tc gazi üniversitesi sağlık bilimleri enstitüsü tıbbi biyoloji ve genetik
advertisement
T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK ANABİLİM DALI KOLON KANSER HÜCRE HATLARINDA RESEPTÖR TİROZİN KİNAZ VE JAK-STAT İNHİBİTÖRLERİNİN APOPTOTİK VE ANTİPROLİFERATİF ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI DOKTORA TEZİ Atiye Seda YAR Tez Danışmanı Prof. Dr. Sevda MENEVŞE ANKARA Kasım 2012 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK ANABİLİM DALI KOLON KANSER HÜCRE HATLARINDA RESEPTÖR TİROZİN KİNAZ VE JAK-STAT İNHİBİTÖRLERİNİN APOPTOTİK VE ANTİPROLİFERATİF ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI DOKTORA TEZİ Atiye Seda YAR Tez Danışmanı Prof. Dr. Sevda MENEVŞE Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından 01/2011-56 proje numarası ile desteklenmiştir. ANKARA Kasım 2012 I İÇİNDEKİLER Sayfa No Kabul ve Onay I İçindekiler II Şekiller ve Grafikler VIII Tablolar XII Semboller, Kısaltmalar XIII Önsöz XVII 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Kanser 4 2.2. Kolonun anatomisi 6 2.3. Kolon Kanseri 7 2.4. Reseptör Tirozin Kinaz 9 2.4.1. Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü 11 2.4.1.1. EGFR ve Kolon Kanser İlişkisi 14 2.5. Tirozin Kinaz İnhibitörleri 15 2.6. Janus Kinaz / Sinyal Dönüştürücü ve Transkripsiyon Aktivatörü Sinyal İleti Yolağı 17 2.6.1. JAK/STAT Sinyal Yolağı 20 2.6.2. JAK/STAT Sinyal Yolağı ve Kanser 23 2.7. Programlı Hücre Ölümü: Apoptoz 24 2.7.1. Apoptotik Sinyal Yolakları 24 2.7.1.1. Dışsal Yolak (Ölüm Reseptör Yolağı) 25 II 2.7.1.2. İçsel (Mitokondriyal) Yolak 26 2.7.2. Apoptozun Düzenlenmesi 28 2.7.2.1. Bcl-2 Protein Ailesi 28 2.7.2.2. p53 30 2.7.2.3. Kaspazlar 31 2.7.3. Apoptoz ve Kanser 32 2.8. Siklin D1 33 2.9. CDK İnhibitörü p27Kip1 34 2.10. Gefitinib 36 2.11. Kukurbitasin B 38 2.12. HT-29 Kolon Kanser Hücre Hattı 40 2.13. HCT-116 Kolon Kanser Hücre Hattı 41 3. GEREÇ VE YÖNTEM 43 3.1. Kullanılan Araç ve Gereçler 43 3.1.1. HT-29 ve HCT-116 Hücre Hattı 43 3.1.2. Kullanılan Cihazlar 43 3.1.3. Kullanılan Sarf Malzemeler 44 3.1.4. Kullanılan Kimyasal Maddeler 44 3.1.5. Kullanılan Kitler 47 3.2. 47 Besiyeri, Tampon ve Çözeltilerin Hazırlanışı 3.2.1. % 10’luk DMEM Besiyerinin Hazırlanması 47 3.2.2. % 1’lik DMEM Besiyerinin Hazırlanması 48 3.2.3. MTT Karışımının Hazırlanması 48 3.2.4. 0.2 M Na2HPO4 Çözeltisinin Hazırlanması 48 III 3.2.5. 0.1 M Sitrik Asit Çözeltisinin Hazırlanması 48 3.2.6. Fosfat-Sitrat Çözeltisinin (pH: 7.8) Hazırlanması 48 3.2.7. % 0.25 Nonidet P-40 (NP-40) Çözeltisinin Hazırlanması 49 3.2.8. 1 mg/ml Proteinaz K Çözeltisinin Hazırlanması 49 3.2.9. 1 mg/ml Ribonükleaz A (RNaz A) Çözeltisinin Hazırlanması 49 3.2.10. 10X Tris Borat EDTA (TBE) Stok Çözeltisinin Hazırlanması 49 3.2.11. 1X Tris Borat EDTA (TBE) Tamponunun Hazırlanması 49 3.2.12. 0.5 M EDTA Çözeltisinin Hazırlanması 50 3.2.13. Oranj G Jel Yükleme Tamponunun Hazırlanması 50 3.2.14. Stok Etidyum Bromür Boyasının Hazırlanması 50 3.2.15. Agaroz Jelin Hazırlanması 50 3.2.16. 1X PBS Çözeltisinin Hazırlanması 50 3.2.17. 56 mM Stok Gef Çözeltisinin Hazırlanması 51 3.2.18. 36 mM Stok Kukurbitasin B (CuB) Çözeltisinin Hazırlanması 51 3.2.19. 0,5 M Tris-HCl Çözeltisi (100 ml, 1,25M) (pH 6.8) 51 3.2.20. 1,5 M Tris-HCl Çözeltisi (100 ml, 1,25M) (pH 8.8) 51 3.2.21. Akrilamid / Bisakrilamid Stok Çözeltisi (100 ml, %30) 52 3.2.22. Amonyum Persülfat (APS) Stok Çözeltisi (100 ml, %10) 52 3.2.23. Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) Stok Çözeltisi (100 ml, %10) 52 3.2.24. 2X Yükleme Tamponu (Laemmli - Sample Buffer) (10 ml) 52 3.2.25. 2X Protein Yükleme Tamponu İndirgeyici 53 3.2.26. Tris Baz Stok Çözeltisi (100 ml, 1,5 M) 53 3.2.27. 10X Jel Yürütme Tamponu (Running Buffer) (1000 ml) 53 3.2.28. 1X Jel Yürütme Tamponu (Running Buffer) (1000 ml) 53 IV 3.2.29. Jelden Membrana Proteinleri Transfer Tamponu (1000 ml) 53 3.2.30. Jel Boyama Çözeltisi – Coomassie Parlak Mavisi (1000 ml) 54 3.2.31.Ponceau S Çözeltisi (100 ml) 54 3.2.32. Jelden Boya Çıkartıcı Çözelti (1000 ml) 54 3.2.33. TBS (Tris-tuz) Çözeltisi (500 ml) 54 3.2.34. TBST (Tris-tuz-tween 20) Çözeltisi (300 ml) (pH: 7.4) 54 3.2.35. Bloklama Çözeltisi (%3 Süttozu içeren TBST) (10 ml) 55 3.2.36. PBS ( Fosfat-tuz tamponu) 55 3.2.37. Antikor Çözeltileri 55 3.2.38. Sodyum Azid (NaN3) 55 3.2.39. İmmünolojik Saptama için Kullanılan Çözelti 55 3.3. Yöntemler 56 3.3.1. Hücre Kültürü 56 3.3.2. Gef ve CuB Uygulanan HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde Etkin Dozun MTT Yöntemi ile Belirlenmesi 56 3.3.3. Canlı, Apoptotik ve Nekrotik Hücre Ayrımının Floresan Mikroskobunda İncelenmesi 57 3.3.4. Besiyerine Salınan Laktat Dehidrojenaz (LDH) Miktarının Ölçülerek Sitotoksik Etkinin Belirlenmesi 58 3.3.5. Hücre Çoğalmasının Bromodeoksiuridin (Brdu) ile Belirlenmesi 59 3.3.6. DNA Fragmentasyonunun ELISA Yöntemi ile Belirlenmesi 61 3.3.7. DNA Fragmentasyonunun Agaroz Jel Elektroforezi ile Gösterilmesi 62 3.3.7.1 Agaroz Jel Elektroforezi 63 3.3.8. Aktif kaspaz-3 miktarının Sandwich ELISA yöntemi ile Belirlenmesi 63 V 3.3.9. Hücre Kültüründen Total RNA’nın Elde Edilmesi 65 3.3.10. Komplementer DNA (cDNA) Sentezi (RT-PCR) 67 3.3.10.1 Reverse Transkriptaz PCR (RT-PCR) Programı 67 3.3.11. Gen İfadesinin Real-Time PCR ile Belirlenmesi 68 3.3.12. Bcl-2 Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi 68 3.3.13. Bax Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi 69 3.3.14. Bak Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi 69 3.3.15. Bad Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi 70 3.3.16. Siklin D1 Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi 70 3.3.17. GAPDH Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi 71 3.3.17.1 Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH Genleri için RealTime PCR Tepkime Karışımı 72 3.3.17.2. Light Cycler (LC) Deney Programı 72 3.4. Western Blot Yöntemi 74 3.4.1. Hücreden Protein İzolasyonu 74 3.4.2. Protein Miktar Tayini 75 3.4.3. SDS-PAGE Jelin Hazırlanması 75 3.4.4. Proteinlerin SDS-PAGE’e Yüklenme Öncesi Hazırlanması 77 3.4.5. Proteinlerin SDS-PAGE’e Yüklenmesi ve Elektroforez İşlemi 77 3.4.6. Elektrotransfer İşlemi (Protein Örneklerinin Nitroselüloz Membrana Aktarılması) 78 3.4.7. Bloklama 79 3.4.8. Membran Üzerindeki Proteinin İmmunolojik Gösterilmesi 79 3.4.9. Görüntüleme 80 3.5. İstatistiksel Analiz Yöntemleri 80 VI 4. BULGULAR 81 4.1. HT-29 ve HCT-116 Hücrelerinin Gef ve CuB’ye Duyarlılığının MTT Hücre Canlılığı Yöntemi ile İncelenmesi 81 4.2. Canlı, Apoptotik ve Nekrotik Hücre Dağılımının Floresan Mikroskobunda İncelemesi 85 4.3. Besiyerine Salınan Laktat Dehidrojenaz (LDH) Miktarının Ölçülerek Sitotoksik Etkinin Belirlenmesi 88 4.4. Hücre Çoğalmasının Bromodeoksiuridin (BrdU) ile Belirlenmesi 90 4.5. DNA Fragmentasyonunun ELISA Yöntemi ile Belirlenmesi 92 4.6. DNA Fragmentasyonunun Gösterilmesi Agaroz Jel Elektroforezi ile 93 4.7. Aktif Kaspaz-3 Düzeyinin Belirlenmesi 95 4.8. Gen İfade Düzeylerinin Kantitatif Değerlendirilmesi 97 4.9. Gen İfade Düzeylerinin Karşılaştırması 102 4.9.1. CuB ve Gef’in Bcl-2, Bax, Bak, Bad, ve Siklin D1 Genlerinin İfade Düzeylerine Etkisi 102 4.10. Protein İfade Düzeylerinin Karşılaştırması 104 4.10.1. Bcl-2, Bax, Bak, p27kip1 ve Siklin D1 proteinlerinin protein düzeyinde ifade düzeylerinin Belirlenmesi 104 5. TARTIŞMA 106 6. SONUÇ 118 7. ÖZET 120 8. SUMMARY 122 9. KAYNAKLAR 124 10. EKLER 159 11. ÖZGEÇMİŞ 160 VII ŞEKİLLER ve GRAFİKLER Sayfa No Şekil 1: Kalın bağırsağın başlıca bölümleri 6 Şekil 2: Kolonda ortaya çıkan polipler 7 Şekil 3: Kalın bağırsakta polipten kanser gelişimi 8 Şekil 4: EGFR’nün yapısı 12 Şekil 5: Monoklonal antikor ve Tirozin Kinaz İnhibitörleri’nin etki mekanizması 16 Şekil 6: Janus Kinaz’ın yapısı 19 Şekil 7: STAT’ın yapısı 20 Şekil 8: JAK/STAT sinyal yolağı 22 Şekil 9: İçsel ve dışsal apoptotik yolaklar 27 Şekil 10: Bcl-2 protein ailesi üyelerinin şematik gösterimi 29 Şekil 11: Gef’in kimyasal yapısı 37 Şekil 12: Gef’in etki menizması 37 Şekil 13: Kukurbitasin B’nin kimyasal yapısı 39 Şekil 14: HT-29 hücrelerinin morfolojik görüntüsü 41 Şekil 15: HCT-116 hücrelerinin morfolojik görüntüsü 42 VIII Şekil 16: Bcl-2 mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi 68 Şekil 17: Bax mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve 69 UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi Şekil 18: Bak mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve 70 UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi Şekil 19: Bad mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi 70 Şekil 20: Siklin D1 mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan 71 primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi Şekil 21: GAPDH mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler 71 ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi Şekil 22: HT-29 hücrelerinde apoptozun morfolojik olarak 86 gösterilmesi Şekil 23: HCT-116 hücrelerinde apoptozun morfolojik olarak gösterilmesi 86 Şekil 24: HT-29 hücrelerinin Gef, CuB ve bu ilaçların birlikte 94 kullanımı sonunda görülen DNA fragmentasyonunun %1.5’luk agaroz jeldeki görüntüsü Şekil 25: HCT-116 hücrelerinin Gef, CuB ve bu ilaçların birlikte 94 kullanımı sonunda görülen DNA fragmentasyonunun %1.5’luk agaroz jeldeki görüntüsü Şekil 26: Bcl-2 geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak 97 gösteren amplifikasyon eğrileri Şekil 27: Bax geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak 98 gösteren amplifikasyon eğrileri Şekil 28: Bak geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak 99 IX gösteren amplifikasyon eğrileri Şekil 29: Bad geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak 100 gösteren amplifikasyon eğrileri Şekil 30: SiklinD geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif 100 olarak gösteren amplifikasyon eğrileri Şekil 31: GAPDH geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif 101 olarak gösteren amplifikasyon eğrileri Şekil 32: HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde 24 saat süreyle belirli 105 dozlarda Gef, CuB ve bu ilaçların birlikte kullanılması sonucunda Bcl-2, Bax, Bak, p27kip1 ve Siklin D1 protein düzeylerini gösteren protein bantları Grafik 1: HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin (10.000 hücre/kuyu) Gef 82 ile 24 ve 48 saat inkübasyonu sonunda belirlenen hücre canlılık oranları. Grafik 2: HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin (10.000 hücre/kuyu) 83 CuB ile 24 ve 48 saat inkübasyonu sonunda belirlenen hücre canlılık oranları. Grafik 3: HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin (10.000 hücre/kuyu) Gef 84 ve CuB ile birlikte 24 ve 48 saat inkübasyonu sonunda belirlenen hücre canlılık oranları. Grafik 4: HT-29 hücrelerinin (106 hücre/kuyu) Gef, CuB ve bu 87 ajanların birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda belirlenen Canlı / Apoptotik / Nekrotik hücre oranları. Grafik 5: HCT-116 hücrelerinin (106 hücre/kuyu) Gef, CuB ve bu 88 ajanların birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda belirlenen Canlı / Apoptotik / Nekrotik hücre oranları. Grafik 6: HT-29 hücrelerinin Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 89 24 saat inkübasyonu sonunda görülen LDH salınımı X Grafik 7: HCT-116 hücrelerinin Gef, CuB ve bu ajanların 90 birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen LDH salınımı Grafik 8: HT-29 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 91 24 saat inkübasyonu sonunda görülen DNA sentez oranlarındaki değişim Grafik 9: HCT-116 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların 91 birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen DNA sentez oranlarındaki değişim Grafik 10: HT-29 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların 92 birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen DNA fragmentasyon oranı Grafik 11: HCT-116 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların 93 birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen DNA fragmentasyon oranları Grafik 12: HT-29 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların 96 birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen aktif kaspaz-3 oranları Grafik 13: HCT-116 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların 97 birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen aktif kaspaz 3 oranları Grafik 14: HT-29 hücrelerinin doza bağlı olarak Gef, CuB ve bu 103 ajanların birlikte uygulanması sonrasında Bcl-2, Bad, Bax, Bak ve SiklinD mRNA düzeylerindeki değişiklik Grafik 15: HCT-116 hücrelerinin doza bağlı olarak Gef, CuB ve bu 104 ajanların birlikte uygulanması sonrasında Bcl-2, Bad, Bax, Bak ve SiklinD mRNA düzeylerindeki değişiklik XI TABLOLAR Sayfa No Tablo 1: RT-PCR tepkime karışımı 67 Tablo 2: Otomatik ısı döngüsü cihazında uygulanan program 67 Tablo 3: Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH Real-Time 72 PCR tepkime karışımı Tablo 4: Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH genlerinin 73 ifade düzeylerinin belirlenmesi için kullanılan Real Time PCR tepkime program Tablo 5: %10’luk SDS-PAGE için ayırma jelinin bileşenleri 76 Tablo 6: %12’lik SDS-PAGE için ayırma jelinin bileşenleri 76 Tablo 7: %5’lik SDS-PAGE için yığınlama jelinin bileşenleri 77 XII SEMBOLLER ve KISALTMALAR ºC : Santigrad Derece µl : Mikrolitre μg : Mikrogram μM : Mikromolar aa : Aminoasit AIF : Apoptoz Uyarıcı Faktör Apaf-1 : Apoptotik Proteaz Aktive Edici Faktör-1 APS : Amonyum persülfat ATP : Adenozin trifosfat Bax : BCL2 İlişkili X Proteini Bcl-2 : B hücresi lenfoma geni 2 bç : Baz Çifti BH : Bcl-2 Homoloji Bölgesi BrdU : 5-bromo-2'-deoksiüridin cDNA : Komplementer DNA Ca+2 : Kalsiyum cDNA : Komplementer DNA CDK : Siklin Bağımlı Kinaz CDKI : Siklin Bağımlı Kinaz İnhibitörleri Cp : Crossing point CuB : Kukurbitasin B DEPC : Dietilpirokarbonat DISC : Ölüm-Tetikleyici Sinyal Kompleksi Dk : Dakika XIII DNA : Deoksiribonükleik asit dNTP : Deoksiribonükleotidtrifosfat DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Media DMSO : Dimetil Sülfoksit EDTA : Etilendiamintetraasetikasit EGF : Epidermal Büyüme Faktörü EGFR : Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü FBS : Fetal Sığır Serumu FDA : Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi FGF : Fibroblast Büyüme Faktörü GAPDH : Gliseraldehit 3 Fosfat Dehidrojenaz Gef : Gefitinib g : Gram IFN : İnterferon JAK : Janus Kinaz JH : Janus Homoloji Domain JNK : c-Jun N-terminal Protein Kinaz Kaspaz : Sistein Bağımlı Aspartata Spesifik Proteaz kDa : Kilo dalton KHDAK : Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri LC : Light Cycler LDH : Laktat Dehidrojenaz M : Molar mAb : Monoklonal antikor mg : Miligram MgCI2 : Magnezyum Klorür XIV ml : Mililitre mRNA : Elçi RNA MTT : 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromid nM : Nanomolar NP-40 : Nonidet P-40 p53 : Protein 53 PBS : Fosfat Tamponlu Tuz Çözeltisi PCR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu PDGF : Trombosit Kaynaklı Büyüme Faktörü PMSF : Fenilmetilsülfonilflorid Rb : Retinoblastoma REST : Relatif Ekspresyon Software Tool RNA : Ribonükleik asit RNaz A : Ribonükleaz A rpm : Dakika Başına Dönme Sayısı RTK : Reseptör Tirozin Kinaz RT-PCR : Ters Transkriptaz-Polimeraz Zincir Tepkimesi SH2 : Src-homology-2 S : Saat Sn : Saniye STAT : Sinyal Dönüştürücü ve Transkripsiyon Aktivatörü Taq : Thermus aquaticus TBE : Tris Borat EDTA Tamponu TGFβ : Transforme Edici Büyüme Faktörü Beta TNF : Tümör Nekroz Faktörü TNF- α : Tümör Nekroz Faktörü-α XV TNFR : Tümör Nekroz Faktör Reseptörü TK : Tirozin Kinaz TKİ : Tirozin Kinaz İnhibitörü UPL : Universal Prob Kütüphanesi UV : Ultraviyole V : Voltaj WHO : Dünya Sağlık Örgütü XVI ÖNSÖZ “Kolon Kanser Hücre Hatlarında Reseptör Tirozin Kinaz Ve JAK-STAT İnhibitörlerinin Araştırılması” Saymanlığı’nca konulu bu 01/2011-56 Apoptotik tez, kod ve Gazi no’lu Anti-Proliferatif Üniversitesi proje ile Etkilerinin Araştırma Fon desteklenmiştir. Çalışmamız, Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Laboratuvarı’nda gerçekleştirilmiştir. XVII 1. GİRİŞ Kanser günümüzün en önemli sağlık problemlerinden biridir. Kanser türleri arasında özellikle kolon kanseri, dünyada kadın ve erkeklerde gözlenen en yaygın kanser tipi olup, kansere bağlı ölümlerde erkeklerde ikinci, kadınlarda üçüncü sıradadır. Kolon kanseri gelişiminde genetik ve çevresel faktörler önemli rol oynamaktadır. Sinyal iletimi sırasında protein aktivasyonunu sağlayan protein kinazlar membran yerleşimli ve sitoplazmik tirozin kinazlar olmak üzere iki gruba ayrılır. Membran yerleşimli protein kinazlara reseptör tirozin kinaz (RTK) adı verilir. RTK’lar, büyüme faktörlerinin sinyalinin düzenlenmesinde önemli bir hedeftir. Kanserle ilişkili bulunan ilk hücre yüzeyi reseptörü olan Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü (EGFR) aynı zamanda bir RTK’dır. EGFR, hücre döngüsünün ilerlemesi, hücre proliferasyonu, sağ kalımı, adezyon, invazyon ve damar oluşumu gibi sağlıklı hücrelerin gelişimi ve homeostazisinde rol alır. Bununla birlikte kanser hücresinin proliferasyonu, sağ kalımı ve metastaz yeteneği kazanmasında da EGFR etkilidir. EGFR, hem monoklonal antikorlar, hem de tirozin kinaz (TK) inhibitörleri (TKİ) ile inhibe edilebilir. Kanser tedavisinde oral TKİ olarak uygulanan ve EGFR seçici inhibitörü olan Gefitinib (Gef), EGFR’nün ATP bağlanma bölgesine bağlanır ve EGFR’nün dimerizasyonunu ve otofosforilasyonunu inhibe ederek moleküler sinyal iletimini baskılar. Gef’in farklı kanser hücre hatlarında ve tümör ksenograft modellerinde, tek başına veya çeşitli sitotoksik ilaçlarla birlikte kombine uygulandığı zaman hücre proliferasyonunu ve metastazı inhibe ettiği, hücre döngüsünü durdurduğu ve anjiyogenezi baskıladığı gözlenmiştir. 1 Sitokin dönüştürücü sinyallerin en iyi bilinen şekli bir enzim olan janus kinazlar (JAK) ve sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü (STAT) olarak adlandırılan transkripsiyon faktörleridir. JAK aktivasyonunu takiben aktive olan STAT’lar reseptörden ayrılıp nükleusa göç eder ve hedef genlerin transkripsiyonunu aktive eder. JAK-STAT sinyal ileti yolağı, sitokinlere ve büyüme faktörlerine hücresel yanıtın düzenlenmesinde görev alarak, hücrelerdeki proliferasyon, farklılaşma, ve apoptozun düzenlenmesini sağlar. Kanser, yalnızca artmış bir hücre çoğalma hızıyla değil, aynı zamanda azalmış bir hücre ölüm hızı sonucu oluşur. Programlanmış hücre ölümü olan apoptoz, çok hücreli organizmalarda hem gelişim esnasında hem de gelişimini tamamlamış organizmaların homeostazisinin sağlanmasında istenmeyen hücrelerin yok edilmesi için evrimleşmiş en önemli mekanizmadır ve birçok farklı sinyal ileti mekanizmaları aracılığıyla uyarılabilmektedir. Bu uyarı, mitokondri aracılı olarak hücre içinden olabileceği gibi, ölüm reseptörleri aracılığıyla hücre dışından da olabilir. Kanser hücresinin önemli bir özelliği apoptoza direnç göstermesidir. Hücrelerin normal apoptotik süreçten kaçmalarını sağlayan bir özellik kazanmaları hemen bütün kanser hücrelerinde gözlenen bir özelliktir. Kanser hücreleri ya Bcl-2, Bcl-xL gibi anti-apoptotik proteinlerin aşırı yapımıyla, ya da Bax, Bak, Bad gibi pro-apoptotik proteinlerin yapımlarının azalmasıyla apoptoza dirençli özellik kazanır. Bu nedenle, apoptotik yolakların aktifleştirilmesi kanser terapisinin temel ilkelerinden biridir. Apoptozdan kaçmakta olan kanser hücreleri aynı zamanda, hücre döngüsünün kontrolünde görev alan siklin D1 geninin aşırı ifade edilmesine ve siklin bağımlı kinaz inhibitörü (CDKI) olan p27Kip1 geninin baskılanmasına neden olarak sürekli bölünmekte ve çoğalmaktadırlar. 2 Geleneksel olarak uygulanan tedavilerde önemli gelişmeler olmasına rağmen yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesi gerekmektedir. Son yıllarda kanser hücrelerini yok etmek için yeni hedefler ortaya çıkmıştır. Bu hedefler arasında yer alan en önemli sinyal yolaklarından biri olan JAK-STAT yolağı, yeni ilaçların geliştirilmesinde hedef proteinler olarak kanser tedavisinde yer almaktadır. JAK-STAT sinyal yolağının kuvvetli bir inhibitörü olan kukurbitasin B (CuB), iberis amara tohumlarından izole edilmiştir. CuB’nin, çeşitli kanser hücre hatlarında, JAK-STAT fosforilasyonunu inhibe ederek apoptozu uyardığı ve hücre proliferasyonunu baskıladığı, böylece tümör gelişimini inhibe ettiği gözlenmiştir. Bu bilgilerin ışığında, CuB’in tek başına ve Gef ile birlikte belirli doz ve sürelerde uygulanması sonucunda p53 mutant HT-29 ile p53 yabanıl tip (wild type) HCT-116 insan kolon kanser hücre hatları üzerindeki apoptotik ve anti-proliferatif etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaç kapsamında, apoptotik süreçte etkili olan Bcl-2, Bax, Bak, Bad genleri ile hücre döngüsü ve çoğalmasında etkili olan siklin D1 ve p27kip1 genlerinin mRNA ve protein düzeyinde doğrulandı. Ayrıca kolon kanser hücrelerinin Gef ve CuB’ye verdiği apoptotik ve sitotoksik yanıtlar da araştırılarak ilaçların hücre ölümüne olan etkisi değerlendirildi. 3 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Kanser Ölüme en sık neden olan hastalıklar arasında yer alan kanser, günümüzün en önemli sağlık problemlerinden biridir. Kanser, hücrenin büyümesi ve bölünmesini kontrol eden genlerin (onkogenler ve tümör baskılayıcı genler) mutasyonu, aşırı aktivasyonu veya fonksiyon kaybı sonucunda hücrelerin kontrolsüz bir şekilde bölünerek sürekli çoğalması ve hücre ölüm programının bozulması ile ortaya çıkan genetik bir hastalıktır 1,2 . Kanserleşme çok faktörlü ve çok basamaklı bir olay olup, normal bir hücrenin kanser hücresine dönüşebilmesi için çok sayıda genetik değişikliğin olması gereklidir. Bu genetik değişiklikler arasında nokta mutasyonları, translokasyonlar, gen amplifikasyonları, hücresel onkogen aktivasyonu ve tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonu gibi mekanizmalar yer alır. Bu değişimler, kanser hücrelerinin kontrolsüz biçimde çoğalma ve bölünmeyi sürdürerek çevre doku ve organları istila etmesine ve sonunda tüm vücuda yayılmasına (metastaz) neden olur 3,4. Kanserleşen hücreler, çeşitli kontrol mekanizmaların denetiminden kurtularak çoğalmaya devam ederler ve tümör ya da neoplazma olarak adlandırılan anormal hücre kitlesinin oluşumuna neden olurlar 5. Bu tümör hücreleri tek bir kitle içinde kümelenmiş bir şekilde durdukları sürece iyi huylu (benin) olarak sınıflandırılırlar. İyi huylu kitleler cerrahi müdahaleler ile çıkartılarak bireyin tam tedavisi sağlanabilirken, tümör hücreleri kötü huylu (malin) olup etraflarındaki başka dokulara sızma, yayılma ve yerleşme özelliği kazanmış kanser hücresi olarak kabul edilir 5,6. 4 Kanser hücreleri iki önemli özelliğe sahiptir. Sağlıklı hücreler belli bir kontrol altında, ihtiyaca göre bölünerek çoğalırken, kanser hücreleri normal hücrelerin sahip olduğu hücre bölünme sınırlamalarına karşı koyarak sürekli ve kontrolsüz bir şekilde çoğalırlar ve çoğalma hızları çok yüksektir. İkinci özellik ise kanser hücrelerinin özgün mikroçevreden bağımsız olarak yaşamlarını devam ettirme ve diğer hücrelerin yaşam alanlarına yayılarak yerleşmeleridir 1-4. Normal hücreler ile kanser hücreleri arasındaki bir başka fark da, sağlıklı hücreler bir taraftan apoptoz (programlı hücre ölümü) denen olay ile yok olurken, diğer taraftan büyüme faktörlerinin etkisiyle çoğalırlar, ancak kanser hücreleri hücre dışı büyüme faktörlerine daha az gereksinim duyar ve bu hücrelerin çoğunda apoptoz görülmez, bu nedenle sağlıklı hücrelerden daha uzun yaşarlar 1-3. Tümörün köken aldığı dokunun tipine göre kanserin; karsinoma, sarkoma, lenfoma ve lösemi gibi birkaç temel çeşidi vardır. Karsinoma deri veya iç organları çevreleyen epitel hücrelerden türevlenen malin tümörlerdir ve tüm kanser türlerinin %85’ini kapsarlar. En yaygın görülen karsinoma türleri meme, kolon, prostat ve akciğer kanseridir. Sarkoma kemik, kıkırdak, yağ, kas, kan damarları, veya diğer bağ ve destek dokusunda görülen kanserdir. Lenfoma ve myeloma ise savunma sistemi hücrelerinde görülen kanserdir. Lösemi kan oluşturan kemik iliği gibi dokularda başlar ve çok sayıda anormal kan hücreleri üretilir ve dolaşıma girer 6,7 . Bazı kanser türlerinin tanı ve tedavisinde son yıllardaki ilerlemelere karşın, kanserin erken tanı ve tedavisi halen önemli bir problem olmaya devam etmektedir 7-9. 5 2.2. Kolonun anatomisi Kalın bağırsak, sindirim sisteminde ince bağırsak ile anüs arasındaki yaklaşık 1,5 - 2 m uzunluğundaki kısımdır. Kalın bağırsak; çekum (kör bağırsak), kolon, rektum ve anüs bölümlerinden meydana gelir. Kalın bağırsağın ilk ve en uzun bölümü kolondur. Yaklaşık 5 cm kalınlığında kaslı bir tüp olan kolonda, besin maddelerinden su ve mineral maddeler absorbe edilir 10,11 . Kolon; çekum aracılığıyla ince bağırsağın ileumuna, sigmoid kolon üzerinden ise rektuma bağlanır. Kolon; çıkan kolon, transvers kolon, inen kolon ve sigmoid kolon adı verilen bölümlerden oluşmaktadır 10-12 . Kolon, karın içerisinde ters dönmüş U harfi şeklinde karnın sağ alt tarafından çekum ile başlar ve yukarı doğru çıkar (çıkan kolon), karaciğer altından keskin bir dönüşle karnı yatay olarak (transvers kolon) geçer, sol üst köşede yerleşen dalağın altına geldiğinde yine keskin bir dönüş yaparak sol taraftan aşağı doğru yönelir (inen kolon). İnen kolon, kolonun son kısmı olan sigmoid kolon ile rektumla birleşir. Sindirim sisteminin son kısmı olan rektum, kalın bağırsağın genişlemesi sonucu oluşan son 15 cm'lik bölümüdür ve anüsle dışarı açılır (Şekil 1) 10,11 . Şekil 1: Kalın bağırsağın başlıca bölümleri 13 6 2.3. Kolon Kanseri Kolon kanseri, bağırsak iç yüzeyini kaplayan epitel tabakayı oluşturan hücrelerde gelişen bir kanser türüdür. Kalın bağırsağın iç yüzeyini örten tabakadan bağırsak içine doğru gelişen kabartı ve şişliklere polip adı verilir 12,14,15 . Kalın bağırsağın adenom yapılarının %90’dan fazlası lümene uzanım göstererek polip oluşturur (Şekil 2) 14,15 . Bir adenomatöz polipin kanserleşmesi için yaklaşık 8-10 yıl kadar bir süre geçer. Polipler kanser öncüsü oldukları için kanserleşmeden önce çıkarılması gerekir. Zamanla polipi oluşturan hücreler çeşitli sebeplerle kanser hücrelerine dönüşerek çoğalır ve tümör kitlesini oluştururlar (Şekil 3). Oluşan kitle bağırsak duvarını işgal eder, böylece kontrolsüz büyümeye ve çoğalmaya devam eden hücreler bağırsağı tıkar. Buradan vücudun diğer hücrelerine ve organlarına metastaz yaparak ilerler 12,14. Şekil 2: Kolonda ortaya çıkan polipler 16 Kanser türleri arasında özellikle kolon kanseri gelişmiş ülkelerde ciddi morbidite ve mortalite gösteren en yaygın kanser tiplerinden biridir 9,17,18 . Kolon kanseri, dünyada kadın ve erkeklerde gastrointestinal sistemde oldukça sık görülen ve erişkin yaştaki toplumu 7 etkileyen bir kanser türü olması nedeni ile önemli onkolojik sorunlardan biridir 9,17 . Kolon kanseri, görülme sıklığı bakımından tüm kanserler arasında akciğer, meme ve prostat kanserlerinden sonra dördüncü sırada yer alırken, kansere bağlı ölüm nedenleri arasında akciğer ve meme kanserinden sonra üçüncü sırada yer almaktadır ve tüm kanser ölümlerinin %10’nundan sorumludur 19-21 . Dünya Sağlık Örgütünün (WHO) verilerine göre dünya genelinde her yıl 1 milyondan fazla kişi kolon kanserine yakalanmakta ve yaklaşık 650.000 kişi kolon kanseri nedeniyle ölmektedir 8,22,23 , bu nedenle bu hastalıkla ilgili çalışmalar toplum sağlığı ve hasta açısından önemli bir yer tutmaktadır. Şekil 3: Kalın bağırsakta polipten kanser gelişimi 24 Kolon kanseri gelişimi birçok faktörle ilişkili olduğu bilinen çok basamaklı bir süreçtir. Kolon kanserinin kesin etiyolojisi bilinmemekle birlikte, bazı genetik düşünülmektedir 20,25,26 ve çevresel faktörlerin önemli rol oynağı . Genellikle DNA tamir mekanizmalarında, hücre çoğalmasında, hücre farklılaşması ve kotrollü hücre ölümünde önemli fonksiyonlara sahip genlerdeki değişikliklerle ortaya çıkmaktadır 20,27-29 . Hücresel onkogenler, tümör baskılayıcı genler, DNA tamir genleri, büyüme faktörleri ve reseptörleri gelişimde rol oynamaktadır 21,30,31 . Kolon kanseri, 8 yaşa bağlı olarak artmaktadır, orta yaşın üzerinde daha çok ortaya çıkmakla birlikte, olguların %90’dan fazlası 50 yaş ve üzeridir 21,31,32. 