YAC (Yeast Artificial Chromosome) Maya Yapay Kromozomu

YAPAY KROMOZOMLAR
Yapay kromozomlar ilk defa
tomurcuklanan maya olan Saccharomyces
cerevisiae.’de kurulmuştur. Halkasal
plazmid maya sentromerinden,replikasyon
orijininden, seçici bir işaret geninden ve
bir palindromik telomerik yapılardan
oluşur.
1
Doğrusal yapılar, 50 kb uzunluğunda, bir
sentromer içeren, bir replikasyon orijini ve
replike olmuş iki telomer and %99 doğrulukta
ayrışım gösteren mitoz bölünmede en az 20
nesil boyunca kültürde kaybolmayan yapılardır.
2
YAPAY KROMOZOMLARIN
TARİHİ


Kromozomlar 1880’de isimlendirildi
fakat bu onların kalıtım bilgisini
içeren moleküler kompleksler olduğunu
açıkça göstermiyordu.
1980’lerde yapısı bozulmuş gerçek
kromozomu taklit eden nukleoprotein
yapıda kompleksleri oluşturulması
denenmiştir.
3

Doğal kromozomların işlevsel olan ve olmayan
dizilerinin analizi yerine bunlar üzerinde çalışılmıştır.

Yapay kromozomların de novo formasyonlarının
oluşmasında klonlanmış kromozomal DNA
elementlerinin transferi öncülük etmiştir. Bu
elementler tekrarlanmış telomerik ve sentromerik
DNA, Ori/ARS bölgeleri, çok klonlama bölgeleri ve
işaret genler.
4
YAC
(Yeast Artificial Chromosome)
Maya Yapay Kromozomu
5
Maya yapay kromozomları (YACs)
genellikle yabancı DNA’ların (Örneğin
insan DNA’sı) çok büyük bir parçasını
klonlamak için kullanılan vektörlerdir.
6
YAC’lar karakteristik olarak 250.000 ile 1
milyon baz çifti uzunluğundadır.
YAC’lar ilk olarak Burke tarafından 1987’de
yaratılmıştır. O günden sonra YAC’lar büyük ölçüde
fiziki haritalamada, contig yapımında ve harita
bazlı gen klonlamasında kullanılmıştır.
7
YAC; sentromer, replikasyon orijini
ve S.cerevisiae’nın içine girebilmesini
kolaylaştıran iki telomere sahiptir. Ek
olarak her kromozom kolu seçilebilir
ürünleri kodlayan genleri içerir.
8
Bunlar, doğal maya kromozomlarının
temel işlevsel kısımlarının birleştirilmesiyle
meydana getirilir. Daha sonra yabancı DNA
parçası ile birleştirilir.
9
Meydana gelen bu kromozom tekrar maya
hücresine (sanki maya kromozomunun normal
bir parçasıymış gibi) sokulur. Sonuç olarak
oluşan koloni hücrelerinin her biri yabancı
DNA’nın aynı parçasını içeren bir kopyasını
taşır.,
10
11
İşlevsel YAC, kendi kendinin çoğalmasını
mümkün kılan 3 tane spesifik DNA
fragmentine ihtiyaç duyar
1.Telomer: Her kromozomun sonunda
bulunur. Doğrusal DNA’yı nükleazlar
tarafından kesilmekten korurlar.
12
2.Sentromer: Mitotik iğ ipliklerinin
bağlanma bölgesidir.
3.Replikasyon Orijini: DNA replikasyon
makinelerinin DNA üzerine tutunmasını
sağlayan özel DNA dizileridir.
13
14
Yapay kromozomlara birkaç özel diziler
de eklenebilir. Örneğin:
•Seçici İşaretler (Selectable marker): Yapay
kromozomu alan maya hücrelerinin kolay
izolasyonuna imkan verir.
•Tanıma Bölgeleri : İki restriksiyon enzimi
içindir (EcoRI ve BamHI)
15
YAC’LARIN FAYDALARI ve
KUSURLARI
YAC vektörlerinin esas kullanım
avantajı; onların 200-800 kbp
büyüklüğünde DNA parçasıyla
birleşebilmesidir.
16
Maya hücresine klonlanabilen en uzun
DNA parçası 0.5 ile 1 milyon nükleotid
arasındadır. Bakteri de ise yaklaşık olarak
sadece 50.000 nükleotiddir. Büyük
insertlerin olması daha az klonun
incelenmesini sağlar.
