XVIII. Ulusal Kimya Kongresi, Kars, 2004 BK MADIMAK

XVIII. Ulusal Kimya Kongresi, Kars, 2004
BK
MADIMAK YAPRAKLARINDAN GLUKOZ 6-FOSFAT DEHİDROGENAZ
ENZİMİNİN SAFLAŞTIRILMASI, KARAKTERİZASYONU VE BAZI KİNETİK
ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ
/
7
7
7
Hülya Demir , Şükrü Beydemir', Mehmet Çiftçi, O. irfan Küfrevioğlu'
1
Atatürk Üniversitesi, Biyoteknoloji Uygulama ve Araştırma Merkezi, 25240, Erzurum
Atatürk Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Bölümü, 25240, Erzurum
Glukoz 6-fosfat dehidrogenaz enzimi (D-glukoz 6-fosfat: NADP+ oksidoredüktaz, EC
1.1.1.49; G6PD) bir çok dokuda özellikle sitoplazmik kısımlarda lokalize olan ve pentoz
fosfat metabolik yolunun ilk basamağını katalizleyen kilit enzimdir [1]. Bu çalışmada bu
önemli enzimin, madımak yapraklarından saflaştırılması ve karakterizasyonu amaçlandı.
Çalışmada G6PD enziminin saflaştırılması için madımak bitkisi yaprakları kullanıldı.
Saflaştırma basamakları; homojenat hazırlanması, % 20-40 amonyum sülfat çöktürmesi ve
DEAE-Sephadex A50 iyon değişim kromatografisini içeren üç ana kısımdan oluştu.
Çalışmaların başından itibaren sıcaklık +4°C'de tutuldu. Enzimin doğal halinin molekül
kütlesi Sephadex G 200 jel fıltrasyon kromatografisi, alt birim molekül kütlesi ise SDSpoliakrilamid jel elektroforezi yapılarak belirlendi. Enzimin, stabil pH, optimum pH, optimum
sıcaklık, Km ve Vmax (G6P ve NADP+ için) değerleri bulundu. Bütün kinetik çalışmalarda
enzim aktivitesi, Beutler metoduna göre ölçüldü [2].
Spesifik aktivitesi 1,896 EU/mg protein olan G6PD enzimi, yukarıda belirtilen
yöntemler kullanılarak % 57,6 verimle yaklaşık 120 kat saflaştırıldı. Enzimin stabil pH ve
optimum pH'ları 0.1 M Tris-maleat tampon çözeltisi kullanılarak her ikisi için de 8,0 olarak
bulundu. Optimum sıcaklığın 45°C olduğu belirlendi. Enzimin tabii halinin molekül kütlesi jel
fıltrasyon kromatografisi ile 40,5 kDa ve SDS-PAGE vasıtasıyla alt birim molekül kütlesi
40,7 kDa olarak tespit edildi. Böylece enzimin aktif formunun monomer olduğu belirlenmiş
oldu. Ayrıca, Lineweaver-Burk grafiklerinden, NADP+ ve G6P için Km ve Vmax değerleri
sırasıyla 0.011 mM, 0.063 mM, 0.104 EU/ml, 0.050 EU/ml olarak hesaplandı.
Kaynaklar
1. H. Demir, Ş. Beydemir, M. Çiftçi, and Ö.İrfan Küfrevioğlu, Journal of Food Biochemitry
(2004) (in Press).
2. E. Beutler, Red celi metabolism manuel of biochemical methods. (1971) 68-71.
534