Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi

1
Biyolojik Örneklerde İlaç
Analizi
ECZ 344
1. ders/07.03.2014
2. ders/14.03.2014
PROF. DR. DİLEK AK
ECZACILIK FAKÜLTESİ
ANALİTİK KİMYA ANABİLİM DALI
2
İçerik

Biyolojik sıvılar,

Biyolojik örneklerin saklanması koşulları,

Ekstraksiyon işlemleri,

Kurutma işlemleri,

Bulaşma kaynakları ve hatalar,

Miktar tayini yöntemleri,

Yöntem seçimi,

Sonuçların değerlendirilmesi.
3
Öğrenme Çıktıları

Biyolojik sıvılarda ilaç analizinin önemini
değerlendirebilecektir.



İlaç analizinin hangi alanlarda önemli olduğunu açıklar.
İlaç analizi yapılan biyolojik sıvıları tanımlar.
İlaçların kimyasal yapıları, ilaç metabolitleri ve
degredasyon ile ilgili problemleri açıklar.
4
Öğrenme Çıktıları

Biyolojik örneklerle ilgili işlemlerde karşılaşılan
problemleri tartışabilecektir.

Analiz yapılacak biyolojik örneklerin saklanmasını
açıklar.

Ekstraksiyon işlemlerini açıklar.

Bulaşma ve diğer hata kaynaklarını tartışır.
5
Öğrenme Çıktıları

İlaç analizinde kullanılan yöntemleri tartışabilecektir.

Spektroskopik yöntemleri açıklar.

Kromatografik yöntemleri açıklar.

Diğer Yöntemleri açıklar.

Yöntem seçimi ve ölçüm sonuçlarının
değerlendirilmesini tartışır.
6
İlaç Analizi

Yılda 5000 makale üretilir.

Analizcilerin klinisyenler, farmakokinetikçiler,
biyokimyacılar ve toksikologlar için ürettiği kaba analiz
verileri sunulur.

Bir çok makale ve kitap analizler sırasında karşılaşılan
problemleri ele alır.

Tarihsel derlemeler belirli bir tekniğin ilk olarak kim
tarafından ve ne zaman uygulandığını bildirir.

Bazı yazarlar seçicilik ve duyarlık bakımından bir
yöntemin diğerinden ne kadar üstün olduğunu detaylı
bir şekilde açıklarlar, ancak bu üstünlüğün niçin gerekli
olduğunu açıklamayı dikkate almazlar.
7
Bir
ilaç
ürününün
araştırma,
geliştirme
ve
uygulamasında analitik veri girişi gerektiren basamaklar
İlacın Keşfi
Yeni bir kimyasalın sentezi
Farmakolojik Testler
Geliştirme
Akut Toksisite Hayvan Farmakokinetikleri
Kronik Toksisite Hayvan Metabolizması
İnsanda Faz I çalışmaları
Insandaki farmakokinetikler
İnsan Metabolizması
Klinik
İnsanda Faz II çalışmaları
Compliance (uyunç) testleri
Farmakodinamikler
İlaç Pazarlama
Formülasyon geliştirme
Aşırı Doz
İlaç İzleme
Adli (Forensic) Toksikoloji
8
İlaç Kullanımı

Adli Toksikoloji

Doz aşımı

İlaç suistimali

Sporda ilaç kullanımı

Terapötik ilaç izleme

Farmakogenetik
9
Araştırma – Geliştirme Alanı

Farmakoloji

Toksikoloji

Faz-I klinik testler

Metabolizma

Farmakokinetikler

Formülasyon geliştirme

Faz-II klinik testler

Farmakodinamikler
10
Adli Toksikoloji

Bir suç işlenmişse soruşturmayı yürüten kurumun
mağdurun ölüm sonrası zehirlenmenin kanıtı olan ilgili
örneklerinin incelenmesiyle varılan sonuçları bilmek
istemesi

yabancı bir maddenin varlığı ve kimliği (ne olduğu)
ile ilgili kanıtlar

Tarama testleri (ITK)

Doğrulayıcı testler (Kromatografi + Kütle
spektrometri, IR)
11
Doz Aşımı

Toksik etki gösteren madde teşhis edildiğinde uygun
tedavi başlatılabilir.