17
YAC’lar bilim adamlarının büyük ve
kompleks kromozoma sahip
organizmaların genetik özelliklerinin
büyük parçalarıyla çalışmalarını
mümkün kılar.
18
İnsan genomunun tamamını
haritalamak için (3x1.000.000.000
nükleotid baz çifti) 100.000’den fazla
plazmid klonuna ihtiyaç duyulur fakat
yaklaşık 10.000 YAC klonuyla
gösterilebilir.
19
YAC’ların kullanımının dezavantajı ise düşük
transformasyon verimidir. Ayrıca YAC transformantları
görüntülenmeden önce ayrı ayrı muamele edilmelidir.
Bundan başka, transformant hücrelerden büyük
miktarlarda rekombinant DNA elde etmek güçtür.
20
YAC’lar BAC’lardan daha az kararlıdır.
Bir çok halde protein üretimi için BAC’lar
kullanılsa da bazı hallerde endotoksin
eksikliğinden dolayı YAC’lar daha iyi vektör
oluyorlar.
21
Hepatit B antijeninin üretiminde
YAC’lar kullanıldığı zaman ürünler
E.coli de üretilenlerden daha yüksek
aktiviteye sahip oluyorlar.
22
YAC’a yabancı bir DNA’nın klonlanması 4 ana
adımda gerçekleşir.
1. Genomik DNA restriksiyon enzimi olan
EcoRI ile kısmen kesilir ve çok büyük bir
DNA parçası elde edilir.
2. YAC 2 restriksiyon enzimi ile (EcoRI ve
BamHI) ile kesilir.
23
3. Bu iki element EcoRI bölgesinde rekombine olur
ve DNA ligaz tarafından kovalent bir şekilde
bağlanır.
4. Rekombinant YAC vektörü, genomik DNA içeren
maya yapay kromozomu, üretilmiş olur. Bu vektör
maya hücrelerini enfekte etmek için kullanılabilir
ve sınırsız sayıda kopya üretilebilir.
24
YAC TEKNOLOJİSİNİN
UYGULAMALARI
YAC’ın esas uygulaması genom
araştırmalarının başlangıç aşamasında
kullanıldı. YAC’lara genomların fiziksel
haritalarının çıkarılmasında ihtiyaç
duyulur.
25
Mayalar,insan DNA’sında olduğu gibi yüksek
derecede tekrarlanmış dizileri içeren yabancı
DNA’lara karşı daha fazla toleranslıdır. YAC’ların
ortaya çıkışıyla insan genomik kitaplıklarının
üretimi kolaylaştırılmıştır. Bu andan itibaren YAC
kitaplıkları Arabidopsis ve insan genom projesinde
kullanılmıştır.
26
Fiziksel harita iki nedenle
faydalıdır. Birincisi; fiziksel harita
genomun genetik olarak tanımlanmış her
bölgesinden faydalanma imkanı sağlar.
İkincisi ise; küresel genomik çalışmalar
için bir başlangıç noktası sağlamasıdır.
27
YAC’lar büyük genlerin klonlanmasında kullanıldığı
gibi HAC’ların kurulmasında da kullanılabiliyorlar. YAC’lar
genlerin klonlanması için olduğu kadar memeli telomerik ve
sentromerik bölgeleri ve replikasyonun kromozomal orijini
içinde kullanışlıdır. Bu nedenle HAC’ların gelişmesinde
önemlidirler.
28
BAC
(Bacterial Artifical Chromosome)
Bakteri Yapay Kromozomu
29
Bakteri yapay kromozomu:
Orta büyüklükte DNA parçası (100.000-
200.000 baz büyüklüğünde) ile birleşen
bakteriyel DNA’dır. Bu DNA parçasının
bakteride çoğalmasını ve dizilenmesini
sağlar.
30
Genom Analizi İçin BAC
Kitaplıkları
Harita bazlı klonlamanın ve büyük
kromozomal bölgelerin fiziksel analizinin
başarısı için esas olanlardan biri genomik
DNA’nın büyük insertlerini içeren
kitaplıkların elde edilmesidir.
31
32
Son yıllarda BAC kitaplıkları insan, fare, ve
Arabidopsis, domates, arpa, mısır ve sorghum gibi
bitki türleri için kurulmuşlardır.
