Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi ECZ 344 Prof.Dr. Dilek AK

1
Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi
ECZ 344/8. Ders 22.05.2014
Prof.Dr. Dilek AK
YÖNTEM SEÇİMİ VE DEĞERLENDİRME
2
Yöntem Seçimi

Biyolojik sıvılarda ilaç analizi için yöntem seçiminde validasyon
parametreleri, hız ve kolaylık için farklı gereksinimler söz konusudur.

Örneğin,

aşırı doz için yapılan işlemlerde bol miktarda plazma numunesi ile
ekstraksiyon, kromatografik saflaştırma ve analiz basamakları izlenir.

Yüksek düzeyde kesinlik ve duyarlılık gerektiğinde ucuz olmayan ve
uzmanlık gerektiren yöntemlere ihtiyaç duyulur.

Analitik verilerin çok önemli olmadığı durumlarda ucuz bir yöntem veya
rutin bir deney protokolü kullanılır.
3
Yöntem Seçimi

İlacı sentezleyen kimyacı NMR ve kütle spektrumu yardımı ile gerekli yapısal
bilgileri sağlar.

UV spektrumu bilindiğinde sonraki kromatografik çalışmanın saptama
basamağı için önemli bir veri elde edilir.

ITK ile ön ilaç formu, yan ürünler ve parçalanma ürünleri veya metabolitler
ilgili bileşikten ayrılabilir.

Stabilite hakkında bilgi sahibi olmak çok önemlidir.
Analitik Profil
Bileşiğin Karakterizasyonu

Fizikokimyasal karakteristikleri

UV-görünür bölge spektrumu

Floresans spektrumu

ITK

HPLC

GC

Kütle Spektrometri

NMR

Çözünürlük
4
5
Fizikokimyasal Karakteristikler
Çalışılan bileşik için,

Çeşitli çözücülerde çözünürlük

İyonize olabiliyorsa bileşiğe ait pKa değeri

Molekül ağırlığı

Optikçe aktif formun varlığı
analizi yürüten tarafından bilinmelidir.
6
Ultraviyole-Görünür Bölge Spektrometri

Absorpsiyon düzeyi incelenir, yüksek mi? HPLC’de UV detektör dalga
boyuna buradan karar verilir.

Spektrum pH değişikliklerinden etkilenir mi? Absorpsiyonu ve duyarlılığı
artırmak için yararlıdır.

Absorpsiyon spektrumu spesifik değildir, ancak spesifik bir ekstraksiyon
işleminden sonra veya ilaç metabolizmaya uğramadığında uygulanabilir.

Absorpsiyon spektrumu metabolizmadan az etkilenir.
7
Floresans Spektrum

Floresans ışın yayma özelliği olan maddeler, kendilerine özgü dalga
boyundaki ışınlarla uyarılabilir ve tayin edilebilirler.

Floresans özelliği olmayan maddeler, üzerinde taşıdığı çeşitli fonksiyonel
gruplar kullanılarak türev oluşturabilen ajanlar ile türevi oluşturulduktan
sonra tayin edilebilir. Örn primer amin grubu taşıyan maddeler, floreskamin
ve dansil klorür ile türev yapılabilir. Ancak türevin kolayca oluşması ve
stabilitesi değerlendirilmelidir.

Metabolizma floresans karakteristiklerini değiştirebilir.
8
ITK

Analog ve potansiyel metabolitlerin yanı sıra parçalanma ürünleri ile ilgili
veri sağlar.

Lekelerin görünürleştirilmesinde kullanılan sprey reaktifler olası kolorimetrik
tayin için fikir verebilir.

Kantitatif sonuçlar için uygun değil (!)

Plazma analizi için nadiren densitometre ile kullanılır.

Densitometre, özellikle idrar numunelerinde ilaç suistimalinin
araştırılmasında, kolay, ucuz ve kullanışlı bir yol ile incelemeye imkan sağlar.
9
HPLC

Biyolojik sıvılarda ilaç analizi için en uygun yöntemdir. Özellikle ters-faz
sistemler (C8 ve C18 kolon ile) ayırma ve tayin başarıyla gerçekleştirilir.

Metabolitler polardır ve ana bileşikten önce elüe olur.

Kısa analiz süresi için yöntem optimize edilebilir.

pH etkisi dikkate alınmalı, iyon çifti kromatografi uygulanabilir.

Türevlendirme nadiren kullanılır
10
GC

Uçucu olmayan veya labil bileşiklerin türevleri için uygulanır.

Nonpolar sabit fazlar ( örn. OV-1)

Seçici sabit fazlar (örn. OV-101)

Türevlerin alıkonma karakteristikleri kullanılır.

Cihaz karakteristikleri biyolojik analizler için uygundur.

GC için bir yöntem geliştirilemiyorsa HPLC nin uygulanması da zordur.
11
Kütle Spektrometri

Bileşiklerin kütle spektrumları standart koşullarda belirlenmelidir.