2.4. Reseptör Tirozin Kinaz Sinyal iletimi sırasında protein fosforilasyonunu sağlayan protein kinazlar, membran yerleşimli ve sitoplazmik tirozin kinaz (TK)’lar olmak üzere iki ana gruba ayrılır. Bunun yanı sıra bu proteinler, katalitik özelliklerine göre (fosforilasyona uğrayan aminoasit (aa) türü) tirozin ve serin / treonin kinazlar olarak da 2 grupta sınıflandırılırlar 33,34 . TK enzimi, protein fosforilasyonunu sağlayarak, ligandın reseptör ile etkileşmesini ve hücre içine alınmasını ve bunların bir sonucu olarak da hücre içi biyolojik aktivitelerin devamlılığını sağlayan protein kinaz ailesine ait bir enzimdir. TK’lar, Adenozin trifosfatın (ATP) yapısında bulunan fosfat atomunun polipeptitlerdeki tirozin birimlerine transfer edilmesinde rol oynarlar. Bunlar hücresel proliferasyon, diferansiyasyon (farklılaşma), hücrenin canlılığı ve hücre hareketi gibi önemli düzenleyici fonksiyonlarda rol alırlar. TK’ler başlıca, reseptör yapıda olanlar ve reseptör yapıda olmayanlar olmak üzere iki ana gruba ayrılırlar 33-35. Sinyal ileti moleküllerine bağlanan ve substrat proteinleri üzerindeki tirozin birimlerini fosforillemek üzere aktive edilen hücre yüzeyi reseptörlerine reseptör tirozin kinazlar (RTK) adı verilir. RTK’lar hücre dışından gelen sinyalin hücre içine iletilmesini sağlarlar. Bu reseptörler arasında insülin reseptörü, büyüme faktörleri [(epidermal büyüme faktörü (EGF), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), platelet-türevli büyüme faktörü (PDGF), fibroblast büyüme faktörü (FGF)] reseptörleri ve ephrin (EphA, EphB) reseptörleri yer almaktadır 34,35 . RTK’lar, membranda yerleşim gösteren hücre dışı ligand bağlanma bölgesi, transmembran bölge ve oldukça iyi korunmuş hücre içi bölge kısımlarından oluşan 9 kinazlardır, sitozolik hücre içi bölgelerinde aktivasyondan sorumlu TK bölgesi içerirler 35,36. İstirahat halindeki hücrelerde, RTK’nın inaktif ve aktif konformasyonları denge halindedir. Uygun ligandın olmadığı durumlarda RTK’lar fosforile olmamış, monomerik durumdadırlar ve reseptörün kinaz bölgeleri inaktiftir. Bu reseptörler, ligand (büyüme faktörleri veya sitokinler) bağlanması, hücreler arası adezyon molekülleri ya da G-protein bağlı reseptörlerin uyarılmasından sonra aktif hale geçerler ve sitoplazmadaki hedef proteinleri ile etkileşerek sinyal iletimini gerçekleştirirler 34-36 . RTK aktivasyonu sonucu, reseptör kendi kendini fosforile eder ve bu fosforlanan bölgelere çeşitli adaptör proteinler bağlanır, böylece uyarının hücre içine iletimini sağlar. Adaptör proteinlerin ortak yapısal özelliği SH2 (Src-homology-2) bölgeleri içermeleridir. Bu proteinler, SH2 bölgeleri aracılığıyla reseptöre bağlanarak, RTK ile proteinleri arasında köprü görevi yapmaktadır sitoplazmadaki 37-39 efektör . RTK aktivasyonunun sonlandırılmasından fosfataz grubu proteinler sorumludur. Buna göre, fizyolojik koşullarda sinyal iletimi tersinir özellik taşır ve RTK aracılı sinyal iletimi kontrol altında tutulur 34,38,39. Çoğu RTK’ların büyüme faktörü reseptörleri olması nedeniyle, reseptörün işlev kazandıran mutasyonları veya reseptör-ligand aşırı ifadelenmesi gibi düzensizlikler çok çeşitli kanserlerin oluşumunda ve gelişiminde etkin rol oynamaktadır. Bunun yanı sıra kanserleşme sürecinde sürekli ve kontrolsüz RTK aktivasyonu, onkojenik sinyal iletimi, transformasyon, tümör büyümesi, motilite ve invazyon artışı ile anjiyogenez gibi malin fenotipe özgü hücresel olayları hızlandırır. Bu nedenle birçok kanserin tedavisinde RTK’ların inhibe edilmesinin etkili olduğu görülmüştür 37-40 . Bu nedenle RTK’lar günümüzde, özellikle kanserleşme sürecinde malin transformasyonda önemli araştırmaların konusu olmuş ve anti-kanser ilaçların primer hedefi haline gelmişlerdir 40 . 10 Bugün 10 kadar Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) onaylı RTK inhibitörü klinikte kemoterapötik amaçlı kullanılmaktadır 41,42. 2.4.1. Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü (EGFR), hücresel büyüme, farklılaşma ve proliferasyonu etkileyen çeşitli sinyal ileti sistemlerini içeren bir glikoproteindir. EGF, 1962 yılında keşfedilirken EGFR, 1980 yılında keşfedilmiştir 44,45 43 , . Reseptörün daha sonra ligand bağımlı bir RTK olduğu ve ana formunun kuşlardaki viral onkogen v-erbB ile homolog olduğu gösterilmiştir 46 . 170 kDa ağırlığında transmembran hücre yüzey reseptörü olan EGFR, yapısal olarak birbirine benzeyen, ancak fonksiyonel olarak farklı olan erbB1 (HER1, EGFR), erbB2 (HER2/neu), erbB3 (HER3) ve erbB4 (HER4) adı verilen 4 adet reseptörden oluşan RTK ailesinin ilk üyesidir 46-48. EGFR, üç bölgeden oluşur: Hücre dışı ligandların bağlandığı N terminal bölge, hidrofobik transmembran bölge ve hücre içi yerleşimli tirozin kinaz aktivitesine sahip C terminal bölge. Hücre içi C terminal bölgenin özgün tirozin içeren aa dizilimleri fosforile olduklarında SH2 içeren sinyal proteinleri için bağlanma bölgeleri oluştururlar (şekil 4) 47-49. 11 Şekil 4: EGFR’nün yapısı 50 EGFR geni 7p12 kromozomunda lokalizedir ve 1186 aa’den oluşan tek bir polipeptid zincirinden oluşmuştur. Bunun 622 aa’lik hücre yüzey bölgesi, 11 ve 12. konumlarındaki asparajin’den glikolizlenmiştir ve ligand bağlanma bölgesine sahiptir. 542 aa içeren hücre içi bölge fosforile olabilme yetisindedir ve TK içerir. Bu kısım uyarımdan etkilenen ilk bölümdür. Reseptörün TK bölgesi 694. aa’ten başlayarak 250 aa’lik bölgeyi kapsar. ATP bağlanma bölgesi 694. aa’ten başlar ve 150 kDa ve 20 kDa molekül ağırlığında iki parçaya ayrılır. 150 kDa’luk bölüm ise 110 kDa ve 40 kDa’luk parçalara bölünür. 40 kDa’luk bölüm ATP bağlayabilen, otofosforile olan tirozin aktivitesinin % 30’undan sorumludur. 1172 pozisyonundaki tirozin, EGF ile uyarılan önemli bir fosforilasyon bölgesidir. Aynı zamanda 1068 ve 1148 pozisyonlarındaki tirozinler de fosforile olur (şekil 4) 47-49,51. Sağlıklı hücrenin proliferasyonu ve sağ kalımı için hücre dışından gelen uyarılara gereksinim vardır. Büyüme faktörlerinin hücre yüzeyindeki reseptörlere bağlanarak ilişkili sinyal ileti ağlarını uyarması, bu bilgi iletimini sağlayan temel mekanizmalardan biridir 52,53 . EGFR sinyal 12 iletimi normal hücrelerde reseptör-ligand etkileşimi sonucu gelişen, çok evreli bir yolak ile meydana gelir. Ligandın bağlanması ile aktive olan EGFR sinyalinin; hücre döngüsünün ilerlemesi, hücre çoğalması, sağ kalımı (motilite), hücre adezyonu, farklılaşması, hücre göçü, invazyon, apoptoz ve damar oluşumu olgularında normal dokuların gelişimi ve homeostazisinde önemli rolü vardır 52-54 . Reseptörler inaktif monomerler şeklinde hücre membranında bulunurken, ligandın reseptörün hücre dışı bölgesine bağlanmasının ardından ya başka bir homodimerizasyon ya da EGFR ailesinden başka heterodimerizasyon ile aktive olur 55,56 bir EGFR ile reseptörle . Dimerizasyonun ardından, hücre içi TK bölgesinin C-terminalindeki tirozin birimlerini çapraz fosforillemesi (otofosforilasyon) sonucu TK bölgesi aktive olarak mitojenik sinyalizasyonda rol alan sitoplazmik proteinlerin aktivasyonunu sağlar ve hücre içi bir dizi olay zinciri başlar. Bu da nükleustaki gen ekspresyonlarını aktive ederek hücresel cevabı indükler 47,54,57. EGFR sinyal iletiminin normal hücrelerde reseptör-ligand etkileşimi sonucu gelişmesinin ve TK aktivitesinin uyarılmasının yanı sıra, EGFR'nün, ligand olmaksızın çapraz etkileşim veya transaktivasyon aracılığıyla da kendiliğinden aktive olabildiği gösterilmiştir. Stres, membran depolarizasyonu, radyasyon, oksidan ve alkilleyici ajanlar gibi çeşitli fizyolojik olmayan uyarılara bağlı olarak ortaya çıkan transaktivasyon, EGFR’nün tirozin birimlerini fosforilleyebilmektedir. Yine G protein reseptörleri, sitokin reseptörleri ve integrinler de EGFR tirozin fosforilasyonunu indükleyerek sinyal ileti yolaklarını aktive edebilmektedir 48,49,54,58 . 13 2.4.1.1. EGFR ve Kolon Kanser İlişkisi EGFR, kanserle ilişkili bulunan ilk hücre yüzey reseptörüdür 48,49,54 . EGFR sinyal ileti yolaklarının kontrolünün kaybı ve aşırı aktivasyonu, kanserli hücre proliferasyonu artışı dışında, kanserli hücrenin farklılaşması, göçü, apoptozun inhibisyonu, sağ kalımı, invazyonu ve metastaz yeteneği kazanması gibi çeşitli hücresel tümörojenik süreçlerin düzenlenmesi ile yakından ilişkilidir 52,59,60 . İnsan kanserlerinde en sık görülen mekanizma, EGFR'nün aşırı ifadelenmesi, buna bağlı olarak gen amplifikasyonu veya transkripsiyon anormallikleri ve otokrin uyarımı ile artmış EGFR üretimidir 61. EGFR ekspresyonunda artışa yol açan bir diğer mekanizma da, çeşitli mutasyonlar aracılığıyla EGFR aktivitesinde meydana gelen tümörojenik değişiklikler sonucunda bağlanmaksızın reseptörün kendiliğinden aktivasyonudur kanserlerinde mutasyonlar çok sayıda reseptörün EGFR hücre 59-61 ekspresyonunu değiştirir delesyonu dışı ligand ligand 60,61 . İnsan gösterilmiş olup, bu bağlayan bölgesinin . Preklinik çalışmalarda artmış EGFR ekspresyonu ile tümör oluşumu arasında güçlü bir ilişki olduğu gösterilmiştir. Bazı vakalarda tek başına EGFR düzeylerinin değişimi bile kanser gelişimini indüklemek için yeterli olabilmektedir 60,61 . Kolon, meme, deri, baş-boyun, özofagus, mide, pankreas, KHDAK, böbrek, mesane, serviks ve over gibi pek çok kanserde hem EGFR hem de ligandlarının aşırı ekspresyonu in vivo olarak gösterilmiştir 47,48,59,62-66 . Normal hücrelerde, hücre başına EGFR ekspresyonu 40-100 bin reseptör arasında iken, malin epitelyal tümörlü hücrelerde bu sayı belirgin bir artış göstermektedir. Örneğin bazı meme kanserlerinde hücre bahsedilmektedir başına 48,60,62,67,68 2 milyon EGFR ekspresyonundan . Bu aşırı ekspresyon kötü prognozla ve kısa sağ kalımla paraleldir. 14 Kolorektal karsinomda EGFR ekspresyonu hem tümörün evresi hem de tümörün derecesi ile ilişkilidir. Kolorektal kanserlerde EGFR ailesi aracılığıyla sinyalizasyon sıklıkla bozulmuştur. EGFR’nün normal kolon mukozasına göre tümörde daha yoğun ifade edildiği gözlenmiştir 52,53,56 . EGFR, kolon kanserinin % 25-77’sinde ve özellikle metastatik olanlarında saptanmıştır 52,59,60 . Yine preklinik çalışmalarda hem kimyasal olarak indüklenmiş kolon kanser modellerinde, hem de farelerde adenom gelişiminde aşırı EGFR ekspresyonunun rolü gösterilmiştir 52,67-69. Bununla birlikte in vitro modellerde, EGFR aktivasyonu ve ekspresyonunun kolorektal kanserin geç progresyonunda da etkisi gösterilmiştir 70 . EGFR, yaygın olarak eksprese edilmesi nedeniyle, kolorektal kanser tedavisinde hedef olarak seçilmiştir. Fazladan EGFR’ne sahip olmanın, kolon kanseri hücrelerinde çoğalmada artış ve kolon kanserli hastalarda daha kısa yaşam beklentisi ile bağlantılı bulunduğu bilinmektedir. Sonuç olarak bu bulgular artmış EGFR ekspresyonunun kötü prognozla ilişkili olduğunu destekler niteliktedir 53,56,68 . Kolorektal kanserin moleküler patogenezinin belirgin olarak ortaya konmaya başlanmasından sonra, kolorektal kanser tedavisinde son yıllarda spesifik hedefler ve bu hedeflere yönelik tedavilerinin kullanımı giderek yaygınlaşmıştır. EGFR gibi hedefler ve bunlara karşı geliştirilmiş tedavi yöntemleri ile ümit verici sonuçlar elde edilmektedir 47,48,53,54,56,70. 2.5. Tirozin Kinaz İnhibitörleri Moleküler olarak hedeflenmiş tedavi yaklaşımlarında TK’ları hem direk olarak inhibe eden küçük moleküller, hem de reseptör düzeyinde etki göstererek TK yolaklarını indirek olarak inhibe eden monoklonal antikor (mAb)’lar kullanılmaktadır 71,72 . Reseptöre bağlanan mAb’lar ilgili ligandın bağlanmasına engel olarak TK’ın dimerizasyonu ve aktivasyonunu engeller. Böylece mAb’lar ligand-reseptör etkileşimini bloke ederek, ligand bağımlı sinyal iletimini durdururlar (şekil 5) 73-75 . mAb’ler, 15 RTK sinyalini inhibe etmek için sadece hücre yüzeyinde ifadelenen ve salgılanan moleküller üzerinden etki gösterebilir, hücre membranı içinden geçme yetenekleri yoktur. mAb’lere örnek olarak Rituximab, Trastuzumab, Bevacuzimab, Cetuximab, Panitumomab, Alemtuzumab, Gemtuzumab, İbritomumab ve Tositumomab verilebilir 73-76. Şekil 5: Monoklonal antikor ve Tirozin Kinaz İnhibitörleri’nin etki mekanizması 77 Tirozin kinaz inhibitörleri (TKİ) ise sinyal iletim yolağının aktivasyonundan sorumlu olan TK’ları inhibe eden, küçük molekül ağırlıklı farmasötik maddelerdir 78,79 . TKİ, hem reseptör hem de reseptör yapıda olmayan TK’ların hücre içi kinaz bölgesinin aktivitesini inhibe eder (şekil 5). TKİ’nin bazıları substrat ile geri dönüşümlü olarak yarışırken (kompetitif), diğerleri ATP ile geri dönüşümlü olarak yarışan özelliktedir. Bu nedenle, TK inhibisyonu iki şekilde olmaktadır; ATP-bağlanma bölgesinin inhibisyonu ve substrat bağlanma bölgesinin inhibisyonu 79,80 . TKİ, RTK’ın hücre içindeki TK bölgesindeki ATP bağlanma bölgesine yarışmalı olarak bağlanarak bu bölgenin otofosforilasyonu inhibe eder, böylece 16 fosforilasyon tamamlanamaz ve hücre içi sinyal iletimi inhibe olur 78-80. TKİ, hücre yüzey reseptörlerinin sitoplazmik parçaları ve hücre içi sinyal molekülleri ile etkileşebilirler 79-81. Günümüze kadar kanserde hedefe yönelik tedavide RTK sinyalinin inhibisyonu en sık başarının sağlandığı alan olmuştur. TKİ, hücre içi iletişimden ve buna bağlı olarak hücrenin büyüme mekanizmasından sorumlu olan TK’ları inhibe ederek tümör gelişimini engellerler. Bu aktiviteden yola çıkılarak TKİ’nin kanser tedavisinde önemli bir yeri olabileceği düşünülmüştür. Bu amaçla geliştirilen pek çok TKİ vardır ve kanser tedavisi için en önemli mekanizmalardan biri olan TKİ, son yıllarda üzerinde en fazla çalışılan ajanlar olmuş ve tümör önleyici etkileri klinik denemeler ile kanıtlanmıştır 71,72,79-82 . TK’lar arasında ATP bağlanma bölgesi çok benzerlik göstermesine rağmen, kinaz bölgesinin yapısındaki küçük farklılıklar, farklı TKİ’nin geliştirilmesine izin vermektedir. Bu inhibitörler, Erlotinib, Gefitinib, İmatinib, Lapatinib, Lestaurtinib, Canertinib, Nilotinib, Dasatinib, Semaxanib, Vatanalib, Sorafenib ve Sunitinib’tir 71,72,79-82. Genel olarak bu maddelerin temel etki mekanizmaları TK’ın katalitik bağlanma bölgesinde yarışmalı ATP inhibisyonu olmasına rağmen her birinin hedeflediği kinaz spekturumu, farmakokinetikleri ve yan etki profilleri birbirinden farklılık göstermektedir. TKİ genel olarak iyi tolere edilen ilaç grupları arasındadır ve oral olarak kullanılmaktadırlar 79-83. 2.6. Janus Kinaz / Sinyal Dönüştürücü ve Transkripsiyon Aktivatörü Sinyal İleti Yolağı Hücre proliferasyonu ve farklılaşması interferon (IFN), interlökin (IL) ve koloni uyarıcı faktör (CSF) olarak bilinen bir grup polipeptid yapılı sitokinler tarafından kontrol edilmektedir. Bu sitokinler reseptörlerine bağlanarak çeşitli sinyal ileti yolaklarını aktive ederler 84 . 17 Sitokin dönüştürücü sinyallerin en iyi bilinen şekli, bir enzim olan janus kinaz (JAK) ve sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü (STAT) olarak adlandırılan transkripsiyon faktörleridir 84,85 . 1990’lı yıllarda IFN sinyallerinin biyokimyasal ve genetik analizleri JAK/STAT yolağının keşfine yol açmıştır 86,87 . Sonraları JAK/STAT yolağının büyüme hormonu, eritropoetin, EGF gibi pek çok sitokin ve büyüme faktörü ile ilişkili oldukları ve bu sitokinlerin sinyal iletimlerinde önemli rolleri olduğu gösterilmiştir 89 87- . JAK ailesi, sitokin aracılı sinyallerin dönüşümünü sağlayan bir grup hücre içi reseptör olmayan TK’a verilen isimdir. Sitozolik TK’ların JAK ailesi, JAK1, JAK2, JAK3 ve Tirozin kinaz 2 (TYK2) olmak üzere, 120140 kDa arasında değişen moleküler ağırlığa sahip dört üyeden oluşmaktadır 84,85,90,91 . Bunlar, reseptörlerin hücre içi subunitlerine bağlanarak onları fosforile eder ve adaptör proteinler için bağlanma alanları oluştururlar. JAK proteinleri mRNA ekspresyonunun anahtar mediyatörleridir ve “erken büyüme cevap genleri” olarak karakterize edilmiştir 84,85,92 . JAK’ların yapısında birbiri ile neredeyse aynı, iki adet fosfat transfer edici bölge vardır. Bu iki bölgeden bir tanesi kinaz aktivitesi sergilerken, ikincisi bu kinaz aktivitesini negatif yönde regüle eder. Sadece biri aktif olan bu iki kinaz ucu içerdikleri için eski Roma’da kapıların ve başlangıçların tanrısı olan iki başlı Roma tanrısı Janus’dan esinlenerek Januse Kinaz adını almışlardır 93,94. JAK’lar, Janus homoloji domain 1-7 (JH 1-7) olarak adlandırılan yedi alt birimden oluşmaktadır (Şekil 6). JH1, JAK’ın enzimatik aktivitesi için önemli olan kinaz domaini olup, JAK aktivasyonu için gerekli tirozinleri içerir. Dolayısıyla bir TK’ın tipik özelliklerine sahiptir. Bu tirozin çiftlerinin fosforilasyonu JAK proteininde konformasyonel değişikliğe yol açarak substratın bağlanmasını kolaylaştırır. JH2, tirozin kinaza benzer yapıdaki psödokinaz domainidir. JH2, JH1’in aktivitesini düzenlemede 18 görev alan, normal bir kinaz aktivitesi için gerekli olan, fakat enzimatik aktivitesi olmayan kısımdır. JAK’ların JH3-JH4 domaini SH2 domainler ile benzerlik göstermektedir. Amino (NH2) terminal uç olan JH4-JH7 ise FERM domain olarak adlandırılır ve JAK’ların sitokin reseptörleri ve diğer kinazlar ile olan ilişkilerinde rol alır 84,85,90-92. Şekil 6: Janus Kinaz’ın yapısı 95 JAK proteinleri, bir grup hücre içi sinyal proteinlerini aktive eder. Bunlar içinde en iyi tanımlanmış transkripsiyon faktörleri STAT grubudur 84,85 . Her bir reseptör alt ailesi tarafından tanınan STAT grubu, spesifik biyolojik cevabın belirlenmesinde kritik basamağı oluşturur. Memeli hücrelerinde yedi adet STAT proteini tanımlanmıştır. Bunlar; STAT1-4, STAT5a, STAT5b ve STAT6 olarak adlandırılmaktadır 96. Yapısı oligomerizasyon çok bölgesi, iyi DNA aydınlatılmış bağlanma olan STAT proteini, SH2 bölgesi, bölgesi, transaktivasyondan sorumlu karboksil (COOH) terminal bölgesi ve çok iyi korunmuş NH2 terminal bölgesinden oluşmaktadır (şekil 7) 97 . Oligomerizasyon bölgesi, diğer proteinler ile etkileşir ve STAT tetrameri oluşumunu sağlar. DNA bağlanma bölgesi, DNA’ya özgün bağlanmadan sorumludur; ligand uyarısına özgül sinyal oluşumunu sağlar. SH2 bölgesi; STAT-reseptör, STAT-JAK ve STAT-STAT etkileşimlerinden sorumlu bölgedir. SH2 bölgesi tirozin fosforilasyona uğrayan kısım olup, STAT moleküllerinin aktivasyonu için gereken temel kısımdır 96,97. 19 Şekil 7: STAT’ın yapısı 98 STAT proteinleri, JAK reseptörleri, src reseptörleri ve EGFR başta olmak üzere çeşitli reseptörler aracılığıyla tirozin lokalizasyonundan fosforlanıp aktive oluncaya kadar sitoplazmada inaktif durumdadır. Transaktivasyondan sorumlu COOH terminal bölgesi ise, transkripsiyonel aktivitenin özgünlüğü ve kontrolünden sorumludur. Tirozin, N-ucundan yaklaşık 700 aa uzaklıktadır. Tirozin fosforilasyonu, bütün STAT proteinlerinin DNA’ya bağlanma aktivitelerini düzenler 89,92,99 . STAT’lar, hücre içinde bazen birbirine zıt olaylara aracılık ederler. Örneğin hem hücre proliferasyonunu hem de apoptozu uyarabilirler 84-86. 2.6.1. JAK/STAT Sinyal Yolağı JAK/STAT sinyal yolağı, sitokinlere ve büyüme faktörlerine hücresel yanıtın düzenlenmesinde görev alarak, gen ekspresyonunu düzenler. Diğer bir deyişle, aktive JAK/STAT proteinleri, hücre dışı polipeptidlerde taşınan sinyallerin dönüşümü ve hücre çekirdeğine iletisine olanak tanır. Bu proteinlerin vücuttaki işlevleri oldukça geniş bir yelpazededir. Hücre büyümesi, çoğalması, farklılaşması, apoptoz, fetal gelişim, inflamasyon, hematopoez ve immün yanıtın düzenlenmesini sağlar 84,85,92. CSF’ler, prolaktin, büyüme faktörleri ve IFN, IL gibi pek çok sitokin JAK/STAT sinyal yolağını kullanan moleküllere örnek olarak 20 verilebilir. Her ligand kendi reseptörüne bağlandığı zaman, her iki reseptör molekülü bir araya gelir ve reseptör ile ilişkili olan her iki JAK domaini birbirlerini fosforile edecek şekilde yakınlaştıran bir konformasyonel değişime uğrar. Bu sayede JAK’lar spesifik tirozin motiflerinden fosforlanarak aktive olurlar. Aktif JAK proteinleri, reseptörün de sitoplazmik bölgelerindeki tirozin motiflerini fosforile eder ve reseptörde SH2 bölgesi (fosfotirozin bağlanma bölgesi) bulunduran proteinlerle etkileşime girebilecek bölgeler ortaya çıkar. Bu fosfotirozin birimlerine bağlanabilen, SH2 bölgesine sahip olan STAT’lar reseptörde birikir ve reseptör ile etkileşerek JAK bağımlı tirozin fosforilasyonu ile aktive olurlar. STAT proteinlerinin SH2 ucu başka bir STAT proteininin fosfotirozin birimine bağlanma yeteneğine sahiptir. Sonuç olarak aktive olan ve homodimer veya heterodimer formunu alan iki STAT proteini birbirine bağlanır ve reseptörden ayrılır. Aktive ve dimerize olan STAT’lar hücre çekirdeğine göç eder, DNA’ya bağlanır ve DNA üzerinde özgül cevap elemanı dizileri ile etkileşerek hücre döngüsünü arttıran ve bölünmeyi hızlandıran genler (siklin D, siklin E, myc, p21, p27) ile anti-apoptotik genler (survivin, Bcl-2, Bcl-xL ve Mcl-1) 85-88,100,101 gibi çeşitli hedef genlerin transkripsiyonunu uyararak gen aktivasyonunu başlatır 90-92,96,99,102 . STAT’ların direkt olarak RTK’lar tarafından tirozin fosforillenmesi (örneğin EGFR) ve hatta reseptör dışı TK’larla fosforillenmesi (örneğin c-src) de mümkündür 85,92,97 . Yani, JAK-STAT yolağı hücre yüzey reseptörleri ile hücre büyümesine yol açan nüklear transkripsiyonel olaylar arasında önemli bir bağlantıdır. Saatler içinde ligandların stimüle ettiği sinyaller azalır ve STAT’lar tekrar sitoplazmaya döner. Her bir döngüden sonra yeni STAT proteinleri sitokin reseptörlerine bağlanabilir, fosforilize olabilir, dimerize olup tekrar nükleusa göçebilir (Şekil 8) 101,102. 21 Şekil 8: JAK/STAT sinyal yolağı 96,103 JAK/STAT yolağında, kontrol mekanizması olarak, aktivasyon hızlı ve geçicidir. JAK/STAT aktivasyonu pozitif yönde olduğu kadar negatif yönde de düzenlenebilir. JAK/STAT yolağının çok sayıda negatif regülasyon mekanizmaları belirlenmiştir 92 . Bunlardan bir tanesi olan protein tirozin fosfatazlar, hem sitokin reseptörlerinden, hem de aktif STAT’lardan fosfatları ayırır 84-86 . Bir tirozin fosfataz olan SH2 içeren fosfatazlar (SHP), JAK moleküllerini defosforile ve deaktive edebilir ve aktif STAT ailesinin inhibitör protein üyeleri fosforile STAT proteinlerine bağlanır, onların DNA ile etkileşimini güçlendirir 102 . Proteozom aracılı yıkım ve tirozin defosforilasyonu, inaktivasyonda önemli mekanizmalardır. Bir başka mekanizma olan sitokin sinyali baskılayıcısı olarak bilinen Sitokin Sinyal Baskılayıcıları (SOCS) sistemi JAK’ları bağlar, ya da STAT’lar ile reseptör bağlanma fosforilasyonunu inhibe eder 104 bölgeleri için yarışarak STAT . Yine, STAT’ların, Aktive Edilmiş 22 STAT’ların Protein İnhibitörleri (PIAS) isimli negatif regülatörlerle hücre çekirdeğinde inhibisyonu da mümkündür 105 . SOCS ve PIAS, inhibisyonun en önemli mediatörleridir 104,105. 2.6.2. JAK/STAT Sinyal Yolağı ve Kanser JAK/STAT aktivasyonu karsinogenez ile ilişkilidir. Sağlıklı hücrelerde kısıtlı süre aktivasyon gösteren JAK/STAT yolağı, kanser hücrelerinde bu özelliğini yitirerek sürekli aktif hale gelir yolağının sürekli aktivasyonu lösemi 109 melanom kolorektal , akciğer 114 110 , over 99 ve meme kanseri 106 , lenfoma , prostat 88 111 107 99-101 . JAK/STAT , multiple myeloma , baş-boyun 112 , mide 108 , 113 , gibi çok çeşitli tümör hücrelerinde saptanmıştır. STAT proteinleri iki mekanizma aracılığıyla karsinogenezde etkili olur. Bunlardan biri STAT’ın sürekli aktivasyonu iken, diğeri proteinin COOH ucunun mutasyona uğramasıdır. Devamlı olarak aktive olan STAT proteini anti-apoptotik yolları uyararak malin süreçte etkili olabilir 114,115 . STAT aracılı sinyal iletimi ile uyarılan hedef genlerin (örneğin c-myc, siklin D1 ve Bcl-xL) hücre döngüsünün kontrolünü sağlayarak ve/veya apoptozu önleyerek karsinogenez sürecinde etkili oldukları öne sürülmektedir. Devamlı aktif STAT3 proteini ile hastalıksız sağ kalım süresi arasındaki ters ilişki anlamlı bulunmuştur 107,115 . Ancak STAT aktivasyonu kötü prognozun nedeni olabileceği gibi, bu sürecin kendisi de STAT aktivasyonunu tetikleyebilir. STAT proteinlerinden bugüne kadar onkojenik özellikleri en net ortaya konanlar, STAT-1, 3, 5 ve 6’dır. Örneğin STAT1, STAT3 ve STAT5 ekspresyonu kanserin neredeyse her tipinde belirlenmiştir ve STAT3 ve STAT5 aktivitelerinin kontrolsüz işleyişi malin transformasyonda rol oynamaktadır 85,92,99. 23 2.7. Programlı Hücre Ölümü: Apoptoz Çok hücreli bir organizmanın hücreleri, oldukça organize olmuş bir topluluğun üyeleridir. Bu topluluktaki hücrelerin sayısı, hücre bölünmesi ve hücre ölüm oranının kontrol edilmesiyle düzenlenir. Yaşayan her hücre yaşam ve ölüm için programlanmıştır. Hücrelere gereksinim duyulmadığı zaman, hücre içi ölüm programının aktive olmasıyla hücreler intihar etmektedir. Bu işlem programlanmış hücre ölümü veya apoptoz olarak adlandırılır 1,116 . Apoptoz terimi ilk olarak 1972 yılında Kerr ve arkadaşları tarafından tanımlanmıştır 117 ve Yunancada “yaprak dökümü”, “ayrı düşme” ya da “sonbahar” gibi anlamlara gelmektedir 1,116,118. Fizyolojik şartlarda ihtiyaç duyulmayan veya patolojik koşullarda fonksiyonları bozulan hücrelerin, çevreye zarar vermeden, genetik faktörlerin kontrolünde programlı bir şekilde olan ölümüne apoptoz denir 118,119 korunması . Apoptoz, hücrelerin yaşam ve ölüm arasındaki dengesinin için esansiyeldir. Apoptotik hücre ölümü, çok hücreli organizmalarda, hem gelişim esnasında hem de gelişimini tamamlamış organizmaların homeostazisinin sağlanmasında istenmeyen hücrelerin yok edilmesi için evrimleşmiş en önemli mekanizmadır 119-121 . Apoptozun işlevsel mekanizmaları hücrede bir denge unsuru oluşturmaktadır 1,116-118. 2.7.1. Apoptotik Sinyal Yolakları Pek çok farklı molekül tarafından hassas bir şekilde kontrol edilen apoptoz, genel olarak hücre membranında bulunan ölüm reseptörlerinin aktifleşmesi ile karakterize edilen dışsal (reseptör aracılı) ve mitokondri-apoptozom sisteminin aktifleşmesi ile karakterize edilen içsel (mitokondriyal) yolak olmak üzere iki yolla başlatılabilir. Bu iki yol 24 birbiriyle bağlantılıdır ve bir yolakta yer alan molekül diğer yolağı etkiler 117119,121 . 2.7.1.1. Dışsal Yolak (Ölüm Reseptör Yolağı) Dışsal yolakta, hücre ölümünü başlatan sinyal, hücre dışından gelir ve apoptozun başlaması hücre zarındaki reseptörler aracılığıyla olur. Hücrelerin yüzeyinde yer alan ve “ölüm reseptörleri” olarak adlandırılan moleküller, ölüm sinyallerinin varlığında sinyali algılayarak hücrenin dışsal apoptoz yolağını tetiklemektedir 119-121 . Apoptoz, birbiriyle yapısal olarak akraba olan ölüm reseptörleri tarafından aktif olarak uyarılır. Ölüm reseptörleri, tümör nekroz faktörü (TNF) ailesinin üyeleridir ve en iyi bilinen örnekleri Fas ve TNF reseptörleri (TNFR)’dir. Ölüm reseptörleri hücre zarı içine tutunmuş, bir ucu hücre dışına, bir ucu hücre içine bakan ve hücre içi tarafında prokaspaz-8’in aktifleşmesini sağlayan oldukça iyi korunmuş 80 aa’lik bir ölüm bölgesi (DD) bulunan hücre yüzey reseptörleridir ve bu reseptör ailesinin günümüze kadar 8 üyesi tanımlanmıştır 117-119,122. Hücre zarında bulunan kendileri için özgün reseptörlere bağlanan ligandlar, reseptör yapısında konformasyonel değişime neden olarak reseptörün trimerik (üç bileşenden oluşan) bir yapıya dönüşmesine yol açarlar. Konformasyonel değişim sonucu aktive olan reseptörler, hücre içinde adaptör moleküller adı verilen bir dizi molekülle etkileşirler. Reseptör ile adaptör proteinlerin etkileşimi sonucu ölüm-tetikleyici sinyal kompleksi (DISC) adı verilen protein kompleksi oluşur 121-123 . Bu ölüm kompleksi ise prokaspaz-8’i iki farklı büyüklükte parçaya bölerek başlatıcı kaspaz denen aktif kaspaz-8 oluşumunu sağlarlar 123,124 . Aktif kaspaz-8, inaktif durumdaki proenzimler olan kaspaz-3, kaspaz-6 ve kaspaz-7 nin bir zincir biçiminde aktifleşmesine yol açar 123-125 . Aktifleşen tüm kaspazlar 25 hücre makromoleküllerini oluşumuna yol açarlar parçalayarak 124,125 tipik apoptoz morfolojisinin . Ayrıca aktif kaspaz-8, Bcl-2 ailesi proteinlerinden Bid proteinini de keserek proteolitik olarak aktifleşmesine yol açar. Kesilerek aktifleşen Bid (tBid), mitokondri dış membranının geçirgenliğini tetikleyerek, mitokondriden sitokrom c ve kalsiyum (Ca+2)’un sitoplazmaya salınmasına yol açar. Böylece ölüm reseptörleri yolağı mitokondriyal yolağı da aktifleştirmiş olur (Şekil 9) 125-127. 2.7.1.2. İçsel (Mitokondriyal) Yolak İçsel yolak, çeşitli sinyaller tarafından mitokondri dış membranının geçirgenliğinde değişim olması sonucunda kaspaz-9’un aktifleşmesi ile sonuçlanan apoptotik aktivasyon sürecidir. Bu yolak hücre içinde oluşan apoptotik sinyaller ile başlar 121,123 . Apoptotik sinyallerin hücre içinde oluşmasına neden olan faktörler; UV radyasyonu, ısı şoku, osmotik şok ve hipoksi gibi fiziksel ve kimyasal hasarlar, c-myc, c-FOS, p53, PTEN gbi hücresel onkogenlerin ve tümör baskılayıcı genlerin ifadesindeki değişiklikler, hücre iskelet yapısının bozulması, mutajenik ajanlar ve sitositatik ajanların neden olduğu DNA hasarı, büyüme faktörü ve sitokin yetersizliği, nükleotid ve ATP yetersizliği, hatalı katlanmış proteinlerin birikimi 1,116-120,128 ve oksidatif stres gibi faktörlerdir. Hücre içinde oluşan bu sinyaller apoptozu mitokondri aracılığı ile başlatır 166-168 . Mitokondri, apoptoz başlatan yolların kesişme noktasıdır ve geri dönüşümsüz bir döneme girildiğine işaret eder. Bu süreçteki en kritik basamak, spesifik polipeptidlerin mitokondrideki membranlar arası alandan sitoplazmaya salınmalarıdır 129,130. Elektron transport sisteminin bir bileşeni olan sitokrom c, normal koşullarda mitokondri iç ve dış zarları arasında yer alır 131 . Apoptozu uyaran faktörlerin varlığında, mitokondriden sitoplazmaya 26 sitokrom c’nin salınması ile kaspaz kaskadı başlatılır 131-133 . Sitoplazmaya salınan sitokrom c molekülü, bir sitoplazma proteini olan apoptotik proteaz aktive edici faktör-1 (Apaf-1)’e ve inaktif prokaspaz-9'a bağlanarak aktive eder ve apoptozom kompleksini oluşturur. Aktifleşen kaspaz-9, bir seri kaspaz aktivasyonunu başlatır ve içsel yolak üzerinden apoptozun tetiklenmesine neden olur 122,134-136 . Kaspazların ard arda aktive olmalarıyla diğer proteolitik aktiviteye sahip yolaklar da aktive olacağından, sitoplazmik proteinler ve kromozomal DNA yıkılır. Bunun sonucunda, programlanmış hücre ölümünün son aşamaları olan, hücrenin düzenleyici ve yapısal moleküllerinin parçalanması ile sonuçlanan apoptozun son yıkım aşaması gerçekleşir. Daha sonra bu hücre artıkları ve apoptotik hücreler fagositozla ortamdan uzaklaştırılır (Şekil 9) 134-136. Şekil 9: İçsel ve dışsal apoptotik yolaklar 137 27 2.7.2. Apoptozun Düzenlenmesi Aşırı miktarda apoptozun olması veya apoptoza karşı oluşan direnç, hücresel homeostazisin dengesini bozarak hücre ve organ işlevini değiştirir ve organizmanın yaşamını etkiler. Apoptoz fizyolojik olarak hassas bir şekilde kontrol edilmekte ve dengede tutulmaktadır. Kontroldeki başarısızlık sonucu nörodejenerasyon ve çıkmaktadır 128 baskılayıcı şekilde gelişimsel kanser kusurlar, gibi patolojik hastalıklar, koşullar ortaya . Çeşitli proteinler apoptozu uyarıcı veya apoptozu apoptozu düzenlemektedir düzenlenmesinde Bcl-2 protein ailesi 166,167,174,179,180 çeşitli otoimmün 131,132,135 , p53 118-120 . 