Pseudomonas sp - Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
advertisement
Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2010 Cilt:22-2 PSEUDOMONAS SP. SUŞLARINDA COLD SHOCK PROTEİN İZOLASYONU VE * SDS-PAGE ANALİZİ Isolation of Cold Shock Protein From Pseudomonas sp. Strains and Analysis of SDS-PAGE Zuhal ÜZÜMCÜ Biyoloji Anabilim Dalı Burhan ARIKAN Biyoloji Anabilim Dalı ÖZET Bu çalışmada, Soğuk Şoku Proteini izolasyonu için, Balcalı Hastane Laboratuarından alınan Pseudomonas cinsi bakterilerle Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 suşları kullanılmıştır. Bu suşların 5, 10, 20, 37ºC sıcaklıklardaki kültürlerinden soğuk şoku proteini izole edilip SDS-PAGE sisteminde moleküler ağırlıkları hesaplanmıştır. P.aeruginosa Balcalı 1 ‘in 20ºC’ de 60 dakika ve 5,10,20 ºC’de 480 dakika sonra 77066 Da’ luk cold shock protein sentezledikleri bulunmuştur. SDS_PAGE analizleri P. aeruginosa Balcalı-2 suşunda 22666 ve 21576 Da’luk iki farklı protein ürettiğini gösterdi. Araştırmada kullanılan suşlar içerisinde P. aeruginosa Balcalı-1 ve 2 suşlarının, P. aeruginosa ATCC 27853 suşundan daha yüksek düzeyde soğuk şok yanıt oluşturmuştur. Sonuç olarak P.aeruginosa’ nın 3 farklı suşu, soğuk şokuna maruz bırakıldığında, 10 ºC sıcaklıkta 60 dakika inkübasyon süresinde en fazla protein sentezi gerçekleştirmiştir. Anahtar kelimeler: Pseudomonas aeruginosa, Soğuk Şoku Proteini, SDS-PAGE. ABSTRACT In this study, Pseudomonas aeruginosa balcalı 1, Pseudomonas aeruginosa balcalı 2 which taken Balcalı Hospital Laboratory for cold shock protein isolation and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 were used. These strains 20, 10 and 5 º C temperature of the cold shock proteins from the cultures have cold shock proetin were isolated and moleculer weights were determined by SDSPAGE. P. aeruginosa Balcalı 1 produced the protein in 77066Da cold shock protein at 20ºC at for 60minutes and 5, 10, 20ºC for 480 minutes incubation SDS-PAGE analysis showed that P. aeruginosa Balcalı 2 strains two different protein bands in 22666and 21576 Dalton molecular weight. Strains used in the study of P. aeruginosa balcalı-1 and balcalı-2 from Cold Shock response higher constituted than P. aeruginosa ATCC 27853. As a conclusion, Pseudomonas three different strains isolated the most cold shock protein 10 ºC at for 60 minutes incubation * Yüksek Lisans Tezi-Msc. Thesis 81 Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2010 Cilt:22-2 Keywords: Pseudomonas aeruginosa, SDS-PAGE, Cold Shock Protein Giriş Pseudomonas cinsi bakterilerin çoğu doğada toprak ve sularda yoğun olarak bulunur. Bazı türleri insan, hayvan ve bitki patojenidir. Bu cinsin türleri glikozu oksidasyon yoluyla parçalayan fakat fermantasyon yapmayan bakterilerdir. Türlerin tamamı katalaz pozitif, Gram negatif, aerobik, polar flagellasıyla hareket edebilen çubuk şekilli bakterilerdir. Pseudomonas ' ları gıdalar için önemli kılan pek çok özellik vardır. Bazı türleri proteolitik ve lipolitik aktivite göstermektedir. Aerobik olmaları nedeniyle gıdaların yüzeyinde hızla gelişebilmeleri sonucu okside ürünler ve mukoz madde oluştururlar. Psikrofil, mezofil veya psikrotrof türleri vardır. Biyolojik sistemler; ultraviyole ışını, pH, tuzluluk, oksijen kullanılabilirliği, basınç veya termal gibi stres koşullarından etkilenebilirler. Sıcaklığın düşmesi membran akışkanlığını