KS nin bir cihaz olarak ilk uygulamaları biyolojik sıvılarda ilaç analizinde
saflaştırılmış metabolitlerin karakterizasyonu ile ilgilidir. Daha sonra daha
basit rutin işlemlerin spesifikliğini değerlendirmek için spesifik bir detektör
olarak kullanılmıştır.

Selective ion monitoring ve Tandem mass spectrometry’nin kullanılması,
KS’nin spesifikliğinin analiz yöntemlerinde hayati olduğunu göstermiştir.

Farklı tipteki iyonlaştırma işlemleri ve farklı türevler spesifik iyon verimini
artırmak için kullanılır ve eğer spektrum elde edilebiliyorsa analitik profil
derlemesinde yerini alabilir.
12
NMR

Biyolojik örneklerde ilaç analizi için fazla değerli bir yöntem değildi.

Kütle Spektrometri gibi, metabolitlerin karakterizasyonu için kullanılırdı. İzole
edilen metabolitin miktarı cihazdaki analiz için yetersiz düzeyde olurdu.

Modern yüksek alanlı cihazlar, bilgisayar teknikleri, NMR spektroskopisinin
daha iyi anlaşılması ile NMR kullanımı temel teknikler arasında yer
almaktadır.
13
Çözünürlük

Belirli çözücüler kullanılarak ilacın çözünürlüğü incelenmelidir, böylece en
iyi ekstraksiyon yöntemi belirlenebilir.

En uygun ekstraksiyon çözücüsü “ilacın tamamını yada büyük bir kısmını
endojen bileşik veya metabolitlerden çekip alan” çözücüdür.

Ekstraksiyonda geri kazanım düşük ise kesinlik de düşüktür

Zayıf asit ve bazlar için pH seçimi önemlidir.

pH-çözünürlük profili çıkarılmalıdır. Organik çözücü ile belirli bir pH deki
tampon çözelti arasında ilacın dağılımı için organik faza geçen ilaç miktarı
ölçülerek pH ya karşı grafiği çizilir. İlacın radyoaktif işaretlenmiş formu ile bu
işlemleri yapmak özelikle düşük derişimlerde kolaylık sağlar.
14
Yöntemin Seçimi

Ekstraksiyon koşulları

İç standart kullanımı
15
Ekstraksiyon Koşulları

Ekstraksiyon koşullarının teorisi lipofil özellik ve zayıf asit/bazların iyonizasyonuna
dayanır ve tamponlanmış biyolojik sıvıdan ilacın ektraksiyonu için optimum
koşullar fizikokimyasal özelliklerden tahmin edebilir. Ancak metabolitler ve
endojen bileşikler varlığında bu basit bir konu değildir.

Mevcut literatür bilgisi (pKa, logP, plazma proteinlerine bağlanma
karakteristikleri) ve benzer yapılar için oluşturulmuş ekstraksiyon şemalarından
yararlanılabilir.

Analitik profil verileri ve verimli bir ekstraksiyon şemasına karar verildikten sonra
seçici ölçüme olanak sağlayan bir ayırma tekniği ile biyolojik sıvıdaki
uygulamalara geçilir.

Bu aşamada biyolojik sıvının kendisi ve ilaç katılmış hali için uygun yanıtlar
alındığı takdirde metabolitler eklenerek işlemlere devam edilir.
16
Ekstraksiyon Koşulları


Olası sorunlar şunlarla ilgili olabilir:

İlacın proteinlere kuvvetli bağlanması (plazmadan kolayca ekstre edilemez).

Numunenin denaturasyonu sırasında çökmüş proteinlere ilacın istenmeyen
absorpsiyonu

Endojen bileşiklerden kaynaklanan girişim (kromatografi ve ekstraksiyon sırasında
bunların yeterince uzaklaşmaması).

Kromatografik sistemin yeniden gözden geçirilmesi ve daha seçici dedektörlerin
kullanılması çözüm olabilir.
Uygun bir sistem belirlendikten sonra miktar tayini yapılır. Yüzde geri kazanım
belirlenir. Kör numuneye bilinen miktar ilaç katılarak olası kayıplar kontrol edilir.
Tekrar edilebilir sonuçların eldesi partisyon düşük olsa bile değişkenlerin
yönteme etkisini azaltacaktır.
17
İç Standart (IS) Kullanımı

Özellikle kromatografik yöntemlerde uygun kullanımla kesinlik artar.

IS,

analite benzer yapıda olmalı,

bilinen derişimde olmalı,

analizden önce bilinen derişimlerde numuneye katılmalı,

derişimi analitinkine yakın olmalı,

ölçümler sonunda geri kazanım yüzdesi analitin yanıtlarını düzeltmek için
kullanılabilmelidir.
18
İç Standart (IS) Kullanımı

En yaygın uygulama analizden hemen önce final ekstreye katılmasıdır.
Ancak bu uygulama ekstraksiyon ile ilgili değişkenlikleri yansıtmaz.