1,116,117,121 Apoptozun ve kaspaz enzimleri gibi bazı hücresel moleküller görev almaktadır. 2.7.2.1. Bcl-2 Protein Ailesi B hücresi lenfoma geni 2 (Bcl-2) protein ailesi, hem proapoptotik hem de anti-apoptotik proteinleri içerir ve bu proteinlerin göreceli seviyelerinin yaşam ile ölüm arasındaki seçeneği belirleyerek hücre kaderinin kararını verebileceği kabul edilmektedir 131,132 . Bcl-2 protein ailesinin benzer homoloji gösteren 20’den fazla üyesi belirlenmiştir 131,132,135 . Bcl-2 ailesine üye olan proteinler taşıdıkları Bcl-2 homoloji (BH) bölgelerine göre ve ayrıca fonksiyonel ve yapısal kriterler göz önünde bulundurulduğunda, üç farklı grup halinde incelenebilir 1,131-135 : Anti- apoptotik özellik gösteren grup I (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1/Bfl1, Boo/Diva, Nrf3 ve Bcl-B), pro-apoptotik özellik gösteren grup II (Bax, Bak, Bok/Mtd) ve grup III (Bid, Bad, Bik, Bim, Blk, Bmf, Hrk, Bnip3, Nix, Noxa, PUMA ve Bcl-G) (Şekil 10) 131-135,138. 28 Şekil 10: Bcl-2 protein ailesi üyelerinin şematik gösterimi 139 Anti-apoptotik grup I üyeleri genellikle oldukça korunmuş dört BH bölgesini ve mitokondri dış membranı, endoplazmik retikulum membranı gibi çeşitli hücre içi membran yüzeylerine bağlanabilmelerine olanak sağlayan C terminal transmembran bölgesini içermektedirler. Proapoptotik grup II üyeleri ise N terminal BH4 bölgesi dışında tüm diğer BH bölgelerini ve transmembran bölgesini içermektedirler. Son olarak grup III üyeleri diğer gruplara göre oldukça heterojendir ve tek ortak homolojileri 15 aa’lik BH3 bölgesidir. (Şekil 13) 131,132,135 . Bcl-2 protein ailesinin grup I üyeleri apoptozu inhibe ederken, grup II üyeleri apoptozu aktive eder. Üçüncü sınıfa dahil olan grup III moleküller ise, anti-apoptotik üyelere bağlanarak apoptozu inaktive eder 1,116-119,131-135. Bcl-2 protein ailesi, apoptotik yolağın kontrolünde merkezi bir rol oynar. Mitokondri dış membranında bulunan Bcl-2 protein ailesi, mitokondriden sitokrom c salınmasını kontrol eder ve iyon transportunu düzenleyerek mitokondri dış zar potansiyelinin değişimini düzenler. Ailenin Bax, Bak gibi pro-apoptotik üyeleri normal koşullarda inaktif durumdadır, bu nedenle mitokondriyal zar geçirgenliği Bcl-2, Bcl-xL gibi anti-apoptotik proteinlerin etkisi sayesinde değişmez 132,135 . Bu anti-apoptotik proteinler, apoptozu engelleme fonksiyonunu ya kaspazların öncü formlarını durdurarak ya da aktif kaspaz akışını direkt olarak aktive eden 29 sitoplazmadaki apoptoz uyarıcı faktör (AIF) ve sitokrom c gibi apoptojenik faktörlerin mitokondriden salınmasını engelleyerek gerçekleştirir Ancak apoptozu uyaran çeşitli faktörler pro-apoptotik 131,132,135 . grubun aktifleşmesine yol açar. Bu durumda anti-apoptotik proteinler, proapoptotik aile üyeleri tarafından baskılanır. Apoptotik sinyalin alınmasından sonra, Bax, Bak gibi pro-apoptotik proteinler, hem heterodimerizasyon yoluyla kaspaz serbestleşmesini uyarır hem de mitokondri zarının geçiş porlarının açıklığını değiştirerek zar potansiyelinin değişimine yol açar ve zardaki Ca+2 gibi iyonların geçirgenliğini arttırabilir. Zardaki bu değişiklikler nedeniyle sitokrom c ve AIF gibi mitokondri zarı içinde yer alan faktörler sitoplazmaya geçer. AIF doğrudan yoğunlaşan kromatine ve parçalanan çekirdeğe yönelirken, sitoplazmaki sitokrom c apoptozun en son basamağında görev alır 1,116-120,131-135,138 . Sonuç olarak Bcl-2, Bcl-xL gibi anti-apoptotik üyelerin oranı fazla ise apoptoz engellenerek hücre yaşamını sürdürürken, Bax, Bak gibi pro-apoptotik üyelerin oranı fazla ise hücre apoptoza yönlendirilerek, hücre ölümü gerçekleşir. 2.7.2.2. p53 Apoptozun düzenlenmesi, p53 ile başlayan ve kaspazlara kadar devam eden bir süreçtir. Bu nedenle apoptozun diğer bir düzenleyicisi olan ve tümör baskılayıcı bir gen olan p53 kritik bir öneme sahiptir. p53 sitoplazmada bulunan ve DNA’nın ya da hücrenin ağır biçimde hasar görmesi durumunda DNA da belli genlerin aktivasyonuna (Bax, Bak, Bcl-Xs Apaf-1, Fas) belli genlerin de baskılanmasına (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1) yol açarak apoptozu tetikleyen bir moleküldür 120,138,140,141 1,117- . p53, hücrede DNA hasarı oluştuğunda S fazına geçişi bloke eder ve G1 duraklamasını sağlar. Böylece DNA tamiri için zaman kazanılır. Bu şekilde DNA tamirine yardım etmekte ve DNA tamir genlerini uyarmaktadır. DNA’sı hasarlanan ve tamir edilemeyen hasarlı hücre p53 30 tarafından apoptoza yönlendirilir 138,140,141 . p53, mutasyona uğradığı ya da bulunmadığı zaman hücre yaşamı uzar. Yine p53’ün kaybında da DNA hasarları onarılamamaktadır. İnsanlarda görülen pekçok kanser tipinde p53 geninin normal fonksiyonlarını yapamadığı veya hasara uğradığı saptanmıştır 120,138,140,141. 2.7.2.3. Kaspazlar Apoptozun bir diğer düzenleyici ise kaspaz (CASPASE; sistein bağımlı aspartata spesifik proteaz) enzimleridir 142-144 . Bunlar sistein proteazlardır ve substratlarını aspartik asitten sonraki peptid bağını kırarak keserler. Apoptotik hücre ölüm yolağının ana düzenleyicileri olan kaspazlar, 400’den fazla substratı proteolitik olarak keserek görev yaparlar 124,133,134,142 . İç ve dış sinyallerle apoptoz tetiklendiğinde hücre içinde kaspaz enzimleri aktive olur. Kaspaz aracılı protein yıkımı apoptotik hücrelerde gözlenen bazı biyokimyasal olayların da temelini oluşturmaktadır. Kaspazların ard arda aktive olmalarıyla diğer proteolitik aktiviteye sahip yolaklar da aktive olur, sitoplazmik proteinler ve kromozomal DNA yıkılır. Kaspaz enzimlerinin aktivitesi apoptozun tetiklenmesinden DNA fragmentasyonuna, plazma membranının tomurcuklanmasından, fosfolipid asimetrisinin bozulmasına kadar tüm apoptoz sürecinde yer almaktadır 124,125,133,134,142. İnsanlarda bilinen 12 kaspazdan 7’sinin (kaspaz -2, -3, -6, -7, -8 , -9 ve -10) apoptotik süreçte rol oynadığı saptanmıştır. Kaspazlar, öncül formlarında enzimatik olarak inaktif zimojenler sentezlenmekte ve apoptoz sırasında aktifleşmektedirler olarak 124,125,133,142-144 . Kaspaz enzimleri, apoptoz sürecindeki rolleri göz önünde bulundurularak iki ana grupta incelenebilir. Başlatıcı kaspazlar (kaspaz-2, 8, 9, 10), çeşitli hücre-içi ya da hücre-dışı sinyalleri proteolitik aktiviteye çevirerek kaspaz 31 kaskadının başlatılmasından sorumlu olan kaspazlardır. Effektör (cellat) kaspazlar (kaspaz-3, 6, 7) ise hücre içerisindeki spesifik polipeptid hedeflerini proteolitik olarak keserek tamamlanmasını sağlayan enzimlerdir apoptoz 133,134,142-144 mekanizmasının . 2.7.3. Apoptoz ve Kanser Bir hücrenin DNA’sında oluşan hasar, tamir mekanizmaları ile düzeltilemezse, bu hücre güvenli bir şekilde genetik kontrol mekanizmalarının öncülüğünde apoptoza gider, çünkü hücrenin hasarlı genetik materyalle mitoza girmesi genomik kararsızlığa yol açabilir 122,145 . Fakat, genetik kontrol mekanizmalarını oluşturan proteinlerde (p53, Rb, v.s.) bir hasar sözkonusu ise, hücre apoptoza gidemez ve hasarlı bir şekilde bölünür. Aşırı bölünen bu hücreler başlangıcını tetikler ve kanser oluşumu başlar neoplazik 146-148 oluşumun . Apoptozun normal mekanizmasının bozulmasının kanser oluşumunun önemli bir nedeni olduğu düşünülmektedir. Apoptoz kanser hücrelerinin zararına çalışırken, organizmanın yararına çalışır. Kanser hücreleri ya anti-apoptotik proteinlerin aşırı yapımıyla ya da pro-apoptotik proteinlerin yapımlarının ya da etkilerinin azalmasıyla apoptoza dirençli bir nitelik kazanırlar 146,147. Hücrelerin normal apoptotik süreçten kaçmalarını sağlayan bir özellik kazanmaları hemen bütün kanser hücrelerinde gözlenen bir özelliktir. Apoptotik yolakların aktifleştirilmesi kanser terapisinin temel ilkelerinden biridir. Hasarlanmış hücrelerin yok edilmesini hedefleyen terapilerde çoğunlukla spesifik olarak apoptozun tetiklenmesi tercih edilmektedir 122,145 mekanizmaları, . Günümüzde, birçok anti-kanser ilacın olası etki hedef yetenekleriyle ilgilidir kanser 149-151 hücrelerinde apoptoza neden olma . Çoğu kanser ilacı neden oldukları DNA hasarı üzerinden etki göstermektedir ve kanser hücrelerinin DNA tamir 32 mekanizmalarındaki yetersizlikten yararlanarak hücreleri apoptotik sürece sürüklemektedir 150 . Kanser ilaçlarının etkinliğini arttırabilmek ve olası direnç mekanizmalarının önüne geçebilmek amacıyla anti-neoplastik ajanların aktifleştirdikleri apoptotik yolakların tanımlanması güncel araştırma konusudur. Günümüzde farklı kanserlerin tedavisinde kanser hücrelerini ölüme götürmek için radyoterapi ve kemoterapiden sıklıkla yararlanılmaktadır 149-151 . Çeşitli tedaviler ile apoptozun uyarıldığı kanser hücrelerinde, tedavinin hangi genlerin ekspresyon miktarını değiştirdiğinin belirlenmesi, o kanser hücresinde apoptozun hangi düzeyde regüle edildiğinin anlaşılmasını sağlar. 2.8. Siklin D1 Ökaryotik canlılarda hücrenin çoğalması, hücre döngüsünü de içine alan kompleks bir işlemdir. Ökaryot hücre döngüsü M (mitoz) G1, S ve G2 fazlarından oluşmaktadır ve G1-S geçişinde, G2-M geçişinde ve M-G1 geçişinde kontrol noktaları bulunmaktadır noktaları, hücrenin içerisinde bulunduğu 152-154 fazın . Bu kontrol tamamlanıp tamamlanmadığı ve bir sonraki faza geçiş için koşulların uygunluğunun kontrol edildiği süreçlerdir 153-157 . G1-S kontrol noktasında, hücrenin replikasyon için hazır olup olmadığı, G2-M kontrol noktasında hücrenin mitoz bölünme için uygun olup olmadığı, M-G1 kontrol noktasında ise kromozomların yerleşimi kontrol edilir 152-155. Hücre döngüsü siklinler, siklin bağımlı kinazlar (CDK) ve siklin bağımlı kinaz inhibitörleri (CDKI) tarafından kontrol edilir 152,153 . Hücre döngüsü kontrol noktalarında iş gören protein yapısındaki siklinlerin, protein kinaz aktivitesi için ortamda mutlaka bulunmaları gereklidir. Siklinler, hücre döngüsünün belirli evrelerinde sentez edilirler ve katalitik alt birim olan CDK’ı aktive ederek bir arada heterodimer formunda aktivite gösterirler 158 . Bu heterodimerin asıl görevi çeşitli hücre içi proteinlerin forforillenmesi ile hücre yaşam 33 döngüsünün devamlılığının sağlanmasıdır. Fonksiyonlarını yerine getiren siklinlerin düzeyi hızla düşer 153-156. Hücre döngüsünün sistematik biçimde düzenlenmesinde işlevleri en iyi bilinen siklinler, siklin A, B, D ve E’dir 152-155 . D tipi siklinlerin ise 3 alt grubu vardır. Bunlar; siklin D1, D2 ve D3’tür. D tipi siklinler, hücre döngüsünde artan ilk siklinlerdir ve hücre döngüsünün G1 evresinde CDK4 ve CDK6’ya bağlanarak aktive eder. Bu sayede retinoblastoma (Rb) proteini fosforile olur ve hücre G1 fazından S fazına geçer 154,156-158. Hücre döngüsünün düzenlenmesi ve kontrolü, normal hücrelerin büyüme ve farklılaşması yanı sıra kanser gelişiminde de önemli rol oynamaktadır 159,160 . Çeşitli kanser türlerinde siklinlerin ve CDK’ın aşırı ekspresyonu söz konusudur 159-161 . Siklin D1, büyüme faktörü sinyal iletiminin önemli hedeflerinden biri olduğundan, siklin D1 regülasyonundaki bozukluklar, kanser hücrelerinin karakteristik özelliği olan kontrolsüz çoğalmaya neden olur. Buna göre insan kanserlerinin çoğunun, hücre döngüsü regülasyonundaki bozukluklar sonucu kaynaklandığı bulunmuştur 159-162 . Kanserin karakteristik özelliklerinden en önemlisinin kontrolsüz hücre bölünmesi olduğu düşünüldüğünde ifadelenme profilindeki bu değişimin önemi anlaşılmaktadır. Kolon kanseri de dahil olmak üzere çeşitli insan kanser tiplerinde siklin D1’in aşırı ifadelenmesi hastalığın agresif seyri ile ilişkilidir. Ayrıca siklin D1 ifadesinin engellenmesinin kolon kanseri hücre hatlarında tümörün büyümesini durdurduğu bildirilmiştir 23,161,162 . 2.9. CDK İnhibitörü p27Kip1 CDK’ların hücre döngüsündeki işlevlerinin düzenlenmesi, CDKI tarafından gerçekleştirilmektedir. CDKI, hücre döngüsünün negatif 34 kontrolünden sorumludurlar ve siklin-CDK komplekslerinin aktivitelerini sıkı bir şekilde denetlemektedirler 155,156 . Büyümeyi inhibe edici sinyalden sonra, CDK aktivitesini düzenleyen ve hücre döngüsü baskılanmasını uyaran başlıca iki sınıf CDKI tanımlanmış olup, bunlar Cip/Kip (Cdk Inhibitory protein / Kinase Inhibitory Protein) Ailesi ve INK4/ARF Ailesi’dir. Cip/Kip ailesi üyeleri; p21Cip1 (CDKN1A), p27Kip1 (CDKN1B) ve p57Kip2 (CDKN1C) iken, INK4/ARF ailesi üyeleri p14 ve p16’dır 156,163,164 . CDKI molekülleri; ya CDK’lar ile ilişki kurarak, ya da siklin - CDK kompleksi ile ilişki kurarak kinaz aktivitesini baskılamaktadır. Cip/Kip ailesi inhibitörleri siklin-CDK kompleksine bağlanarak kinaz aktivitesini engellerken, INK4/ARF ailesi inhibitörleri spesifik olarak CDK’ya bağlanarak siklinlere bağlanmasını engeller 163-165. Cip/Kip ailesinden p27Kip1 anti-mitojenik sinyallere karşı oluşan cevapta, büyümeyi düzenleyen önemli bir moleküldür 164,165 . Hücre döngüsünün inhibitör proteinlerinden olan p27Kip1 CDKI’nin siklin-CDK kompleksine bağlanması için, sitoplazmadan hücre çekirdeğine yer değiştirmesi gerekir 165-167 . Onkojenik uyarı halinde bu protein fosforilasyona uğrar. Bunun sonucunda, p27Kip1 sitoplazmaya geri döner 168,169 ve hücre döngüsündeki inhibitör etkisi ortadan kalkar . p27Kip1 geni DNA hasarı sonucu hücre döngüsünün durdurulması ya da hücrelerin apoptoza yönlendirilmesi sürecinin anahtar bileşenlerindendir. P27Kip1 miktarındaki artış, hücrelerin G1 fazından S fazına ya da S fazından G2 fazına geçişlerini engeller ve böylece hücreler genomik onarım tamamlanıncaya kadar G1 fazında durdurulur 170-172. Hücre döngüsünün düzenlenmesindeki hatalar, hücre döngüsü kontrol noktalarındaki değişimler hücre bölünmesinin kontrolünün bozulmasına ve kanser gelişimine neden olabilir 163,164 . CDKI, hücre döngüsünde ve tümör baskılayıcı fonksiyonlarından dolayı kanser gelişiminde birer genetik değişiklik hedefidirler. Çeşitli kanser türlerinde bu 35 tümör baskılayıcı proteinlerin eksikliği, siklin ve CDK’ların ise aşırı ekspresyonu söz konusudur 23,163,164,173,174 . Bu nedenle; kanser hücrelerinde, p21, p27 ve p57 CDKI’leri gibi hücre döngüsünün negatif kontrolünden ve tümör baskılanmasından sorumlu moleküllerin fonksiyonlarının saptanması ve bu fonksiyonların neoplastik süreçteki etkilerinin belirlenmesi, klinik tanı, tedavi ve prognozun belirlenmesinde faydalı olmaktadır 23,172-174. 2.10. Gefitinib Günümüzde, hedefe yönelik tedavi amacıyla pek çok ilaç geliştirilmiştir ve geliştirilmeye devam edilmektedir. TK’ların ve TK hedefli inhibitörlerin klinikte gelişimi kanser tedavisine yenilik getirmiştir 175,176 . Örneğin EGFR, malin hastalıklara karşı yeni ilaçların geliştirilmesinde önemli bir stratejik hedeftir. EGFR yolunu hedefleyen ajanlardan reseptör düzeyinde etki gösteren mAb’lar ile hücre içi sinyal ileti yolağını bloke eden TKİ son yıllarda üzerinde en fazla çalışılan ajanlar olmuştur 60,175,176. Gefitinib (Gef) (IressaTM, ZD 1839), anilinoquinazolinler sınıfına dahil olan, oral olarak aktif ve iyi bilinen bir EGFR-TKİ’dür (şekil 11) 60,177,178 . Yapısal formülü C22H24ClFN4O3’dür ve 446,9 moleküler ağırlığa sahiptir. Kimyasal adı 4-kinazolinamin ve sistematik adı N-(3-chloro-4-fluorophenyl)-7-methoxy-6-(3-morpholin-4-ylpropoxy)quinazolin-4-amine olan Gef, EGFR’nün TK aktivitesini inhibe eden anti-kanser yeni sınıf ilaçların ilkidir ve günümüzde EGFR hedefli terapide klinikte kullanılmaktadır 179-181. Gef, 2003 yılı Mayıs ayında FDA tarafından onaylanarak ileri evre küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) tedavisinde tek ajan olarak kullanılmaya başlanmıştır 182-184 . Günümüzde ise 64 ülkede pazarlanan Gef’in, oral kullanımda biyoyararlanımı % 59’dur. Vücuttan atılımı fekal yol ile olur. En çok görülen yan etkisi akne benzeri cilt reaksiyonlarıdır. Hastaların % 1’inde ishal, bulantı, kusma ve dehidratasyon görülmüştür 178-181 . 36 Şekil 11: Gef’in kimyasal yapısı 185 Gef, kanser hücrelerinin büyümesi, çoğalması ve sağ kalımlarını kontrol eden sinyal ileti yolaklarını durduran ilk seçici EGFRTKİ’dür. Gef, EGFR’nin sitozolik TK bölgesindeki ATP bağlanma bölgesine bağlanarak EGFR-TK’ın otofosforilasyonunu ve hücre içi sinyal iletimini inhibe eder (şekil 12) 179-181 . Böylece tümör büyümesini engelleyerek bir anti-kanser ilaç gibi davranır. Şekil 12: Gef’in etki menizması 186 Gef’in, tümör ksenogreft modellerinde ve baş-boyun, prostat, meme, yumurtalık, mide, kolon, KHDAK gibi çeşitli insan kanser hücre hatlarında EGFR otofosforilasyonunu önlediği ve çeşitli sitotoksik ilaçlarla 37 birlikte kombine uygulandığı zaman tümörlü hücrelerin büyümesini inhibe ettiği, hücre döngüsünü durdurduğu, metastaz oluşumunu azaltma yeteneğine sahip olduğu, pro-apoptotik etkiyi doza bağımlı olarak arttırdığı gözlenmiştir. Bu nedenle Gef, kanser tedavisi için yeni tedavi edici stratejiler sunmaktadır 175,187-190. 2.11. Kukurbitasin B Bitki özleri, kanser tedavisinde geleneksel ilaç olarak yüzyıllardır kullanılmaktadır. Doğal ürünlerden elde edilen tedavi edici bitkisel kökenli ilaçlar ise kanser tedavisinde uzun yıllar önce yaygın olarak kullanılmaya başlanmış ve kanser tedavisinde önem kazanmıştır 191-193 . Fitokimyasallar, kolon kanseri sıklığını azaltmada önemli rol oynayan biyoaktif bitkisel bileşiklerdir 194,195 . Fitokimyasalların bir grubu olan kukurbitasinler, bitkiler aleminin Scrophulariaceae, Cruciferae gibi bazı ailelerinde bulunmakla birlikte yaygın olarak Cucurbitaceae (Kabakgiller) bitki ailesinden izole edilen ve yüksek yapısal farklılığı olan tetrasiklik triterpenoidlerin bir grubudur 193,196,197 . Kukurbitasin, acı tadı ve toksik etkisi iyi bilinen ve yüksek oranda oksijenlenmiş bir maddedir. Yapısal olarak, tetrasiklik cucurbitane çekirdek iskeletinin 19-(10→9β)-abeo-10lanost-5-ene ile karakterize olan kukurbitasin, kimyasal olarak çok çeşitli bir bileşik olup, yan zincir modifikasyonları ve stereokimya değerlerine göre A’dan T’ye kadar olmak üzere 12 alt gruba ayrılır 193,196-198 . Serbest veya glikozillenmiş formda bulunabilen bu bileşik ailesi ateş düşürücü, ağrı kesici, anti-inflamatuar, anti-mikrobiyal, anti-diyabetik ve kanser önleyici etkilerinden dolayı Çin ve Hindistan gibi Asya ülkelerinde yüzyıllardır geleneksel tedavi yöntemi olarak kullanılmaktadır 199-203. 38 Şekil 13: Kukurbitasin B’nin kimyasal yapısı 204 Kukurbitasinlerden en bol olanı ve in vivo ve in vitro çalışmalar için en yaygın olarak kullanılanı kukurbitasin B (CuB)’dir 193,197,203,205 düşük . Önemli bir anti-inflamatuar, anti-oksidan, anti-diyabetik ve ilacı olarak geleneksel kullanılmakta olan CuB tedavi 193,197,198,206,207 yönteminde uzun yıllardır , gelecek vaat eden bir anti-kanser ilaç adayıdır, buna rağmen etki mekanizması henüz tam olarak anlaşılamamıştır (şekil 13) 208. Günümüzde pek çok araştırma CuB’nin kanser üzerindeki inhibe edici etkisine odaklanmaktadır. Son yıllarda yapılan çeşitli çalışmalarda CuB’nin hepatoma, lösemi, lenfoma, multiple myeloma, melanoma, glioblastoma, oral kavite kanserleri, nazofarinks, meme, prostat, kolon, akciğer, pankreas, serviks ve merkezi sinir sistemi dahil olmak üzere in vitro insan kanser hücre hatlarında ve in vivo tümör ksenograft modellerinde kanserli hücre büyümesini inhibe edici etkisi olduğu gösterilmiştir 193,205-207,209-214 . CuB’nin tümör önleyici mekanizması çeşitli sinyal iletim yolaklarını durdurmasının yanı sıra, hücre iskeletinin bozulması, hücre döngüsünün durması veya bozulması, apoptoz uyarımı ve farklılaşma dahil olmak üzere çeşitli etkileri içerir 209-212,215 . CuB’in, anti- tümörijenik aktivitesini önemli onkojenik yolaklardaki JAK/STAT sinyal yolağını inhibe ederek tümör gelişimini baskıladığı gösterilmektedir 208,212,213 . CuB, kanserli hücre büyümesini baskılayıcı etkisini STAT3 39 fosforilasyonunu baskılaması sonucu JAK/STAT yolağını inhibe etmesi, apoptoz uyarımı ve hücre döngüsünün bozulması veya durması ile göstermektedir 214-216. CuB, STAT3 tirozin (Tyr705) fosforilasyonunu inhibe ederek, JAK2 ve STAT3 aktivasyonunu, STAT3 DNA bağlanmasını ve STAT3 aracılı gen ifadelenmesini baskılayarak kanserli hücre büyümesini inhibe etmektedir 202,208,214-216 . CuB, apoptoz ile ilişkili genler ve hücre döngüsünü düzenleyen genler gibi JAK-STAT yolağının downstream genlerini düzenler ve JAK/STAT yolağını baskılar, sonuç olarak tümör büyümesini inhibe ederek apoptozu uyarır 208,212,214,216. CuB, fosfotirozin-STAT3’ü hücresel düzeyde baskılarken, fosfo-ERK1/2, fosfo-JNK ve fosfo-AKT’yi baskılayamaz. CuB kanser hücrelerinde Akt/PKB ve MAPK/ERK yolakları gibi diğer büyüme öncesi sinyal yolaklarını inhibe etmez 196,212 . Bu nedenle STAT3 TK bölgesi, CuB için olası moleküler bir hedeftir. 2.12. HT-29 Kolon Kanser Hücre Hattı HT-29 hücre hattı, 1964 yılında Fogh ve ark. tarafından 44 yaşındaki kolorektal adenokarsinoma hastası olan Kafkas bir kadından alınmış ve üretilmiştir 217,218 . Epitel benzeri morfolojiye sahip olan bu hücreler, tümör baskılayıcı p53 geninde mutasyon taşırlar ve mutant p53 proteini üretirler. Ayrıca, HT-29 hücreleri abl, ros ve src genlerini içermezler ve tümör hücrelerinin özelliklerini sergileyen HT-29 hücreleri cmyc, K-ras, H-ras, N-ras, myb, sis ve fos gibi çeşitli onkogenleri ifade ederler. HT-29 hücreleri yaklaşık 40-60 saatte bir bölünerek çoğalırlar (Şekil 14) 217-220. 40 Şekil 14: HT-29 hücrelerinin morfolojik görüntüsü 220 2.13. HCT-116 Kolon Kanser Hücre Hattı HCT-116 hücre hattı, 1981 yılında Brattain ve ark. tarafından kolorektal karsinoma hastası olan bir erkekten alınmış ve üretilmiştir 222,223. Epitel benzeri küçük hücre morfolojisine sahip olan HCT-116 hücrelerinin, Transforme edici büyüme faktörü beta-1 (TGFβ-1) ve beta-2 (TGFβ-2) genlerinde amplifikasyon olduğu ve buna bağlı olarak TGFβ-1 ve TGFβ-2 mRNA düzeylerinin yüksek olduğu bildirilmiştir. Ayrıca bu hücreler ras geninde de mutasyon taşırlar ve mutant ras proteini üretirler. HCT-116 hücreleri yaklaşık 25-48 saatte bir bölünerek çoğalırlar (şekil 15) 222-224. 41 Şekil 15: HCT-116 hücrelerinin morfolojik görüntüsü 224 42 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Kullanılan Araç ve Gereçler 3.1.1. HT-29 ve HCT-116 Hücre Hattı Çalışmamızda, T.C. Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı’na bağlı Şap Enstitüsü Müdürlüğü, Hücre ve Virüs Bankası Bölümü’nden alınan insan kolon karsinoma hücre hattı olan HT-29 hücreleri (HÜKÜK Kayıt No: 96041201) ile bir diğer insan kolon karsinoma hücre hattı, Amerikan Doku Kültür Kolleksiyonu (ATCC)’ndan sağlanan insan kolon karsinoma hücre hattı olan HCT-116 hücreleri (ATCC Kayıt No: CCL-247™) kullanıldı. Her iki hücre hattı da Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM)’lı besiyerinde kültüre edildi. 3.1.2. Kullanılan Cihazlar • Biyogüvenlik kabini (DanLaf, Danimarka) • Buzdolabı (Arçelik, Türkiye) • Derin dondurucu, -30°C (Sanyo, Japonya) • Derin dondurucu, -86°C (Sanyo, Japonya) • Elektroforez tankı (Thermo Scientific, ABD) • Floresan ataçmanlı mikroskop (Olympus BX-50, Japonya) • Güç kaynağı (BIO-RAD) • Hassas terazi (AND-ER-182A, Japonya) • Hybaid PCR-Sprint otomatik ısı döngü cihazı (Thermo Scientific, ABD) • Invert mikroskop (Zeiss, Almanya) • Işık mikroskobu (DCM 4000, Leicia, Almanya) 43 • Jel görüntüleme sistemi (Kodak, ABD) • Karbondioksitli etüv (Sanyo, Japonya) • Küçük poliakrilamid jel sistemi (BIO-RAD) • LightCycler Real-Time PCR cihazı (Roche, Almanya) • Manyetik karıştırıcı (TMA 2071, Almanya) • Mikropipetler, 10μL, 100μL, 100μL (Bt10, Bt100, Bt1000 Biohit, CLP, ABD) • Mikroplaka okuyucu (BioTek ELx800, ABD) • pH metre (WTW 422, Almanya) • Soğutmalı santrifüj (Hettich Mikro 22 R, Almanya) • SpectraMax M3 (Molecular Devices, ABD) • Spektrofotometre (NanoDrop ND-1000) (Thermo Scientific, ABD) • Spin vorteks (Biosan, Rusya) • Western Blot Sistemi (Bio-Rad, İngiltere) 3.1.3. Kullanılan Sarf Malzemeleri • Hücre kriyo (dondurma) ampülü (Greiner, Almanya) • Hücre kültür flaskları, 25 cm2 ve 75 cm2 (Corning, ABD) • Kültür tüpleri (Corning, ABD) • Mikrosantrifüj tüpleri (CLP, Almanya) • Petri kabı, 35mm, 60mm ve 100mm (Corning, ABD) • Pipet uçları (CLP, Almanya) 3.1.4. Kullanılan Kimyasal Maddeler • Agaroz (Peqlab, Erlangen, Almanya) 44 • Amonyum persülfat (Thermo Fisher Scientific, Almanya) • Akridin Oranj (Sigma, ABD) • Akrilamid (Merck Millipore, Almanya) • Asetik asit (Thermo Fisher Scientific, Almanya) • Beta - Merkaptoethanol (Merck Millipore, Almanya) • Borik asit (Ambresco, ABD) • Bovin Serum Albümin (Pierce, ABD) • Bromfenol mavisi (Thermo Fisher Scientific, Almanya) • Coomasie parlak mavisi (Thermo Fisher Scientific, Almanya) • Cucurbitacin B (Tocris, ABD) • Diaminobenzidin (Thermo Fisher Scientific, Almanya) • Dimetil sülfoksit (DMSO) (Ambresco, ABD) • Disodyumhidrojenfosfat (Na2HPO4) (Sigma, ABD) • DMEM besiyeri (HyClone, Thermo, ABD) • DNA Markır (Thermo Fisher Scientific, Almanya) • Etanol (Sigma, ABD) • Etidyum Bromür (Sigma, ABD) • Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (Ambresco, ABD) • Fenilmetilsülfonilflorid (PMSF) (Roche, Almanya) • Fetal sığır serumu (FCS) (inaktif) (HyClone, Thermo, ABD) • Gefitinib (Gef) (Tocris, ABD) • Glisin (Thermo Fisher Scientific, Almanya) • Gliserol (Merck Millipore, Almanya) • Glutamin (HyClone, Thermo, ABD) • Hidrojen peroksit (H2SO4) (Thermo Fisher Scientific, Almanya) • Hidroklorik asit (HCl) (Thermo Fisher Scientific, Almanya) 45 • İnaktive edilmiş fetal sığır serumu (FCS) (HyClone, Thermo, ABD) • Laemmli buffer (Sigma, ABD) • Metanol (Thermo Fisher Scientific, Almanya) • Moleküler ağırlık işaretleyici (Santa Cruz, Almanya) • Nitrosellüloz membran (Amersham Bioscience, ABD) • N’ N’-bis-metilen-akrilamid (Merck Millipore, Almanya) • Nonidet P-40 (NP-40) (Sigma, ABD) • Orange G (Sigma, ABD) • PBS (Tuzlu fosfat tamponu) (Thermo Fisher Scientific, Almanya) • Penisilin/Streptomisin (HyClone, Thermo, ABD) • Ponceau S (Ambresco, ABD) • Primerler (Alfa DNA, Almanya) • Protein Marker (New England Biolabs, Almanya) • Proteinaz K (Sigma, ABD) • Ribonükleaz A (Sigma, ABD) • Sitrik Asit (Sigma, ABD) • Sodyumdihidrojenfosfat (NaH2PO4) (Sigma, ABD) • Sodyum dodesil sülfat (SDS) (Thermo Fisher Scientific, Almanya) • Sodyum hidroksit (NaOH) (Thermo Fisher Scientific, Almanya) • Sodyum klorür (NaCl) (Merck Millipore, Almanya) • Sülfirik asit (H2SO4) (Merck Millipore, Almanya) • Tetrametilendiamin (TEMED) (Thermo Fisher Scientific, Almanya) • Tripsin-EDTA (HyClone, Thermo, ABD) • Tris (Ambresco, ABD) • Tween 20 (Thermo Fisher Scientific, Almanya) • Universal Probe Library (UPL) Probları (Roche, Almanya) 46 3.1.5. Kullanılan Kitler • Cell Death Detection ELISA Plus Kit (Roche, Almanya) • Cell Proliferation ELISA, BrdU (Kolorimetrik) (Roche, Almanya) • Cytotoxicity Detection Kit Plus LDH (Laktat Dehidrogenaz) (Roche, Almanya) • High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Almanya) • High Pure RNA İzolasyon Kiti (Roche, Almanya) • Hücre Canlılığı Kiti (MTT) (Roche, Almanya) • PathScan® Cleaved Kaspaz-3 (Asp175) Sandwich ELISA Kit (Cell Signaling, ABD) • SuperSignal® WestPico Chemilumiscent Substrate (Pierce, ABD) • TaqMan Master Mix (Roche, Almanya) • Transcriptor First Strand cDNA Sentez Kiti (Roche, Almanya) (5-bromo-2’-deoksiuridin) 3.2. Besiyeri, Tampon ve Çözeltilerin Hazırlanışı 3.2.1. % 10’luk DMEM Besiyerinin Hazırlanması 450 ml DMEM besiyeri içerisine, 50 ml fetal sığır serumu (FCS), 200 mM L-glutaminden 10 ml ve son konsantrasyonu 100 IU/ml penisilin ile 100 μg/ml streptomisin eklenerek %10’ luk DMEM besiyeri hazırlandı. 47 3.2.2. % 1’lik DMEM Besiyerinin Hazırlanması 495 ml DMEM besiyeri içerisine, 5 ml FCS, 200 mM Lglutaminden 10 ml, 100 IU/ml penisilin, 100 μg/ml streptomisin eklenerek %1’ lik DMEM besiyeri hazırlandı. 3.2.3. MTT Karışımının Hazırlanması MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] stok solüsyonu hazırlamak için toz halinde olan MTT 1 ml’de 5 mg olacak şekilde tartılarak distile suda çözüldü. Daha sonra filtreden geçirilerek steril hale getirildi. 3.2.4. 