değiştirir ve sonuçta hücresel fonksiyonlar değişir. Hücrede meydana gelen fonksiyonel değişiklikler cold shock adı verilen proteinlerin sentezlenmesi sonucunda gerçekleşir. İlk tanımlanan cold shock protein E.coli’ deki CspA’ dır. Bu protein psikrotrofik, psikrofilik, mezofilik ve termofilik birçok gram negatif ve gram pozitif bakteride de tanımlanmış ve CspA ile homoloji gösterdikleri belirlenmiştir. Sıcaklık düşmesi üremenin yavaşlamasına neden olur. Sıcaklığın düşmesi sırasında organizma stoplazmik membranın komposizyonunu değiştirir ve soğuk şoku proteinleri adı verilen yapılar sentezlenir. SDS-PAGE, proteinlerin molekül ağırlıklarını belirlemede en yaygın olarak kullanılan poliakrilamid jel elektroforez tipidir. Bu çalışmada, buzdolabında saklanan (4 C) ürünlerden ve mezofil ortamdan izole edilecek Pseudomonas sp. suşlarına ait hücresel proteinler SDS-PAGE ortamında analiz edilerek, organizmalarda farklılık gösteren protein yapılarının moleküler ağırlıklarına göre saptanması amaçlanmıştır. Materyal ve Metot Bakteri Stok Kültürlerin Hazırlanışı Pseudomonas suşlarımız, GSP Agar besiyerine tek koloni oluşturacak şekilde ekilerek, 37 ºC’ de 24 saat inkübasyonu gerçekleştirilmiştir. Besiyerinde üreyen mor-menekşe görünümlü koloniler aynı besiyerine çizgi şeklinde ekilerek stok kültür elde edilmiştir. Daha sonra N1 sıvı besiyerine GSP Agarda çizgi ekimle üretilmiş olan Pseudomonas suşlarından alınarak ekim yapılmış ve 200 rpm de 30 ºC’ de çalkalamalı etüvde inkübasyona bırakılmıştır (Anonymous, 1978). Bakterilerin Tanımlanmaları Balcalı Hastane Laboratuarından alınan Pseudomonas sp. örnekleri API 20 E identifikasyon kiti kullanılarak tanımlanmıştır. Tanımlamanın doğruluğunu kontrol etmek için P. aeruginosa ATCC 27853 suşu kullanılmıştır ve yaban tip örnekler (Pseudomonas balcalı-1 ve balcalı-2) ATCC suşu ile karşılaştırılmıştır. 82 Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2010 Cilt:22-2 Cold Shock Protein İzolasyonu İçin Bakterilerin İnkübasyon Koşulları Cold Shock Protein üretimi için 5, 10, 20, 37ºC’lerde 60 ve 480 dakika inkübasyonda gerçekleştirilmiştir. Cold Shock Protein izolasyonu için örneklerimiz 37 ºC’ de N1 besi yeri kullanılarak bir gece üretilmişlerdir (Horton ve ark., 2000). Bir gecelik kültürden (37 ºC’ de üretilmiş) bakteri örnekleri 1 ml miktarda 9 ml N1 buyyon besiyerine aktarılarak önceden belirlenen ortamlara konulup, inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Altmış dakikanın sonunda örnekler alınarak 6000 devir/dk ve +4 ºC’ lik sentrifüjde çöktürülerek bakteriler besiyerinden uzaklaştırılmıştır. İnkübasyona devam eden örnekler 480 dakikanın sonunda alınarak çöktürülüp bakteri pelletleri elde edilmiştir. Aynı işlemler 37ºC’deki kontrol örneği içinde yapılmıştır. Protein İzolasyonu Farklı sıcaklıklarda üretilip çöktürülerek elde edilen bakteri pelletlerinin üzerine 2 ml Sol-1 çözeltisi eklenerek 37 ºC 60 dakika inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Örnekler 2000 rpm ve +4 ºC’ de 10 dakika süreyle çöktürülmüşlerdir. Üst faz temiz bir tüp içerisine aktarılarak sıvıdaki protoplast yapılarının çöktürülmesi için 8000 rpm ve +4 ºC’ de 10 dakika sentrifüj edilmiştir. Üst faz dökülerek protoplastların patlatılması amacıyla örneğin üzerine 2 ml distile su eklenmiş ve -33 ºC de 60 dakika dondurma, 70 ºC de 60 dakika çözme uygulaması yapılmıştır. Bu işlem