XIII. Ulusa/ Kimya Kongresi. İstanbul. 2003 BK

XIII. Ulusa/ Kimya Kongresi. İstanbul. 2003
BK-S3
SIÇAN ERİTROSİTLERİNDEN 6-FOSFOGLUKONAT DEHİDROGENAZ
ENZİMİNİN SAFLAŞTIRILMASI, KARAKTERİZASYONU VE BAZI KİNETİK
ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ
S.Bevdemir'. M. Çiftçi1, H. Yılmaz2
'Atatürk Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Bölümü, Erzurum.
:
Dicle Üniversitesi, Eğitim Fakültesi, Kimya Bölümü, Diyarbakır.
6-Fostbglukonat dehidrogenaz (E.C. 1.1.1.44; 6-PGD) pentoz fosfat metabolik
yolunun üçüncü reaksiyonu olan NADP+"nin varlığında 6-PGA"nın (6-fosfoglukonat) Dribuloz-5-fosfat"a dönüşümünü katalizleyen enzimdir [1]. Çalışmamızda bu enzimin sıçan
eritrositlerinden saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı kinetik özelliklerinin araştırılması
amaçlanmıştır.
Çalışmada 6-PGD enziminin saflaştırılması için Sprague-Da\vley tipi sıçan
kullanıldı. Saflaştırma basamakları; yüksek hızda santrifügasyon. % 20-50 amonyum sülfat
çöktürmesi ve 2',5'-ADP Sepharose 4B afinite kromatografisini içeren üç ana kısımdan
oluştu. Çalışmaların başından itibaren sıcaklık +4°C'de tutuldu. Enzimin doğal halinin
molekül ağırlığı Sephadc\ G200 jel filtrasyon kolon kromatografısi. alt birim molekül
ağırlığı ise SDS-poliakrilamid jel elektroforczi yapılarak belirlendi [2]. Enzimin, stabil pH.
optimum pH, optimum sıcaklık, Km ve Vmax (6-fosfoglukonat ve NADP+ için) değerlen
bulundu. Ayrıca. ATP. NADPH ve NADH'ın sıçan eritrosit 6-PGD enzimi üzerindeki
etkileri araştırılarak bu maddeler için K, sabitleri tespit edildi. Yapılan bütün kinetik
çalışmalarda enzim aktivitesi. spektrofotometrik bir yöntem olan Beutler metoduna göre
ölçüldü [3].
Spesifik aktivitesi 5.15 EU/mg protein olan sıçan eritrosit 6-PGD enzimi, yukarıda
belirtilen yöntemler kullanılarak % 78,4 verimle 2575 kat saflaştırıldı. Enzimin stabil pH
ve optimum pHMarı İM Tris-HCl tampon çözeltisi kullanılarak sırasıyla 8,0 ve 7,0 olarak
bulundu. Sıçan eritrosit 6-PGD enzimi için optimum sıcaklık 45"C olduğu belirlendi.
Enzimin tabii halinin molekül ağırlığı jel filtrasyon kromatografısi ile 111 kDa ve SDSPAGE vasıtasıyla altbirim molekül ağırlığı 59,566 kDa olarak tespit edildi. Böylece
enzimin aktif formunun dimer olduğu belirlenmiş oldu. Ayrıca, Linevveaver-Burk
grafiklerinden, NADP+ ve 6-PGA için Km ve Vmax değerlen sırasıyla 0,059 mM, 0,194
mM, 0,063 EU/ml. 0,054 EU/ml olarak hesaplandı. K, sabitleri ise ATP, NADPH ve
NADH için sırasıyla 2,50±0,866 mM, 0,05210,007 mM ve 0,07±0,007 mM olarak
bulundu.
Kaynaklar
l.M. Çiftçi. Ş. Bevdemir, H. Yılmaz, and E. Bakan, Polish J. Pharmacol., 54 (2002) 275280.
2.D.K. Laemmli, Nature, 227(1970) 680-83.
3.E. Beutler, Red Celi Metabolism Manuel of Biochemıcal Methods, (1971) 68-71.
266