0.2 M Na2HPO4 Çözeltisinin Hazırlanması 1.42 g Na2HPO4 tartılarak son hacim 50 ml olacak şekilde distile su içinde çözüldü. 3.2.5. 0.1 M Sitrik Asit Çözeltisinin Hazırlanması 0.96 g sitrik asit tartılarak son hacim 50 ml olacak şekilde distile su içinde çözüldü. 3.2.6. Fosfat-Sitrat Çözeltisinin (PH: 7.8) Hazırlanması 0.2 M Na2HPO4 çözeltisi ile 0.1 M sitrik asit çözeltisi 48:2 oranında karıştırılarak hazırlandı. Hazırlanan çözeltinin pH’sı 7.8’e ayarlandı. 48 3.2.7. %.25 Nonidet P-40 (Np-40) Çözeltisinin Hazırlanması 25 μL NP-40 alınarak son hacmi 10 ml olacak şekilde distile su içerisinde çözüldü. 3.2.8. 1 mg/ml Proteinaz K Çözeltisinin Hazırlanması 1 mg Proteinaz K tartılıp son hacim 1 ml olacak şekilde distile su içerisinde çözülerek hazırlandı. 3.2.9. 1 mg/ml Ribonükleaz A (RNaz A) Çözeltisinin Hazırlanması 1 mg RNaz A enzimi tartılıp son hacim 1ml olarak şekilde distile su içerisinde çözülerek hazırlandı. 3.2.10. 10X Tris Borik Asit EDTA (TBE) Stok Çözeltisinin Hazırlanması Öncelikle 54 g Tris bazı, 27.5 g Borik Asit ve 20 ml 0.5 M EDTA (pH: 8) bir miktar distile suda çözündükten sonra son hacim 500 ml olacak şekilde üzerine distile su eklendi. 3.2.11. 1X Tris Borat EDTA (TBE) Tamponunun Hazırlanması 100 ml 10X TBE, 900 ml distile su ile 1000 ml’ye tamamlanarak hazırlandı ve istenilen konsantrasyona seyreltildi. 49 3.2.12. 0.5 M EDTA Çözeltisinin Hazırlanması 29.2 g EDTA, 160 ml distile su içerisinde çözündükten sonra son hacim distile su ile 200 ml’ye tamamlandı ve pH = 8’e ayarlandı. 3.2.13. Oranj G Jel Yükleme Tamponunun Hazırlanması 55 ml Gliserol, 100 mg Orange G ve 45 ml 1X TBE tamponu karıştırılarak hazırlandı. 3.2.14. Stok Etidyum Bromür Boyasının Hazırlanması 100 mg etidyum bromür son hacmi 10 ml olacak şekilde distile suda çözülerek hazırlandı. 3.2.15. Agaroz Jelin Hazırlanması % 1.5’ luk agaroz jel hazırlamak için, 1.52 g agaroz hassas terazide tartıldıktan sonra üzerine son hacmi 100 ml olacak şekilde 1X TBE çözeltisi koyuldu ve mikrodalga fırın kullanılarak kaynatıldı. Agarozun homojen bir şekilde erimesinden sonra içine 4 μL etidyum bromür eklendi ve yatay jel elektroforez tankına dökülerek jelin donması sağlandı. Sonra jelin üzerini örtecek şekilde 1X TBE tamponundan eklendi. 3.2.16. 1X PBS Çözeltisinin Hazırlanması 1.09 g Na2HPO4, 0.32 g NaH2PO4 ve 9 g NaCl2 tartılıp 800 ml distile su içerisinde çözüldükten sonra pH’sı 7.4’e ayarlanıp son hacim distile su ile 1 litreye tamamlandı. 50 3.2.17. 56 mM Stok Gef Çözeltisinin Hazırlanması 25 mg Gef tartılıp son hacmi 1 ml olacak şekilde saf dimetilsülfoksit (DMSO) içerisinde çözüldü. Elde edilen stok çözeltisi 1 ve 0.5 ml’lik tüplere dağıtılarak -20 ºC’de saklandı. 3.2.18. 36 mM Stok Kukurbitasin B (CuB) Çözeltisinin Hazırlanması 20 mg CuB tartılıp son hacmi 1 ml olacak şekilde saf dimetilsülfoksit (DMSO) içerisinde çözüldü. Elde edilen stok çözeltisi 1 ve 0.5 ml’lik tüplere dağıtılarak -20 ºC’de saklandı. 3.2.19. 0,5 M Tris-HCl Çözeltisi (100 ml, 1,25M) (pH 6.8) 19,7 g Tris-HCl, 90 ml distile su içinde çözdürüldü. Çözelti, sodyum hidroksit ve hidroklorik asitle pH 6.4’e ayarlandı ve distile su ile 100 ml tamamlanarak otoklavlandı. Çözelti oda ısısında muhafaza edildi. 3.2.20. 1,5 M Tris-HCl Çözeltisi (100 ml, 1,25M) (pH 8.8) 19,7 g Tris-HCl, 90 ml distile su içinde çözdürüldü. Çözelti, sodyum hidroksit ve hidroklorik asitle pH 8.8’e ayarlandı ve distile su ile 100 ml tamamlanarak otoklavlandı. Çözelti oda ısısında muhafaza edildi. 51 3.2.21. Akrilamid / Bisakrilamid Stok Çözeltisi (100 ml, %30) 29 g akrilamid ve 1 g bisakrilamid distile su ile 100 ml’ye tamamlanarak çözdürülerek filtreden geçirildi ve +4 °C’de koyu renkli cam sise içerisinde muhafaza edildi. 3.2.22. Amonyum Persülfat (APS) Stok Çözeltisi (100 ml, %10) 1 g APS tartılıp 10 ml distile su içinde çözdürüldü ve +4 °C’de muhafaza edildi. 3.2.23. Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) Stok Çözeltisi (100 ml, %10) 100 g SDS distile su ile 1000 ml’ye tamamlanarak çözdürüldü ve 0,22 mikronluk filtreden geçirilerek sterilize edildi. Çözelti oda ısısında muhafaza edildi. 3.2.24. 2X Yükleme Tamponu (Laemmli - Sample Buffer) (10 ml) 7 ml 4X Tris-HCI (4X yığınlama jeli çözeltisi), 3,6 ml gliserol, 1g SDS, 1,2 mg bromfenol mavisi distile su ile 10 ml’ye tamamlandı. 5-10 dk kaynatıldı. 52 3.2.25. 2X Protein Yükleme Tamponu İndirgeyici 100 µl tampon içine 4 µl β-merkapto etanol eklendi. 10 g SDS hafifçe ısıtılan distile su içinde çözüldü. 3.2.26. Tris Baz Stok Çözeltisi (100 ml, 1,5 M) 18,165 g Tris baz distile su ile 90 ml’ye tamamlanarak çözdürüldü. Çözelti, sodyum hidroksit ve hidroklorik asit kullanılarak pH 6.8’e ayarlandı ve distile su ile 100 ml’ye tamamlandı. Daha sonra çözelti otoklavlanarak oda ısısında muhafaza edildi. 3.2.27. 10X Jel Yürütme Tamponu (Running Buffer) (1000 ml) 28,8 g Glisin, 6 g Tris baz ve 2 g SDS distile su ile 1000 ml’ye tamamlanarak çözdürüldü. Tampon +4°C’de muhafaza edildi. 3.2.28. 1X Jel Yürütme Tamponu (Running Buffer) (1000 ml) 100 ml 10X Elektroforez Yürütme Tamponu 10 ml %10 SDS eklendi ve distile su ile 1000 ml’ye tamamlandı. Tampon +4°C’de muhafaza edildi. 3.2.29. Jelden Membrana Proteinleri Transfer Tamponu (1000 ml) 6 g Tris baz, 28,8 g Glisin ve 200 ml metanol distile su ile 1000 ml ‘ye tamamlanarak çözdürülerek hazırlandı. 53 3.2.30. Jel Boyama Çözeltisi – Coomassie Parlak Mavisi (1000 ml) 5 g Coomasie blue R-250 tartılarak 450 ml distile su içinde çözdürüldü. 450 ml metanol ve 100 ml glasiyal asetik asit ilave edilerek 1000 ml’ye tamamlandı. Çözelti oda ısısında muhafaza edildi. 3.2.31.Ponceau S Çözeltisi (100 ml) 0,5 g Ponceau S, % 0,1 asetik asit içinde çözdürüldü. 3.2.32. Jelden Boya Çıkartıcı Çözelti (1000 ml) 100 ml glasiyel asetik asit, 100 ml metanol, 800 ml distile su ile 1000 ml’ye tamamlanarak hazırlandı. Her Western blot işleminde yeni çözelti hazırlandı. 3.2.33. TBS (Tris-tuz) Çözeltisi (500 ml) 2,42 g Tris-HCl ile 9 g sodyum klorür (NaCI) tartılıp 800 ml distile su içinde çözdürüldü. Çözelti, sodyum hidroksit ve hidroklorik asit kullanılarak pH 7.4’e ayarlandı ve distile su ile 1000 ml’ye tamamlanarak hazırlandı. 3.2.34. TBST (Tris-tuz-tween 20) Çözeltisi (300 ml) (pH: 7.4) 1000 ml TBS çözeltisi içine 100 μl Tween 20 eklenerek hazırlandı. Her Western blot işleminde taze çözelti hazırlandı. 54 3.2.35. Bloklama Çözeltisi (%3 Süttozu içeren TBST) (10 ml) 0,3 g yağsız süt tozu tartılarak 10 ml TBST (% 0.1) çözeltisi içinde çözdürülerek hazırlandı. 3.2.36. PBS ( Fosfat-tuz tamponu) 1 PBS tableti 100 ml distile su içinde çözdürülerek hazırlandı. 3.2.37. Antikor Çözeltileri Hazır liyofilize şekildeki antikorlar belirtilen miktarda steril distile su içinde çözdürüldü, 40 μl %2’lik sodyum azid eklendi ve -20 °C’de muhafaza edildi. 3.2.38. Sodyum Azid (NaN3) 0.2 g NaN3 10 ml distile su içinde çözüldü. 3.2.39. İmmünolojik Saptama için Kullanılan Çözelti 6 mg diaminobenzidin, sodyum hidroksit ve hidroklorik asit kullanılarak pH’sı 7.2’ye ayarlanmış olan 10 ml PBS içinde çözdürüldü. Daha sonra 10 μl %30’luk hidrojen peroksit eklenerek kullanıma hazır hale getirildi. Her Western blot işleminde yeni çözelti hazırlandı. 55 3.3. Yöntemler 3.3.1. Hücre Kültürü HT-29 ve HCT-116 hücreleri, %10’luk DMEM besiyerinde %95 nem ve %5 CO2 içeren ortamda 37 ºC’de kültüre edilerek çoğaltıldı. 3.3.2. Gef ve CuB Uygulanan HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde Etkin Dozun MTT Yöntemi ile Belirlenmesi HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde Gef, CuB ve Gef+CuB uygulamasının hücrelerin canlılığı üzerine olan etkilerinin belirlenmesi için kolorimetrik MTT yöntemi kullanıldı. Hücreler, %10 FCS içeren DMEM içerisinde homojen bir şekilde dağıtıldıktan sonra 96 kuyucuklu hücre kültür kaplarına her kuyucuğa 10.000 hücre / 100 μL olacak şekilde ekildi. Hücrelerin üzerine son konsantrasyonu 0,1-100 μM aralığında çeşitli konsantrasyonlarda olacak şekilde %10’luk DMEM içerisinde seyreltilmiş olan stok Gef ve CuB çözeltilerinden eklendi. DMSO çözücü kontrolü olarak kullanıldı ve aynı süre için inkübe edildi. Daha sonra hücreler 24 ve 48 saat süreyle 37°C’de %5 CO2’li etüvde inkübe edildi. İnkübasyon süresi bittikten sonra 10 μl MTT (5 mg/ml) her bir kuyucuğa eklendi ve 4 saat süre ile inkübe edildi. Bu sürenin sonunda, her bir kuyucuğa 100 μl DMSO eklendi ve formazan kristalleri çözündükten sonra 570 nm’ de Spectramax M3 (Molecular Devices, ABD) cihazı ile ölçüldü. Her bir doz için deney 5 tekrarlı yapılarak ortalama absorbans değerleri belirlendi. Elde edilen ortalama absorbans değerleri, madde uygulaması yapılmayan kontrole oranlanarak hücre canlılığı üzerine ilaçların etkisi belirlendi. Sadece besiyeri ve MTT karışımını içeren örnekler absorbansların belirlenmesinde kör olarak kullanıldı. Hücre canlılığının 56 hesaplanması için örneklerin absorbans değerlerinden kör örneğin absorbans değeri çıkartıldı. Daha sonra örneklere ait 5 farklı absorbans değerinin ortalaması alındı. Sadece hücre içeren kontrol örneğinin ortalama absorbansı %100 canlılığa karşılık gelen değer olarak kabul edildi ve ilaç uygulanan hücrelerden elde edilen absorbans değerleri, kontrol hücrelerine göre oranlanarak hücre canlılığı yüzde olarak belirlendi. 3.3.3. Canlı, Apoptotik ve Nekrotik Hücre Ayrımının Floresan Mikroskobunda İncelenmesi Hücre kültürlerinin sonlandırılmasını takiben hücreler 3μL akridin oranj (100µg/ml) ve 3μL etidyum bromür (100µg/ml) ile boyanarak floresans mikroskobunda apoptoz açısından değerlendirildi. Akridin oranj sadece canlı hücrelerin zarından içeri girip bu hücrelerin DNA’sına bağlandığından canlı hücreler yeşil renkte görülür. Etidyum bromür ise ölü hücrelerin zarından geçip DNA’ya bağlandığından, nekrotik hücrelerde kırmızı rengin oluşmasına neden olur. Buna karşın her iki boya da apoptotik hücre zarından içeri girebildiği için sarı-turuncu renkte ve karakteristik apoptotik nükleus görünümünün görüntülenmesine olanak sağlar 225. Hücre kültürlerinin sonlandırılmasını takiben hücreler 3 μL, 100 μg/ml akridin oranj ve etidyum bromür içeren çözelti ile boyanarak floresan mikroskobunda canlı, apoptotik ve nekrotik hücre oranlarının belirlenmesi için değerlendirildi. 57 3.3.4. Besiyerine Salınan Laktat Dehidrojenaz (LDH) Miktarının Ölçülerek Sitotoksik Etkinin Belirlenmesi Glikoliz sırasında laktatın pirüvata dönüşümünü sağlayan LDH molekülü tüm hücrelerde bulunan stabil bir enzimdir. Hücre zarının hasar görmesiyle birlikte hızlı bir şekilde besiyerine salınır. Ölü veya hücre zarı hasarlı olan hücrelerin miktarındaki artış besiyerindeki LDH aktivitesinin artması ile sonuçlanmaktadır. LDH aktivitesindeki bu artış da deney sonunda oluşan renkli formazan kristalinin miktarının artmasına dolayısı ile elde edilen absorbansın yüksek olmasına neden olmaktadır 226,227 . 1. HT-29 ve HCT-116 hücreleri 96’lık kültür kaplarına her bir kuyucuğa 10.000 hücre gelecek şekilde ekildi. Bu enzimin besiyerindeki aktivitesi Cytotoxicity Detection (LDH) kiti kullanılarak aşağıdaki protokole göre ölçüldü. 2. Gef ve CuB’nin belirlenen dozlarının inkübasyon süreleri dolduktan sonra kültür ortamından 100 μL besiyeri alınıp 96 kuyulu mikroplağın her bir kuyucuğuna eklendi. 3. Kuyulara kit içerisinde bulunan 100 μL taze hazırlanmış reaksiyon karışımı eklendi. Işıktan uzak bir ortamda, oda sıcaklığında 30 dk bekletildi. 4. Mikroplaka okuyucu cihazı ile 490 nm dalga boyundaki absorbans değerleri okundu. 5. Deney protokolünde kullanılan kontroller: 58 Kör kontrol: Besiyeri Düşük kontrol: Besiyeri+Hücre Yüksek kontrol: Triton X-100 solüsyonu+Besiyeri+Hücre 6. Elde edilen absorbans değerlerinden kör kontrolün absorbansı çıkartıldıktan sonra, ilaçların sitotoksisite değerinin yüzdesi aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı. Sitotoksisite (%) = (örnek abs. – düşük kontrol abs. / yüksek kontrol abs. – düşük kontrol abs.) x 100 3.3.5. Hücre Çoğalmasının Bromodeoksiuridin (Brdu) ile Belirlenmesi Bu yöntem, bir primidin analoğu olan 5-bromo-2'- deoksiüridinin (BrdU) DNA sentezi sırasında timin yerine DNA'ya katılması esasına dayanır. BrdU'nun DNA'ya katılması immunolojik yöntem ile belirlenir. Böylece DNA sentezi geçiren hücre döngüsünün S fazında olan hücrelerin oranları belirlenmektedir 226. HT-29 ve HCT-116 hücreleri Gef ve CuB ile muamele edildikten sonra ilaçların hücre çoğalması üzerine olan etkisi “Cell Proliferation ELISA, BrdU” kiti kullanılarak aşağıdaki protokole göre araştırıldı. 1. HT-29 ve HCT-116 hücreleri 96’lık kültür kaplarına her bir kuyucuğa 10.000 hücre gelecek şekilde ekildi. 59 2. Bir gece sonra belirtilen dozlarda Gef ve CuB ile muamele edilerek aynı sürelerde bekletildi. Her bir konsantrasyon için deney üç tekrarlı yapıldı. 3. İnkübasyon süreleri dolduktan sonra her bir kuyucuğa 10 μL BrdU çözeltisi eklendi. 37 °C’de 2 saat inkübe edildi ve besiyeri uzaklaştırıldı. 4. 200 μL FixDenat çözeltisi eklendi ve 25 °C’de 30 dk inkübe edildi. 5. FixDenat çözeltiside uzaklaştırıldıktan sonra her bir kuyucuğa 100 μL peroksidaz enzimi ile konjuge BrdU antikorunu içeren anti-BrdU-POD solüsyonu eklendi. 25 °C’de 90 dk inkübe edildi. 6. Antikor uzaklaştırıldıktan sonra her bir kuyucuk 300 μL 1X PBS ile 3’er defa yıkandı. 7. Substrat olarak kit içerinde bulunan tetrametilbenzidin (TMB) çözeltisinden 100 μL eklenerek yeterli renk değişimi gözlenene kadar 25 °C’de 5-30 dk bekletildi. 8. Her bir kuyucuğa 25 μL 1M H2SO4 eklenerek karıştırıldı. 5 dakika içinde mikroplaka okuyucu ile 450 nm dalga boyundaki absorbans değerleri belirlendi. 60 3.3.6. DNA Fragmentasyonunun ELISA Yöntemi ile Belirlenmesi Belirtilen kültür sürelerinin dolmasıyla kullanılan ilaçların neden olduğu hücre ölümünü ve hücrelerde görülen DNA fragmentasyonunu belirlemek için Cell Death Detection ELISA PLUS kiti kullanılarak ELISA yöntemiyle aşağıda belirtilen protokole göre belirlenmiştir; 1. HT-29 ve HCT-116 hücreleri 96 kuyulu kültür kaplarında her bir kuyucuğa 10.000 hücre gelecek şekilde ekildi. Hücrelere daha önce belirtilen miktarda Gef ve CuB verilerek uygun sürelerde inkübe edildi. Her bir konsantrasyon için deney üç tekrarlı yapıldı. 2. İnkübasyon süreleri dolduktan sonra her kuyuya 200 μL lizis tamponu eklendi. Oda sıcaklığında 30 dk bekletildi. 3. Mikrosantrifüj tüpüne alınan hücre lizatı oda sıcaklığında, 1000 rpm’de 10 dk santrifüj edildi. 4. Santrifüj sonrası üstte kalan sıvıdan 20 μL alınıp streptavidin kaplı mikroplakaya aktarıldı. 5. 80 μL anti-histon biyotin ile anti-DNA POD eklendi ve oda sıcaklığında çalkalayıcı üzerinde 2 saat süreyle inkübe edildi. 6. Örnekler 300 μL yıkama çözeltisi ile oda sıcaklığında 3 defa yıkandı. 61 7. Her bir kuyucuğa kit içerisinde bulunan peroksidaz substrat solüsyonundan ABTS 100 μL eklendi. Renk değişimi gözleninceye kadar oda sıcaklığında 20 dk inkübe edildi. 8. 100 μL ABTS durdurucu solüsyonu eklendikten sonra mikroplaka okuyucu cihazı ile 405 nm dalga boyundaki absorbans değerleri okundu. 3.3.7. DNA Fragmentasyonunun Agaroz Jel Elektroforezi ile Gösterilmesi 1. Her bir doz için 106 hücre olacak şekilde belirtilen miktarda Gef ve CuB verilerek uygun sürelerde inkübe edildikten sonra hücreler 10 ml’lik tüplere alınıp santrifüj edildi. 2. Hücreler 1200 rpm’de 10 dk santrifüj edilip üstte kalan sıvı atıldı. Çökelti üzerine 50 μL fosfat-sitrat tamponu (pH 7.8) eklenerek oda sıcaklığında 1 saat bekletildi. 3. Karışım 1200 rpm’de 10 dk santrifüj edilerek süpernatan 1.5 ml’lik mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı. 4. Süpernatan üzerine 3 μL RNaz A ve 3 μL NP-40 çözeltilerinden eklenerek 37 °C’de 1 saat inkübe edildi. 5. Bu süre sonunda 3 μL Proteinaz K çözeltisi eklenerek tekrar 37 °C’de 1 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonrasında örnekler elektroforez yöntemi uygulanana kadar +4 °C’de saklandı. 62 3.3.7.1 Agaroz Jel Elektroforezi Bunun için daha önceden hazırlanmış olan %1.5’luk agoroz jele DNA örneklerinden 15 μL alınarak, 3 μL Orange G jel yükleme tamponu karıştırılıp jeldeki kuyulara yüklendi. Aynı zamanda kuyulardan birine de 100 baz çiftlik (bç) DNA moleküler ağırlık belirteci yüklenerek 90 dk dakika 75 volt sabit akımda yürütüldü. Süre sonunda “Kodak Gel Logic 100” görüntüleme sistemi kullanılarak jelin fotoğrafı çekildi. 3.3.8. Aktif kaspaz-3 miktarının Sandwich ELISA yöntemi ile Belirlenmesi 1. HT-29 ve HCT-116 hücreleri 6 kuyulu kültür kaplarında her bir kuyuya 106 hücre gelecek şekilde ekildi. Hücrelere daha önce belirtilen miktarda Gef ve CuB verilerek uygun sürelerde inkübe edildi. Her bir konsantrasyon için deney üç tekrarlı yapıldı. 2. İnkübasyon sürelerinin dolmasından sonra kültür ortamından Gef ve CuB içeren besiyeri uzaklaştırıldı ve hücreler soğuk 1X PBS ile buz üzerinde bir defa yıkandı. 3. PBS uzaklaştırıldıktan sonra 1 mM PMSF içeren 0.5 ml soğuk 1X lizis tamponu eklendi ve 5 dk buz üzerinde beklendi. 4. Hücreler kültür kabından hücre kazıyıcı ile kazınarak uzaklaştırıldı ve mikrosantrifüj tüpüne alındı. 5. Hücre lizatı sonikatör cihazı ile 15 sn boyunca ses dalgaları yardımıyla hücrelerin parçalanması sağlandı, ardından 10 dakika 63 +4 °C’de 15.500 rpm’de santrifüj edilip üstte kalan sıvı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne alındı. 6. Elde edilen hücre lizatlarından 100 μL antikor ile kaplanmış mikroplaka kuyularına dağıtıldı. 7. Kuyuların üzeri bir bant yardımıyla sıkıca kapatılarak, 37 °C’de 2 saat süreyle bekletildi. 8. Kuyuların içeriği boşaltıldıktan sonra 4’er defa 200 μL 1X yıkama tamponu ile yıkandı. 9. Her bir kuyucuğa 100 μL primer antikor eklendi. Kuyucukların üzeri bir bant yardımıyla sıkıca kapatıldı. 37 °C’de 1 saat süreyle bekletildi. 10. Dört defa 200 μL 1X yıkama tamponu ile yıkandı. 11. Örneklerin üzerine 100 μL yaban turpu peroksidazı (HRP) bağlanmış ikincil antikor eklendi. Kuyucukların üzeri bir bant yardımıyla sıkıca kapatıldıktan sonra 37 °C’de 30 dk süreyle inkübe edildi. 12. Örnekler 4 defa 200 μL 1X yıkama tamponu ile yıkandı. 13. Her bir kuyuya 100 μL TMB substratı eklendi. Kuyucukların üzeri bir bant yardımıyla sıkıca kapatılıp 37 °C’de 10 dk süreyle inkübe edildi. 64 14. Renksiz olan TMB eklendikten sonra peroksidaz tepkimesinin belirteci olan mavi renk dönüşümü gerçekleşti. 15. Her bir kuyucuğa 100 μL durdurucu solüsyon eklendi. Durdurucu solüsyonun eklenmesinden bir süre sonra mavi olan rengin sarı renge dönüştüğü gözlendi. 16. Sarı renk oluşumu görüldükten sonra mikroplaka okuyucu ile 450 nm dalga boyundaki absorbans değerleri okundu. 17. İlaç uygulanmamış hücrelerden elde edilen absorbans değeri bir olarak kabul edilip ilaç uygulanan hücrelerdeki aktif CASP3 miktarı belirlendi. 3.3.9. Hücre Kültüründen Total RNA’nın Elde Edilmesi Gef ve CuB ile inkübasyon sürelerinin dolmasıyla, hücrelerden RNA izolasyonu, “High Pure RNA Isolation Kiti” kullanılarak, aşağıda yazılı olan protokole göre biyogüvenlik kabininin içinde yapıldı. 1. Hücrelerin üzerine 200 μL soğuk PBS ve 400 μL Lizis tamponu eklenip 15 saniye vortekslendi. 2. Filtre, toplama tüpüne yerleştirilip tüm karışım filtre üstüne aktarıldı. 3. Tüp 9000 rpm’de 15 saniye santrifüj edildi. 65 4. Toplama tüpünde toplanan sıvı atılıp filtre aynı tüpe tekrar yerleştirildi. 5. Her bir örnek için 90 μL DNaz inkübasyon tamponu steril tüpe alındı ve 10μL DNaz I eklendi. Pipetaj ile karıştırıldıktan sonra karışım filtrenin ortasına bırakıldı. 15 dakika oda sıcaklığında bekletildi. 6. 500 μL’lik 1. yıkama çözeltisi filtre üzerine eklendi ve 9000 rpm’de 15 saniye santrifüj edildi. Filtre altında toplanan kısım atıldıktan sonra aynı toplama tüpü içerisine yerleştirildi. 7. 500 μL’lik 2. yıkama çözeltisi filtre üzerine eklendi ve 15 saniye 9000 rpm’de santrifüj edildi. Filtre altında toplanan kısım atıldıktan sonra aynı toplama tüpü içerisine yerleştirildi. 8. 200 μL’lik 3. yıkama çözeltisi filtre üzerine eklendi ve 3 dk 13500 rpm’de santrifüj edildi. 9. Toplama tüpü atıldı. Filtre, steril 1.5 ml’lik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirildi. 10. Filtre üzerine 20 μL örnek seyreltme çözeltisi eklendi ve 9000 rpm’de 1 dk santrifüj edildi. 11. Elde edilen RNA’ların miktarları ve saflığı “NanoDrop ND1000 Spektrofotometre” cihazında ölçülerek RT-PCR’da kullanılana kadar -80 °C derin dondurucuda saklandı. 66 3.3.10. Komplementer DNA (cDNA) Sentezi (RT-PCR) Elde edilen RNA’lar spektrofotometrede 260 nm dalga boyunda ölçülerek mikrolitredeki mikrogram değerleri belirlendi. Primer olarak random hekzamerler kullanılarak cDNA sentez kiti ile total RNA’dan cDNA sentezi yapıldı. cDNA sentezi sırasında kullanılan kimyasallar ve miktarları Tablo 1’de verilmiştir. Tablo 1: RT-PCR tepkime karışımı Steril H2O-PCR Grade Reaksiyon Tamponu dNTP Random hekzamer primeri RNaz inhibitörü Transkriptor Ters Transkriptaz Total RNA Son Konsantrasyon 1x (8mM MgCl2) 1mM 60μM 20 ünite 10 ünite 1μg Hacim RNA miktarına göre değişken 4μL 2μL 2μL 0.5μL 0.5μL 1μg olacak şekilde cDNA için PCR karışımı ince çeperli 0.2 ml’lik tüplere dağıtıldıktan sonra elde edilen total RNA eklendi. 3.3.10.1 Reverse Transkriptaz PCR (RT-PCR) Programı Otomatik ısı döngüsü cihazı, Tablo 2’de belirtilen programa ayarlanarak cDNA sentezi yapıldı. Tablo 2: Otomatik ısı döngüsü cihazında uygulanan program Primer Bağlanması Ters Transkripsiyon İnaktivasyon Soğutma Sıcaklık 25°C 50°C 85°C 4°C Zaman 10dk 60dk 5dk - Döngü sayısı 1 1 1 1 67 Reaksiyon sonucunda elde edilen cDNA örnekleri Real-Time PCR’da kullanılana kadar -20 °C’lik derin dondurucuda saklandı. 3.3.11. Gen İfadesinin Real-Time PCR ile Belirlenmesi Bcl-2, Bax, Bak, Bad ve siklin D1 mRNA miktarları, RealTime PCR yöntemi ile Light CyclerTM cihazı kullanılarak belirlendi. Amplifikasyonlar 20 μL toplam tepkime hacmi içerisinde; cDNA, mRNA’ya özgü primerler, UPL probu, LightCycler TaqMan Master karışımı ve distile su kullanılarak gerçekleştirildi. Bcl-2, Bax, Bak, Bad ve siklin D1 ifade miktarlarını normalize etmek için GAPDH mRNA düzeyi referans olarak alındı. 3.3.12. Bcl-2 Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi Bcl-2 genine ait UPL prob ve primerlerin özellikleri ve gen bölgesindeki yerleşimleri şekil 16’da gösterilmiştir. Bcl-2 Forward primer: 5’- AGTACCTGAACCGGCACCT -3’ Bcl-2 Reverse primer: 5’- GCCGTACAGTTCCACAAAGG -3’ 75 numaralı prob dizisi: 5’- GGAGGCTG -3’ Şekil 16: Bcl-2 mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000398117 giriş no’lu dizi) Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır. 68 3.3.13. Bax Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi Bax genine ait UPL prob ve primerlerin özellikleri ve gen bölgesindeki yerleşimleri şekil 17’de gösterilmiştir. Bax Forward primer: 5’- ATGTTTTCTGACGGCAACTTC -3’ Bax Reverse primer: 5’- ATCAGTTCCGGCACCTTG -3’ 57 numaralı prob dizisi: 5’- CTGGGGCC -3’ Şekil 17: Bax mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000293288 giriş no’lu dizi) Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır. 3.3.14. Bak Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi Bak genine ait UPL prob ve primerlerin özellikleri ve gen bölgesindeki yerleşimleri şekil 18’de gösterilmiştir. Bak Forward primer: 5’- AAACTGGGCTCCCACTCA -3’ Bak Reverse primer: 5’- CAGTGGAGGACGGGATCA -3’ 66 numaralı prob dizisi: 5’- CAGCAGCC -3’ 69 Şekil 18: Bak mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000374467 giriş no’lu dizi) Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır. 3.3.15. Bad Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi Bad genine ait UPL prob ve primerlerin özellikleri ve gen bölgesindeki yerleşimleri şekil 19’da gösterilmiştir. Bad Forward primer: 5’- CAGTCACCAGCAGGAGCA -3’ Bad Reverse primer: 5’- CGACTCCGGATCTCCACA -3’ 46 numaralı prob dizisi: 5’- GCAGCCAT -3’ Şekil 19: Bad mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000309032 giriş no’lu dizi) Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır. 3.3.16. Siklin D1 Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi Siklin D1 genine ait UPL prob ve primerlerin özellikleri ve gen bölgesindeki yerleşimleri şekil 20’de gösterilmiştir. 70 Siklin D1 Forward primer: 5’- GCCGAGAAGCTGTGCATC -3’ Siklin D1 Reverse primer: 5’- CCACTTGAGCTTGTTCACCA -3’ 58 numaralı prob dizisi: 5’- CTCCATCC -3’ Şekil 20: Siklin D1 mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000227507 giriş no’lu dizi) Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır. 3.3.17. GAPDH Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi GAPDH genine ait UPL prob ve primerlerin özellikleri ve gen bölgesindeki yerleşimleri şekil 21’de gösterilmiştir. GAPDH Forward primer: 5’- AGCCACATCGCTCAGACAC -3’ GAPDH Reverse primer: 5’- GCCCAATACGACCAAATCC -3’ 60 numaralı prob dizisi: 5’- TGGGGAAG -3’ Şekil 21: GAPDH mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000229239 giriş no’lu dizi) Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır. 71 3.3.17.1 Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH Genleri için Real-Time PCR Tepkime Karışımı Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH genlerine uygun verilen primer ve problar kullanılarak Real-time PCR tepkimesi LC cihazında gerçekleştirildi. Tepkime karışımını hazırlamak için kullanılan bileşenlerin miktarları tablo 3’te verilmiştir. Tablo 3: Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH Real-Time PCR tepkime karışımı Son Konsantrasyon Hacim - 6.2μL 4mM 1.2μL Primer F (10pmol/μL) 2.5pmol 0.25μL Primer R (10pmol/μL) 2.5pmol 0.25μL TaqMan prob (100pmol/μL) 10pmol 0.1μL 1x 1μL - 1μL dH2O MgCI2 (25mM) TaqMan karışımı (10x) cDNA 3.3.17.2. Light Cycler (LC) Deney Programı Real-time PCR karışımları hazırlandıktan sonra kapiller tüplere dağıtıldı ve üzerine cDNA’lar eklendi. Kapiller tüpler 3000 rpm’de 10 sn santrifüj edildi. Tüpler cihaza yerleştirildikten sonra Tablo 4’te belirtilen amplifikasyon programı kullanılarak PCR tepkimesi gerçekleştirildi. Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH genleri için aynı program kullanıldı. 72 Tablo 4: Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH genlerinin ifade düzeylerinin belirlenmesi için kullanılan Real Time PCR tepkime programı Program 1. Ayrılma (Denatürasyon) Program Verisi Değer Döngüler Analiz Modu Sıcaklık Hedefleri 1 Kısım 1 Hedef Sıcaklık (°C) İnkübasyon zamanı (s:dk:sn) Sıcaklık Geçiş Hızı (°C/sn) 95 10:00dk 20.0 Program 2. Primer Bağlanması ve Uzama (Hibridizasyon ve Polimerizasyon) Program Verisi Değer Döngüler Analiz Modu Sıcaklık Hedefleri 50 Çoğalma Kısım 1 Kısım 2 Hedef Sıcaklık (°C) İnkübasyon zamanı (s:dk:sn) Sıcaklık Geçiş Hızı (°C/sn) 95 10sn 20.0 60 20sn 10.0 Program 3. Soğutma Program Verisi Değer Döngüler Analiz Modu Sıcaklık Hedefleri 1 Kısım 1 Hedef Sıcaklık (°C) İnkübasyon zamanı (s:dk:sn) Sıcaklık Geçiş Hızı (°C/sn) 40 30sn 20.0 Reaksiyon sonucu deney gruplarına ait Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH genlerinin mRNA ifade düzeylerini gösteren Crossing point (Cp) değerleri belirlendi. Bcl-2, Bax, Bak, Bad ve siklin D1 gen ifade düzeyleri GAPDH ifade düzeyine göre normalize edildi. 73 3.4. Western Blot Yöntemi HT-29 ve HCT-116 kolon kanser hücre hatlarına belirlenen doz ve sürelerde CuB, Gef ve CuB+Gef uygulandıktan sonra bu hücrelerden protein izole edildi. Bcl-2, Bax, Bak, siklin D1 ve p27kip1 proteinlerinin ifadelerinin varlığı Western Blot (WB) yöntemiyle belirlendi. housekeeping olarak beta-aktin (ACTB) proteini kullanıldı. Çalışmamızda tespit edilmek istenilen Bcl-2 proteininin molekül ağırlığı 29 kiloDalton (kDa), Bax proteininin molekül ağırlığı 20 kDa, Bak proteininin molekül ağırlığı 25 kDa, siklin D1 proteininin molekül ağırlığı 36 kDa ve p27 proteininin molekül ağırlığı 27 kDa olması nedeniyle %12’lik poliakrilamid jel kullanılarak SDS-Page jeli hazırlandı 228,229 : 3.4.1. Hücreden Protein İzolasyonu 1. HT-29 ve HCT-116 kolon kanser hücreleri 6 kuyulu kültür kaplarında her bir kuyuya 106 hücre gelecek şekilde ekildi. Hücrelere daha önce belirtilen miktarda CuB, Gef ve CuB+Gef verilerek uygun sürelerde inkübe edildi. Her bir konsantrasyon için deney üç tekrarlı yapıldı. 2. İnkübasyon sürelerinin dolmasından sonra kültür ortamından CuB, Gef ve CuB+Gef içeren besiyeri uzaklaştırıldı ve hücreler soğuk 1X PBS ile buz üzerinde bir defa yıkandı. 3. PBS uzaklaştırıldıktan sonra 1 mM PMSF içeren 0.5 ml soğuk 1X lizis tamponu eklendi ve 5 dk buz üzerinde beklendi. 4. Hücreler kültür kabından hücre kazıyıcı ile kazınarak uzaklaştırıldı ve mikrosantrifüj tüpüne alındı. 74 5. Hücre lizatı sonikatör cihazı ile 15 sn boyunca ses dalgaları yardımıyla hücreler parçalandı. Daha sonra 10 dakika +4 °C’de 15.500 rpm’de santrifüj edildi ve üstte kalan süpernatan yeni bir mikrosantrifüj tüpüne alınarak protein miktar tayini yapılana kadar -80 °C’de saklandı. 