her örnek için üç kez tekrarlanmıştır. Dondur/çöz yöntemiyle patlatılan örneğin üzerine örneğin eşit hacımda soğuk etanol ilave edilerek -33 ºC’ de bir gece bekletilmiştir. Örnekler +4 ºC’ de 20 dakika 10000 rpm de çöktürülerek üst faz atılmış ve total protein eldesi gerçekleştirilmiştir. Her bir tüpe 200 µl örnek tamponu ilave edilerek örnekler süspansiyon haline getirilmiştir. Hazırlanan örnekler 100 ºC 5 dakika kaynatılarak proteinler denatüre edilmiş ve 10000 rpm’ de 10 dakika süreyle +4 ºC’ de sentrifüj edilmişlerdir. Üst faz temiz bir ependorf tüpüne alınarak elektroforez analizlerinde kullanılmışlardır (Maniatis ve ark. 1982). Poliakrilamid Jel Elektroforezinde (PAGE) Moleküler Ağırlık Analizi Cold shock proteinlerin moleküler ağırlıkların saptanması için SDS-PAGE jel sistemi kullanılmıştır ( Laemmli,1970). PAGE uygulamasında dengeleme ve ayırma jeli olmak üzere, yoğunlukları farklı iki ayırma ortamının birlikte kullanılması söz konusudur. Jel oluşturulması sırasında uygun şekilde hazırlanmış cam plakalar kullanılır. Dengeleme jeli, ayırıcı jelin üstünde yer alır ve örneklerin yüklenmesi için tarak gözlerinin oluşturulduğu bölümdür. SDS-PAGE sisteminde jelde denatüre edici ajan olarak SDS bulunur. Bulgular ve Tartışma P. aeruginosa ATCC 27853 numaralı suştan izole edilen cold shock proteinleri % 12 ‘lik SDS-PAGE jel sisteminde moleküler ağırlıkları saptanmış ve çizelge-1 de protein profilleri gösterilmiştir. 83 Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2010 Cilt:22-2 Çizelge-1.P. aeruginosa ATCC 27853 suşuna ait cold shock proteinlerin % 12’ lik SDS-PAGE jelinde oluşan protein profilleri 60 Dakika 480 Dakika 37 ºC 5 ºC 10 ºC 20 ºC 5 ºC 10 ºC 20 ºC Marker 68000Da 97140Da 18133Da 90660Da 90660Da 85000Da 90660Da 30220Da 85000Da 80000Da 85000Da 75550Da 85000Da 17430Da 75550Da 71570Da 75550Da 18130Da 75550Da 17000Da 17210Da 20000Da 20920Da 17000Da 18130Da 15632Da 18130Da 18130Da 17000Da 15111Da 16790Da 17000Da 15110Da 14620Da P. aeruginosa ATCC 27853 suşu ile yapılan cold shock uygulamasında, cold shock proteinlerin 60 dakikalık inkübasyonda özellikle 5 ve 10 ºC, 480 dakikalık uygulamada ise 20 ºC’ de sentezlendikleri (diğer sıcaklıklarda ortaya çıkmamışlardır) saptanmıştır. İki proteinin (85000 ve 75550 Da) 37 ºC’ lik inkübasyon sonunda da ortaya çıktıkları dikkate alındığında, hem 60 hem de 480 dakikalık (5, 10 ve 20 ºC) inkübasyonlar sonunda elde edilen yeni protein bantlarının, cold shock proteinler olduğu ortaya çıkmaktadır. Khan ve ark., (2003), farklı sıcaklıklarda inkübe ettikleri (4, 10, 20, 30 ve 37 ºC ) Pseudomonas flourocessens MTCC 103 suşundan 14000 Da ağırlığında cold shock, Pseudomonas flourocessens mutant CRPF suşundan 35000 Da ağırlığında cold resistant proteini izolasyonu gerçekleştirmişlerdir P. aeruginosa balcalı-1 numaralı suştan izole edilen cold shock proteinler % 12 ‘lik SDS-PAGE jelinde analiz edilmiş, çizelge-2’de gösterilen farklı moleküler ağırlıklara sahip protein fraksiyonları elde edilmiştir. Çizelge-2.P. aeruginosa balcalı-1 suşuna ait cold shock proteinlerin % 12’ lik SDSPAGE jelinde oluşan protein profilleri 60 Dakika 480 Dakika 37 ºC 5 ºC 10 ºC 20 ºC 5 ºC 10 ºC 20 ºC Marker 68000Da 85629Da 85629Da 85629Da 88923Da 85629Da 85629Da 92480Da 72250Da 72250Da 74580Da 77066Da 77066Da 77066Da 85629Da 64222Da 62486Da 23591Da 24083Da 21407Da 21811Da 77066Da 60842Da 25688Da 