Geliştirme ve Değerlendirme

1
Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi
ECZ 344
Prof.Dr. Dilek AK
02.05.2014 /7. DERS
İLAÇ METABOLİTLERİ
2
İlaç Metabolitleri

Bütün biyolojik sıvılar araştırılan ilacın metabolitlerinin
potansiyel varlığına sahiptir.

Analizci belirli bir ilaçtan üretilecek metabolit
tipinden haberdar olmalıdır. Bu oldukça kompleks bir
konudur.

Herhangi bir ilacın tamamlanmış metabolizması
sadece yapısından tahmin edilemez.

Metabolizma devam eden bir işlemdir
ve
metabolitler kendi kinetiklerine sahiptirler. Bu yüzden
metabolitin ana ilaçla ilişkili olan miktarı zamanla
değişebilir.
3
İlaç Metabolitleri

Transformasyon olaylarının büyük çoğunluğu suda kolay
çözünen bileşiklerin üretilmesi ve atılmasının
kolaylaştırılması ile ilgilidir.

Metabolik transformasyon molekülün deaktivasyonu
için garantili bir yol değildir.

Her bir reaksiyon türü farmakolojik olarak daha aktif
veya daha toksik olan bir türevini oluşturabilir.

İlaç metabolizması için söz edilecek reaksiyon türleri,
herhangi bir ilaç için meydana gelebilir. Ancak
reaksiyon türü veya reaksiyon zinciri, ilacın kendi veya
ara metabolitinin herhangi bir enzim için substrat olarak
davranabilme yeteneğine ve substratın metabolizma
yerinden uzaklaştırılma hızına bağlıdır.
4
İlaç Metabolitleri

Metabolizma basamakları iki faz olarak sınıflandırılır.

1. fazda ilaç yapısında basit bir değişikliği sağlayacak
tek bir enzimin atağı ile reaksiyon gerçekleşir. Böyle
reaksiyonlar genellikle oksidasyon, redüksiyon ya da
hidroliz biçimindedir ve ilaç yapısında uygun bir
fonksiyonel grubun 2. fazda kullanılmasına neden olur.

2. faz ilacın fonksiyonel grubuna suda çözünebilir
fonksiyonel grubun katıldığı ya da faz 1 metabolitinin
suda
çözünebilir
konjugatını
(glukuronidasyon,
asetilasyon, sulfat oluşumu) oluşturduğu ve böylelikle
idrarla kolayca vücuttan atıldığı sentetik bir basamağı
içerir. Metabolizmanın her iki fazının ana yeri
karaciğerdir.
5
FAZ I METABOLİTLERİ

Oksidasyon:

Aromatik bileşikler doğrudan hidroksilasyon ile metabolizmaya
uğrar. Benzen fenole, naftalen b-naftole dönüşür.

Alifatik bileşikler w-hidroksilasyon ile primer alkollere dönüşür.

Alkoller, aldehit ve ketonlara yükseltgenir ve ardından asitlere
dönüşür. Aldehit ve ketona yükseltgenme tersinir bir reaksiyondur.

Aromatik eterler O-dealkilasyon ile birlikte fenole dönüşür. Aromatik
tiyoeterler de benzer şekilde davranır.

Aromatik aminler hidroksillenerek hidroksilamino türevlerini oluşturur.

Tersiyer aminler N-oksit yapısına, sekonder aminler dealkillenme
sonrası karşılık gelen aldehide dönüşür.

Tiyoeterler sülfoksit yapısına okside olurlar.
6
Faz I metabolitleri

Redüksiyon:
Alkollerin ketonlara oksidasyonu tersinirdir,
bu yüzden ketonların metabolizmasında
alkollerin oluşumu beklenebilir.
 C=C yapısı doygun türevine indirgenebilir,
ancak bu nadiren görülür.
 N=N yapısı hidrazin üzerinden primer amine
dönüşür.
 Nitro grupları özellikle aromatik nitro
grupları primer amine indirgenir.

7
Faz I metabolitleri

Hidroliz:

Esterlerin tamamı spesifik veya
nonspesifik esterazların farklı türleri ile
kolayca hidrolize uğrar.