3.4.2. Protein Miktar Tayini Elde edilen total protein miktarı BCA Protein Assay kiti kullanılarak ölçüldü. Kit protokolüne uygun olacak şekilde konsantrasyonları 25 µg ile 2000 µg arasında değişen 7 adet Bovine Serum Albumin (BSA) dilüsyonları oluşturuldu. Kit içerisinde bulunan A ve B çözeltileri 50:1 oranında karıştırılarak elde edilen karışım standart protein dilüsyonlarına eklendi ve 30 dk 37 ºC’de inkübe edildi. Süre sonunda standartların konsantrasyonları SpectraMax M3 (Molecular Devices, ABD) cihazında 562 nm dalga boyunda ölçülerek standart eğri hazırlandı. Hücreden izole edilen protein örnekleri de benzer şekilde hazırlandıktan sonra absorbans değerleri ölçülüp oluşturulan standart eğri yardımıyla protein miktarları belirlendi. 3.4.3. SDS-PAGE Jelin Hazırlanması Jelin dökülmesi sırasında kullanılacak olan camlar alkol ile temizlenip iki camın arasına ayıraçlar yerleştirildikten sonra jel kasetine yerleştirildi. Camlar kasete konulduktan sonra ayırma jeli için 50 ml % 8’lik akrilamid jel karışımı hazırlandı. Tablo 5 ve 6’da belirtilen miktarlarda Akrilamid, Tris bazı, SDS bir miktar distile suda çözüldükten sonra karışım Whatman kağıdından geçirilerek süzüldü ve son hacim 50 ml’ye tamamlandı. Bu karışım içine jel dökülmeden hemen önce yine tablo 5 ve 6’da belirtilen miktarlarda APS ve TEMED eklendi. Ayırıcı jel karışımı 75 tarağın bir miktar alt kısmında işaretlenen düzeye kadar döküldü. Jel döküldükten hemen sonra bütanol veya izopropanol ilave edilerek jelin polimerizasyonu beklendi. Ayırma jeli polimerize olduktan sonra bütanol veya izopropanol uzaklaştırıldı. Yığınlama jeli (stacking gel) tablo 7’ de belirlenen oranlarda kimyasalların karıştırılmasıyla hazırlanarak ayırıcı jelin üzerine döküldü. Tablo 5: %10’luk SDS-PAGE için ayırma jelinin bileşenleri %10’luk Ayırma Jeli %30’luk Akrilamid / Bisakrilamid karışımı Hacim (mL) 5 mL 1,5 M Tris Bazı (pH 8.8) 3.8 mL %10 SDS 0.15 mL %10 APS 0.15 mL TEMED 0.006 mL dH2O 5.9 mL Tablo 6: %12’lik SDS-PAGE için ayırma jelinin bileşenleri %12’lik Ayırma Jeli %30’luk Akrilamid / Bisakrilamid karışımı Hacim (mL) 6 mL 1,5 M Tris Bazı (pH 8.8) 3.8 mL %10 SDS 0.15 mL %10 APS 0.15 mL TEMED 0.006 mL dH2O 4.9 mL 76 Tablo 7: %5’lik SDS-PAGE için yığınlama jelinin bileşenleri %5’lik Yığınlama Jeli Hacim (mL) %30’luk Akrilamid / Bisakrilamid karışımı 1.005 mL 1,5 M Tris Bazı (pH 6.8) 1.875 mL %10 SDS 0.075 mL %10 APS 0.0375 mL TEMED 0.0075 mL dH2O 4.6125 mL 3.4.4. Proteinlerin SDS-PAGE’e Yüklenme Öncesi Hazırlanması Daha önceden içerdikleri toplam protein miktarları belirlenmiş olan örneklerin her birinden 30 µg/ml olacak şekilde protein karışımı alındı ve protein miktarları distile su, numune ve yükleme tamponu oranları ile eşitlenen numuneler 5 dakika 95 ºC’de kaynatılarak proteinlerin denatürasyonu sağlandıktan sonra, SDS-PAGE’e yükleninceye kadar +4 ºC’de bekletildi. 3.4.5. Proteinlerin SDS-PAGE’e Yüklenmesi ve Elektroforez İşlemi Jelin polimerleşmesinin ardından jel kaseti dikey elektroforez tankına yerleştirildi. Hazırlanan 10X yürütme tamponundan 1X yürütme tamponu hazırlanarak anot-katot boşluklarından jel tankına döküldü ve tarak dikkatlice çıkartıldı. Oluşan kuyucukların içi enjektör yardımıyla 1X yürütme tamponu ile iyice yıkanarak kuyucuklardaki akrilamid kalıntıları temizlendi. Her kuyucuğa 50 μg/ml oranında protein içeren numuneler ve boyalı peroksidaz işaretli protein moleküler ağırlık belirteci kuyucuklara yüklenerek elektroforez işlemi başlatıldı. Elektroforez tankı güç kaynağına 77 bağlandı. Jelin yığınlama kısmında 100 V, 300 mA akım uygulanırken, örnekler ayırma jeline geçtiğinde ise voltaj 150’ye çıkartıldı ve yükleme boyası jelin alt kısmına gelince işlem sonlandırıldı. 3.4.6. Elektrotransfer İşlemi (Protein Örneklerinin Nitroselüloz Membrana Aktarılması) Çalışmamızda proteinlerin jelden nitroselüloz membrana elektrotransfer işlemi için ıslak transfer yöntemi kullanıldı. Elektroforez işlemi bittikten sonra camlar ayrılarak jel ortaya çıkartıldı ve jelin protein bulunmayan yığınlama kısmı kesilip atıldı. Nitroselüloz membran, jel ile aynı büyüklükte kesilerek sırasıyla ilk olarak 10 sn %100 metanol, 2 dk distile su ve son olarak 1X transfer tamponu içerisinde 15 dk süreyle ıslatıldı. Bu sırada jel 1X transfer tamponu içeren kabın içerisine alındı. Başka bir kabın içine de 4 adet 3 mm kalınlığındaki Whatman kağıtları ve 2 adet sünger ped konularak 1X transfer tamponu içerisinde ıslatıldı. Transfer kasedinin katot (-) elektrot kısmına bir adet 1X transfer tamponu içerisinde ıslatılmış olan sünger yerleştirildi, sünger ped’in üstüne 2 adet Whatman kağıdı konularak üzerine 15 dk transfer tamponunda bekletilmiş jel yerleştirildi. Jelin üstüne de daha önceden distile su içerisinde ıslatılıp 15 dk 1X transfer tamponunda bekletilen nitroselüloz membran dikkatlice konulduktan sonra, membran ile jel arasında hava kabarcığı kalmaması için bir cam tüp ile üzerinden geçildi. Membranın üstüne yine sırayla iki adet Whatman kağıdı ve bir sünger ped konuldu. Transfer kasetinin anot (+) ve katot (-) kısımları plastik “clamp” ile kapatılarak elektroblotting tankına yerleştirildi ve tank 1X transfer tamponu ile dolduruldu. Transfer işlemi 250 mA’ de 100 V akımda 1,5 saat süreyle gerçekleştirildi. Uygulanan akım nedeniyle tamponun ısınmasını engellemek için ve transfer işleminin soğuk ortamda gerçekleştirilmesi elektroblotting işlemi +4 ºC’de gerçekleştirildi 228,229 gerektiği için, . Transfer sonunda, transfer sandviçi tankın içerisinden çıkartılarak açıldı, membran dikkatlice 78 alındı ve proteinlerin elektrotransfer ile jelden nitroselüloz membrana aktırılıp aktarılmadığı Ponceau S boyası ile boyanarak kontrol edildi. Yine, SDS-PAGE işleminden sonra jelde protein kalıp kalmadığını kontrol etmek amacıyla, Coomassie Parlak Mavisi kullanıldı. Jel üzerindeki proteinler nitroselüloz membrana aktarıldıktan sonra proteinlerin immünolojik saptanması işlemini yapıldı. 3.4.7. Bloklama Membran yüzeyine antikorun özgül olmayan bağlanma yapmasını engellemek için StartingBlockTM (TBS) Bloklama tamponu kullanıldı. Bu tamponu kullanmadan hemen önce % 0.1 oranında Tween20 eklendi. TBS-T tamponu ve % 5’lik yağsız süt tozu içeren kapatma solüsyonunda bloklama işlemi 1 saat oda ısısında otomatik yatay çalkalayıcı üzerinde gerçekleştirildi. 3.4.8. Membran Üzerindeki Proteinin İmmunolojik Gösterilmesi Membran, bloklama amaçlı kullanılan tamponun içerisinde Bcl-2, Bax, Bak, siklin D1 ve p27kip1 için her bir antikor 1:1000 oranında seyreltilerek +4 ºC’de bir gece otomatik yatay çalkalayıcı üzerinde inkübe edildi. Süre sonunda membran, TBS-T tamponu içerisinde 3 kez 10’ar dk otomatik yatay çalkalayıcı üzerinde çalkalanarak yıkandı. Yıkama işlemi sonunda proteinleri görünür hale getirebilmek için, primer antikorları tanıyacak olan 1:2000 oranında sulandırılan HRP konjuge anti-rabbit IgG sekonder antikoru ile oda sıcaklığında 1 saat otomatik yatay çalkalayıcı üzerinde inkübe edildi. Sekonder antikor döküldükten sonra membran, tekrar TBS-T tamponu içerisinde 3 kez 10’ar dk otomatik yatay çalkalayıcı üzerinde çalkalanarak yıkandı ve film çekimine geçildi. 79 3.4.9. Görüntüleme İnkübasyon Chemiluminescent sonunda Substrate kiti Super kullanılarak Signal® WestPico HRP’nin substratını parçalayarak floresan sinyal oluşturması sağlandı. Substratla inkübasyon için; membran üzerine üretici firma talimatına uygun olarak reaktifleri 1 : 1 oranında karıştırılan Super Signal Chemiluminisans (Super Signal® WestPico Chemiluminescent Substrate, Pierce, Katalog No: 34080T) ile kaplandı ve 5 dakika bekletildi. Elde edilen floresan sinyal ile bantların, Kodak Gel Logic 2200 Carestream görüntüleme sisteminde fotoğrafı çekilerek protein bantları analiz edildi. 3.5. İstatistiksel Analiz Yöntemleri Doza ve zamana bağlı olarak değişen, Bcl-2, Bax, Bak, ve siklin D1 mRNA ifade düzeylerindeki farklılıklar “REST (2009 V2.0.13)” istatistik programı ile karşılaştırıldı 230 . Hücre canlılığı, apoptoz ve nekrotik oranlardaki değişimler ise “tek yönlü Anova” testiyle karşılaştırıldı. Veriler “SPSS 15.0” istatistik programı kullanılarak değerlendirildi. 0.05’den küçük olan p değerleri istatistiksel açıdan anlamlı olarak kabul edildi. 80 4. BULGULAR Çalışmamızda, p53 mutant HT-29 ile p53 yabanıl tip HCT116 insan kolon kanseri hücre hatlarında, çeşitli doz ve inkübasyon sürelerinde CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulanması sonucunda sitotoksik ve apoptotik etkileri hem morfolojik hem de DNA, mRNA ve protein düzeylerinde araştırıldı. 4.1. HT-29 ve HCT-116 Hücrelerinin Gef ve CuB’ye Duyarlılığının MTT Hücre Canlılığı Yöntemi ile İncelenmesi CuB ve Gef’nin HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin canlılığı üzerine etkisini belirlemek için öncelikle MTT yöntemi uygulandı. CuB ve Gef’in ayrı ayrı ve birlikte kullanımlarının hücre canlılığı üzerine etkisinin belirlenmesinde MTT kullanılarak ilaçların hücre canlılığı üzerine olan etkisi araştırılmıştır. Buradan elde edilen canlılık oranlarından, kullanılan ilacın hücre canlılığı üzerine etkisinin belirlenmesi amaçlandı. HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin 24 ve 48 saat Gef ile muamelesine verdiği cevabı belirlemek için 96 kuyulu hücre kültür kaplarına 104 hücre/kuyu olacak şekilde hücreler ekildi. Öncelikle HT-29 hücreleri, son konsantrasyon 70 μM olacak şekilde ve HCT-116 hücreleri, son konsantrasyon 80 μM olacak şekilde Gef ile 24 ve 48 saat süre ile inkübe edildi. Süre sonunda MTT analizi yapıldı. 81 Grafik 1: HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin (10.000 hücre/kuyu) Gef ile 24 ve 48 saat inkübasyonu sonunda belirlenen hücre canlılık oranları. Grafik 1’ de 24 ve 48 saat inkübasyon sonucunda hücrelerin Gef’e olan cevabı hücre canlılık oranları ile gösterilmektedir. Buna göre HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin canlılık oranlarının artan Gef dozuna bağlı olarak düştüğü belirlendi. HT-29 hücrelerinde kullandığımız en yüksek Gef konsantrasyonu olan 70 μM’da hücre canlılığının 24 saatte yaklaşık % 33 48 saatte ise yaklaşık %23 olduğu görülmektedir. HCT-116 hücrelerinde kullandığımız en yüksek Gef konsantrasyonu olan 80 μM’da ise hücre canlılığının 24 saatte yaklaşık %35, 48 saatte ise yaklaşık %19 olduğu belirlendi. Sonuçlarımıza göre Gef için IC50 dozunun HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde 24 saat inkübasyon sonunda yaklaşık 50 μM olduğu gözlendi. 48 saat inkübasyon sonucunda ise HT-29 hücrelerinde IC50 dozu 40 μM iken HCT-116 hücrelerinde IC50 dozunun yaklaşık 30 μM olduğu belirlendi. HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin 24 ve 48 saat CuB ile muamelesine verdiği cevabı belirlemek için yine 96 kuyulu hücre kültür kaplarına 104 hücre/kuyu olacak şekilde hücreler ekildi. Öncelikle her iki hücre hattına, son konsantrasyon 100 μM olacak şekilde CuB ile 24 ve 48 saat süre ile inkübe edildi ve süre sonunda MTT analizi yapıldı. 82 Grafik 2: HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin (10.000 hücre/kuyu) CuB ile 24 ve 48 saat inkübasyonu sonunda belirlenen hücre canlılık oranları. Grafik 2’ de 24 ve 48 saat inkübasyon sonucunda hücrelerin CuB’e olan cevabı hücre canlılık oranları ile gösterilmektedir. Buna göre HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin canlılık oranlarının artan CuB dozuna bağlı olarak düştüğü belirlendi. HT-29 hücrelerinin, HCT-116 hücrelerine göre daha düşük konsantrasyonlardaki CuB dozlarından etkilendiği gözlendi. HT-29 hücrelerinde kullandığımız en yüksek CuB konsantrasyonu olan 100 μM’da, hücre canlılığının 24 saatte yaklaşık %31, 48 saatte ise yaklaşık %17 olduğu görülmektedir. Sonuçlarımıza göre CuB için IC50 dozunun HT-29 hücrelerinde 24 saat inkübasyon sonunda yaklaşık 10 μM, 48 saat inkübasyon sonunda 5 μM olduğu gözlendi. HCT-116 hücrelerinde kullandığımız en yüksek CuB konsantrasyonu olan 100 μM’ da, hücre canlılığının 24 saatte yaklaşık %41, 48 saatte ise %19 olduğu gözlendi. HCT-116 hücrelerinde 24 saat inkübasyon sonucunda IC50 dozunun yaklaşık 80 μM, 48 saat inkübasyon sonucunda ise IC50 dozunun yaklaşık 50 μM olduğu belirlendi. Bu sonuçlara göre CuB’nin HT-29 hücrelerine göre HCT-116 hücrelerinin canlılığını daha yüksek konsantrasyonlarda etkilediği gözlendi. 83 Kültür ortamındaki HT-29 hücrelerine, 5 μM ve 10 μM dozlarındaki Gef’e ilave olarak, 0,0125 μM - 20 μM doz aralığında olacak şekilde CuB eklenerek 24 ve 48 saat sonunda MTT analizi yapıldı. Yine kültür ortamındaki HCT-116 hücrelerine, 5 μM ve 10 μM dozlarındaki Gef’e ilave olarak, 0,5 μM - 80 μM doz aralığında olacak şekilde CuB eklenerek 24 ve 48 saat sonunda MTT analizi yapıldı. Grafik 3: HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin (10.000 hücre/kuyu) Gef ve CuB ile birlikte 24 ve 48 saat inkübasyonu sonunda belirlenen hücre canlılık oranları. Grafik 3’ te 24 ve 48 saat inkübasyon sonucunda hücrelerin CuB ve Gef birlikteliğine olan cevabı hücre canlılık oranları ile gösterilmektedir. Buna göre HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin canlılık oranlarının CuB ve Gef‘in birlikte kullanımı sonucu doza bağlı olarak düştüğü belirlendi. HT-29 hücrelerinde kullandığımız en yüksek Gef + CuB konsantrasyonu olan 10 μM Gef + 20 μM CuB’de, hücre canlılığının 24 ve 48 saatte yaklaşık % 35 olduğu görülmektedir. HCT-116 hücrelerinde ise kullandığımız en yüksek Gef + CuB konsantrasyonu olan 10 μM Gef + 80 μM CuB’de hücre canlılığının 24 saat sonunda yaklaşık %34, 48 saat sonunda ise yaklaşık %18 olarak bulundu. Sonuçlarımıza göre HT-29 hücrelerinde 24 ve 48 saat inkübasyon sonunda IC50 dozunun yaklaşık 10 84 μM Gef + 0,5 μM CuB olduğu belirlendi. HCT-116 hücrelerinde ise 24 saat inkübasyon sonucunda IC50 dozunun yaklaşık 10 μM Gef + 10 μM CuB olduğu gözlendi. 4.2. Canlı, Apoptotik ve Nekrotik Hücre Dağılımının Floresan Mikroskobunda İncelemesi CuB ve Gef’in HT-29 ve HCT-116 hücrelerine olan etkilerinin belirlenmesi amacıyla kullandığımız MTT hücre canlılığı yönteminden elde edilen bulgular, ajanların uygulanmasını takiben gözlenen canlı hücrelerin oranını göstermektedir. CuB ve Gef’in, HT-29 ve HCT-116 hücreleri üzerine olan apoptotik ve nekrotik etkilerinin belirlenmesi amacıyla, CuB ve Gef’in ayrı ayrı ve birlikte uygulanmasından sonra hücreler, akridin oranj / etidyum bromür ile boyanıp, floresan ataçmanlı mikroskopta hücrelerin analizi yapılarak, canlılık, apoptoz ve nekroz açısından değerlendirildi. Bunun için yaptığımız MTT hücre canlılık deneyi sonucunda elde edilen hücre canlılık oranları dikkate alınarak, hücrelerin canlılığının belirgin bir düşüş gösterdiği belirlendi. Böylece MTT yönteminden elde edilen hücre canlılık oranlarının doğrulanması sağlandı. Hücrelerin floresan mikroskobundaki görünümleri Şekil 22 ve 23’te gösterilmiştir. 85 B A Şekil 22: HT-29 hücrelerinde apoptozun morfolojik olarak gösterilmesi. A: Kontrol, B: 10μMGef+0,05μMCuB. Yeşil renkte görülen hücreler canlı hücreleri (1), kırmızı renkte görülen hücreler nekrotik hücreleri göstermektedir (3). Apoptozun aşamasına göre değişik şekillerde boyanmış olan apoptotik hücreler ise 2 numara ile gösterildi (MB: 400x). B A 2 2 3 1 3 1 1 1 2 Şekil 23: HCT-116 hücrelerinde apoptozun morfolojik olarak gösterilmesi. A: Kontrol, B: 10μMGef+10μMCuB. Yeşil renkte görülen hücreler canlı hücreleri (1), kırmızı renkte görülen hücreler nekrotik hücreleri göstermektedir (3). Apoptozun aşamasına göre değişik şekillerde boyanmış olan apoptotik hücreler ise 2 numara ile gösterildi (MB: 400x). 86 Floresan mikroskobunda yapılan analizlere göre, 24 saat sonunda HT-29 hücre hattında CuB ve Gef uygulaması sonrasında hücrelerde doza bağlı olarak apoptozun arttığı, hücre canlılığının ise azaldığı gözlendi. Kullanılan en yüksek Gef konsantrasyonu olan 50 µM dozunda apoptotik oranın %26.6, 0,5 µM CuB konsantrasyonunda ise apoptotik oranın %26,3 olduğu bulundu. Ayrıca 10 μM Gef + 0,5 μM CuB birlikteliğinde apoptotik oran %32,2 olarak bulundu (Grafik 4). Grafik 4: HT-29 hücrelerinin (106 hücre/kuyu) Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda belirlenen Canlı / Apoptotik / Nekrotik hücre oranları. *; p<0.05 (ilaç uygulaması yapılmayan kontrol hücreleri ile ilaç uygulanan hücrelerde belirlenen apoptotik hücrelerin karşılaştırılması) 24 saat sonunda HCT-116 hücre hattında benzer şekilde CuB ve Gef uygulaması sonrasında hücrelerde doza bağlı olarak apoptozun arttığı, hücre canlılığının ise azaldığı gözlendi. Kullanılan en yüksek Gef konsantrasyonu olan 50 µM Gef dozunda apoptotik oranın %29.4, 40 µM CuB konsantrasyonunda ise apoptotik oranın %28,1 olduğu bulundu. Ayrıca 10 μM Gef + 10 μM CuB birlikteliğinde apoptotik oran %29,7 olarak bulundu. (Grafik 5). 87 Grafik 5: HCT-116 hücrelerinin (106 hücre/kuyu) Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda belirlenen Canlı / Apoptotik / Nekrotik hücre oranları. *; p<0.05 (ilaç uygulaması yapılmayan kontrol hücreleri ile ilaç uygulanan hücrelerde belirlenen apoptotik hücrelerin karşılaştırılması) Floresan mikroskobu deneyimizin sonuçlarını dikkate aldığımızda her bir doz ve süre için elde ettiğimiz hücre canlılık oranlarının MTT sonuçlarımızla uyumlu olduğu belirlendi. 4.3. Besiyerine Salınan Laktat Dehidrojenaz (LDH) Miktarının Ölçülerek Sitotoksik Etkinin Belirlenmesi HT-29 hücrelerine 24 sat süreyle CuB, Gef ve birlikte uygulanmaları sonrasında ilaçların hücreler üzerine olan sitotoksik etkilerini belirlemek için besi yeri ortamına salınan LDH miktarı ölçüldü. CuB ve Gef’in neden olduğu sitotoksik etkinin yüzdesel değeri, LDH analizinden elde edilen verilerin kontrol grubu ile karşılaştırılması ile hesaplandı. Elde sitotoksisite değeri edilen yüzde veriler olarak kontrol grubu hesaplandı. ile karşılaştırılarak Sonuçlarımıza göre konsantrasyona bağlı olarak besiyerine salınan LDH miktarının arttığı belirlendi. Özellikle HT-29 hücrelerinde, 25 µM Gef ile 0,05 µM CuB 88 uygulamasında 24 saat sonunda sitotoksisite oranlarında istatistiksel olarak anlamlı bir artış gözlendi (p<0.05). Buna göre MTT hücre canlılığı testinin sonuçları ve floresan mikroskobunda yapılan hücre sayması analizleri ile uyumlu olacak şekilde en yüksek sitotoksik değerin 10 µM Gef + 0,5 µM CuB konsantrasyonunda olduğu görüldü (Grafik 6). Grafik 6: HT-29 hücrelerinin Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen LDH salınımı. *; p<0.05. HCT-116 hücrelerine 24 saat süreyle CuB, Gef ve birlikte uygulanmaları sonrasında, özellikle 50 µM Gef ile 10 µM CuB uygulamasında 24 saat sonunda sitotoksisite oranlarında istatistiksel olarak anlamlı bir artış gözlendi (p<0.05). MTT hücre canlılığı testinin sonuçları ve floresan mikroskobunda yapılan hücre sayımı analizleri ile uyumlu olacak şekilde, sitotoksik etkinin en fazla görüldüğü konsantrasyon 10 µM Gef+10 µM CuB konsantrasyonunda olduğu görüldü (Grafik 7). 89 Grafik 7: HCT-116 hücrelerinin Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen LDH salınımı. *; p<0.05. 4.4. Hücre Çoğalmasının Bromodeoksiuridin (BrdU) ile Belirlenmesi CuB ve Gef’in ayrı ayrı ve birlikte uygulamasının hücre çoğalması (DNA sentezi) üzerine etkisinin belirlenmesinde hücre çoğalması ELISA, BrdU yöntemi kullanıldı. HT-29 hücre hattında 24. saatte apoptoz açısından en etkili doz olan 10 μM Gef + 0,5 μM CuB konsantrasyonundaki hücre çoğalması %57 olarak belirlendi (p<0.05) (Grafik 8). 90 Grafik 8: HT-29 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen DNA sentez oranlarındaki değişim. *; p<0.05. HCT-116 hücre hattında ise 24. saatte apoptoz açısından en etkili doz olan 10 μM Gef + 40 μM CuB konsantrasyonundaki hücre çoğalması %53,2 olarak belirlendi (p<0.05) (Grafik 9). Grafik 9: HCT-116 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen DNA sentez oranlarındaki değişim. *; p<0.05. 91 4.5. DNA Fragmentasyonunun ELISA Yöntemi ile Belirlenmesi CuB ve Gef uygulanmış HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde gözlenen DNA fragmentasyonunun belirlenmesinde, sitoplazmik mono ve oligo nükleozomların miktarlarının ELISA yöntemi ile saptanmasını temel alan kit kullanıldı. Buna göre doza bağlı olarak hücrelerde görülen DNA fragmentasyon miktarının arttığı belirlendi. En yüksek artış HT-29 hücreleri için 10 μM Gef + 0,5 μM CuB konsantrasyonunda kontrole göre yaklaşık 6 kat artmış olduğu gözlendi (p<0.05). Bu veri bu dozda belirlenen yüksek apoptoz oranları ile uyumluluk göstermektedir (Grafik 10). Grafik 10: HT-29 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen DNA fragmentasyon oranı. *; p<0.05. HCT-116 hücrelerinde ise fragmentasyon oranlarının konsantrasyona bağlı olarak arttığı belirlendi (p<0.05). En yüksek fragmentasyon oranı 10 µM Gef + 40 µM CuB uygulamasında kontrole göre yaklaşık 5.3 kat artmış olduğu gözlendi (p<0.05). Bu veri bu dozda 92 belirlenen yüksek apoptoz oranları ile uyumluluk göstermektedir (Grafik 11). Grafik 11: HCT-116 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen DNA fragmentasyon oranları. *; p<0.05. 4.6. DNA Fragmentasyonunun Agaroz Jel Elektroforezi ile Gösterilmesi Agaroz jel elektroforezi ile DNA fragmentasyonun gösterilmesine dayanan yöntemde daha çok yüksek oranda apoptoz gözlendiği takdirde ve DNA fragmentasyonunun fazla olduğu durumlarda jelde belirgin düzeyde fragmentasyon görülür. Bu deneyde, CuB ve Gef’in tek başına ayrı ayrı ve birlikte uygulanması sonucu hücrelerde gözlenen DNA fragmentasyonu, agaroz jel elektroforezi ile de gösterilerek hücre ölümü belirleyici ELISA deney sonuçları ile uyumlu olup olmadığı araştırıldı. Deney sonucunda ajanların tek başına ve birlikte uygulandığı zaman hem HT-29 hem de HCT-116 hücrelerinde doza bağımlı olarak 93 kontrole göre ilgili dozlarda DNA fragmentasyonunun olduğu gözlendi (Şekil 24 ve 25). Şekil 24: HT-29 hücrelerinin Gef, CuB ve bu ilaçların birlikte kullanımı sonunda görülen DNA fragmentasyonunun %1.5’luk agaroz jeldeki görüntüsü Şekil 25: HCT-116 hücrelerinin Gef, CuB ve bu ilaçların birlikte kullanımı sonunda görülen DNA fragmentasyonunun %1.5’luk agaroz jeldeki görüntüsü 94 4.7. Aktif Kaspaz-3 Düzeyinin Belirlenmesi HT-29 ve HCT-116 hücreleri 24 saat süre ile farklı konsantrasyonlarda CuB, Gef ve bu ajanların birlikte uygulanması ile inkübe edildikten sonra, hücrelerde ilaca verilen apoptotik cevap sırasında oluşan aktif kaspaz-3 düzeyi ELISA yöntemi kullanılarak belirlendi. HT-29 hücrelerine Gef tek başına uygulandığı zaman, aktif kaspaz-3 miktarını kontrole göre 2 katın üstünde arttıran doz 24. saatte 50 μM iken, CuB tek başına uygulandığı zaman, aktif kaspaz-3 miktarını kontrole göre 2 katın üstünde arttıran doz yine aynı sürede 0,5 μM olduğu belirlendi. CuB+Gef kombinasyonu uygulandığı zaman, bu artışın 24. saatte 10 μM Gef + 0,0125 μM CuB konsantrasyonuna düştüğü bulundu. Sonuç olarak, CuB+Gef kombinasyonu uygulandığında belirlenen aktif kaspaz-3 miktarlarının, tek başına CuB ve tek başına Gef uygulandığı duruma göre daha yüksek olduğu gözlendi. Buna göre, HT-29 hücrelerinde, belirlenen aktif kaspaz-3 miktarının doza bağlı olarak artma eğiliminde olduğu belirlendi (p<0.05) (Grafik 12). 95 Grafik 12: HT-29 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen aktif kaspaz-3 oranları. *; p<0.05. HCT-116 hücrelerine, Gef tek başına uygulandığı zaman, aktif kaspaz-3 miktarını kontrole göre 2 katın üstünde arttıran doz 24. saatte 50 μM iken, CuB tek başına uygulandığı zaman, aktif kaspaz-3 miktarını kontrole göre 2 katın üstünde arttıran doz yine aynı sürede 10 μM olduğu belirlendi. CuB+Gef kombinasyonu uygulandığı zaman, bu artışın 24. saatte 10 μM Gef + 1 μM CuB konsantrasyonuna düştüğü bulundu. Aynı şekilde HCT-116 hücrelerine CuB+Gef kombinasyonu uygulandığı zaman belirlenen aktif kaspaz-3 miktarlarının, tek başına CuB ve tek başına Gef uygulandığı duruma göre yine daha yüksek olduğu gözlendi. Buna göre, HCT-116 hücrelerinde, bu ajanlar tek başına ve birlikte uygulandığında belirlenen aktif kaspaz-3 miktarlarının doza bağlı olarak arttığı belirlendi (p<0.05) (Grafik 13). Sonuç olarak, her iki hücre hattında da tek başına uygulamaya göre birlikte kullanımın kaspaz-3 aktivasyonunda daha etkili olduğu gözlendi (Grafik 12 ve 13). 96 Grafik 13: HCT-116 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen aktif kaspaz 3 oranları. *; p<0.05. 4.8. Gen İfade Düzeylerinin Kantitatif Değerlendirilmesi Bcl-2, Bax, Bak, Bad ve Siklin D1 genlerinin ifade düzeyinin kantitatif değerlendirilmesi için Light Cycler cihazı kullanıldı. HT-29 ve HCT-116 hücre hatlarından elde edilen cDNA’larda Bcl-2, Bax, Bak, Bad, Siklin D1 ve bu genlerin normalizasyonu için seçilen GAPDH genlerine özgül primerler ve UPL LNA probları kullanılarak çalışıldı. Bcl-2 geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren Real Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 26’da gösterildi. Şekil 26: Bcl-2 geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. Bcl-2 geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir. 97 Bax geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren Real Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 27’de gösterildi. Şekil 27: Bax geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. Bax geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir. Bak geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren Real Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 28’de gösterildi. 98 Şekil 28: Bak geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. Bak geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir. Bad geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren Real Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 29’da gösterildi. 99 Şekil 29: Bad geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. Bad geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir. Siklin D1 geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren Real Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 30’da gösterildi. Şekil 30: Siklin D1 geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. SiklinD geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir. GAPDH geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren Real Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 31’de gösterildi. 100 Şekil 31: GAPDH geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren amplifikasyon eğrileri. GAPDH geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir. Göreceli gen ifadesi sonuçları REST programı kullanılarak “Pfaffl” matematiksel yöntemi ile hesaplandı. Pfaffl eşitliği aşağıda belirtilmiştir. Eşitlikte belirtilen Ct, tepkime sırasında oluşan floresan sinyalin eşik değeri geçtiği andaki döngü sayısını ifade etmektedir. Ct değeri tepkimenin başında mevcut olan mRNA (cDNA) miktarı ile ters orantılıdır. ∆Ct değeri ise kontrol ile örneklerin Ct değerleri arasındaki farkı göstermektedir. Eşitlikte belirtilen E, PCR etkinliğini, elde edilen R ise ifade oranını göstermektedir. 101 4.9. Gen İfade Düzeylerinin Karşılaştırması 4.9.1. CuB ve Gef’in Bcl-2, Bax, Bak, Bad, ve Siklin D1 Genlerinin İfade Düzeylerine Etkisi HT-29 ve HCT-116 hücrelerine CuB ve Gef ayrı ayrı ve Gef + CuB kombine uygulanmasından sonra Bcl-2, Bax, Bak, Bad, ve Siklin D1 genlerinin ifade düzeylerinin doza bağlı olarak karşılaştırmalı değerlendirmeleri yapıldı. Bu genlerin mRNA ifade düzeylerini belirlemek için kantitatif Real-time PCR yöntemi kullanıldı. HT-29 hücrelerinde anti-apoptotik özellikteki Bcl-2 ve proliferasyonda rolü olan Siklin D1 mRNA ifade düzeylerinde 24 saat sonunda CuB’nin tek başına veya Gef ile birlikte uygulanmasından sonra anlamlı düzeyde azalma belirlendi (p<0.05). Kullanılan en yüksek doz olan 10 μM Gef + 0.5 μM CuB konsantrasyonunda Bcl-2 mRNA düzeyinin yaklaşık 2.6 kat azaldığı, Siklin D1 mRNA düzeyinin ise yaklaşık 7 kat azaldığı gözlendi (p<0.05). Apoptotik özellikte olan Bad, Bax ve Bak mRNA ifade düzeylerinde kontrole göre artış gözlendi. CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulanması sonucunda Bad ve Bax mRNA ifade düzeylerinin istatistiksel olarak anlamlı düzeyde arttığı belirlendi (p<0.05). Ayrıca tek başına Gef uygulanmasının ardından Bax mRNA düzeyinde de anlamlı bir artış olduğu gözlendi (p<0.05). Kullanılan en yüksek doz olan 10 μM Gef + 0.5 μM CuB konsantrasyonunda Bad mRNA düzeyinin yaklaşık 2.6 kat, Bax mRNA ifade düzeyinin ise yaklaşık 4 kat arttığı gözlendi (p<0.05) (Grafik 14). 102 Grafik 14: HT-29 hücrelerinin doza bağlı olarak Gef, CuB ve bu ajanların birlikte uygulanması sonrasında Bcl-2, Bad, Bax, Bak ve Siklin D1 mRNA düzeylerindeki değişiklik. Hedef genin ifade düzeyleri GAPDH mRNA ifade düzeyi temel alınarak normalize edildi. *; p<0.05. HCT-116 hücrelerinde anti-apoptotik özellikteki Bcl-2 ve proliferasyonda rolü olan Siklin D1 mRNA ifade düzeylerinde 24 saat sonunda CuB’nin tek başına veya Gef ile birlikte uygulanmasından sonra anlamlı düzeyde azalma belirlendi (p<0.05). Kullanılan en yüksek doz olan 10 μM Gef + 10 μM CuB konsantrasyonunda Bcl-2 mRNA düzeyinin yaklaşık 3.2 kat, Siklin D1 mRNA düzeyinin ise yaklaşık 6.3 kat azaldığı gözlendi (p<0.05). Apoptotik özellikte olan Bad, Bax ve Bak mRNA ifade düzeylerinde yine kontrole göre artış gözlendi. Ancak, CuB ve Gef’in sadece kombine uygulanması sonucunda Bad mRNA ifade düzeyinde istatistiksel olarak anlamlı bir artış gözlenirken, Bax ve Bak mRNA ifade düzeylerinin bu ilaçların hem tek başına hem de birlikte uygulanması sonucunda istatistiksel olarak anlamlı düzeyde arttığı gözlendi (p<0.05). Kullanılan en yüksek doz olan 10 μM Gef + 10 μM CuB konsantrasyonunda Bad ve Bax mRNA düzeyinin yaklaşık 1.9 kat, Bak mRNA düzeyinin ise yaklaşık 1.8 kat arttığı belirlendi (p<0.05) (Grafik 15). 