Analizin temel amacı derişimi yerine ilacın teşhis
edilmesi olmasına karşın, miktar tayini belli düzeyde
gerekebilir.

Örneğin, ilacın düzeyi ve insandaki eliminasyon
karakteristikleri, ilacın uzaklaştırılıp
uzaklaştıralamayacağı, veya vücudun eliminasyon
işlemini kendi mekanizmaları ile tamamlamasını
sağlayan yolların çalıştırılmasına izin verilmesi hakkında
doktorun karar vermesine olanak sağlar.

Alternatif olarak , tedavi sürerken tekrar analiz için daha
fazla kan örneğinin alınması ile ilerlemeyi izlemek yararlı
olabilir.
12
İlaç Suistimali

İlaç suistimalcileri (uyuşturucu müptelaları) büyük bir
olasılıkla ilaç alışkanlığı yüzünden hastalıklar
nedeniyle çalışamama, daha fazla sağlık hizmeti
kapsamı, iş yerinde daha az verim veya daha fazla
tehlike oluşturma olayları yaşarlar.

ilaç testleri aday seçimi işlemlerinin rutin uygulanan
bir parçasıdır.

En fazla test edilen madde marihuanadır.

İdrar en yaygın kullanılan test örneğidir.
13
Sporda İlaç Kullanımı

At yarışlarında doping, 1666 da Worksop daki
yarışlarda uyarıcı maddelerin yasaklanması kaydına
kadar eski zamanlara uzanır.

At ve köpek yarışlarında hayvanların tamamen
ilaçsız olması gerekir.

İnsanlarla ilgili yarışmalarda doping listeleri ilgili etik
kurullar tarafından oluşturulmuştur.

Yasaklı ilaçların kullanımı idrar numunelerinde
araştırılır.
14
Terapötik İlaç İzleme

Toksik etkilerin meydana geldiği dozlara göre daha düşük
dozlarda etkili olan yeni bileşiklerin geliştirilmesi ile zararlı
etkilerden yararlı etkilerin ayrılması istenir.

Terapötik oranı (toksik düzeylerin terapötik düzeylere oranı)
düşük olan, dar terapötik pencereli ilaçlar kullanılırken aşırı özen
gösterilerek dozlama yapılması zorunludur.

Doğru ilaç dozu uygulansa bile etki yerindeki ilaç derişimi de
önemlidir.

İlaç tayinleri istenen terapötik plazma düzeyleri toksik plazma
düzeylerine yakın kişilerde ilaç dozunun titre edilmesinde çok
yararlıdır, örn digoksin kan düzeyi izlenerek yüksek terapötik ve
düşük toksik etki elde edilir.

Genellikle HPLC, GC gibi yöntemlerin yanı sıra
radyoimmunolojik tayin (RIA) yöntemleri de sıklıkla kullanılır.
15
Farmakogenetik

Dar terapötik pencereli ilaçların doz ve kan düzeyleri arasında bireyler arası bir ilişki
olmaması farklılıkların genetik temelde incelenmesine yol açmıştır.

Desipraminin farklı hastalarda ulaşılan plazma düzeylerinin 36 misli farklı olduğu ve bu
etkinin ilacı hidroksilleyen enzimlerin farklı aktivitelerinden kaynaklanabileceği
belirlenmiştir.

Debrisoquin ile rutin klinik farmakolojik çalışmalar sürerken gönüllülerden bazılarında ağır
hipotansif yanıtlar 4-hidroksidebrisoquin’e metabolize etmekteki yetersizliğine bağlı
bulunmuştur.

Enzim ile metabolit üretmedeki yetersizlik zayıf metabolizer için bir tanım üretilmesine
neden olmuştur.

Hastaya test ilacı (debrisoquin, spartein, dextrometorfan) uygulanır ve belirli bir zaman
sonra idrarda değişmeyen ilaç ve major metaboliti ölçülür. Bu iki değerin oranı mebolizma
kapasitesidir. Zayıf metabolizerlerin belirlenmesinde önemlidir.

