasyonu
gerçekleştirildi. Heterolog ekspresyon LB büyüme ortamında, 0,3 mM IPTG varlığında ve
37ºC’de 4 saat süreyle gerçekleştirildi. Hücreler sonikasyon yardımıyla parçalandı ve
homojenat 2 saat hazırlanan manyetik nanopartiküllerle muamele edildi. Elde edilen Alkol
Dehidrogenaz/aminoasit/metal
bağlı
manyetik
nanopartiküller
ile
hazırlanan
biyonanopartiküller enzimin saflaştırılması ve elektrokimyasal ölçüm sistemi ile NAD+
izlenmesi biyosensör uygulaması ile gerçekleştirildi. Optimizasyon çalışmaları sonrasında
karakterizasyon çalışmaları yapıldı.
Şekil: Elde edilen nanopartiküllerin AFM görüntüleri.
KAYNAKLAR
1. Pennacchio, A., Pucci, B., Secundo, F., La Cara, F., Rossi, M. and Raia, C.A., Applied
and Environmental Microbiology, 74(13), 3949–3958, 2008.
2. Medine, İ., 2008, 125/131I işaretli urasil’in glukuronid sentezi ve manyetik özellik
kazandırılarak yeni bir manyetik ilaç taşıyıcı oluşturulması. Doktora Tezi, EÜ Nükleer
Bilimler Enstitüsü, 69-72s.