103 Grafik 15: HCT-116 hücrelerinin doza bağlı olarak Gef, CuB ve bu ajanların birlikte uygulanması sonrasında Bcl-2, Bad, Bax, Bak ve Siklin D1 mRNA düzeylerindeki değişiklik. Hedef genin ifade düzeyleri GAPDH mRNA ifade düzeyi temel alınarak normalize edildi. *; p<0.05. 4.10. Protein İfade Düzeylerinin Karşılaştırması 4.10.1 Bcl-2, Bax, Bak, p27kip1 ve Siklin D1 proteinlerinin protein düzeyinde ifade düzeylerinin Belirlenmesi Western blot yöntemi için Bcl-2 antikoru, Bax antikoru, Bak antikoru, p27kip1 antikoru ve siklin D1 antikoru olmak üzere 5 farklı apoptotik ve proliferatif yolakta yer alan proteinlere ait antikor kullanılmıştır. HT-29 ve HCT-116 hücrelerine CuB’in tek başına ve Gef ile birlikte uygulandığında 24 saat sonunda pro-apoptotik özellikteki Bax ve Bak protein ifade düzeylerinde artış belirlenirken, anti-apoptotik özellikteki Bcl-2 protein ifade düzeylerinde azalma gözlendi. Özellikle HT-29 hücrelerinde Bax protein ifade düzeyindeki artışın kontrol ile karşılaştırıldığında oldukça belirgin bir düzeyde olduğu gözlendi. CuB’nin 104 tek başına ve Gef ile birlikte uygulamasından sonra proliferasyonda rolü olan Siklin D1 protein ifadelenme düzeyinde bir azalma gözlendi. p27kip1 protein ifadelenme düzeyinde ise ilaçların birlikte uygulaması sonucunda her iki hücre hattında da kontrole göre belirgin şekilde bir artış gözlendi (Şekil 32). Şekil 32: HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde 24 saat süreyle belirli dozlarda Gef, CuB ve bu ilaçların birlikte kullanılması sonucunda Bcl-2, Bax, Bak, p27kip1 ve Siklin D1 protein düzeylerini gösteren protein bantları 105 5. TARTIŞMA Tümör hücrelerinin gelişimini önleyen (anti-neoplastik) kemoterapötik ajanlar, sitotoksik etkileri ile tümör hücrelerinin büyüme ve çoğalmalarını baskılayarak apoptoza neden olurken, tümör hücrelerinin çevresindeki sağlıklı hücrelere verdikleri hasar ile bu hücrelerin de ölümüne yol açmaktadırlar 191,231 . Sağlıklı hücreler üzerinde en düşük sitotoksik etkiye sahip olan kemoterapötik ajan arayışı, araştırmaları bitkilerden elde edilen doğal bitkisel ilaçlara yönlendirmiştir. Alternatif ve tamamlayıcı tıpta en çok kullanılan ürünler olan bu bitkisel ilaçlar, yüzyıllardır anti-kanser ajanlar olarak kullanılmaya devam etmektedir 193 191- . Ayrıca, çoklu ilaçlarla kombinasyon terapisi, toksisiteyi azaltmak ve sinerjik etkiyi uygulanmaktadır arttırmak 191-193,232 için kanser tedavisinde yaygın olarak . Bu amaç doğrultusunda çalışmamızda, anti- neoplastik etkili ve doğal bitkisel bir ürün olan CuB’nin tek başına ve antineoplastik bir ajan olan Gef ile birlikte kolon kanser hücreleri üzerindeki apoptotik ve anti-proliferatif etkileri araştırıldı. Bitkilerde doğal olarak bulunan fitokimyasalların, kanserin görülme sıklığını azaltarak kanser tedavisinde, özellikle tamamlayıcı tedavide önemli yeri olduğu yapılan çalışmalarla desteklenmektedir 235 231,233- . Kukurbitasinler, doğada bol bulunan ve yaygın olarak kullanılan fitokimyasallardır 193-196 . Kukurbitasin ailesinin bir üyesi olan CuB’nin çeşitli insan kanser hücre hatlarında ve ksenograft tümör modellerinde apoptotik ve anti-proliferatif etki göstererek tümör büyümesini inhibe ettiği ve çeşitli anti-kanser ajanlarla gösterilmiştir 203,205,207,209-214,236-241 JAK-STAT sinyal etkisini iletim arttırabildiği yapılan çalışmalarda . CuB’nin tümör önleyici mekanizması yolağını durdurmasının yanı sıra, hücre döngüsünün bozulması, apoptoz uyarımı, hücre iskeletinin bozulması ve farklılaşma da dahil olmak üzere çeşitli etkileri içerir 210-212,241 . CuB’nin büyümeyi önleyici etkisi, JAK/STAT yolağının inhibisyonu ile artan apoptoz 106 ve G2/M faz kontrol noktası ile ilişkilidir 215,216,241,242 . Bu nedenle, CuB agresif kanser türleri için yeni bir tedavi stratejisi sağlar. Bununla birlikte, CuB’nin HT-29 ve HCT-116 insan kolon karsinoma hücrelerine karşı etki mekanizması ile ilgili herhangi bir çalışma halen yapılmamıştır. Yaptığımız literatür araştırması sonucunda kolon kanseri olgularının çoğu adenokarsinoma olduğundan bu konuda yapılan çalışmalarda daha çok HT-29 ve HCT-116 kolon adenokarsinoma hücre hatlarının tercih edildiği görülmektedir 243 . HT-29 ve HCT-116 hücreleri benzer morfolojiye sahip olsalar da, genetik profilleri birbirinden oldukça farklıdır. HT-29 hücrelerinde p53 geni mutasyona uğramış ve inaktif iken, HCT-116 hücrelerinde p53 geni mutasyona uğramamış ve aktiftir 244 . Bu nedenle HCT-116 hücreleri apoptotik uyarılmaya karşı HT-29 hücrelerine göre daha duyarlıdır. Ayrıca HT-29 hücrelerinde Ras proto-onkogeni normal ve inaktif iken, HCT-116 hücrelerinde mutant ve aktiftir 245 . Bunun yanı sıra bu hücrelerin çalışmadaki önemi, kolonik epitelyum yapının pek çok özelliğini göstermeleridir 246 . Bu amaçla çalışmamızda kolon kanser modeli olarak HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin her ikisi de kullanılmıştır. Çalışmamızda, HT-29 ve HCT-116 hücrelerine CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulanması sonucunda, doza ve zamana bağlı olarak hücre canlılık oranlarında azalmaya neden olduğunu belirledik. Buna göre tek başına CuB uygulandığında her iki hücre hattında, hücrelerin yarısını öldürmek için gerekli olan IC50 dozunun zamana bağlı olarak azaldığı bulundu. Buna göre HT-29 hücrelerinde IC50 dozu 24. Saatte 10 μM iken, 48. saatte ise 5 μM olduğu belirlenirken, HCT-116 hücrelerinde ise 24. saatteki IC50 dozu yaklaşık 80 μM iken, 48. Saatte yaklaşık 50 μM olduğu belirlendi (Grafik 2). CuB’nin Gef ile birlikte uygulandığında hücre canlılık oranlarında daha belirgin bir azalmanın meydana geldiği gözlendi. Buna göre, HT-29 hücrelerinde 24 saatlik CuB + Gef uygulamasında IC50 değerinin 10 μM Gef + 0,5 μM CuB 107 birlikteliğinde, HCT-116 hücrelerinde ise 24 saatlik CuB + Gef uygulaması için IC50 değerinin 10 μM Gef + 10 μM CuB uygulamasında görüldü (Grafik 3). Bu verilerden yola çıkarak CuB’nin Gef ile birlikte uygulanmasının hücreleri CuB’e daha duyarlı hale getirdiğini söyleyebiliriz. Sonuçlarımızla uyumlu olacak şekilde çeşitli kanser hücre hatlarının kullanıldığı çalışmalarda CuB’in bu hücreleri farklı ajanlara ve klasik kemoterapi ilaçlarına duyarlı hale getirdiği gösterilmiştir 200,207,212,247-251 . Yapılan çeşitli in-vitro çalışmalarda da kolon kanser hücreleri üzerine etkili olduğu gösterilen CuB, değerlendirilmiştir yeni 247,252 anti-kanser ajan olarak klinik açıdan . Bu çalışmalardan birinde, Yasuda ve ark. SW480 kolon kanser hücrelerinde CuB’nin uygulandığında, SW480 hücrelerine 20, 40 ve 80 nM dozlarda 24, 48 ve 72 saat süre ile CuB uygulandığında; 20 nM doz için hücre canlılık oranı yaklaşık % 80 civarında iken, 40 ve 80 nM dozları için bu oranın yaklaşık % 65 olduğunu belirtmişlerdir 247 . Bir diğer çalışmada ise Caco-2 kolon kanser hücrelerinde CuB’nin etkisi araştırıldığı zaman, 1, 5, 10, 50, 100 ve 150 μM artan dozlarda CuB uygulandığında 48 saatlik inkübasyonun sonunda canlılık oranının doza bağlı bir şekilde azaldığı, dolayısı ile apoptotik etkinin doza bağlı olarak arttığı belirlenmiştir 254. CuB’nin kolon kanser hücreleri üzerine olan etkisini araştıran çalışmalar bu iki çalışma ile sınırlı olmakla birlikte, literatürde hepatoma 249,253 252,260 203,248 , lösemi , osteosarkoma 254 211,239 , lenfoma , gırtlak 211 207,213,255,256 , glioblastoma , meme 210 , melanoma 209,236,257-259 ve akciğer kanseri gibi çeşitli kanser hücre hatları ile yapılan çalışmalar da mevcuttur. Sonuçlarımız ve yapılan birçok çalışma arasındaki doz ve zaman farklılıkları, farklı kanser hücre hatlarının kullanılmasından, başlangıçta kültür kaplarına ekilen hücre sayısının ve deney ortamının farklı olmasından, çalışmalarda kullanılan HT-29 ve HCT-116 hücre hatlarının pasaj sayılarının farklılığından ve hücrelerin apoptoza giderken kullanmış olabileceği yardımcı farklı moleküler mekanizmaların varlığından ileri gelebilir. Ayrıca bu çalışmalardan elde edilen hücre canlılık oranları ve apoptotik değerler sadece tek bir analiz yönteminin sonucu olarak 108 verilmiştir. Chen ve ark. Duangmano ve ark. ve ark. 248 257 251 , Yasuda ve ark. 247 , Chan ve ark. sadece akım sitometrisini, Zhang ve ark. , Lee ve ark. 254, Dakeng ve ark. 259 253 239,261 , , Zhou , Duangmano ve ark. 258 ve Kongtun ve ark. 252 ise sadece MTT analizi sonuçlarının canlılık değerlerini kullanmışlardır. Elde edilen bu verilerin MTT analizi, LDH analizi, DNA Fragmentasyon analizi ve hücrelerin florösan mikroskobunda morfolojik açıdan değerlendirilmesi gibi birbirini doğrulayabilecek nitelikte olan yöntemlerle desteklenmemesi de bu çalışmalar için bir dezavantaj olabilir. Bizim çalışmamızda ise, HT-29 ve HCT-116 hücrelerine CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulanması sonrasında, hücre canlılık oranları ve hücrelerin apoptoza yöneldiğine dair elde ettiğimiz değerler MTT analizi, AO/EtBr ile hücrelerin florösan mikroskobunda morfolojik açıdan değerlendirilmesi, besiyerine salınan LDH miktarının belirlenmesi, kalitatif ve kantitatif DNA Fragmentasyon analizi, BrdU ELISA yöntemi, aktif kaspaz-3 ELISA yöntemi ile de doğrulanmıştır. CuB ile yapılan araştırmalar sadece kanser hücre kültürleri ile sınırlı kalmayıp, hayvan kanser modellerinde de çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmalarda da CuB’nin tek başına veya diğer anti-kanser ajanlar ile birlikte kullanımının tümör hücrelerinin sayısını azalttığı gösterilmiştir 203,207,212-214,238,239,241,250,254 . Hayvan modellerinde CuB tek başına veya bir başka anti-kanser ajan ile birlikte uygulandığında melanoma, osteosarkoma, hepatoma, pankreas, larinks tümörlerinin büyüklüğünü azaltmaktadır 203,212,250,253,254,256,261,262 . Bir molekül tek başına uygulandığı zaman, kanser hücrelerinin ortadan kaldırılma ihtimali daha düşük olduğu için, günümüzde kanser tedavisinde birden fazla sayıda ajan içeren tedavi rejimleri uygulanmaktadır 203,207,212-214,253,254 . Benzer şekilde farklı fare tümör modellerinde methotrexate, docetaxell, gemsitabin, AG490, MG132 ve N-acetyl-L-cysteine gibi ajanların CuB’nin de dahil olduğu çeşitli kukurbitasinlerin daha etkili olmasına neden olduğu gösterilmiştir 200,203,207,212-214,250,263 . Bu durum kukurbitasinlerin standart 109 kemoterapötikler ile birlikte kullanıldığı zaman hastalığın kontrol altında tutulmasında daha yararlı olabileceğini göstermektedir. Biz de tez çalışmamızda bu verilerle benzer şekilde CuB’nin, Gef ile birlikte uygulandığında HT-29 ve HCT-116 hücreleri üzerine olan etkisinin, CuB’nin tek başına kullanılmasına oranla arttığını belirledik. Çalışmamızda HT-29 ve HCT-116 hücrelerine, CuB’in tek başına ve Gef ile birlikte uygulanması sonrasında belirlenen hücre canlılık oranlarındaki azalmanın altında yatan moleküler mekanizmanın, apoptozdan mı yoksa nekrozdan mı kaynaklı olduğunu belirlemek için hücreler öncelikle AO/EtBr ile boyanarak floresan mikroskobunda incelendi (Şekil 22 ve 23). Buna göre HT-29 ve HCT-116 kolon kanser hücrelerinin yüksek CuB konsantrasyonlarında ve düşük CuB+Gef kombinasyonunda apoptoza daha çok yöneldiği belirlendi (Grafik 4 ve 5). Elde edilen bulgular, apoptoz üzerine en etkili CuB dozunun HT-29 hücreleri için 24. saatte 0,5 µM konsantrasyonunda olduğu, HCT-116 hücreleri için 24. saatte 40 µM konsantrasyonunda olduğu ve her iki hücre hattında da CuB’nin Gef ile birlikte uygulandığında, aynı doz ve sürede daha etkin olabileceğini gösterdi. Diğer yandan, CuB, bulgularımızla paralellik gösterecek 191,237,252,260,264 şekilde düşük sitotoksik etkiye sahiptir . Bu bulguların doğruluğu besi yerine salınan LDH miktarının belirlenmesi ile test edildi. Hipoksik durumlarından dolayı kanser hücreleri, enerji için anaerobik glikolize bağımlıdırlar. Dolayısıyla kanser hücrelerinde, anaerobik glikolizin son basamağı olan laktatın pirüvata çevrimi için gerekli olan laktat dehidrogenaz enziminin sitoplazmadaki miktarında artış görülmektedir. Çalışmamızda, HT-29 ve HCT-116 hücreleri için en etkili apoptoz dozları olarak belirlenmiş olan CuB dozlarının Gef ile birlikte uygulanması sonrasında oluşan sitotoksik etki LDH düzeyinde kontrole göre anlamlı bir artış ile doğrulandı. LDH testine göre düşük ilaç konsantrasyonlarında hücrelerde gözlenen ölüm nedeninin 110 nekroz olmadığı, hücre kültür ortamına salınan LDH miktarının az olması ile meydana geldiği belirlendi (Grafik 6 ve 7). CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikteliğinin hücre çoğalması üzerine olan etkisi, BrdU ELISA yöntemiyle de belirlendi. Bu yöntemde hücre kültür ortamına eklenen BrdU DNA sentezi gerçekleşen hücrelerin DNA’sına katılmaktadır. Daha sonra BrdU’ya özgü olan antikorlar ile muamele edildiğinde DNA’ya katılmış olan BrdU miktarı replikasyon geçiren hücrelerin oranını yansıtmaktadır 265,266 . BrdU ELISA deneyinin sonuçlarına göre, CuB’nin her iki hücrenin çoğalma oranını doza bağlı olarak azalttığı belirlendi. Buna göre kontrol ile karşılaştırıldığında 24. saatte DNA sentez oranındaki en yüksek azalmanın HT-29 hücreleri için %62,7 ile 0,5 μM CuB ve HCT-116 hücreleri için %60 ile 40 μM CuB dozunda olduğu görüldü. CuB+Gef uygulamasında ise bu oranların daha da azaldığı belirlendi (HT-29 için; 24 saat CuB+Gef için %56,7; HCT-116 için; 24 saat CuB+Gef için %53,2) (Grafik 8 ve 9). Yapılan çalışmalarda CuB’nin hücre döngüsünü çeşitli aşamalarda durdurabildiği gösterilmiştir. Örneğin, Yasuda ve ark. kolon kanser hücre hattı olan SW480 hücrelerine 24 ve 48 saat süre ile 20, 40 ve 80 nM artan konsantrasyonlarda CuB uygulandığı zaman, kolon kanser hücrelerini hücre döngüsünün G2 fazında durduğu belirlenmiştir 247 . Yine bir başka bir çalışmada ise, SKBR- 3 ve MCF-7 meme kanser hücrelerine 50-100 μM konsantrasyonlarında CuB, 24 ve 48 saat uygulandıktan, hem 24. hem de 48. saatte G2/M geçişinin engellendiği gösterilmiştir 259 . Bir başka çalışmada da pankreas kanser hücre hattı olan PANC-1 hücrelerine 0.1, 0.3 ve 1 μM artan konsantrasyonlarda CuB uygulandığında hücrelerin G2 fazında biriktiği ve M aşamasına giren hücre sayısının azaldığı bildirilmiştir 240 . Bu çalışmalara ek olarak meme, pankreas, hepatoma, deri ve larinks kanser hücre hatları ile yapılan çalışmalarda hücrelere değişen konsantrasyonlarda CuB uygulandığı zaman hücre döngüsünü S ve G2/M fazlarında durdurduğu gösterilmiştir 207,213,257,258,261 . Bu sonuçlarla uyumlu 111 olacak şekilde CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulandığında DNA sentez fazına giren HT-29 ve HCT-116 hücre sayısının azaldığı bulunmuştur. Ancak çalışmamızda hücrelerin fazına girme S kullandığımız yüzdesini yöntem sadece belirlediğinden dolayı hücre döngüsünün hangi aşamada durduğunun anlaşılması için akım sitometrisi kullanılarak hücresel DNA içeriğinin belirlenmesi daha kesin bir bilgiye ulaşmamızı sağlayabilir. Programlanmış hücre ölümünde genel olarak kromatin yoğunlaşarak çekirdek zarının altında birikir, DNA’nın fragmentasyonu, hücrenin küçülmesi ve tomurcuklanması görülmektedir 128 . Ancak bazı durumlarda DNA fragmentasyonu olmadan da apoptozun meydana gelebileceği bildirilmiştir görülen apoptotik 267-269 . Bu nedenle floresan mikroskobunda hücrelerdeki DNA fragmentasyonunun varlığının araştırılması amacıyla HT-29 ve HCT-116 hücrelerine CuB ve Gef uygulanan hücrelerde oluşan DNA fragmentasyonunun varlığı hem hücre ölümü belirleyici ELISA yöntemi ile kantitatif olarak (Grafik 10 ve 11), hem de hücrelerden elde edilen genomik DNA’nın agaroz jelde yürütülmesi ile kalitatif olarak (Şekil 24 ve 25) araştırıldı. Buna göre CuB’in tek başına ve Gef ile birlikte uygulandığında DNA fragmentasyonuna neden olduğu ve iki ilacın kombinasyonunun daha fazla DNA parçaları oluşturduğu belirlendi. Çalışmamızla benzer şekilde uygulanan farklı anti-kanser ajanların HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde de DNA fragmentasyonunun gerçekleştiği gösterilmiştir 270-275. Apoptoza uğrayan hücrelerde DNA fragmentasyonunun gerçekleşebilmesi için kaspaz-3 enziminin aktifleşerek bir endonükleaz olan CAD molekülünü aktif hale getirmesi gerekmektedir. Aktifleşen bu endonükleaz ise nükleozomlar arasından DNA’yı parçalara ayırarak fragmentasyona neden olmaktadır 276,277 . CuB ve Gef uygulanan HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde gördüğümüz DNA fragmentasyonunun ve apoptotik 112 olayların yıkım fazının başlatıcısı konumunda olan kaspaz-3’ün aktivitesini araştırmak amacıyla, hücrelerdeki aktif kaspaz-3 miktarı ELISA yöntemi ile araştırıldı. Bunun sonucunda CuB’nin, Gef’in ve kombine grupların her iki hücre hattına uygulanması sonucunda, ilaç uygulanmamış kontrol hücrelerine oranla doza bağımlı olarak aktif kaspaz-3 enzim düzeyinde artış olduğu belirlendi (Grafik 12 ve 13). İçsel ve dışsal apoptotik yolaklarda kaspazlar arasında hücre ölümünün doğrulanmasında en önemli role sahip olan kaspaz-3 aktivitesinde gözlemlenen protein düzeyindeki bu artış, HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin apoptoza giderken p53’ten bağımsız bir yolak izlediğini ve hücre ölümünün kaspaz kaskadını kullanarak apoptozdan kaynaklandığını gösterdi. Kukurbitasinlerin kanser hücre hatları üzerindeki etkilerini araştıran çalışmalara bakıldığında, hücre tipine özgü apoptotik cevap gözlenmektedir. Örneğin Boykin ve ark.’larının yaptıkları bir çalışmada kukurbitasin IIa’nın hepatoma, akciğer ve prostat kanser hücrelerinde (H22, NCI-H1299, PC-3, CWR22Rv-1) kaspaz-3 aktivasyonuna neden olarak apoptoza yol açtığı bildirilmiştir 278 . Yine yapılan başka bir çalışmada, kukurbitasinlerin bir türevi olan 23,24Dihydrocucurbitacin B (DHCB)’e maruz bırakılan Bcap37 meme kanser hücrelerinde gerçekleşen apoptotik cevapta kaspaz 3 aktivasyonu olduğu bildirilmiştir 279. Çalışmamız, diğer kanser hücre hatları üzerine CuB’nin apoptotik sürece olan etkilerini gösteren çalışmalar 200,203,212,213,250,253,261,262 ile paralellik göstermektedir. Ayrıca, CuB’nin diğer anti-kanser ajanlar ile birlikte kullanımı sonucunda, CuB’nin tek başına kullanıldığında göstermiş olduğu apoptotik etkiden daha fazla artış meydana geldiği yapılan çeşitli çalışmalar ile de gösterilmiştir 200,203,212,213,250,253 . Bu sonuçlar, CuB’nin diğer kemoterapötik ajanlarla beraber kullanılmasının en etkili doz ve süreye ulaşmada, tek başına kullanılmasına göre çok daha yararlı olabileceğini göstermiştir. HT-29 ve HCT-116 hücre hatları üzerine apoptotik etkileri belirlenen birçok fitokimyasal bulunmaktadır 231,275,280-284 . 113 Ancak, şimdiye kadar HT-29 veya HCT-116 hücrelerine CuB’nin uygulanmasına ilişkin literatürde hiçbir çalışmaya rastlanılmamıştır. HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde gözlenen apoptozun moleküler mekanizmalarını ortaya çıkartmak için CuB, Gef ve kombine olarak uygulanan ve uygulanmayan her iki hücrede de apoptoz ile ilişkili olduğu bilinen Bcl-2, Bax, Bak ve Bad genlerinin ve hücre döngüsünün G1/S fazının kontrol noktasında görev alan siklin D1 geninin ifade düzeyleri kantitatif Real Time PCR yöntemi ile araştırılırken, Bcl-2, Bax ve Bak proteinlerinin ve siklin D1 ve hücre döngüsü inhibitörlerinden biri olan p27kip1 proteinlerinin ifade düzeyleri Western Blot yöntemi ile araştırıldı. Hücreler apoptotik bir uyarı ile karşılaştıkları zaman içsel ve dışsal apoptotik yolaktan biri aktive olur 116-119 . İçsel yolakta görevli olan Bcl-2 protein ailesi, apoptozun düzenlenmesinde önemli bir role sahiptir. Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-l gibi anti-apoptotik proteinler apoptozu inhibe eder iken, Bax, Bak, Bad gibi pro-apoptotik proteinler apoptozu uyarmaktadırlar 116-118 . Bu bilgiler ışığında anti-apoptotik protein Bcl-2 ve pro-apoptotik proteinler Bax, Bak ve Bad mRNA’larının düzeylerini belirlemeye yönelik yaptığımız deneylerin sonuçlarına göre; HT-29 hücrelerine CuB’in tek başına ve Gef ile birlikte uygulanmasını takiben Bcl-2 mRNA düzeyinde görülen azalma ile ve Bax ve Bad mRNA düzeylerinde görülen artışın istatistiksel açıdan anlamlı olduğu bulundu (p<0.05). Ancak Bak mRNA miktarında görülen artışın ise istatistiksel açıdan anlamlı olmadığı belirlendi (p>0.05) (Grafik 14). HCT-116 hücrelerinde ise; Bcl-2 mRNA düzeyinde görülen azalmanın ve Bax, Bak ve Bad mRNA düzeylerinde görülen artışın istatistiksel açıdan anlamlı olduğu belirlendi (p<0.05) (Grafik 15). Anti-apoptotik protein Bcl-2 ve pro-apoptotik proteinler Bax ve Bak proteinlerinin ifade düzeylerini belirlemeye yönelik yaptığımız Western Blot deneylerinin sonuçlarına göre ise; her iki hücre hattına CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulanmasını takiben Bcl-2 protein ifade düzeyinde azalma görülürken, Bax ve Bak protein ifade düzeylerinde artış belirlendi (Şekil 32). CuB’nin, 114 HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde Bcl-2, Bax, Bak ve Bad genlerinin mRNA ve protein ifade düzeylerine olan etkisi ile ilgili herhangi bir çalışmaya literatürde rastlamamakla birlikte, Thoennissen ve ark. PL45, ve Panc-1 pankreatik kanser hücrelerinde, PANC-1 pankreas kanseri hücrelerinde karsinoma hücrelerinde, Liu ve ark. hücrelerinde yapmış oldukları ve 212 Zhang ve ark. HepG2 207,213,255,256 MiaPaCa-2, 240 hepatoselüler Hep-2 larinks kanser çalışmalarla, CuB’nin uygulaması sonrasında doza bağımlı olarak Bcl-2 ve Bcl-xL protein düzeylerinde belirgin bir azalma olduğunu belirtmişlerdir. Buna karşın SW480 kolon kanser hücrelerinde yapılan bir çalışmada, CuB’nin etkisi ile gerçekleşen apoptoz moleküler seviyede incelendiğinde 20-80 nM CuB uygulanan kolon kanser hücrelerinde 24 ve 48 saat sonra Bcl-2 ve Bcl-xL protein düzeylerinde belirgin bir değişiklik gözlenmedi sıra Shi ve ark. 213 247 . Bu çalışmaların yanı SU-DHL-1 ve Karpas 299 anaplastik büyük hücre lenfoma (ALCL) hücrelerinde, Su ve ark. hücrelerinde ve Tseng ve ark. 285 263 A172 ve U251 glioblastoma ATC-CD133+ anaplastik tiroid kanser hücrelerinde yapmış oldukları çalışmalarla, kukurbitasin I uygulaması sonrasında doza bağımlı olarak Bcl-2 ve Bcl-xL mRNA ve protein miktarlarında belirgin bir azalma olduğunu belirtmişlerdir. Ayrıca, kukurbitasin D ve E türevlerinin Bcl-2, Bcl-xL ve Mcl-1 protein düzeylerine olan etkisine ilişkin başka çalışmalar da bulunmaktadır 286,287 . Bulgularımız bu çalışmalar ile paralellik göstermektedir. mRNA ve protein ifadelenme düzeyinde bulduğumuz bu sonuçlar, CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulamasından sonra görülen apoptotik etkide Bcl-2 protein ailesi üyelerinin anahtar rol oynadığını göstermektedir. Buradan yola çıkarak HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde görülen apoptotik cevapta içsel apoptotik yolağın aktive olduğunu söyleyebiliriz. Siklinler, hücre döngüsünün çeşitli fazlarını aktive eden spesifik proteinlerdir. D-tipi siklinlerden Siklin D1, CDK4 ve CDK6’ya bağlanarak onları aktive eder ve G1 fazının S fazına ilerleyişinden 115 sorumludur 156,288 . Cip/Kip ailesi üyesi olan p27Kip1 CDKI, siklin-CDK 164 kompleksine bağlanarak kinaz aktivitesini engeller . Bu bilgilere dayanarak, çalışmamızda HT-29 ve HCT-116 hücrelerine CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulanmasını takiben siklin D1 mRNA düzeyinde görülen azalmanın istatistiksel açıdan anlamlı olduğu bulundu (p<0.05) (Grafik 14 ve 15). Yine her iki hücre hattına CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulanmasını takiben Siklin D1 protein ifade düzeyinde belirgin bir azalma görülürken, p27kip1 protein ifadelenme düzeyinde her iki hücre hattında da kontrole göre bir artış belirlendi (Şekil 32). CuB’nin, HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde siklin D1 ve p27kip1 genlerinin mRNA ve protein düzeylerine olan etkisi ile ilgili bir çalışmaya literatürde rastlamamakla birlikte, farklı hücre hatları ile yapılan diğer çalışmalar ile sonuçlarımız paralellik gösterdi. Dakeng ve ark. 259 , SKBR-3 and MCF-7 meme kanser hücrelerine, Duangmano ve ark. 257 , MDA-MB-231, MCF7:5C, SKBR-3 meme kanser hücrelerinde, Zhang ve ark. pankreas kanseri hücrelerinde ve Li ve ark. 287 240 , PANC-1 , HL-60 akut miyeloblastik lösemi hücrelerinde CuB uygulaması sonrasında siklin D1 protein düzeyinde azalma, p21 ve p27kip1 protein düzeylerinde anlamlı bir artış belirlemişlerdir. Bulgularımız CuB'nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulanmasının in vitro olarak anti-kanserojenik etki gösterdiğini ortaya çıkarmıştır. Bu durum HT-29 ve HCT-116 kolon kanser hücrelerinde büyümenin baskılanması ve apoptozun uyarılması ile gösterilmiştir. CuB ve Gef’in kombine bir şekilde kullanılması ise sinerjistik bir etki göstermiş olup, CuB’nin tek başına gösterdiği apoptotik orandan daha yüksek bir değer elde edilmiştir. Sonuç olarak çalışmamız, HT-29 ve HCT-116 insan kolon kanseri hücre hatlarında CuB'nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulanması sonucu apoptozu uyarıcı ve proliferasyonu baskılayıcı özelliğini gösteren 116 ilk çalışmadır. Ayrıca, Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve p27kip1 mRNA ve protein düzeyleri ile ilgili elde ettiğimiz bulgular ve p53 mutant HT-29 ve p53 yabanıl tip HCT-116 hücrelerinin kullanılmış olması, CuB’nin apoptotik süreçte p53’den bağımsız olarak içsel apoptotik yolağı uyardığını göstermektedir. Çalışmamız, CuB’nin, Gef gibi kanser tedavisinde kullanılan anti-neoplastik ajanlarla birlikte uygulanmasının, kanser hücrelerinin apoptoza yönelmesinde gerekli olan etkin doz ve süreyi azaltabileceği doğrulanmıştır. 117 6. SONUÇ Bu tez çalışmasında CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte doza ve zamana bağımlı olarak kullanımları sonucunda kolon kanser hücre hatları olan HT-29 ve HCT-116 hücreleri üzerine olan etkilerini araştırdık. İlaç uygulaması sonunda 24. saatte hücre kültürleri sonlandırılarak hücrelerin canlılık, nekroz ve apoptotik oranları uygun yöntemler kullanılarak belirlendi. Ayrıca, CuB ve Gef’in DNA fragmentasyonu, DNA sentezi ve kaspaz aktivasyonuna olan etkileri araştırıldı. Buna ek olarak araştırmamızda, ilaçların HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde apoptoz ve hücre proliferasyonu ile ilişkili olan genlerin ve proteinlerin ifadesi üzerine etkisi Real-time PCR ve Western Blot yöntemleri kullanılarak araştırıldı. HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde Gef ve CuB’nin ayrı ayrı uygulandıkları zaman hücre çoğalmasını engelleyerek hücreleri apoptoza yönlendirdikleri belirlendi. Ancak Gef ve CuB’nin birlikte uygulanması sonrasında apoptoz oranı, DNA sentez oranı, kaspaz-3 aktivasyon miktarı, DNA fragmentasyon miktarı ve apoptotik ve proliferatif genlerin ve proteinlerin ifadelerindeki değişiklikler daha fazla artış gösterdi. Ayrıca yaptığımız bu tez çalışması sonucunda ilaç uygulanan hücrelerde içsel yolakta görev alan ve anti-apoptotik bir gen olan Bcl-2 mRNA miktarının azalışının ve proapoptotik genler olan Bax, Bak, Bad mRNA miktarlarının artışının istatiksel açıdan anlamlı olması (p<0.05), yine hücre proliferasyonunda görevli bir gen olan Siklin D1 mRNA düzeyinde anlamlı azalmanın görülmüş olması (p<0.05) ise hücrelerde içsel apoptotik yolağın aktifleştini ve hücresel proliferasyonu baskıladığını ortaya çıkardı. Bu durum hücrelerde Bcl-2, Siklin D1 protein düzeylerinin azaldığının, buna karşılık Bax, Bak ve p27kip1 protein düzeylerinin arttığının bulunmasıyla doğrulandı. 118 Fizyolojik bir süreç olan apoptoz, inflamasyona neden olmadığından ve çevre dokulara zarar vermediğinden kanser tedavisinde tercih edilen bir yöntemdir. Çalışmamız, HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde CuB’nin Gef etkisi ile 24 saatte düşük doz konsantrasyonlarda hücre ölümünün tetiklenebildiğini ve hücre proliferasyonunun baskılanabildiğini göstermektedir. Sonuç olarak, yapılacak in vitro ve in vivo çalışmalar ile CuB’nin, Gef gibi anti-neoplastik ajanlar ile düşük dozlu birliktelikleri sonucunda HT-29, HCT-116 ve diğer kolon kanser hücre hatları üzerine olan potansiyel kanser önleyici etkisinin belirlenmesi, daha etkin tedavi seçeneklerinin geliştirilmesine olanak sağlayacağı gibi, bu molekülün uyardığı ya da baskıladığı sinyal yolaklarının tanımlanması, bu yolaklara özgül olabilecek yeni moleküllerin tasarlanmasına ve kolon kanseri tedavisinde daha başarılı yaklaşımların ortaya çıkmasına olanak sağlayacaktır. 119 7. ÖZET Kolon Kanser Hücre Hatlarında Reseptör Tirozin Kinaz Ve JAK-STAT İnhibitörlerinin Apoptotik Ve Anti-Proliferatif Etkilerinin Araştırılması Kolon kanseri, dünyada kadın ve erkeklerde ölüme neden olan en yaygın 4. kanser tipidir. Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü (EGFR), kolorektal kanser olgularında sıklıkla ifade edilmekte olan bir tirozin kinaz (TK) reseptörüdür. Gefitinib (Gef), EGFR’nün hücre içi TK bölgesinin ATP bağlanma yerine bağlanan, oral olarak aktif TK inhibitörüdür. JAK-STAT gibi EGFR ile ilişkili sinyal yolakları kanser gelişiminde önemli bir rol oynar. Triterpenoid bir bileşik olan Kukurbitasin B (CuB), güçlü anti-tümör aktivitesi ile JAK-STAT sinyal yolağının seçici ve kuvvetli bir inhibitörüdür. Bu çalışmada, CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte kullanımının HT-29 ve HCT-116 kolon kanser hücre hatları üzerine olan apoptotik ve anti-proliferatif etkilerini araştırmayı amaçladık. Çalışmamızda, p53 mutant HT-29 ve p53 yabanıl tip HCT116 insan kolon adenokarsinom hücre hatlarında, çeşitli doz ve inkübasyon sürelerinde, CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulanması sonrasında, MTT yöntemi, AO/EtBr boyaması ve BrdU ELISA yöntemleriyle hücre canlılığı belirlendi. Apoptotik oran LDH, DNA Fragmentasyon ve Kaspaz-3 ELISA yöntemleri kullanılarak değerlendirildi. Apoptotik ve proliferatif sinyal iletim yolaklarında görev alan Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve p27kip1 genlerinin mRNA ve protein ifade düzeylerinin belirlenmesi için kantitatif Real-Time PCR ve Western Blot yöntemleri kullanıldı. 120 Sonuçlarımız CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte kullanılmasının doza bağlı olarak her iki hücre hattında apoptotik cevaba neden olduğunu gösterdi. Aynı zamanda, CuB’nin apoptotik etkisinin Gef varlığında daha da arttığını belirledik. Bu bulgular, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, apoptotik ve anti-proliferatif genlerin ve proteinlerin, sırasıyla mRNA ve protein ifade düzeylerindeki uygun değişimlerin olması ile doğrulandı. Elde ettiğimiz veriler, CuB’nin kolon kanser tedavisinde potansiyel anti-neoplastik ajan olarak yararlı olabileceğini düşündürmektedir. Sonuç olarak çalışmamız, JAK/STAT yolağı hedefli kanser tedavisinde, CuB’nin kemoterapötik ajanlarla birlikte kullanılmasının, uygun apoptotik ve anti-proliferatif etkiye düşük doz ve sürede ulaştırabilmesine bağlı olarak, klinik açıdan yararlı olabileceğine dikkat çekmektedir. Buna ek olarak, kukurbitasinlerin moleküler etkilerinin tam olarak belirlenmesi kolon kanser tedavisi için yeni moleküler hedeflerin tanımlanmasına olanak sağlayacaktır. Anahtar kelimeler: Kukurbitasin B, Gefitinib, HCT-166 hücre hattı, HT-29 hücre hattı, Real-time PCR, Western Blot 121 8. SUMMARY Investigation of the Apoptotic and Anti-Proliferative Effects Of Receptor Tyrosine Kinase and JAK/STAT Pathway Inhibitors in Colon Cancer Cell Lines Colon cancer is the fourth most common cause of cancer death in men and women in the world. The Epithelial Growth Factor Receptor (EGFR) is a tyrosine kinase (TK) receptor that is frequently overexpressed in colorectal cancer. Gefitinib (Gef) is an orally active inhibitor of TK that targets the ATP binding site of the intracellular TK domain of EGFR. The EGFR-associated signaling pathways, such as JAK-STAT, play an important role in cancer development. Cucurbitacin B (CuB) is a triterpenoid compound, which is a potent and selective inhibitor of JAK-STAT signaling pathway with potent antitumor activity. In this study, we aimed to investigate the apoptotic and anti-proliferative effects of CuB as a single agent and in combination with Gef on HT-29 ve HCT116 colon cancer cell lines. In our study, cell viability was identified in the p53 mutant HT29 and p53 wild type HCT-116 human colon adenocancer cell lines by MTT assay method and AO/EtBr staining and BrdU ELISA methods, for different dosages and incubation times, following CuB alone and in combination with Gef treatments. Apoptotic ratio was assessed using LDH, DNA Fragmentation and Caspase-3 ELISA methods. Quantitative Real-Time PCR and Western Blot methods were used for analysis of mRNA and protein expression levels of Bcl-2, Bax, Bak, Bad, cyclin D and p27kip1 genes which take part in apoptotic and proliferative signal pathways. 122 Our results showed that treatment with CuB alone and in combination with Gef resulted in an apoptotic response in a dose dependent manner in both cell lines. We also found that the apoptotic effects of CuB increased in the presence of Gef. These results were also confirmed with appropriate changes in the mRNA and protein expression levels of apoptotic and anti-proliferative genes and proteins, in comparison to the control group. Our data suggest that CuB could be useful as a potential anti-neoplastic agent in the management of colon cancer. In conclusion, our study draws attention to the possible clinical effectiveness of use of CuB with chemotherapeutic agents with the opportunity of attaining convenient apoptotic and anti-proliferative effect with reduced dose and time in cancer treatment targeting JAK/STAT pathway. In addition to this, determination of the exact molecular effects of cucurbitacins would allow us to identify new molecular targets for the treatment of the colon cancer. Key Words: Cucurbitacin B, Gefitinib, HCT-116 cell line, HT29 cell line, Real-time PCR, Western Blot 123 9. KAYNAKLAR 1. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular biology of the cell. 4th ed. New York: Garland Science; 2002. 2. Weinberg RA. The Biology of Cancer. 1st ed. New York: Garland Science; 2007. 3. Croce CM. Oncogenes and cancer. N Engl J Med 2008; 385: 503511. 4. Doğu GG, Çıtıl R, Dikilitaş M, Özkan M, Er Ö, Öztürk A, Altınbaş M. Kemoterapi alan hastaların sosyodemografik ve tanısal özellikleri. Erciyes Tıp Dergisi 2007; 29(2): 132-138. 5. Vogelstein B, Kinzler KW. The Genetics Basis of Human Cancer. 2nd ed. New York: The McGraw-Hill Companies Inc; 2002. 6. Merlo LM, Pepper JW, Reid BJ, et al. Cancer as an evolutionary and ecological process. Nat Rev Cancer 2006; 6: 924-935. 7. Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y. Cancer Statistics. CA Cancer J Clin. 2008; 58(2): 71-96. 8. Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y, Xu J, Thun MJ. Cancer statistics. CA Cancer J Clin 2009; 59: 225-249. 9. Ries LA, Wingo PA, Miller DS, Howe HL, Weir HK, Rosenberg HM, et al., The annual report to the nation on the status of cancer, 19731997, with a special section on colorectal cancer. Cancer 2000; 88(10): 2398-424. 124 10. Alemdaroglu, K., Akçal, T., Bugra, D, editörler. Kolonun anatomisi. Kolon Rektum ve Anal Bölge Hastalıkları. İstanbul: Türk Kolon ve Rektum Cerrahisi Derneği; 2003. 11. Buğra D. Kolon, Rektum, Anal Bölge Anatomisi. Kolorektal Özel Sayısı. Türkiye Klinikleri Journal of Surgery 2004; 9(1): 1-9. 12. Sayek İ, editör. Kolorektal Karsinomlar. Temel Cerrahi Cilt I. Ankara: Günes Kitapevi Ltd. Sti; 1991. 13. [internette]. [11 Ocak 2012 tarihinde okundu]. elektronik adresi: http://www.furkan.com.tr/4-sindirim.html 14. Yılmazlar T, Öztürk E. Kolon Kanseri. Kolon & Rektal Cerrahinin El Kitabı. Corman ML, Allison SI, Kuehne JP, editörler. Alabaz Ö, çeviri editörü. Adana: Nobel Tıp Kitapevleri; 2004. sayfa 423–474. 15. Itzkowitz SH, Kim YS. Colonic polyps and polyposis syndromes. In: Feldman M, Scharschmidt B.F, Sleisenger M.H, editors. Sleisenger and Fordtran’s Gastrointestinal and Liver Disease. 7th ed. W.B. Saunders Company pres; 2003. p.1865-1942. 16. [internette]. [12 Nisan 2012 tarihinde okundu]. elektronik adresi: http://www.meb.unibonn.de/cancer.gov/Media/CDR0000415500.jpg 17. Ahmed FE. Effect of environmental/chemopreventive diet, life factors style, on and other colorectal cancer development, and assessment of the risks. J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev. 2004; 22(2): 91–147. 18. Terzıc J, Grıvennġkov S, Karın E, Karın M. Inflammation and Colon Cancer. Gastroenterology 2010; 138: 2101–2114. 125 19. Erturk T, Kaygusuz A, Dagtekin T, Dinçel U, Kınacı E, Çalıskan YK. Bir Olgu Nedeniyle Kolonda Senkron Tumor Tanısında Güçlükler. İstanbul Tıp Dergisi 2004; 4: 45-48. 20. Skibber JM, Minsky BD, Hoff PM. Cancer of the colon. In: DeVita VT, Hellman S, Rosenberg SA. editors. Cancer Principles & Practice of Oncology. 6th Ed. Philadelphia: Lippincott Williams&Williams; 2001. p. 1216-1271. 21. Edwards BK, Howe HL, Ries LA, Thun MJ, Rosenberg HM, Yancik R, et al. Annual report to the nation on the status of cancer, 19731999, featuring implications of age and aging on U.S. cancer burden. Cancer 2002; 94(10): 2766-92. 22. Ay ME, Terzioglu O, Terzi C, Ay Öİ. Kolorektal Kanserlerde, p21, p27, p57 Siklin Bagımlı Kinaz İnhibitör Geni (cdkı) Ekspresyonlarının Degerlendirilmesi. Akademik Gastroenteroloji Dergisi 2006; 5 (1): 20-25. 23. Oskay S. P53-/- ve P53 +/+ HCT116 Kolon Kanser Hücre Serilerinde Radyasyonun Hücre Proliferasyonu ve Telomeraz Aktivitesi Üzerine Etkisi. Yüksek Lisans. Ankara: Ankara Üniversitesi; 2008. 24. [internette]. [12 Nisan 2012 tarihinde okundu]. elektronik adresi: http://www.kolonrektum.com/kolon-rektum-polipleri, http://www.kolonkanser.com/ 25. Sağkan RI. Bazı Sitokinlerin İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde CAIX İfade Düzeylerine Etkilerinin Belirlenmesi. Doktora. Balıkesir: Balıkesir Üniversitesi; 2009. 26. Korkmaz F. Isırgan Otu (Urtica Dioica) Ekstresinin Kolon Kanseri Hücre Serileri Üzerindeki Apoptotik, Antiproliferatif ve Antioksidan 126 Etkilerinin Araştırılması. Yüksek Lisans. Ankara: Ankara Üniversitesi; 2010. 27. Çiftlikçi A. Kolorektal Kanserlerde Tümör Belirleyicilerinin İncelenmesi. Yüksek Lisans. Malatya: İnönü Üniversitesi; 2002. 28. Deveci KD, Yüce H, Etem H, Doğru O, Özercan İ. Kolorektal kanserlerdeki Kromozomal Değişikliklerin Tespiti. F.Ü. Sağlık 2004; 18: 175-180. 29. Levin B, Raijman I. Malignant tumors of the colon and rectum. In: Haubrich WS, Schaffner F, Berk JE, editors. Bockus Gastroenterology Volume II. 5th ed. Philadelphia, Pennsylvania: W.B. Saunders company; 1995: p. 1744-1772. 30. Doğan AL, Güç D. Sinyal iletimi mekanizmaları ve kanser. Hacettepe Tıp Dergisi 2004; 35: 34-42. 31. McCormick F. Signalling networks that cause cancer. Trends in Cell Biol. 1999; 9(12): M53-M56. 32. American Cancer Society. Colorectal Cancer Staging. CA Cancer J Clin 2005; 54: 362-365. 33. Pawson T, Raina M, Nash P. Interaction domains: From simple binding events to complex cellular behavior. FEBS Letters 2002; 513: 2-10. 34. Pawson T. Regulation and targets of receptor tyrosine kinases. Eur J Cancer 2002; 38(5): 3-10. 35. Fisher DA, Lakshmanan J. Metabolism and effects of epidermal growth factor and related growth factors in mammals. Endoc. Rev. 1990; 11(3): 418-422. 127 36. Das M. “Epidermal growth factor: mechanism of action”, Int. Rev. Cytol., 1982; 78: 233-236. 37. Blume-Jensen P, Hunter T. Oncogenic kinase signaling. Nature 2001; 411: 355-64. 38. Bağdatoğşu ÖT. Saydam G. Gastrointestinal Kanserli Hastalarda G protein β3 geni (GNB3) C 825T Polimorfizminin Değerlendirilmesi. Doktora. Mersin: Mersin Üniversitesi; 2008. 39. Jones RJ, Brunton VG, Frame MC. Adhesion-linked kinase in cancer; emphasis on Src, focal adhesion kinase and PI 3-kinase. Eur J Cancer 2000; 36: 1595-606. 40. Frame MC. Src in cancer: Deregulation and consequences for cell behavior. Biochim Biophys Acta 2002; 1602:114-30. 41. Kim JA. Targeted therapies for the treatment of cancer. Am J Surg 2003; 186: 264-8. 42. Hirsch FR, Scagliotti GV, Langer CJ, et al. Epidermal growth factor family of receptors in preneoplasia and lung cancer: Perspectives for targeted therapies. Lung Cancer 2003; 41: 29-42. 43. Cohen S. Isolation of a mouse submaxillary gland protein accelerating incisor eruption and eyelid opening in the new-born animal. J Biol Chem 1962; 237: 1555-1562. 44. Cohen S, Carpenter G, King L Jr. Epidermal growth factor-receptorprotein kinase interactions. Co-purification of receptor and epidermal growth factor-enhanced phosphorylation activity. J Biol Chem 1980; 255: 4834-4842. 128 45. O’Keefe EJ, Pledger WJ. A Model of Cell Cycle Control: Sequential Events Regulated By Growth Factors. Mol Cell Endocrinol 1983; 31(2-3): 167-186. 46. Downward J, Yarden Y, Mayes E, et al. Close smilarity of epidermal growth factor receptor and v-erbB oncogene protein sequences. Nature 1984; 307: 521-527. 47. Layfield LJ, Bernard PS, Goldstein NS. Color multiplex polymerase chain reaction for quantitative analyis of epidermal growth factor receptor genes in colorectal adenocarcinoma. J Surg Oncol 2003; 83: 227-231. 48. Herbest RS. Review of epidermal growth factor receptor biology. Int J Radiation Oncology Biol Phys 2004; 59: 21-26. 49. Burgess AW. EGFR family: structure physiology signalling and therapeutic targets. Growth Factors. 2008; 26(5): 263-74. 50. Ferguson KM. Structure-based view of epidermal growth factor receptor regulation. Annu Rev Biophys. 2008; 37: 353-73. 51. Turgut A. Kolorektal karsinomalarda EGFR Ekspresyonunun prognostik önemi. Tıpta Uzmanlık. Ankara: Gülhane Askeri Tıp Akademisi; 2007. 52. Aaronson SA. Growth factors and cancer. Science 1991; 254: 1146–1153. 53. Venook AP. Epidermal growth factor receptor-targeted treatment for advanced colorectal carcinoma. Cancer 2005; 103: 2435–46. 54. Scaltriti M, Baselga J. The epidermal growth factor receptor pathway: a model for targeted therapy. Clin Cancer Res 2006; 12(18): 5268 – 5272. 129 55. Yano S, Kondo K, Yamaguchi M, et al. Distribution and function of EGFR in human tissue and the effect of EGFR tyrosine kinase inhibition. Anticancer Res 2003; 23: 3639–50. 56. Mendelsohn J, Baselga J. Status of epidermal growth factor receptor antagonists in the biology and treatment of cancer. J Clin Oncol 2003; 21: 2787-99. 57. Yarden Y, Sliwkowski MX. Untangling the ErbB signalling network. Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2: 127-137. 58. Das M. Epidermal growth factor: mechanism of action. Int Rev Cytol 1982; 78: 233-236. 59. Salomon DS, Brandt R, Ciardiello F, Normanno N. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies. Crit Rev Oncol Hematol 1995; 19(3): 183-232. 60. Johnson LN. Protein kinase inhibitors: contributions from structure to clinical compounds. Q Rev Biophys 2009; 42(1): 1-40. 61. Pinkas-Kramarski R, Soussan L, Waterman H, et al. Diversification of Neu differentiation factor and epidermal growth factor signaling by combinatorial receptor interactions. EMBO J 1996; 15(10): 2452–67. 62. Karunagaran D, Tzahar E, Beerli RR, et al. ErbB2 is a common auxiliary subunit of NDF and EGF receptors: implications for breast cancer. Embo J 1996; 15: 254-264. 63. Perry Je, Grossmann ME, Tindall DJ. Epidermal growth factor induces cyclin D1 in a human prostate cancer cell line. Prostate 1998; 35: 117-124. 130 64. Sheng H, Shao J, Townsend CM Jr, et al. Phosphatydilinositol 3kinase mediates proliferative signals in intestinal epithelial cells. Gut 2003; 52: 1472-1478. 65. Casanova ML, Larcher F, Casanova B, et al. A critical role for rasmediated, epidermal growth factor receptor-dependent angiogenesis in mouse skin carcinogenesis. Cancer Res 2002; 62: 3402-3407. 66. Suzuki S, Dobashi Y, Sakurai H, Nishikawa K, Hanawa M, Ooi A. Protein overexpression and gene amplification of epidermal growth factor receptor in nonsmall cell lung carcinomas. Cancer 2005; 103: 1265-1273. 67. McKay JA, Murray LJ, Curan S, Ross VG, Clark C, Murray GI, et al. Evaluation of the epidermal growth factor receptor (EGFR) in colorectal tumors and lymph node metastases. European Journal of Cancer 2002; 38: 2258-2264. 68. Waxman ES, Herbst RS. The role of the epidermal growth factor receptor in the treatment of colorectal carcinoma. Semin Oncol Nurs 2002; 18: 20-29. 69. Roberts RB, Min L, Washington MK, et al. Importance of epidermal growth factor receptor signaling in establishment of adenomas and maintenance of carcinomas during intestinal tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99(3): 1521–6. 70. Brunton VG, Ozanne BW, Paraskeva C, et al. A role for epidermal growth factor receptor, c-Src and focal adhesion kinase in an in vitro model for the progression of colon cancer. Oncogene 1997; 14(3): 283-93. 131 71. Levitzki A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. European Journal of Cancer 2002; 38(5): 11–18. 72. Madhusudan S, Ganesan TS. Tyrosine kinase inhibitors in cancer therapy. Clin Biochem 2004; 37: 618-635. 73. Carter P. Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies. Nat Rev Cancer 2001; 1: 118 –129. 74. Harris M. Monoclonal antibodies as therapeutic agents for cancer. Lancet Oncol 2004; 5: 292–302. 75. Trikha M, Yan L, Nakada MT. Monoclonal antibodies as therapeutics in oncology. Curr Opin Biotechnol 2002; 13: 609–614. 76. Burton DR, Woof JM. Human antibody effector function. Adv Immunol 1992; 51: 1– 84. 77. Rowinsky EK. Signal events: Cell signal transduction and its inhibition in cancer. Oncologist. 2003; 8(3): 5-17. 78. Krause DS, Van Etten RA. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. N Engl J Med 2005; 353: 172–87. 79. Hartmann JT, Haap M, Kopp HG, Lipp HP. Tyrosine kinase inhibitors - a review on pharmacology, metabolism and side effects. Curr Drug Metab 2009; 10: 470–81. 80. Pawson T. Regulation and targets of receptor tyrosine kinases. Eur J Cancer 2002; 38(5): 3-10. 81. Bhise SB, Nalawade AD, Wadhawa H. Role of protein tyrosine kinase inhibitors in cancer therapeutics. Indian J Biochem Biophys 2004; 41: 273-280. 132 82. Levitzki A, Mishani E. Tyrphostins and other tyrosine kinase inhibitors. Annu Rev Biochem 2006; 75: 93–109. 83. Zhang J, Yang PL, Gray NS. Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat Rev Cancer 2009; 9: 28–39. 84. Kisseleva T, Bhattacharya S, Braunstein J, Schindler CW. Signaling through the JAK/STAT pathway, recent advances and future challenges. Gene 2002; 285: 1-24. 85. Hebenstreit D, Horejs-Hoeck J, Duschl A. JAK/STAT-dependent gene regulation by cytokines. Drug News Perspect 2005; 18: 243249. 86. Darnell JE Jr. Studies of IFN-induced transcriptional activation uncover the Jak-STAT pathway. J Interferon Cytokine Res 1998; 18: 549-54. 87. Remy I, Wilson IA, Michnick SW. Erythropoietin receptor activation by a ligand induced conformation change. Science 1999; 283: 990– 993. 88. Clevenger CV. Roles and regulation of STAT family transcription factors in Human breast cancer. Am J Pathol 2004; 165: 14491460. 89. Sadowski HB, Shuai K, Darnell JE Jr, Gilman MZ. A common nuclear signal transduction pathway activated by growth factor and cytokine receptors. Science 1993; 261: 1739-44. 90. Sandberg EM, Wallace TA, Godeny MD, VonDerLinden D, Sayeski PP. Jak2 tyrosine kinase: a true jak of all trades? Cell Biochem Biophys 2004; 41: 207– 232. 133 91. Schindler CW. JAK-STAT signaling in human disease. J Clin Invest 2002; 109(9): 1133-7. 92. Chen W, Daines MO, Khurana Hershey GK. Turning off signal transducer and activator of transcription (STAT): The negative regulation of STAT signaling. J Allergy Clin Immunol 2004; 114(3): 476-89. 93. Wilks AF. Two putative protein-tyrosine kinases identified by application of the polymerase chain reaction. PNAS 1989; 86: 160316077. 94. [internette]. [14 Ekim 2011 tarihinde okundu]. elektronik adresi: Janus Roman God of Begginings; www.novareinna.com/festive/janus.html 95. Wilks AF, Harpur AG, Kurban RR, Ralph SJ, Zurcher G, Ziemiecki A. Two novel protein-tyrosine kinases, each with a second phosphotransferase-related catalytic domain, define a new class of protein kinase. Mol Cell Biol 1991; 11(4): 2057–65. 96. Bowman T, Garcia R, Turkson J, et al. STATs in oncogenesis. Oncogene 2000; 19: 2474-88. 97. Benekli M, Baer MR, Baumann H, Wetzler M. Signal Transducer and activator of transcription proteins in leukemias. Blood 2003; 101: 2940-54. 98. Leonard WJ. Cytokines and immunodeficiency diseases. Nat Rev Immunol 2001; 1(3): 200-8. 99. Quesnelle KM, Boehm AL, Grandis JR. STAT-Mediated EGFR Signaling in Cancer. Journal of Cellular Biochemistry. 2007; 102: 311–319. 134 100. Bromberg J. STAT proteins and oncogenesis. J Clin Invest 2002;109: 1139–1142. 101. Becker S, Groner B, Müller CW. Three-dimensional structure of the STAT3-homodimer bound to DNA. Nature 1998; 394: 145–151. 102. Chen X, Vinkemeier U, Zhao Y, Jeruzalmi D, Darnell JE Jr, Kuriyan J. Crystal structure of a tyrosine phosphorylated STAT-1 dimer bound to DNA. Cell 1998; 93: 827–839. 103. Xi S, Zhang Q, Dyer KF, Lerner EC, Smithgall TE, Gooding WE, et al. Src kinases mediate STAT growth pathways in squamous cell carcinoma of the head and neck. J Biol Chem 2003; 278: 31574-83. 104. Krebs DL, Hilton DJ. SOCS proteins: negative regulators of cytokine signaling. Stem Cells 2001; 19: 378-387. 105. Shuai K. Regulation of cytokine signaling pathways by PIAS proteins" Cell Research 2006; 16: 196-202. 106. Benekli M, Xia Z, Donohue KA, Ford LA, Pixley LA, Baer MR, et al. Constitutive activity of signal transducer and activator of transcription 3 protein in acute myeloid leukemia blasts is associated with short disease-free survival. Blood 2002; 99: 252-7. 107. Mitchell TJ, John S. Signal transducer and activator of transcription (STAT) signalling and T-cell lymphomas. Immunology 2005; 114: 301-12. 108. Hodge DR, Xiao W, Wang LH, Li D, Farrar WL. Activating mutations in STAT-3 and STAT-5 differentially affect cellular proliferation and apoptotic resistance in multiple myeloma cells. Cancer Biol Ther 2004; 3: 188-94. 135 109. Messina JL, Yu H, Riker AI, Munster PN, Jove RL, Daud AI. Activated STAT-3 in melanoma. Cancer Control. 2008; 15: 196-201. 110. Sánchez-Ceja SG, Reyes-Maldonado E, Vázquez-Manríquez ME, López-Luna JJ, Belmont A, Gutiérrez-Castellanos S. Differential expression of STAT-5 and Bcl-xL, and high expression of Neu and STAT-3 in non-small-cell lung carcinoma. Lung Cancer 2006; 54: 163-8. 111. Barton BE, Karras JG, Murphy TF, Barton A, Huang HF. Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT-3) activation in prostate cancer: Direct STAT-3 inhibition induces apoptosis in prostate cancer lines. Mol Cancer Ther 2004; 3: 11-20. 112. Choi JH, Ahn MJ, Park CK, Han HX, Kwon SJ, Lee YY, Kim IS. Phospho-STAT-3 expression and correlation with VEGF, p53, and Bcl-2 in gastric carcinoma using tissue microarray. APMIS 2006; 114: 619-25. 113. Lassmann S, Schuster I, Walch A, Göbel H, Jütting U, Makowiec F, et al. STAT-3 mRNA and protein expression in colorectal cancer: effects on STAT-3-inducible targets linked to cell survival and proliferation. Clin Pathol 2007; 60: 173-9. 114. Puthier D, Thabard W, Rapp M, Etrillard M, Harousseau J, Bataille R, Amiot M. Interferon alpha extends the survival of human myeloma cells through an upregulation of the Mcl-1 antiapoptotic molecule. Br J Haematol 2001; 112: 358-63. 115. Yang J, Chatterjee-Kishore M, Staugaitis SM, Nguyen H, Schlessinger K, Levy DE, Stark GR. Novel roles of unphosphorylated STAT-3 in oncogenesis and transcriptional regulation. Cancer Res 2005; 65: 939-47. 136 116. Altunkaynak BZ, Özbek E. Programlanmış hücre ölümü: apoptoz nedir? Tıp Arş Der 2008; 6(2): 93-104. 117. Saikumar P, Dong Z, Mikhailov V, Denton M, Weinberg JM, Venkatachalam MA. Apoptosis: definition, mechanisms, and relevance to disease. Am J Med 1999; 107(5): 489-506. 118. Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972; 26(4): 239-57. 119. Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 2007; 35(4): 495-516. 120. Danial NN, Korsmeyer SJ. Cell death: critical control points. Cell 2004; 116: 205-19. 121. Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis. Nature 2000; 407: 770-6. 122. Jin Z, El-Deiry WS. Overview of cell death signaling pathways. Cancer Biol Ther 2005; 4(2): 139-63. 123. Chinnaiyan AM, O’Rourke K, Tewari M, Dixit VM. FADD, a novel death domain-containing protein, interacts with the death domain of Fas and initiates apoptosis. Cell 1995; 81(4): 505–12. 124. Riedl S, Yigong S. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat Rev Mol Biol 2004; 5: 897-907. 125. Lamkanfi M, Festjens N, Declercq W, Vanden Bergle T, Vandenabeele P. Caspases in cell survival, proliferation and differentiation. Cell Death Differ 2007; 14: 44-55. 137 126. Li H, Zhu H, Xu CJ, Yuan J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas patway of apoptosis. Cell 1998; 94(4): 491-501. 127. Donepudi M, Mac Sweeney A, Briand C, Grutter MG. Insights into the regulatory mechanism for caspase-8 activation. Mol Cell 2003; 11(2): 543–9. 128. Klener P Jr, Andera L, Klener P, Necas E, Zivny J. Cell death signalling pathways in the pathogenesis and therapy of haematologic malignancies: overview of apoptotic pathways. Folia Biol (Praha) 2006; 52(1-2): 34-44. 129. Green DR, Kroemer G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science 2004; 305 (5684): 626–9. 130. Goldstein JC, Waterhouse NJ, Juin P, Evan GI, Green DR. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nat Cell Biol 2000; 2(3):156–62. 131. Kluck RM, Bossy-Wetzel E, Green DR, Newmeyer DD. The release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis. Science 1997; 275(5303): 1132-6. 132. Cory S, Huang DC, Adams JM. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene 2003; 22(53): 8590–607. 133. Puentes-Prior D, Salvesen GS. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem J 2004; 384: 201-232. 134. Shi Y. Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis. Mol Cell 2002; 9(3): 459-70. 138 135. Tsujimoto Y. Role of Bcl-2 family of proteins in apoptosis, apoptosomes or mitochondria. Genes Cell 1998; 3: 697-707. 136. Zou H, Li Y, Liu X, Wang X. An APAF-1-cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem 1999; 274(17):11549–56. 137. [internette]. [22 Mayıs 2012 tarihinde okundu]. elektronik adresi: http://www.bioscience.org/2009/v14/af/3509/fulltext.asp?bframe=fig ures.htm&doi=yes 138. Miyashita T, Krajewski S, Krajewska M, Wang HG, Lin HK, Liebermann DA, et al. Tumor suppressor P53 is regulator of Bcl-2 and Bax gene expression in vitro and in vivo. Oncogene 1994; 9: 1799-1805. 139. Özkaya AB. HCT-116 Kolon Kanser Hücre Hattında Yeşil Çay Etken Maddesi Olan (-)-epigallokatekin-3-gallat’ın Apoptoz Üzerine Etkisinin İncelenmesi. Yüksek Lisans Tezi. İzmir: Dokuz Eylül Üniversitesi; 2009. 140. Cregan SP, Mac Laurin JG, Craig CG, Robertson GS, Nicholson DW, Park DS, Slack R. Bax-dependent caspase-3 activation is a key determinant in p53-induced apoptosis in neurons. J neuroscr 1999; 19 (18): 7860-69. 141. Levin AJ. P53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 1997; 83(3): 323-31. 142. Kumar S. Caspase function in programmed cell death. Cell Death Differ 2007; 14: 32-43. 143. Donepudi M, Grutter MG. Structure and zymogen activation of caspase. Biophsical Chem 2002; 101: 145-53. 139 144. Öztürk F. Apopitoz. İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 2002; 9(2): 143–148. 145. Yehielly F, Deiss LP. Apoptosis and cancer, Basic Science of Cancer In: Kruh GD, Tew KD, editors. Chapter 11. Philadelpphia: Current Medicine ınc; 2000. 146. Igney FH, Krammer PH. Death and anti-death: Tumor resistance to apoptosis. Nat Rev Cancer 2002; 2: 277-88. 147. Okada H, Mak TW. Patway of apoptotik and non-apoptotik death in tumour cells. Nat Rev Cancer 2004; 4: 592-603. 148. Jaattela M. Escaping cell death, survival proteins in cancer. Exp Cell Research 1999; 248(1): 30-43. 149. Fadeel B, Orrenius S. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in human disease. J İnternal Med 2005; 258: 479-517. 150. Jaattela M. Multiple cell death patways as regulators of tumor initiation and progression. Oncogene 2004; 449(2): 175-185. 151. Kaufmann SH, Earnshaw WC. Induction of apoptosis by cancer chemotherapy. Exp Cell Res 2000; 256: 42–9. 152. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. The Cell Cycle And Programmed Cell Death. Molecular Biology of the Cell. Garland Science 2007; 991. 153. Zetterberg A, EngstromW, Larsson O. Growth activation of resting cells: induction of balanced and imbalanced growth. Ann N Y Acad Sci 1982; 397: 130–147. 140 154. Murray AW. Recycling the cell cycle: cyclins revisited. Cell 2004; 116: 221–234. 155. Nigg EA. Cyclin-dependent protein kinases: key regulators of the eukaryotic cell cycle. Bioessays 1995; 17(6): 471–80. 156. Stephen JE. Cell Cycle Checkpoints: Preventing an Identity Crisis. Science 1996; 274 (5293): 1664-1672. 157. Sheng H, Shao J, Townsend CM Jr, Evers BM. Phosphatydilinositol 3-kinase mediates proliferative signals in intestinal epithelial cells. Gut 2003; 52: 1472-1478. 158. Macaluso M, Montanari M, Cinti C, Giordano A. Modulation of cell cycle components by epigenetic and genetic events. Semin Oncol 2005; 32(5): 452-7. 159. Sherr CJ. Cancer Cell Cycles. Science 1996; 274: 19672-7. 160. Zhang H. Molecular signaling and genetic pathways of senescence: Its role in tumorigenesis and aging. J Cell Physiol 2007; 210(3): 567-74. 161. Tetsu O, McCormick F. Β-catenin regulates expression of cyclin D1 in colon carcinoma cells. Nature 1999; 398; 422-426. 