CYP2D6 enziminin zayıf metabolizerlerin karaciğerinde olmadığı belirlenmiştir.

Metabolik kapasitenin belirlenmesi için ilaç ve metabolitinin ölçülmesi hayati önem taşır.
16
Araştırma – Geliştirme Alanı

Farmakoloji

Toksikoloji

Faz-I klinik testler

Metabolizma

Farmakokinetikler

Formülasyon geliştirme

Faz-II klinik testler

Farmakodinamikler
17
Farmakoloji

Aynı etkiyi gösteren yeni ilacın daha düşük dozunun bu etkiyi
sağlaması ile ilgili araştırmalar sırasındaki ölçümler önem taşır.
Aktifliği belirlemek için derişimle veya bilinen standartlarla ilişkili
olan in vitro ve in vivo farmakolojik testler yapılır. Genellikle
radyoimmun testler ve reseptör bağlanma deneyleri uygulanır.

“Doz-plazma derişimi-etki” çalışmalarının sonuçları kullanılarak
ilacın ilgili aktivitesi hakkında daha açık bir fikir oluşur.

İlave olarak ilacın dağılımını etkileyen faktörlerle ilgili doğru ve
kapsamlı bir fikir oluşur.

Araştırmacılar o zaman, vücudun tamamındaki farmakolojik
gözlemlerine dayanarak ilaç adayını kabul ya da red etmek
yerine, optimal in vivo etkileri elde etmek için hangi koşulların
değiştirilebileceğine karar verebilirler.

Zayıf absorbe olan ilaçların belirlenmesinde analitik ölçüm
sonuçları ilaç geliştirmede nihai kararı belirler.
18
Toksikoloji

Akut toksisite testlerinde artan ilaç dozları hayvanlara verilerek
LD50 belirlenir, bu sırada plazma düzeylerinin ölçülmesi çok
önemli değildir. İlaç uzman kişiler tarafından genellikle çözelti
halinde tek doz ile tek hayvana uygulanır.

Kronik toksisite (KT) fazında ilaç dozları LD50 nin altında ve uzun
süreli uygulanır. Bu aşamada çok sayıda deney hayvanına
yem veya su ile karıştırılmış halde ilaç verilir.

KT de ilaç veya metabolitinin plazma düzeylerinin ölçülerek
toksisite ile ilişkilendirilmesi gerekir.

Küçük ve büyük deney hayvanlarındaki plazma düzeylerini
belirleme çalışmaları kolay bir konu değildir, sorun ve zorluklar
taşır.

Toksikokinetik son yıllarda toksikologların ilgilendiği, toksikolojik
bakış açısı ile ilacın absorpsiyon hızı, doku dağılımı, enzimatik ve
non-enzimatik biyotransformasyonu ve atılımının incelendiği
yeni bir alandır.
19
Faz Çalışmaları

İnsan denekler üstünde klinik araştırma, “faz çalışması” denilen ve dört basamakta cereyan
eden bir etkinlikler dizisidir. Bu çalışmalar sonucunda yeni bir kimyasal antite ya ilaç olma
özelliğini kazanır ve klinik uygulamaya sunulmak üzere ruhsat alır; ya da ruhsatlı bir ilacın pazar
sonrası takibiyle sonucunda ruhsat değişikliğine gidilebilir. Yönetmelikte yer aldığı üzere ilaç klinik
araştırmalarının bu “fazik safhaları” madde 15 de düzenlenmiştir ve şöyledir:

MADDE 15 – (1) İlaç klinik araştırmalarının safhaları sunlardır:

a) Faz I: Araştırma ürününün farmakokinetik özelliklerinin, toksisitesinin ve vücut fonksiyonlarına
etkisinin tespit edilebilmesi için, araştırmanın niteliğine ve mahiyetine göre seçilmiş yeterli sayıda
sağlıklı gönüllüye veya sağlıklı gönüllülerde çalışılmasına imkân olmayan durumlarda hasta
gönüllülere uygulanmak suretiyle denendiği klinik araştırma safhasıdır.