Amitler esterler kadar kolay olmamakla
birlikte hidroliz olur.
8
FAZ II METABOLİTLERİ

Glukuronidasyon:

Glukuronik asit ile konjugasyon Faz II metabolizmada en
fazla karşılaşılan durumdur. Alkoller ile eter tipi, asitler ile
ester tipi bağlanma gerçekleşir. Meydana gelen türev
suda kolay çözünür ve idrar ile atılır.

Bu tip konjugatların önemli bir özelliği seyreltik bazik
ortamda kolayca hidroliz olmasıdır. Bekletilen idrar bazik
olduğunda hidroliz sonrası değişmeyen ilacın son
derece yüksek derişimleri ile karşılaşılabilir.

Hidroksil amin yapısı glukuronik asit ile kolayca konjugat
oluşturur. Tiyoller S-glukuronit, alkoller O-glukuronit
oluşturur. N-glukuronitler nötral pH dışında çok
dayanıksızdır.
9
Faz II metabolitleri

Sülfat oluşumu:

Sülfürik asit ile konjugasyon ilaçların ve
metabolitlerinin özellikle fenol ve alkollerin ikinci
önemli konjugasyon yoludur. Aromatik aminler bu
metabolizma yolu ile sülfamatları oluşturur.
10
Faz II metabolitleri

Asetilasyon:

Asetik asit ile konjugasyon faz II metabolizma içinde sınıflandırılır ancak
bu olay metabolizma yolunda ikinci basamak olması yerine ilacın
doğrudan asetillenmesi ile ilgilidir.

Aromatik aminler ve sulfonamitlerin asetillenmesi yaygın görülen bir
durumdur.

Asetillenme sadece yabancı bir bileşiğin atılma yolu değil, aynı
zamanda bireylerin metabolik kapasitesinin karakterizasyonunda önemli
bir konudur.

Glisin karboksilik asitlerle hippurik asit oluşturmak üzere konjuge olur.
Bunun en basit örneği benzoik asitin kendiliğinden hippurik aside
dönüşümüdür.

Klorpromazin, 7-hidroksilasyon, S-oksidasyon ve N-demetilasyon ile
metabolizmaya uğrar. Bu üç dönüşüm ile sekiz adet olası metabolit
oluşumu beklenir, ancak klorpromazin için 20 adet metabolit karakterize
edilmiştir ve 200 adet metabolit oluşumu ile ilgili raporlar mevcuttur.
11
Metabolitlerin Önemi

İlaç analizinde metabolitin kendi aktivitesi varsa, ana
ilacın ölçümü yanında metabolit derişiminin ölçümü
önemli olabilir.

Bileşikler eşit aktivitede olduğunda ve benzer
farmakokinetikler sergilediğinde tayin için kullanılan
analitik yöntem bileşiklerin birlikte tayinine imkan
vermelidir.

Ancak bileşikler eşit aktivitede değilse bu tip
ölçümlerden türetilen farmakokinetiklerin önemini
yorumlamak zor bir konudur.

Sigara kullanmak da ilaç metabolize eden enzimleri
indüklediği için terapötik önemi olan bir çok maddenin
farmakokinetiğini ve metabolizmasını değiştirir.
12
Diğer İlaçların Varlığı

Araştırılan ilaç için özellikle yeni bileşiklerin farmakokinetiğinin
araştırılmasında diğer ilaçlar bilindiği takdirde analiz bakımından bir
problem yaşanmaz.

Diğer ilaçların ne olduğunun bilinmediği adli toksikoloji ve benzer
konularda diğer ilaçların varlığı problemlerin önemli bir parçası
haline gelir.

Yeni bileşikler için yapılan klinik çalışmalarda yaşlı ve genç
gönüllülerdeki farmakokinetiklerin aynı olmadığı, diğer ilaçları
kullananlar için analitik yöntemde potansiyel girişim oluşturma
durumu dikkate alınmalıdır. Özellikle belirli bir ilaçtan oluşan
metabolitlerin izlenmesinde bu durum daha fazla önem kazanır.

Kombine ilaçların geliştirilmesi ile ilgili çalışılmalarda bir bileşiğin
diğerinin kinetiğini (formülasyon veya biyolojik) potansiyel olarak
etkilemesi kontrol edilmelidir. Bu durum için ideal çözüm aynı tayin
yöntemi ile kombinasyonu oluşturan bileşiklerin izlenmesidir.
13
Analiz Öncesi Degredasyon

İlacın kendi dayanıksızlığı, idrar gibi sıvıların uç pH
değerlerinde bulunması, plazma proteinlerine
bağlanmanın koruyucu etkisinin kaybedilmesinden
kaynaklanır.