162. Murillo CA, Rychahou PG, Evers BM. RNAi-mediated inhibiton of cyclin D1 decreases colon cancer cell proliferation and MMP protein expression. Alim Tract 2004; 199: 11. 163. Tsihlias J, Kapusta L, Singerland J. The Prognostic Significance of Altered Cyclin-Dependent Kinase Inhibitors in Human Cancer. Anneual Review of Medicine 1999; 50: 401-23. 141 164. Nho RS, Sheaff RJ. p27Kip1 Contributions to Cancer. Progression in Cell Cycle Research 2003; 5: 249-59. 165. Deschênes C, Vézina A, Beaulieu JF, Rivard N. Role of p27Kip1 in Human Intestinal Cell Differentiation. Gastroenterology 2001; 120: 423-38. 166. Bastians H, Townsley FM, Ruderman JV. The Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p27Kip1 Induces N-terminal Proteolytic Cleavage of Cyclin A. PNAS 1998; 95: 5374-81. 167. Blain S, Massagué J. Breast cancer banishes p27 from nucleus. Nat Med 2002; 8: 1076-8. 168. Viglietto G, Motti ML, Bruni P, Melillo RM, D'Alessio A, Califano D, et al. Cytoplasmic relocalization and inhibition of the cyclindependent kinase inhibitor p27Kip1 by PKB/Akt-mediated phosphorylation in breast cancer. Nat Med 2002; 8: 1136-44. 169. Elledge SJ, Harper JW. Cdk inhibitors: on the threshold of checkpoints and development. Curr Opin Cell Biol 1994; 6: 847-52. 170. Shin I, Yakes FM, Rojo F, Shin NY, Bakin AV, Baselga J, et al. PKB/Akt mediates cell-cycle progression by phosphorylation of p27Kip1 at threonine 157 and modulation of its cellular localization. Nat Med 2002; 8: 1145-52. 171. Liang J, Zubovitz J, Petrocelli T, Kotchetkov R, Connor MK, Han K, et al. PKB/Akt phosphorylates p27, impairs nuclear import of p27 and opposes p27-mediated G1 arrest. Nat Med 2002; 8: 1153-60. 172. Adams PD, Kaelin WG. Negative Control Elements of the Cell Cycle in Human Tumors. Current Opinion in Cell Biology 1998; 10: 791-7. 142 173. Narita Y, Nagane M, Mishima K, Huang HJ, Furnari FB, Cavenee WK. Mutant epidermal growth factor receptor signaling downregulates p27 through activation of the phosphatidylinositol 3kinase/Akt pathway in glioblastomas. Cancer Res 2002; 62: 67646769. 174. Liang YC, Lin-Shiau SY, Chen CF, Lin JK. Inhibition of cyclindependent kinases 2 and 4 activities as well as induction of Cdk inhibitors p21 and p27 during growth arrest of human breast carcinoma cells by (-)-epigallocatechin-3-gallate. J Cell Biochem 1999; 75: 1–12. 175. Woodburn JR. The epidermal growth factor receptor and its inhibition in cancer therapy. Pharmacol Ther 1999; 82: 241–250. 176. Lurje G, Lenz HJ. EGFR signaling and drug discovery. Oncology 2009; 77(6): 400-410. 177. Raymond E, Faivre S, Armand JP. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase as a target for anticancer therapy. Drugs 2000; 60: 15-23. 178. Wakeling AE, Guy SP, Woodburn JR, et al. ZD1839 (Iressa): an orally active inhibitor of epidermal growth factor signaling with potential for cancer therapy. Cancer Res 2002; 62: 5749–5754. 179. Lubet RA, Szabo E, Christov K, Bode AM, Ericson ME, Steele VE, et al. Effects of gefitinib (Iressa) on mammary cancers: preventive studies with varied dosages, combinations with vorozole or targretin, and biomarker changes. Mol Cancer Ther 2008; 7(4): 9729. 143 180. Paez JG, Janne PA, Lee JC, et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science 2004; 304: 1497– 500. 181. Woodburn JR, Barker AJ, Wakeling A, Valcaccia BE, Cartlidge SA, Davies DH. 6-Amino-4(3-methyl-phenylamino)- quinazoline: an EGF receptor tyrosine kinase inhibitor with activity in a range of human tumour xenografts. Proc Am Assoc Cancer Res 1996; 37: 390–391. 182. Barker AJ. Studies leading to the identification of ZD1839 (IRESSA): an orally active, selective epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor targeted to the treatment of cancer. Bioorg Med Chem Lett 2001; 11: 1911–1914. 183. [internette]. [28 Mayıs 2012 tarihinde okundu]. elektronik adresi: FDA Drug Approvals http://www.fda.gov/cder/foi/label/2003/21399_iressa_lbl. List, pdf> (2003). 184. Cohen MH, Williams GA, Sridhara R, et al. United States Food and Drug Administration Drug Approval summary: Gefitinib (ZD1839; Iressa) tablets. Clin Cancer Res 2004; 10: 1212-1218. 185. [internette]. [19 Şubat 2012 tarihinde okundu]. elektronik adresi: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Gefitinib_structure.svg 186. Dancey J, Sausville EA. Issues and progress with protein kinase inhibitors for the treatment of cancer. Nature Rev Drug Disc 2003; 2: 296–313. 187. Ciardiello F, Caputo R, Bianco R, Damiano V, Pomatico G, De Placido S, et al. Antitumor effect and potentiation of cytotoxic drugs activity in human cancer cells by ZD-1839 (Iressa), an epidermal 144 growth factor receptorselective tyrosine kinase inhibitor. Clin Cancer Res 2000; 6: 2053-2063. 188. Sirotnak FM. Studies with ZD1839 in preclinical models. Semin Oncol 2003; 30: 12-20. 189. Dancey J, Sausville EA. Issues and progress with protein kinase inhibitors for the treatment of cancer. Nature Rev Drug Discov. 2003; 2: 325–334. 190. Sirotnak FM, Zakowski MF, Miller VA, et al. Efficacy of cytotoxic agents against human tumor xenografts is markedly enhanced by coadministration of ZD1839 (Iressa), an inhibitor of EGFR tyrosine kinase. Clin Cancer Res 2000; 6: 4885-92. 191. Lee CC, Houghton P. Cytotoxicity of plants from Malaysia and Thailand used traditionally to treat cancer. J Ethnopharmacol 2005; 100: 237–243. 192. McGovern PE, Christofidou-SolomidouM, Wang W, Dukes F, Davidson T, El-Deiry WS. Anticancer activity of botanical compounds in ancient fermented beverages (review). Int J Oncol 2010; 37: 5–14. 193. Jayaprakasam antiinflammatory B, Seeram activities NP, of Nair MG. cucurbitacins Anticancer from and Cucurbita andreana. Cancer Lett 2003; 189(1): 11–16. 194. Efferth T, Kahl S, Paulus K, Adams M, Rauh R, Boechzelt H, et al. Phytochemistry and pharmacogenomics of natural products derived from traditional Chinese medicine and Chinese materia media with activity against tumor cells. Mol Cancer Ther 2008; 7: 152–161. 145 195. Ramos S. Cancer chemoprevention and chemotherapy: dietary polyphenols and signalling pathways. Mol Nutr Food Res 2008; 52: 507–526. 196. Chen JC, Chiu MH, Nie RL, Cordell GA, Qiu SX. Cucurbitacins and cucurbitane glycosides: structures and biological activities. Nat Prod Rep 2005; 22: 386–399. 197. Peters RR, Farias MR, Ribeiro-do-Valle RM. Anti-inflammatory and analgesic effects of cucurbitacins from Wilbrandia ebracteata. Planta Med 1997; 63: 525–528. 198. Peters RR, Baier Krepsky P, Siqueira-Junior JM, da Silva Rocha JC, Marques Bezerra M, de Albuquerque Ribeiro R, de BrumFernandes AJ, et al. Nitric oxide and cyclooxygenase may participate in the analgesic and anti-inflammatory effect of the cucurbitacins fraction from Wilbrandia ebracteata. Life Sci 2003; 73: 2185–2197. 199. Lee KH. Discovery and development of natural product-derived chemotherapeutic agents based on a medicinal chemistry approach. J Nat Prod 2010; 73(3): 500-16. 200. Lee DH, Iwanski GB, Thoennissen NH. Cucurbitacin: ancient compound shedding new light on cancer treatment. Scientific World Journal 2010; 10: 413-8. 201. Lavie D, Glotter E. The cucurbitanes, a group of tetracyclic triterpenes. Fortschr Chem Org Naturst 1971; 29: 307-62. 202. Escandell JM, Kaler P, Recio MC, Sasazuki T, Shirasawa S, Augenlicht L, et al. Activated kRas protects colon cancer cells from cucurbitacin-induced apoptosis: The role of p53 and p21. Biochem Pharmacol 2008; 76: 198-207. 146 203. Zhang M, Zhang H, Sun C, Shan X, Yang X, Li-Ling J, Deng Y. Targeted constitutive activation of signal transducer and activator of transcription 3 in human hepatocellular carcinoma cells by cucurbitacin B. Cancer Chemother Pharmacol 2009; 63: 635-642. 204. [internette]. [19 Şubat 2012 tarihinde okundu]. elektronik adresi: http://home.ncifcrf.gov/mtdp/catalog/compounds/49451.html 205. Clericuzio M, Mella M, Vita-Finzi P, Zema M, Vidari G. Cucurbitane triterpenoids from Leucopaxillus gentianeus. J Nat Prod 2004; 67: 1823–1828. 206. Peters RR, Saleh TF, Lora M, Patry C, de Brum-Fernandes AJ, Farias MR, et al. Anti-inflammatory effects of the products from Wilbrandia ebracteata on carrageenan-induced pleurisy in mice. Life Sci 1999; 64(26): 2429-37. 207. Liu T, Zhang M, Zhang H, Sun C, Deng Y. Inhibitory effects of cucurbitacin B on laryngeal squamous cell carcinoma. Eur Arch Otorhinolaryngol 2008; 265(10): 1225-1232. 208. Aggarwal BB, Sethi G, Ahn KS, Sandur SK, Pandey MK, Kunnumakkara AB, et al. Targeting signal-transducer-and-activatorof-transcription-3 for prevention and therapy of cancer: modern target but ancient solution. Ann N Y Acad Sci 2006; 1091: 151-69. 209. Wakimoto N, Yin D, O’Kelly J, Haritunians T, Karlan B, Said J, et al. Cucurbitacin B has a potent antiproliferative effect on breast cancer cells in vitro and in vivo. Cancer Sci 2008, 99: 1793–1797. 210. Yin D, Wakimoto N, Xing H, Lu D, Huynh T, Wang X, et al. Cucurbitacin B markedly inhibits growth and rapidly affects the cytoskeleton in glioblastoma multiforme. Int J Cancer 2008, 123: 1364–1375. 147 211. Haritunians T, Gueller S, Zhang L, Badr R, Yin D, Xing H, et al. Cucurbitacin B induces differentiation, cell cycle arrest, and actin cytoskeletal alterations in myeloid leukemia cells. Leuk Res 2008, 32: 1366–1373. 212. Thoennissen NH, Iwanski GB, Doan NB, Okamoto R, Lin P, Abbassi S, et al. Cucurbitacin B induces apoptosis by inhibition of the JAK/STAT pathway and potentiates antiproliferative effects of gemcitabine on pancreatic cancer cells. Cancer Res 2009; 69: 5876–5884. 213. Liu T, Zhang M, Zhang H, Sun C, Yang X, Deng Y, et al. Combined antitumor activity of cucurbitacin B and docetaxel in laryngeal cancer. Eur J Pharmacol 2008; 587: 78-84. 214. Shi X, Franko B, Frantz C, Amin HM, Lai R. JSI-124 (cucurbitacin I) inhibits Janus kinase-3/signal transducer and activator of transcription-3 signalling, downregulates nucleophosmin-anaplastic lymphoma kinase (ALK), and induces apoptosis in ALK-positive anaplastic large cell lymphoma cells. Br J Haematol 2006; 135: 26– 32. 215. Toyonaga T, Nakano K, Nagano M, Zhao G, Yamaguchi K, Kuroki S, et al. Blockade of constitutively activated Janus kinase/signal transducer and activator of transcription-3 pathway inhibits growth of human pancreatic cancer. Cancer Lett 2003; 201(1): 107–116. 216. Jing N, Tweardy DJ. Targeting Stat3 in cancer therapy. Anticancer Drugs 2005; 16: 601–607. 217. Fogh J, Fogh JM, Orfeo T. One hundred and twenty-seven cultured human tumor cell lines producing tumors in nude mice. J Natl Cancer Inst 1977; 59: 221-226. 148 218. Fogh J, Trempe G. New human tumor cell lines in human tumor cells in vitro. In Human Tumor Cells in Vitro. In: J. Fogh, editor. New York: Plenum Pres;1975. p.115-159. 219. [internette]. [01 Ocak 2012’da okundu]. elektronik adresi: http://www.lgcstandardsatcc.org/LGCAdvancedCatalogueSearch/ProductDescription/tabid/1 068/Default.aspx?ATCCNum=HTB-38&Template=cellBiology 220. [internette]. [01 Ocak 2012’da okundu]. elektronik adresi: http://www.lgcstandards-atcc.org/Attachments/1986.jpg 221. Brattain MG, Fine WD, Khaled FM, Thompson J, Brattain DE. Heterogeneity of malignant cells from a human colonic carcinoma. Cancer Res 1981; 41: 1751-1756. 222. Brattain MG, Brattain DE, Sarrif AM, McRae LJ, Fine WD, Hawkins JG. Enhancement of growth of human colon tumor cell lines by feeder layers of murine fibroblasts. J Natl Cancer Inst 1982; 69: 767-771. 223. [internette]. [01 Ocak 2010’da okundu]. elektronik adresi: http://www.lgcstandardsatcc.org/LGCAdvancedCatalogueSearch/ProductDescription/tabid/1 068/Default.aspx?ATCCNum=CCL-247&Template=cellBiology 224. [internette]. [01 Ocak 2010’da okundu]. elektronik adresi: http://www.lgcstandards-atcc.org/Attachments/1762.jpg 225. Rubins JB, Greatens T, Kratzke RA, Tan AT, Polunovsky VA, Bitterman P. Lovastatin induces apoptosis in malignant mesothelioma cells. Am J Respir Crit Care Med 1998; 157(5 Pt 1): 1616-22. 149 226. Korzeniewski C, Callewaert DM. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods 1983; 64(3): 313-20. 227. Decker T, Lohmann-Matthes ML. A quick and simple method for the quantitation of lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor (TNF) activity. J Immunol Methods 1988; 115(1): 61-9. 228. Coşkun-Arı FF. Western Blotlama Yöntemi ile Protein Tespiti. In: Uygulamalı Hücre Kültürü Teknikleri Kurs Kitabı-I. Karaöz E, Ovalı E, eidtörler. 2003a; 189-198. Isparta Türkiye. 229. Coşkun-Arı FF. Western Blot Uygulaması. In: Uygulamalı Hücre Kültürü Teknikleri Kurs Kitabı-II. Karaöz E, Ovalı E, editörler. 2003b: 72-79. Isparta Türkiye. 230. Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res 2002; 30(9): e36. 231. Swaffar DS, Holley CJ, Fitch RW, Elkin KR, Zhang C, Sturgill JP, et al. Phytochemical investigation and in vitro cytotoxic evaluation of alkaloids from Abuta rufescens. Planta Med 2012; 78(3): 230-2. 232. Vuorelaa P, Leinonenb M, Saikkuc P, Tammelaa P, Rauhad JP, Wennberge T, et al. Natural products in the process of finding new drug candidates. Curr Med Chem 2004; 11(11): 1375-89. 233. Setzer WN, Setzer MC. Plant-derived triterpenoids as potential antineoplastic agents. Mini Rev Med Chem 2003; 3(6) :540-56. 150 234. Mehta RG, Murillo G, Naithani R, Peng X. Cancer chemoprevention by natural products: how far have we come? Pharm Res 2010; 27(6): 950-61. 235. Chen H, Yao K, Nadas J, Bode AM, Malakhova M, Oi N, et al. Prediction of molecular targets of cancer preventing flavonoid compounds using computational methods. PLoS One 2012; 7(5): e38261. 236. Tannin-Spitz T, Grossman S, Dovrat S, Gottlieb HE, Bergman M. Growth inhibitory activity of cucurbitacin glucosides isolated from Citrullus colocynthis on human breast cancer cells. Biochem Pharmacol 2007; 73(1): 56-67. 237. Bartalis J, Halaweish FT. Relationship between cucurbitacins reversed-phase high-performance liquid chromatography hydrophobicity index and basal cytotoxicity on HepG2 cells. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2005; 818(2): 15966. 238. Blaskovich MA, Sun J, Cantor A, Turkson J, Jove R, Sebti SM. Discovery of JSI-124 (cucurbitacin I), a selective Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway inhibitor with potent antitumor activity against human and murine cancer cells in mice. Cancer Res 2003; 63(6): 1270-9. 239. Chan KT, Li K, Liu SL, Chu KH, Toh M and Xie WD: Cucurbitacin B inhibits STAT3 and the Raf/Mek/Erk pathway in leukemia cell line K562. Cancer Lett 2009; 289: 46-52. 240. Zhang M, Sun C, Shan X, Yang X, Li-Ling J, Deng Y. Inhibition of pancreatic cancer cell growth by cucurbitacin B through modulation 151 of signal transducer and activator of transcription 3 signaling. Pancreas 2010; 39(6): 923-9. 241. Sun J, Blaskovich MA, Jove R, Livingston SK, Coppola D, Sebti SM. Cucurbitacin Q: a selective STAT3 activation inhibitor with potent antitumor activity. Oncogene 2005; 24(20): 3236-45. 242. Sahu RP, Srivastava SK. The Role of STAT-3 in the Induction of Apoptosis in Pancreatic Cancer Cells by Benzyl Isothiocyanate. J Natl Cancer Inst 2009; 101: 176–193. 243. Kang H, O'Connell JB, Leonardi MJ, Maggard MA, McGory ML, Ko CY. Rare tumors of the colon and rectum: a national review. Int J Colorectal Dis 2007; 22(2): 183-9. 244. Rodrigues NR, Rowman A, Smith ME, Kerr IB, Bodmer WF, Gannon JV, et al. p53 mutations in colorectal cancer. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 7555–7559. 245. Schroy PC, Brown SS, Kim K, Johnson KA, Murnane MJ, Yang S, et al. Detection of p21ras mutations in colorectal adenomas and carcinomas by enzyme-linked immunosorbent assay. Cancer 1995; 76: 201–209. 246. Evans ME, Jones DP, Ziegler TR. Glutamine prevents cytokineinduced apoptosis in human colonic epithelial cells. J Nutr 2003; 133(10): 3065-71. 247. Yasuda S, Yogosawa S, Izutani Y, Nakamura Y, Watanabe H, Sakai T. Cucurbitacin B induces G2 arrest and apoptosis via a reactive oxygen species-dependent mechanism in human colon adenocarcinoma SW480 cells. Mol Nutr Food Res 2010; 54: 559– 565. 152 248. Zhou X, Yang J, Wang Y, Li W, Li-Ling J, Deng Y, et al. Cucurbitacin B inhibits 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetateinduced invasion and migration of human hepatoma cells through inactivating mitogen-activated protein kinase and PI3K/Akt signal transduction pathways. Hepatol Res 2012; 42(4): 401-11. 249. Ouyang D, Zhang Y, Xu L, Li J, Zha Q, He X. Histone deacetylase inhibitor valproic acid sensitizes B16F10 melanoma cells to cucurbitacin B treatment. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 2011; 43(6): 487-95. 250. Iwanski GB, Lee DH, En-Gal S, Doan NB, Castor B, Vogt M, et al. Cucurbitacin B, a novel in vivo potentiator of gemcitabine with low toxicity in the treatment of pancreatic cancer. Br J Pharmacol 2010; 160(4): 998-1007. 251. Chen W, Leiter A, Yin D, Meiring M, Louw VJ, Koeffler HP. Cucurbitacin B inhibits growth, arrests the cell cycle, and potentiates antiproliferative efficacy of cisplatin in cutaneous squamous cell carcinoma cell lines. Int J Oncol 2010; 37(3): 737-43. 252. Kongtun S, Jiratchariyakul W, Kummalue T, Tan-ariya P, Kunnachak S, Frahm AW. Cytotoxic properties of root extract and fruit juice of Trichosanthes cucumerina. Planta Med 2009; 75: 839– 842. 253. Zhang Y, Ouyang D, Xu L, Ji Y, Zha Q, Cai J, et al. Cucurbitacin B induces rapid depletion of the G-actin pool through reactive oxygen species-dependent actin aggregation in melanoma cells. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2011; 43(7): 556-67. 254. Lee DH, Thoennissen NH, Goff C, Iwanski GB, Forscher C, Doan NB, et al. Synergistic effect of low-dose cucurbitacin B and low153 dose methotrexate for treatment of human osteosarcoma. Cancer Lett 2011; 306(2): 161-70. 255. Liu T, Peng H, Zhang M, Deng Y, Wu Z. Cucurbitacin B, a small molecule inhibitor of the Stat3 signaling pathway, enhances the chemosensitivity of laryngeal squamous cell carcinoma cells to cisplatin. Eur J Pharmacol 2010; 641(1): 15-22. 256. Liu T, Zhang M, Deng Y, Zhang H, Sun C, Yang X, et al. Effects of cucurbitacin B on cell proliferation and apoptosis in Hep-2 cells. Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi 2008; 22(9): 403-7. 257. Duangmano S, Sae-Lim P, Suksamrarn A, Patmasiriwat P, Domann FE. Cucurbitacin B Causes Increased Radiation Sensitivity of Human Breast Cancer Cells via G2/M Cell Cycle Arrest J Oncol 2012; 2012: 601682. 258. Duangmano S, Dakeng S, Jiratchariyakul W, Suksamrarn A, Smith DR, Patmasiriwat P. Antiproliferative Effects of Cucurbitacin B in Breast Cancer Cells: Down-Regulation of the c- Myc/hTERT/Telomerase Pathway and Obstruction of the Cell Cycle. Int J Mol Sci 2010; 11(12): 5323-38. 259. Dakeng S, Duangmano S, Jiratchariyakul W, U-Pratya Y, Bögler O, Patmasiriwat P. Inhibition of Wnt signaling by cucurbitacin B in breast cancer cells: reduction of Wnt-associated proteins and reduced translocation of galectin-3-mediated β-catenin to the nucleus. J Cell Biochem 2012; 113(1): 49-60. 260. Lang KL, Silva IT, Zimmermann LA, Machado VR, Teixeira MR, Lapuh MI, et al. Synthesis and cytotoxic activity evaluation of dihydrocucurbitacin B and cucurbitacin B derivatives. Bioorg Med Chem 2012; 20(9): 3016-30. 154 261. Chan KT, Meng FY, Li Q, Ho CY, Lam TS, To Y, et al. Cucurbitacin B induces apoptosis and S phase cell cycle arrest in BEL-7402 human hepatocellular carcinoma cells and is effective via oral administration. Cancer Lett 2010; 294(1): 118-24. 262. Molavi O, Ma Z, Mahmud A, Alshamsan A, Samuel J, Lai R, et al. Polymeric micelles for the solubilization and delivery of STAT3 inhibitor cucurbitacins in solid tumors. Int J Pharm 2008; 347(1-2): 118-27. 263. Su Y, Li G, Zhang X, Gu J, Zhang C, Tian Z, et al. JSI-124 inhibits glioblastoma multiforme cell proliferation through G(2)/M cell cycle arrest and apoptosis augment. Cancer Biol Ther 2008; 7(8): 1243-9. 264. Meng D, Qiang S, Lou L, Zhao W. Cytotoxic cucurbitane-type triterpenoids from Elaeocarpus hainanensis. Planta Med 2008; 74(14): 1741-4. 265. Muir D, Varon S, Manthorpe M. An enzyme-linked immunosorbent assay for bromodeoxyuridine incorporation using fixed microcultures. Anal Biochem 1990; 185(2): 377-82. 266. Hawker JR Jr. Chemiluminescence-based BrdU ELISA to measure DNA synthesis. J Immunol Methods 2003; 274(1-2): 77-82. 267. Ucker DS, Obermiller PS, Eckhart W, Apgar JR, Berger NA, Meyers J. Genome digestion is a dispensable consequence of physiological cell death mediated by cytotoxic T lymphocytes. Mol Cell Biol 1992; 12(7): 3060-9. 268. Oberhammer F, Wilson JW, Dive C, Morris ID, Hickman JA, Wakeling AE, et al. Apoptotic death in epithelial cells: cleavage of DNA to 300 and/or 50 kb fragments prior to or in the absence of internucleosomal fragmentation. EMBO J 1993; 12(9): 3679-84. 155 269. Sakahira H, Enari M, Ohsawa Y, Uchiyama Y, Nagata S. Apoptotic nuclear morphological change without DNA fragmentation. Curr Biol 1999; 9(10): 543-6. 270. Rezaei PF, Fouladdel S, Hassani S, Yousefbeyk F, Ghaffari SM, Amin G, et al. Induction of apoptosis and cell cycle arrest by pericarp polyphenol-rich extract of Baneh in human colon carcinoma HT29 cells. Food Chem Toxicol 2012; 50(3-4): 1054-9. 271. Altonsy MO, Andrews SC. Diallyl disulphide, a beneficial component of garlic oil, causes a redistribution of cell-cycle growth phases, induces apoptosis, and enhances butyrate-induced apoptosis in colorectal adenocarcinoma cells (HT-29). Nutr Cancer 2011; 63(7): 1104-13. 272. Yuan HD, Quan HY, Zhang Y, Kim SH, Chung SH. 20(S)Ginsenoside Rg3-induced apoptosis in HT-29 colon cancer cells is associated with AMPK signaling pathway. Mol Med Report 2010; 3(5): 825-31. 273. Tsai YL, Chiu CC, Yi-Fu Chen J, Chan KC, Lin SD. Cytotoxic effects of Echinacea purpurea flower extracts and cichoric acid on human colon cancer cells through induction of apoptosis. J Ethnopharmacol 2012; 143(3): 914-9. 274. Park JB, Lee MS, Cha EY, Lee JS, Sul JY, Song IS, et al. Magnolol-Induced Apoptosis in HCT-116 Colon Cancer Cells Is Associated with the AMP-Activated Protein Kinase Signaling Pathway. Biol Pharm Bull 2012; 35(9): 1614-20. 275. Manikandan R, Beulaja M, Arulvasu C, Sellamuthu S, Dinesh D, Prabhu D, et al. Synergistic anticancer activity of curcumin and 156 catechin: an in vitro study using human cancer cell lines. Microsc Res Tech 2012; 75(2): 112-6. 276. Nicholson DW, Thornberry NA. Caspases: killer proteases. Trends Biochem Sci 1997; 22(8): 299-306. 277. Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, Okawa K, Iwamatsu A, Nagata S. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature 1998; 391(6662): 43-50. 278. Boykin C, Zhang G, Chen YH, Zhang RW, Fan XE, Yang WM, et al. Cucurbitacin IIa: a novel class of anti-cancer drug inducing nonreversible actin aggregation and inhibiting survivin independent of JAK2/STAT3 phosphorylation. Br J Cancer 2011; 104(5): 781-9. 279. Yang L, Wu S, Zhang Q, Liu F, Wu P. 23,24-Dihydrocucurbitacin B induces G2/M cell-cycle arrest and mitochondria-dependent apoptosis in human breast cancer cells (Bcap37). Cancer Lett 2007; 256(2): 267-78. 280. Suzui M, Inamine M, Kaneshiro T, Morioka T, Yoshimi N, Suzuki R, et al. Indole-3-carbinol inhibits the growth of human colon carcinoma cells but enhances the tumor multiplicity and volume of azoxymethane-induced rat colon carcinogenesis. Int J Oncol 2005; 27(5): 1391-9. 281. Tabopda TK, Mitaine-Offer AC, Miyamoto T, Tanaka C, Mirjolet JF, Duchamp O, et al. Triterpenoid saponins from Hydrocotyle bonariensis Lam. Phytochemistry 2012; 73(1): 142-7. 282. Malek SN, Lee GS, Hong SL, Yaacob H, Wahab NA, Faizal Weber JF, et al. Phytochemical and cytotoxic investigations of Curcuma mangga rhizomes. Molecules 2011; 16(6): 4539-48. 157 283. Watson JL, Hill R, Lee PW, Giacomantonio CA, Hoskin DW. Curcumin induces apoptosis in HCT-116 human colon cancer cells in a p21-independent manner. Exp Mol Pathol 2008; 84(3): 230-3. 284. Scott DW, Loo G. Curcumin-induced GADD153 gene up-regulation in human colon cancer cells. Carcinogenesis 2004; 25(11): 215564. 285. Tseng LM, Huang PI, Chen YR, Chen YC, Chou YC, Chen YW, et al. Targeting signal transducer and activator of transcription 3 pathway by cucurbitacin I diminishes self-renewing and radiochemoresistant abilities in thyroid cancer-derived CD133+ cells. J Pharmacol Exp Ther 2012; 341(2): 410-23. 286. Ding N, Yamashita U, Matsuoka H, Sugiura T, Tsukada J, Noguchi J, et al. Apoptosis induction through proteasome inhibitory activity of cucurbitacin D in human T-cell leukemia. Cancer 2011; 117(12): 2735-46. 287. Li Y, Wang R, Ma E, Deng Y, Wang X, Xiao J, et al. The induction of G2/M cell-cycle arrest and apoptosis by cucurbitacin E is associated with increased phosphorylation of eIF2alpha in leukemia cells. Anticancer Drugs 2010; 21(4): 389-400. 288. Murray AW. Recycling the cell cycle: cyclins revisited. Cell 2004; 116: 221–234. 158 10. EKLER Doktora eğitimim ve tez çalışmalarım süresince ilgisini ve desteğini daima hissettiğim, engin mesleki bilgi ve tecrübeleriyle eğitimimde ve çalışmalarımda yoluma ışık tutan, ileri görüşlülüğü ve geniş bakış açısı ile bana her zaman yol gösteren, sevgi ve hoşgörüsü ile daima yanımda olan değerli hocam, tez danışmanım, Sn Prof. Dr. Sevda MENEVŞE’ye, Doktora eğitimim süresince engin bilgi ve deneyimlerini büyük bir özveriyle aktaran, desteklerini her zaman hissettiğim çok değerli hocalarım Sn Prof. Dr. Adnan MENEVŞE’ye ve Sn Prof. Dr. Abdullah EKMEKÇİ’ye, Doktora tezimin oluşturulmasında ve her aşamasında bilgisini ve desteğini her zaman hissettiğim, dostluğunu, yapıcı tutumunu ve içten yardımlarını esirgemeyen Sn Yrd. Doç. Dr. Ebru ALP’e, Doktora eğitimim boyunca dostluklarını, tez çalışmalarım sırasında ise yardımlarını esirgemeyen, birlikte çalışmaktan mutluluk duyduğum tüm değerli bölüm arkadaşlarıma, Ailem… Hiçbir teşekkür benim için yaptıklarının karşılığı olamayacak… Sonsuz sevgilerini her zaman yanımda hissettiğim, büyük bir özveri ile her zaman ve her konuda bana destek olan, güvenen ve inanan, büyük emek ve fedakarlıkları ile bugünlere gelmemi sağlayan annem Sıdıka Rana YAR, babam Fatih YAR ve canımdan çok sevdiğim biricik kardeşim Cemre Eda YAR’a minnet ve şükran duygularımla, SONSUZ TEŞEKKÜRLERİMİ SUNARIM… 159 11. ÖZGEÇMİŞ Adı : Atiye Seda Soyadı : YAR Doğum Yeri ve Tarihi : Şanlıurfa, 01.01.1980 Eğitimi : 2008 - Gazi Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı, Doktora Eğitimi 2005 - 2008 Gazi Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı, Yüksek Lisans Eğitimi 2004 - 2006 Gazi Üniversitesi Eğitim Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Öğretmenliği, Tezsiz Yüksek Lisans Eğitimi 2004 - 2005 Ankara Üniversitesi Adli Tıp Enstitüsü, Adli Biyoloji Anabilim Dalı, Özel Öğrenci 1999 - 2004 Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Lisans Eğitimi 1995 - 1998 Antalya Çağlayan Lisesi, Lise Eğitimi 1991 - 1995 AKEV Koleji, Ortaokul Eğitimi 1986 - 1991 Selçuk İlkokulu, İlkokul Eğitimi Yabancı Dili : İngilizce Üye Olduğu Bilimsel Kuruluşlar: Tıbbi Biyoloji ve Genetik Derneği Moleküler Kanser Araştırmaları Derneği (MOKAD) The European Association for Cancer Research (EACR) Bilimsel Etkinlikleri: Projeler: 1. 2012 yılında Gazi Üniversitesi BAP fonunca desteklenen “Mutant ve Yabanıl Tip HCT-116 Kolon Kanser Hücre Hatlarında Farnesil Transferaz İnhibitörünün Apoptotik ve Anti-proliferatif Etkilerinin Araştırılması” konulu 01/2012-50 kodlu proje. 2. 2011 yılında Gazi Üniversitesi BAP fonunca desteklenen “Kolon Kanser Hücre Hatlarında Reseptör Tirozin Kinaz Ve JAK-STAT İnhibitörlerinin Apoptotik ve Anti-proliferatif Etkilerinin Araştırılması” konulu 01/2011-56 kodlu proje. 3. 2011 yılında TÜBİTAK fonunca desteklenen “Kolon Kanser Hücre Hatlarında Akt ve ERK1/2 inhibitörlerinin apoptotik ve antiproliferatif etkilerinin araştırılması” konulu 111S054 kodlu proje. 4. 2010 yılında Gazi Üniversitesi BAP fonunca desteklenen “Tiroid kanser hücre hatlarında Timokinon ve Genistein’in telomeraz aktivitesi ve apoptozis üzerine etkisi” konulu 01/2010-68 kodlu proje 5. 2010 yılında Gazi Üniversitesi BAP fonunca desteklenen “Yara yaşı tayininde apoptotik yolaktaki ilgili genlerin ifadelenmesi” konulu 01/2010-78 kodlu proje. 161 6. 2009 yılında Gazi Üniversitesi BAP fonunca desteklenen “Tıkayıcı Koroner Arter Hastalığı Üzerine Genetik Özelliklerin Etkisi” konulu 01/2009-15 kodlu proje. 7. 2008 yılında Gazi Üniversitesi BAP fonunca desteklenen “Ratlarda gebeliğin değişik dönemlerinde intrauterin dokularda PGF reseptörlerinin belirlenmesi” konulu 01/2008-33 kodlu proje. 8. 2007 yılında Gazi Üniversitesi BAP fonunca desteklenen “Streptozotocin ile oluşturulmuş diyabetli sıçanlarda Resveratrol kullanımı sonucunda Cyclooxygenase-2 Cyclooxygenase-1 (COX-2) genlerinin (COX-1) ve ekspresyonlarının araştırılması” konulu 01/2007-34 kodlu proje. 162