21081Da 21407Da 25130Da 23835Da 23835Da 20104Da 20280Da 21607Da 21407Da 21407Da 19260Da 19260Da 19931Da 19760Da 19760Da 18645Da 18796Da 19266Da 19593Da 19260Da 18796Da 18796Da 84 Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2010 Cilt:22-2 P. aeruginosa balcalı-1 suşunda 60 dakikanın 20 ºC ile 480 dakikanın bütün sıcaklık değerlerinde sentezlenen 77066 Da ağırlığındaki protein yapıları temel cold shock proteinleri olarak değerlendirilmişlerdir. Kontrol amacı ile 37 ºC’ de üretilen organizmadan elde edilen proteinlerin dışında 5, 10 ve 20 ºC’ de ortaya çıkan bütün protein yapıları cold shock proteinlerdir. Bu suş dikkate alındığı zaman özellikle 60 dakikalık inkübasyonda 5 ºC (4 yeni protein) ve 10 ºC’ nin, 480 dakikalık inkübasyonda ise 20 ºC’ nin (6 yeni protein) cold shock yanıtın en fazla gerçekleştiği sıcaklıklar olduğu görülmektedir. Henrike ve ark., (2002), Mikroorganizmanın düşük sıcaklıkta üretilmesinden sonra (10 ºC) cold shock protein sentezinin uyarılma oranının maksimum düzeyde gerçekleştiğini belirtmiştir. Hebraud ve ark., (1994), farklı sıcaklıklarda (4, 10, 15, 20, 30 ve 34 ºC) izolasyonunu gerçekleştirdikleri proteinlerden 7000 ve 8000 Da ağırlığa sahip iki fragmentin 30 ºC ile karşılaştırıldığında sadece 4 ºC’ de sentezlendiğini belirtmişlerdir. P. aeruginosa balcalı-2 numaralı suştan izole edilen cold shock proteinler % 12 konsantrasyona sahip SDS-PAGE jelinde analiz edilmiş, çizelge-3’ de gösterilen farklı moleküler ağırlıklara sahip protein fraksiyonları elde edilmiştir. Çizelge-3. P. aeruginosa balcalı-2 suşuna ait cold shock proteinlerin % 12’ lik SDSPAGE jelinde oluşan protein profilleri 60 Dakika 480 Dakika Marker 37 ºC 5 ºC 10 ºC 20 ºC 5 ºC 10 ºC 20 ºC 68000 83111Da 77379Da 68000Da 24129Da 22240Da 86300Da 80142Da 31170Da 24391Da 22666Da 21576Da 83111Da 77379Da 68000Da 24391Da 22666Da 22000Da 21576Da 86400Da 83111Da 80145Da 31166Da 25500Da 23375Da 22400Da 86300Da 80142Da 70125Da 25213Da 23134Da 21576Da 83111Da 80142Da 70125Da 24933Da 22897Da 22000Da 21576Da 86300Da 77379Da 31100Da 25500Da 23375Da 22240Da P. aeruginosa balcalı-2 suşu ile yapılan cold shock yanıt oluşumu sırasında sentezlenen proteinlerin moleküler ağırlıkları P. aeruginosa ATCC 27853 ve P. aeruginosa balcalı-1 suşlarından elde edilenlere göre daha küçük bulunmuştur. İnkübasyon süresi 60 dakika seçildiği zaman, 22666 ve 21576 Da ağırlığındaki fraksiyonların 5 ve 10 ºC olan sıcaklık değerinde gözlenmesi bu yapıların temel cold shock proteinler olduğunu göstermektedir. İnkübasyon süresinin 480 dakika olarak uygulandığı aşamada, organizma 5 ºC’ de üretildiği zaman 86300, 80142 ve 21576 Da ağırlığındaki fraksiyonlar inkübasyon 5 ºC ve 60 dakika gerçekleştirildiği zaman elde edilenler ile aynı moleküler ağırlığa sahiptirler. Bu durum, inkübasyon süresindeki değişikliğin P. 85 Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2010 Cilt:22-2 aeruginosa balcalı-2 suşunda cold shock yanıt üzerinde farklılık yaratmadığını göstermektedir. Bununla birlikte 70125, 25213, 23134 Da ağırlığındaki fraksiyonlar ilk kez ortaya çıkmışlardır. Proteinlerden 86300 Da ağırlığındaki yapı 5 ºC’ de gerçekleştirilen, 60 ve 480 dakikalık inkübasyon sonunda da saptanmışlardır. Bu yapının her iki zamanda ve 5 ºC’ de sentezlenmiş olması cold shock yanıttan sorumlu olduğunu göstermektedir. Psikrofil bir maya türü olan Trichosporon pullants’ ta