İdrara koruyucu olarak asit eklenmesi barbituratların Nglukozitlerini stabilize etmesine karşın diğer ilaçların
kolayca hidroliz olmasına neden olur.

Degredasyon, numunenin alınmasından sonra devam
eden enzimik aktiviteye de bağlı olabilir. Özellikle
plazma ve serumda bulunan esterazlar bu duruma
neden olur.

Konjugatların analiz için hidroliz edilmesinde spesifik
enzimler serbest ilacı açığa çıkarmak için kullanılır.
Yöntem Seçimi

Biyolojik sıvılarda ilaç analizi için yöntem seçiminde
validasyon parametreleri, hız ve kolaylık için farklı
gereksinimler söz konusudur.

Örneğin,

aşırı doz için yapılan işlemlerde bol miktarda plazma
numunesi ile ekstraksiyon, kromatografik saflaştırma ve
analiz basamakları izlenir.

Yüksek düzeyde kesinlik ve duyarlılık gerektiğinde ucuz
olmayan ve uzmanlık gerektiren yöntemlere ihtiyaç
duyulur.

Analitik verilerin çok önemli olmadığı durumlarda ucuz
bir yöntem veya rutin bir deney protokolü kullanılır.
Yöntem Seçimi

Her analizcinin uzmanlık alanı ile ilgili olan favori bir tekniği
vardır. “Uzmanlık (Expertise)”, yöntem seçiminde belirleyici
unsurdur.

Laboratuvar olanakları ve cihazlar da seçimi etkiler. Ancak
daha hızlı, daha az işlem gerektiren daha ucuz bir yöntem
karmaşık bir yönteme tercih edilir.

Gerekli duyarlılık düzeyi seçimi etkileyen diğer önemli noktadır.
İlaç tahmin edilmeyen şekilde büyük oranda metabolizmaya
uğradığında yüksek dozlar verilse bile plazma ve idrardaki
derişimi az olacaktır. Yöntem seçiminin yeniden gözden
geçirilmesi gerekir.

Her 10 yıl boyunca, duyarlık düzeyinde 10 misli azalma
sağlanmıştır. 10-24 mol-yocto-6 molekülün ölçülmesine karşılık
gelir.

İlacın bilinen kimyasal karakteristiklerini incelemek yeni bir
yöntem geliştirmede önemli bir basamaktır.
Yöntem Seçimi

İlacı sentezleyen kimyacı NMR ve kütle spektrumu
yardımı ile gerekli yapısal bilgileri sağlar.

UV spektrumu bilindiğinde sonraki kromatografik
çalışmanın saptama basamağı için önemli bir veri
elde edilir.

ITK ile ön ilaç formu, yan ürünler ve parçalanma
ürünleri veya metabolitler ilgili bileşikten ayrılabilir.

Stabilite hakkında bilgi sahibi olmak çok önemlidir.
Analitik Profil
Bileşiğin Karakterizasyonu

Fizikokimyasal karakteristikleri

UV-görünür bölge spektrumu

Floresans spektrumu

ITK

HPLC

GC

Kütle Spektrometri

NMR

Çözünürlük
Fizikokimyasal Karakteristikler
Çalışılan bileşik için,

Çeşitli çözücülerde çözünürlük

İyonize olabiliyorsa bileşiğe ait pKa değeri

Molekül ağırlığı

Optikçe aktif formun varlığı
analizi yürüten tarafından bilinmelidir.
Ultraviyole-Görünür Bölge
Spektrometri

Absorpsiyon düzeyi incelenir, yüksek mi? HPLC’de
UV detektör dalga boyuna buradan karar verilir.

Spektrum pH değişikliklerinden etkilenir mi?
Absorpsiyonu ve duyarlılığı artırmak için yararlıdır.

Absorpsiyon spektrumu spesifik değildir, ancak
spesifik bir ekstraksiyon işleminden sonra veya ilaç
metabolizmaya uğramadığında uygulanabilir.

Absorpsiyon spektrumu metabolizmadan az etkilenir.
Floresans Spektrum

Floresans ışın yayma özelliği olan maddeler,
kendilerine özgü dalga boyundaki ışınlarla uyarılabilir
ve tayin edilebilirler.

