KimyaKongreleri.org

7. Ulusal Afinite Teknikleri Kongresi, Ege Üniversitesi, 13-15 Eylül 2013, Çesme / Izmir
P-14
Arginin, Lizin Ve Histidine Spesifik Bir Floresans Protein Sensörünün Tasarlanması,
Rekombinant Üretimi Ve Saflaştırılması
Özge UĞURLU, Hamza Umut KARAKURT, Serap EVRAN
Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyokimya Bölümü 35100 Bornova-İZMİR
[email protected]
Özet: Genetik kodlanmış floresans temelli sensörlerin genel tayin prensibi, biyotanıyıcı
element olarak görev yapan ligand bağlayıcı bir protein ile floresans protein arasında füzyon
oluşturulmasına dayanır. Bu sensörlerin in vivo uygulama potansiyeli en önemli üstünlüklerindendir.
İlgili ligandın bağlanması sonucu, füzyon proteininde gerçekleşen konformasyon değişimleri
floresans yoğunluğunda da bir değişime yol açar [1]. Bu çalışmada benzer prensipten yararlanarak
lizin, histidin ve arginin amino asitleri için genetik kodlanmış floresans protein sensörü tasarlanması
amaçlandı.
Genetik kodlanmış sensörde tanıyıcı element olarak periplazmik bağlayıcı bir protein olan
ArtJ proteini[3] kullanıldı. Bu proteini kodlayan genin amplifikasyonu için Geobacillus
stearothermophilus genomik DNA’sı kalıp olarak kullanıldı. Mavi floresans proteini (BFP) ve sarı
floresans proteini (YFP) kodlayan genlerin amplifikasyonu için ilgili plazmidler kalıp olarak
kullanıldı. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak ArtJ ve floresans proteinleri kodlayan gen
fragmentlerinden oluşan füzyon fragmentleri elde edildi. Füzyon fragmentleri daha sonra pETduet-1
ekspresyon vektörüne klonlandı. Plazmid E. coli BL21 (DE3) hücrelerine transforme edildi ve
heterolog gen ekspresyonu gerçekleştirildi. Füzyon proteini nikel-şelat afinite kromatografisi[2]
kullanılarak saflaştırıldı.
BFP:ArtJ ve YFP:ArtJ füzyon proteinleri farklı konsantrasyonlardaki L-arginin, L-lizin,
L-histidin amino asitleri ile muamele edildi ve floresans emisyon spektrumları karşılaştırıldı. Larginin ve L-histidin için floresans yoğunluğundaki değişim, L-lizine kıyasla düşük düzeyde
gerçekleşti. L-lizin için, 1 µM–100 µM konsantrasyon aralığında elde edilen floresans yoğunluğu
değerleri kullanılarak lineer tayin grafiği elde edildi.
Anahtar Kelimeler: Genetik kodlanmış sensörler, Floresan proteinler, Periplazmik bağlayıcı
proteinler, Metal-şelat afinite kromatografisi
Kaynaklar
[1] Vinkenborg, L J. et. al; ‘’Genetically encoded FRET sensors to monitor intracellular Zn2+ homeostasis’’;
October 2009; vol.6 No.10
[2] Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I. and Belfrage, G.; Metal chelate affinity chromatography, a new approach to
protein fractionation; Nature; 1975, 258: 598−599.
[3] Crystal Structures and Mutational Analysis of the Arginine-, Lysine-Histidine-binding Protein ArtJ from
Geobacillus stearothermophilu. Implications for Interactions of ArtJ with its Cognate ATP-binding Cassette
Transporter, Journal of molecular biology; 2008; 375, 448-459.
Bu çalışma TÜBİTAK 2209 Programı tarafından desteklenmiştir.
50
KimyaKongreleri.org