b) Faz II: Araştırma ürününün; terapötik doz sınırlarının, klinik etkililiğinin ve emniyetinin araştırılması
amacıyla, araştırmanın niteliğine ve mahiyetine göre seçilmiş yeterli sayıda gönüllü hastaya
uygulanmak suretiyle denendiği klinik araştırma safhasıdır.

c) Faz III: Araştırma ürününün; araştırmanın niteliğine ve mahiyetine göre seçilmiş, yeterli sayıda
gönüllü hastaya uygulanarak; etkinliği, emniyeti, yeni bir endikasyon araştırması, farklı dozları,
yeni veriliş yolları ve yöntemleri, yeni bir hasta popülâsyonu ve yeni farmasötik şekiller yönünden
denendiği klinik araştırma safhasıdır.

ç) Faz IV: Türkiye’de ruhsat almış ürünlerin onaylanmış endikasyonları, izinli ürünlerin ise önerilen
kullanımlarına yönelik emniyetinin ve etkililiğinin daha fazla incelenmesi veya yerleşik diğer
tedavi, ürün ve yöntemlerle karşılaştırılması için fazla sayıda hasta üzerinde gerçekleştirilen klinik
araştırma safhasıdır.
20
Faz-I Klinik Testler

Çok düşük bir doz yakından takip edilen sağlıklı gönüllülerin küçük bir grubuna
öncelikle verilir.

Bu doz umulan terapötik dozun epeyce altında olacaktır ve gönüllüler
istenmeyen yan etkilerin herhangi bir işareti için gözlenirler.

Sonra bu doz önerilen terapötik dozun üzerinde bir sınıra yükseltilir ve bu serideki
en yüksek doz hatta hiçbir zaman uygulanmayacak ilaç dozu bile olabilir.

Beklenen bir etki görülmezse veya öngörülmeyen yüksek dozlara kadar
görülmezse bunun ilacın zayıf aktivitesinden mi veya test edilen gönüllülerdeki
zayıf absorpsiyondan mı veya farmakolojik test hayvanları ile karşılaştırıldığında
artan metabolizmadan mı olup olmadığını belirlemek önemlidir.

Plazma düzeylerinin ölçümü bu noktada çok yararlıdır. Düzeyler yüksekse insanda
ilacın inaktif olduğu kabul edilebilir ve analitik yöntem ilaç geliştirmenin
sonlandırılmasında hayati öneme sahip olacaktır.
21
Metabolizma

Hayvan metabolizma çalışmalarının
çalışmalarıyla aynı zamanda yapılır.
başlaması
insandaki
tolerans

Metabolizma çalışmaların en populer nedenlerinden biri toksisite testleri için
seçilen türdeki (kobay, sıçan köpek vb) metabolizma yolaklarının insandaki
ile aynı olup olmadığını belirlemektir.

Eğer metabolizma yolakları 2 türde farklıysa o zaman hayvanda toksik olan
bir metabolitin insanda oluşmama olasılığı mevcuttur. Bundan dolayı
insandaki toksik bir etki ile ilgili olarak yanlış bir yoruma neden olur. Tersi
olarak insanda toksik, hayvanda olmayan bir metabolit oluşursa toksik
potansiyel hayvan çalışmalarından tahmin edilemez ve klinik çalışmalar
sırasında beklenmeyen sonuçlar görülür.

İnsandaki ile aynı kimyasal maruziyete yol açan deney hayvanının test
edilen bir türü veya test türleri kombinasyonu bulunamazsa insanda oluşan
metabolitleri sentezlemek ve toksik etkileri için bunları ayrıca test etmek
gerekebilir. İlaç metabolizması çalışmaları bu yüzden kullanılan toksisite
türünün (deney hayvanının) geçerliliğini gösteren bir bilim olarak gösterilir.
Farmakokinetik çalışmalar
22

Organizmanın ilaca ne yaptığı ile ilgilenir. (Emilim, dağılım, metabolizma ve itrah)

İnsana ilaç uygulamalarının erken basamaklarında farmokokinetik verileri belirleyici kılmak için
kalitesi kanıtlanmış analitik yöntemler uygulanır.