Daha doğru bir uygulama IS nin orijinal biyolojik örneğe katılması ve tüm
işlemlerde yer almasıdır ve gerçek amaca daha uygundur.
19
İç Standart (IS) Kullanımı

Fizikokimyasal özellikleri analite yakın bir kimyasal yapıya sahip IS seçildiğinde,
ilgili pH değerinde sulu ve organik fazlarda partisyonu, kullanılan koşulların
tamamında stabilitesi, türevlerin dönüşümü, cam kaplara absorpsiyon ve
benzer protein bağlanma özellikleri uyumlu olacaktır.

Geniş bir aralıkta görülen geri kazanım değerlerini düzeltme kapasitesi ile
analizler arasında görülen ve kanıtlanamayan farklılıkları telafi etmek için
kullanılmalıdır.

Klinik çalışmalarda en uygun IS birlikte alınan bir ilaç olabilir.

Ölçümlerde hem IS hem analit sinyali (pik alanı veya pik yüksekliği) ölçülerek iki
bileşiğin yanıt oranları hesaplanır ve standart için aynı koşullarda hazırlanan
kalibrasyon eğrisi eşitliğinde çözülerek miktarları hesaplanır.

IS nin kesin değerinin bilinmesine gerek yoktur ancak numune ve standartlara
aynı miktarda katılması önemlidir.
20
İç Standart Kullanımı

pH partisyon profiline dikkat edilmeli, benzer ekstraksiyon karakteristikleri için ilaç
ve IS’nin partisyon profilleri (pH ya karşı ekstre edilen fraksiyon grafiği)
oluşturulmalıdır.

Analitik işlemlerin bir parçası olan bir transformasyon varsa İS de buna maruz
kalmalıdır.

Türevlendirmede sterik etkiler dikkate alınmalıdır.

IS, duyarlılıktaki değişimleri yansıtmalıdır.

Patolojik numunelerle çalışırken dikkat edilmelidir. Normal numunelerde
olmayan, farklı bileşenler analizi etkileyebilir.

İS seçerken yapısına dikkat edilmelidir.

Kalibrasyon ve deneysel örneklere aynı miktar katılması önem taşır, tam
derişiminin bilinmesine gerek yoktur.
21
Yöntemin Değerlendirilmesi

Toksikoloji ve metabolizma çalışmalarında çalışılan türler için girişim veya
metabolizmada farklar nedeniyle değerlendirme gerekir.

Mevcut literatür bilgisinden hareketle uygulanacak yöntem seçilerek
analizin yapılacağı laboratuvar koşullarına uygun hale getirilmelidir. Bunun
için,

Kesinlik

Doğruluk

Spesifiklik

LOD
22
Kesinlik

Bir yöntemin kesinliği tekrarlı ölçümler arasındaki uyum olarak tanımlanır.
SD, RSD ile ifade edilir.

Beklenen derişim aralığında 6 derişimde 6 tekrar analizi tavsiye edilir, gün içi
ve günler arası kesinlik oluşturulur. RSD farklı derişimlerdeki kesinliğin
değerlendirilmesinde daha iyi fikir verir.

Günler arası kesinlik, rutin analizlerin yapıldığı laboratuvarlar için çok
önemlidir.

Analizcinin yetenek ve deneyimi ile cihazın güvenirliğini gösterir.
23
Doğruluk

Bulunan miktarlar ile gerçek değer arasındaki uyumdur. Deney sonucu
bulunan değerlerin bilinen değerler ile karşılaştırılması ile belirlenir.

Materyalin bilinen miktarlarını biyolojik ortama katarak veya aynı
numuneye referans yöntem uygulayarak belirlenir.

Kalibrasyon grafiği analizci tarafından hazırlanmış ise ve bu doğruluk
belirlenmesinde kullanılıyorsa bu durum ifade edilmelidir.
24
Spesifiklik

Endojen bileşikler ve metabolitler varlığında analitik yöntemin tayini
amaçlanan bileşik için yanıt üretme yeteneğidir.

Kromatografik çalışmalarda pikin yerinin kör çalışmada boş olması gerekir.

Analiz edilen ilaç ile metabolit piki üstüste geldiği zaman teşhis için kütle
spektrumları standart maddelerinki ile karşılaştırılmalıdır.

Metabolitler ve diğer ilaçlarla ilgili olası girişim için yöntem test edilmelidir.
25
Saptama Sınırı (LOD)

Körden (blank) farklılaşan ölçülebilen en küçük derişim değeridir.

Bu terim duyarlılık olarak da ifade edilir ancak LOD daha doğrudur.
Duyarlılık derişim yanıt kalibrasyon grafiğinde eğimi tanımlamak için de
kullanılır.

%20 bağıl standart sapma kabul edilebilir kesinlik değeridir.
26
Analitik Yöntem Raporu

Beklenen duyarlık düzeyi ile birlikte problemin genel ifadesi

Önerilen yöntemin detaylı tarifi

Yöntem geliştirme



Ekstraksiyon koşulları

Çözücülerde ilacın stabilitesi

Kromatografik sistemin seçimi

Saptama sisteminin seçimi
Yöntemin değerlendirilmesi

Yöntemin geri kazanımı

Kesinlik

Doğruluk

Spesifiklik

Duyarlılık
Uygulama