yapılan soğuk araştırmalarında ortam sıcaklığı 21 ºC’ den 5 ºC’ ye düşürüldüğünde kontrole göre 26 farklı protein sentezlendiği bulunmuştur. Buna karşılık sıcaklık 15 ºC’ den 5 ºC’ ye indirildiğinde sadece 6 protein, 24 ºC’ den 5 ºC’ ye indirildiğinde ise 10 proteinin sentezlendiği görülmüştür (Jones ve ark. 1987; Uyttendaele ve ark. 1998). Sonuç ve Öneriler Ekstremophil organizmalar düşük veya yüksek sıcaklık (pisikrofil veya termofil), ekstrem pH (asidofil veya alkalofil), yüksek veya düşük tuz konsantrasyonları (halofiller) ve yüksek basınç (barofiller ve endolitler) gibi ekstrem çevre koşullarında yaşamlarını sürdürmektedirler. Ekstrem çevre koşulları içerisinde en iyi tanımlananların başında sıcaklık gelmektedir. Yeryüzünde sıcaklık kutup bölgelerinde sıfır derecenin altında, hidrotemal bölgelerde ise suyun kaynama noktasının üzerindedir. Böylece farklı ekolojik nişler mikroorganizmaların üreyebilmeleri için minimum, optimum ve maksimum sıcaklıkların oluşmasını sağlamaktadırlar. Bakteri hücreleri ekstrem sıcaklık, UV ışını, etanol, tuz veya asidik koşullar gibi çevresel streslerin etkisinde kaldıkları zaman canlılıklarını sürdürebilmek için bu koşullara uygun protein sentezi gerçekleştirmeleri esastır. Bakteriler, düşük sıcaklıkta spesifik olarak cold shock yanıt oluştururlar (Jones ve Inouye, 1994). Sonuç olarak, 1. P. aeruginosa ATCC 27853 suşunda 37 ºC’ de gerçekleştirilen inkübasyon sonunda moleküler ağırlıkları farklı olan 6 protein sentezi gerçekleşmiştir. İnkübasyon süresinin 60 dakika olarak seçildiğinde 15, 480 dakika seçildiğinde 12 olmak üzere toplamda 27 proteinin sentezlendiği gözlenmiştir. 2. P. aeruginosa balcalı-1 suşunda 37 ºC’ de gerçekleştirilen inkübasyon sonunda 9 protein sentezi gerçekleşmiştir. İnkübasyon süresi 60 dakika olarak seçildiği zaman 23, 480 dakika seçildiğinde ise 13 protein sentezi gerçekleşmiştir. Bu suşla yapılan cold shock çalışmasında toplam 36 proteinin üretildiği saptanmıştır. 3. P. aeruginosa balcalı-2 suşunda 37 ºC’ de gerçekleştirilen inkübasyon sonunda 5 protein üretilmiştir. İnkübasyon süresi 60 dakika olarak seçildiği zaman 20, 480 dakika seçildiğinde ise 19 proteinin üretildiği saptanmıştır. Bu suşla yapılan cold shock araştırmasında toplam 39 proteinin üretildiği bulunmuştur. Bacillus pscychrophilus, bakterisinin 0, 5 ve 10 ºC’ de üretildiği zaman sırası ile 11, 10 ve 4 adet cold shock protein sentezlediği belirtilmiştir (Whyte and 86 Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2010 Cilt:22-2 Inniss, 1992). Cold adapted Pseudomonas flourescens bakterisi 5 ºC’ de üretildiğinde 5 adet cold shock protein sentezlemiştir. Pseudomonas flourescens 0 ºC’ de üretildiğinde 28 proteinin sentezinde artış olduğu belirtilmiştir (Colucci ve Inniss, 1996). 4. Her üç organizmada da en fazla protein 60 dakikalık inkübasyonda ve 10 ºC’ de gerçekleşmiştir. Bu sonuç cold shock yanıtın literatürde de belirtildiği gibi organizmanın latent döneminde ve 10 ºC’ de maksimuma ulaştığını göstermektedir. Michel ve ark., (1997), protein sentezinde çeşitliliğin önemli kısmının 60 dakikalık inkübasyon sonunda gerçekleştiği belirtilmiştir. Örneğin 20 ºC’ de sentezlenen 29 proteinden 15’ i, 30 ºC de sentezlenen 37 proteinden 24’ünün, sıcaklık 5 ºC’ye düşürüldüğünde ilk bir saat (60 dakika) içerisinde sentezlendiğini saptamışlardır. 