Eğer i.v. deney yapılmışsa ilacın gerçek eliminasyon yarı ömrü ve dağılım hacmi
belirlenmelidir. O zaman çeşitli doz değerleri için plazma ya da doku derişimleri yoluyla kinetik
parametrelerin tahmin edilmesi için kullanılabilir.

Sonra uygun deneylerle (uygun numune alma ve tayin yoluyla) bu tahminleri test etmek
gerekir. Bu yüzden insandaki erken faz testlerinde analitik yöntem kritiktir ve yaygın olarak
kullanılabilir.

Önemli kararlar bu deneylere dayanarak alınır ve verilerin yüksek kalitede olması çok
önemlidir. İnsanlardaki deneylerin tipik serilerinde doğrusal kinetikleri belirlemek (yani artan
dozda, doz sonrası eşdeğer zamanlarda plazma derişimlerinin orantılı artışını verir),
biyoyararlanım (oral ve intravenöz uygulanan ilacın AUC lerinin karşılaştırılması) ve çoklu
dozları takiben birikmenin kapsamını belirlenmesinin gerekli olduğu düşünülür.

İlaç testlerinin bu fazı, modern ilaç araştırma ve geliştirmenin ciddi harcamaları içerisinde
önemli bir harcama oluşturan 10000 plazma ve idrar analiziyle ilgili olabilir.
23
Formülasyon Geliştirme

İlacın temel farmokokinetiklerinin belirlenmesinden sonra
analitik yöntem ticari dozaj formunun performansını izlemek
için kullanılır. Başlangıçtaki dozaj formu oral biyoyararlanım
için formule edilir.

Böyle çalışmalar oral çözeltilerin ve geliştirilmiş formulasyonun
crossover -çapraz- dizayn biçiminde gönüllülere uygulanması
ve eğri altındaki alan, pik derişimi, pik zamanı gibi plazma
profili ile ilgili ölçütlerin karşılaştırılmasını kapsar ve aynı profile
sahip olması beklenir. (Şekil 1.11).
24
Şekil 1.11 Üç farklı formülasyon uygulanan hastaların tolbutamit ölçümü
ile biyoeşdeğerlik çalışmasında zaman-plazma derişimi profillerinin
karşılaştırılması
25

Daha ileri geliştirmeler için pik plazma düzeyleri incelenir (yani formülasyondaki
değişikliklerle absorpsiyonun yavaşlaması). Bu sırada vücudun ilacın aynı miktarına
maruz kalması sağlanır. Absorpsiyon yavaşladığında pik zamanı gecikir. Pik derişiminin
gerçek değeri azalır. Ancak eğri altındaki alan (AUC) ideal durumda değişmemelidir.

Uzun etkili (sustained release) formulasyonlar için AUC pratikte en iyi biyoyararlanım
formundan daima daha az olacaktır. Çünkü uzun etkili formulasyon absorpsiyon
yerinde sonsuza kadar kalamaz ve gerçek bir eksponansiyel eğri formulasyonun
absorpsiyon yerini terk ettiği noktada kırılacaktır, bu noktada gözlenen eğri plazmadan
ilacın atılması için normal bozunma eğrisine dönecektir (Şekil 1.12).

Formulasyon geliştirme sırasında analitik yöntem için gerekli şartlar temel
farmokokinetik beklentilerin belirlenmesi için olanlarla aynıdır. Eğer metabolizma 1.
derece hız prosesi ile yürüyorsa, metabolitlerle karşılaştırıldığında değişmeyen ilaç için
yöntemin spesifik olması gerekli bir kriter değildir.
26
Şekil 1.12
Uzatılmış salım formundaki ilacın absorpsiyon yerinden
uzaklaşmasının
zaman-plazma derişimi profili üzerine etkisi. İlaç
absorpsiyon yerinden ayrılana kadar sistemik dolaşımda ilaç uzatılmış
plazma derişimi sergiler ve sonrasında plazma düzeyi ilacın yarı ömrüne
göre azalır.