Floresans özelliği olmayan maddeler, üzerinde
taşıdığı çeşitli fonksiyonel gruplar kullanılarak türev
oluşturabilen ajanlar ile türevi oluşturulduktan sonra
tayin edilebilir. Örn primer amin grubu taşıyan
maddeler, floreskamin ve dansil klorür ile türev
yapılabilir. Ancak türevin kolayca oluşması ve
stabilitesi değerlendirilmelidir.

Metabolizma floresans karakteristiklerini değiştirebilir.
ITK

Analog ve potansiyel metabolitlerin yanı sıra
parçalanma ürünleri ile ilgili veri sağlar.

Lekelerin görünürleştirilmesinde kullanılan sprey
reaktifler olası kolorimetrik tayin için fikir verebilir.

Kantitatif sonuçlar için uygun değil (!)

Plazma analizi için nadiren densitometre ile kullanılır.

Densitometre, özellikle idrar numunelerinde ilaç
suistimalinin araştırılmasında, kolay, ucuz ve kullanışlı
bir yol ile incelemeye imkan sağlar.
HPLC

Biyolojik sıvılarda ilaç analizi için en uygun yöntemdir.
Özellikle ters-faz sistemler (C8 ve C18 kolon ile)
ayırma ve tayin başarıyla gerçekleştirilir.

Metabolitler polardır ve ana bileşikten önce elüe
olur.

Kısa analiz süresi için yöntem optimize edilebilir.

pH etkisi dikkate alınmalı, iyon çifti kromatografi
uygulanabilir.

Türevlendirme nadiren kullanılır
GC

Uçucu olmayan veya labil bileşiklerin türevleri için
uygulanır.

Nonpolar sabit fazlar ( örn. OV-1)

Seçici sabit fazlar (örn. OV-101)

Türevlerin alıkonma karakteristikleri kullanılır.

Cihaz karakteristikleri biyolojik analizler için uygundur.

GC için bir yöntem geliştirilemiyorsa HPLC nin
uygulanması da zordur.
Kütle Spektrometri

Bileşiklerin kütle spektrumları standart koşullarda
belirlenmelidir.

KS nin bir cihaz olarak ilk uygulamaları biyolojik sıvılarda
ilaç analizinde saflaştırılmış metabolitlerin
karakterizasyonu ile ilgilidir. Daha sonra daha basit rutin
işlemlerin spesifikliğini değerlendirmek için spesifik bir
detektör olarak kullanılmıştır.

Selective ion monitoring ve Tandem mass
spectrometry’nin kullanılması, KS’nin spesifikliğinin analiz
yöntemlerinde hayati olduğunu göstermiştir.

Farklı tipteki iyonlaştırma işlemleri ve farklı türevler
spesifik iyon verimini artırmak için kullanılır ve eğer
spektrum elde edilebiliyorsa analitik profil derlemesinde
yerini alabilir.
NMR

BSİA için fazla değerli bir yöntem değildi.

MS gibi, metabolitlerin karakterizasyonu için
kullanılırdı. İzole edilen metabolitin miktarı cihazdaki
analiz için yetersiz düzeyde olurdu.

Modern yüksek alanlı cihazlar, bilgisayar teknikleri,
NMR spektroskopisinin daha iyi anlaşılması ile NMR
kullanımı temel teknikler arasında yer almaktadır.
Çözünürlük

Belirli çözücüler kullanılarak ilacın çözünürlüğü incelenmelidir,
böylece en iyi ekstraksiyon yöntemi belirlenebilir.

En uygun ekstraksiyon çözücüsü “ilacın tamamını yada büyük
bir kısmını endojen bileşik veya metabolitlerden çekip alan”
çözücüdür.

Ekstraksiyonda geri kazanım düşük ise kesinlik de düşüktür

Zayıf asit ve bazlar için pH seçimi önemlidir.

pH-çözünürlük profili çıkarılmalıdır. Organik çözücü ile belirli bir
pH deki tampon çözelti arasında ilacın dağılımı için organik
faza geçen ilaç miktarı ölçülerek pH ya karşı grafiği çizilir. İlacın
radyoaktif işaretlenmiş formu ile bu işlemleri yapmak özelikle
düşük derişimlerde kolaylık sağlar.
İlginiz için teşekkür ederim.