Bu kitaplıkların, büyük bölgelerin fiziksel
haritalarının üretiminde ve bir çok önemli genin
izolasyonunda değerli katkıları vardır.
33
BAC kitaplıları YAC kitaplıklarının birçok
dezavantajının üstesinden gelmektedir. Bu
sistem F faktörü bazlı vektörü kullanıyor ve
insan genomik DNA’sının 300 kb’den büyük
parçasını bulundurma kapasitesine sahiptir.
34
YAC klonlamayla karşılaştırıldığında DNA
yüksek verimle klonlanır, kolaylıkla manipüle edilir ve
E.coli ‘de kararlılığını sürdürür.
Bitki BAC kitaplıkları birçok ortak çalışmada
başarıyla kullanılmıştır. Örneğin hastalık direnç
genleriyle ilişkili BAC klonları Arabidopsis ve pirinç
kitaplıklarından izole edilmişlerdir.
35
BAC klonları, bitki kromozomlarında
FISH analiziyle haritalanabilir. Bu teknik,
genomik klonların kromozomal
yerleşimlerinin hızlı tayini için veya genetik
olarak haritalanmış klonların arasındaki
fiziksel mesafenin tayini için kullanılabilir.
36
BAC kitaplıkları kısa zamanda
kurulabildiği ve YAC kitaplıklarından
daha verimli analiz edilebildiği için BAC
sistemi, bitki genom analizi için çok
önemli bir araçtır.
37
MAC
(Mammalian Artificial Chromosome)
Memeli Yapay Kromozomları
38
39
Memeli yapay kromozomları sentromer,
DNA replikasyon orijini ve telomer
bölgelerinin bir araya getirilmesiyle
oluşturulmuştur.
MAC’lar çok büyük genomik parçaları
taşıyabilirler
40
MAC oluşumu YAC’a göre çok daha
zordur.Çünkü memeli telomeri maya telomerinden
10-100 kat; memeli sentromeri ise maya
sentromerinden yaklaşık 1000 kat daha büyüktür.
Memeli sentromer ve telomer dizilerinin çok
fazla sayıda tekrarlanması da memeli yapay
kromozomu oluşturulmasını zorlaştırır.
41
MAC, memeli kromozomunun işlevi için
zorunlu olan cis-acting DNA dizilerinin analizine
olanak verir.
MAC’ın yapısı, normal kromozom replikasyonu
ve ayrışması için ihtiyacımızın ne olduğunu
anlamamızı sağlar.
42
MAC’ların telomerli, sentromerli ve replikasyon
fonksiyonlu yapısına 2 yöntemle ulaşılabilir.
Birincisi: “top down” adı verilen yöntemle, yapay
olarak indüklenmiş kromozom parçalarını, normal
kromozomların mitotik özelliklerini bulunduran minimal
kromozomları tanımlayıcı araç olarak kullanmaktır.
43
İkinci yaklaşım ise “Build up” adı verilen;
işlevsel olarak tanımlanmış telomer
tekrarlarıyla birlikte aday sentromer ve
replikasyon orijin dizilerini içeren MAC
vektörlerini toplamayı denemek üzerine
yoğunlaşır.
44
MAC’lar gen terapisi için ve
transgenik hayvanların üretiminde
faydalı olabilecek genlerin hücre içine
transferinde kullanılmaktadır.
45
HAC
(Human Artificial Chromosome)
İnsan Yapay Kromozomları
46
HAC oluşturulmasında 2 yöntem
vardır.
Doğal kromozomlar parçalanarak ve
de novo kromozomlar oluşturularak.
47
İlk yöntem TACF veya TDT 1991
yılında geliştirilmiştir.Bu yöntem hedef
seçilen kromozomlardan minikromozomlar
oluşturulmasına dayanır.Seçici marker ve
çalışılan kromozomun herhangi bir
bölgesine homolog olan bir dizi kullanılır.
48
Oluşan bu yapıya “engineered
minichromosome” adı verilir. Bu
minikromozomlar otonomdur.Bu yöntem
özellikle insan X ve Y kromozomlarında başarı
göstermiştir.
49
İkinci yaklaşım ise insan telomer
ve sentromer dizilerini insan kültür
hücrelerine aktararak büyüklüğü 1-10
Mb’a kadar değişen de novo kromozom
oluşturmaktır.
50