5. Araştırmada kullanılan suşlar içerisinde P. aeruginosa balcalı-1 ve 2 suşlarının, P. aeruginosa ATCC 27853 suşundan daha yüksek düzeyde cold shock yanıt oluşturmuştur. 6.sonuç olarak, cold shock protein sentezleyen organizmaların atık su arıtma sitemleri başta olmak üzere çevre kirliliğinin giderilmesinde kullanılmaları yönünde araştırmalar vardır. Diğer psikrotrofik dünyanın aksine, Acinetobacter sp. atık suların arıtılmasındaki rolleri, biyosürfaktan üretimi ve lipolitik enzimleri açısından öncelikli olarak araştırılmaktadır (Margesin ve Schinner, 1997; Yamaşhita ve ark., 1998). Bu açıdan bakıldığında özellikle P. aeruginosa balcalı-2 numaralı suş bu amaçla kullanılabilecek potansiyele sahiptir. Ayrıca Pseudomonas cinsi bakteriler gıda endüstrisinin de en başa bela bakterileridir. Besinlerde bozulmaya neden olan soğuk şoku proteinler bakterilerde ortaya çıkarılırsa gıdalarda, özellikle süt endüstrisinde daha uzun bir raf ömrü elde edilebilir. Kaynaklar ANONYMOUS, 1978. Microbiologischen Handbook. Mecrk, Darmstad COLICCI, M.S., and INNISS, W.E. 1996. Ethylene glycole utilization cold and ethylene glycole shock and acclimation proteins in a psychrotrophic bacterium. Curr. Microbiol. 32:179-182. HEBRAUD, M., DUBOIS, E., POTIER, P., and LABADIE, J, 1994. Effect of growth temperatures on the protein levels in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fragi. J. Bacteriol, 176:4017-4024. HENRIKE,H., KARATZAS, A.K., WOUTERS, J.A., and ABEE, T.J. 2002. Enhanced level of cold shock proteins in Listeria monocytogenes Lo28 upon exposure to low temperature and high hydrostatic pressure. Appl. Env. Microbiol. 68 (2): 456-463. HORTON,A.J., HAK, K.M., STEFFAN, R.J., FOSTER, J.W., and BEJ, A.K. 2000. Adaptive response to cold temperatures and characterization of cspA in Salmonella typhimurium LT2. Antonie von Leuwenhook. 77:13-20. JONES, P.G., and INOUYE, M. 1994. The cold shock response-a hot topic. Mol. Microbiol. 11:811-818. 87 Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2010 Cilt:22-2 JONES, P.G., VANBOGELEN, R.A., and NEIDHART, F.C., 1987 Induction of Proteins in Response to Low Temperature in Escherichia coli J. Bacteriol. 169:2092-2095. KHAN, M., BAJPAI,V.K., ANASARI, S.A., KUMAR,A., and GOEL, R. 2003. Characterization and localization of fluorescent Pseudomonas cold shock protein (s) by monospesific polyclonal antibodies. Microbiol İmmünol, 47. LAEMMLI, U.K., 1970., Cleauage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of the Bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685. MICHEL, V., LEHOUX I., DEPRET, G., ANGLADE, P., LABADIE, J., and HEBRAUD, M. 1997. The cold shock response of the psychrotrophic bacterium Pseudomonas fragi involves four low molecular mass nucleic acid binding proteins. J. Bacteriol, 179 (23): 7331-7342. UYTTENDE, M., GRANGETTE, C., ROGERİE, F., PASTEAU, S., DEBEVERE, J., and LANGE, M., 1998. Influence of cold stress on the Preliminary Enrichment Time Needed for Detection of Enterohemorrhagic Escherichia coli in Ground Beff by PCR. Apll Environ. Microbiol. 64:1640-1643. WHYTE, L.G. and INNISS, W.E. 1992. Cold shock proteins and cold acclimation proteins in a psychrotrophic bacterium. Can. J. Microbiol. 38:1281-1285. YAMASHITA, Y., KAWAHARA, H., and OBATA, H. 1998. Purifications and characterizations of anti-freeze proteins produced by Acinetobacter sp. KINI-1 and Bromhomella sp. KAF-1. FASEB J. 11:2449-2460. 88
