abc abc abc abc abcabc abc abc abcabc abc abc abc

Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2009 Cilt:20-1
SEYHAN BARAJ GÖLÜ’NDEN İZOLE EDİLEN ENTEROBACTERIACEAE
GRUBU BAKTERİLERDE ANTİBİYOTİK DİRENÇLİLİĞİ VE PLAZMİD
*
PROFİLLERİNİN BELİRLENMESİ
Antibiotic Resistances Of Enterobacteriaceae İsolated From Seyhan Dam And
Determination Of Plasmid Profile
Prof. Dr. Sadık DİNÇER
Biyoloji Anabilim Dalı
Yasemin KAYA
Biyoloji Anabilim Dalı
ÖZET
Bu çalışmada Seyhan Baraj Gölü’den izole edilen Enterobacteriaceae
grubu 88 bakteri suşunun çoklu antibiyotik dirençliliği (MAR) belirlenmiştir.
İzolatların plazmidleri izole edilerek her bakteriye ait plazmid profili belirlenmiştir.
İzolatlardan MAR indeksi 1 olan tek bir bakteri belirlenmiş ve bu suş Escherichia
coli olarak tanımlanmıştır. İzolatlardan 14 tanesinin MAR indeksinin 0.142 olduğu
belirlenmiştir.
Plazmid izolasyonunda 40 izolatın (% 45.5) plazmid içerdiği belirlenmiştir.
Antibiyotik sayılarının plazmid ile ilşkilerine bakıldığında 7 antibiyotiğe karşı dirençli
olan Escherichia coli suşunda hiç plazmid DNA bandı gözlenmemiştir. Tek
antibiyotiğe dirençli olan diğer bir Escherichia coli suşunda ise toplam 7 plazmid
DNA bandı olduğu belirlenmiştir. Beş farklı antibiyotiğe dirençli olan yine bir diğer
Escherichia coli suşunda ise 14 plazmid DNA bandı gözlenmiştir.
Anahtar Kelimeler : Enterobacteriaceae, Seyhan Baraj Gölü, Antibiyotik
Dirençliliği, Plazmid izolasyonu, Elektroforez
ABSTRACT
In this study, Multiple antibiotic resistance was determined 88
Enterobacteriaceae strains which were isolated from Seyhan Dam. Plasmids of
these strains were isolated and each of these strains plasmide profile was
determined.
MAR index of one strain was determined to be 1 and this strain was
identified as Escherichia coli. MAR index of 14 strains in total 88 isolates were
determined to be 0.142.
It was determined that 40 isolates contain plasmid in 88 total isolates. It
were seen that relationship with antibiotic count and plasmid profile, Escherichia
coli, which was resist to 7 antibiotic, has not any plasmid. But another strain of
Escherichia coli, which was resist to 1 antibiotic, has contain total 7 plasmid bands.
Moreover, the other Escherichia coli strain resist to 5 antbiotics. But it has 14
plasmid bands.
Key Words : Enterobacteriaceae, Seyhan Dam, Antibiotic Resistance, Plasmid
isolation, Electrophoresis
*
Yüksek Lisans Tezi-MSc. Thesis
22
Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2009 Cilt:20-1
Giriş
Mikroorganizmalar değişen çevre koşullarına hızla uyum sağlayabilme
yeteneklerine sahip yeryüzünün en eski canlılarıdır (Demirtürk ve Demirdal, 2004).
Akuatik çevrelerde bakteriler ekosistemin doğal bir parçasıdır (Robinson ve
Tuovinen, 1984). İnsanların günlük yaşam gereği harcadığı ve kullanım sularının
oluşturduğu atık sular, çeşitli şekillerde yerleşim birimlerinden çevre sularına
katılmaktadırlar. Bu nedenle sucul ortamlar, katılan suların içerdiği kirlilik
etkenlerine bağlı olarak organik ve inorganik maddeler tarafından kirletilmektedir
(Karayakar ve ark., 2004).
Evsel atıklar, R-plazmidi taşıyan ve çoğunluğu insan barsak florasından
kaynaklanan bakteriler içerir. Bu bakterilerde antibiyotiklere dirençlilik kazandıran
R-plazmidleri yaygın olarak bulunduğundan, atık suların çevre sularına deşarjı, bu
tip dirençli bakterilerin çevreye yayılmasına neden olmaktadır (Karayakar ve ark.,
2004).
Son yıllarda antibiyotiklere karşı giderek artan direnç sorunu tüm dünyayı
tehdit eder hale gelmiştir (Akçam ve ark., 2004). Bugün için ise klinik önemi
bulunan bakterilerde antibiyotik dirençliliği ile ilgili 100’den fazla gen bulunduğu
bilinmektedir. Bir diğer yönden dirençlilik yayılabilir bir özelliktir ve oluştuktan sonra,
büyük bir hızla sadece aynı tür ve cinsler içinde değil, plazmid ve transpozonlar
gibi aktarılabilir genetik materyallerle diğer bakterilere de geçebilmektedir
(Doğancı, 2001).
Antibiyotikler, bazı bakteri ve mantar türü mikroorganizmalar tarafından
üreme ortamlarında oluşturulan ve başka mikroorganizmalar için mikrobiyostatik ya
da mikrobisid etki gösteren ve sağaltımda kullanılan maddelerdir (Bilgehan, 1994).
İlk defa İskoç bakteriyolog Alexander Fleming’in 1929’da gözlediği ve 1940
yılında Chain ve Flarey’in Penicillium notatum’un salgılarından elde ettiği ve
penisilin adını verdikleri ilacın birçok mikroba öldürücü etkide bulunmasının
keşfedilmesi bir devrim olmuştur. İnfeksiyon hastalıklarının tedavisinde
antibiyotikler son 50 yılda son derece faydalı olmuşlar ve eskiden öldürücü olduğu
bilinen pek çok hastalığın tedavisi için vazgeçilmez unsurlar haline gelmişlerdir
(Berzeg, 2005).
Antibiyotik direnci; bir mikroorganizma türünün bazı suşlarının
antibiyotikten etkilenmemesi ya da antibiyotiğe duyarlı bir suşun çeşitli direnç
mekanizmalarından biri ile dirençli hale dönmesi olarak tanımlanır (Demirtürk ve
Demirdal, 2004).
Antimikrobik kemoterapötik maddeler günümüzde etki mekanizmalarına
göre 5 gruba ayrılır;
1. Hücre duvarı sentezini inhibe edenler
2. Sitoplazmik membranın yapı ve fonksiyonunu inhibe edenler
3. Protein sentezini inhibe edenler
4. Kimyasal yapılarındaki benzerlik dolayısı ile bakteri metabolizmasını
bozanlar
5. Nükleik asit sentezini inhibe edenler (Baştürk, 2005).
23
Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2009 Cilt:20-1
Kazanılmış antibiyotik direnci, ya mikroorganizma kromozomunda oluşan
mutasyonlarla ya da dirençli bir mikroorganizmanın direnç genini duyarlı
mikroorganizmalara aktarması ile ortaya çıkar. (Demirtürk ve Demirdal, 2004).
Kromozom dışında, bakterilerin içinde bulunan, DNA yapısında içinde
bulunduğu hücreye bazı önemli özellikler kazandıran ve bu özellikleri genetik
kontrol altında tutan elementlere plazmid denilmektedir. Plazmidler çift iplikli DNA
molekülünden yapılmış, sitoplazma içinde dairesel yapıda bir uçları ile bakteri
sitoplazmasının bir noktasına bağlanmış şekilde, bakteri kromozomundan ayrı
olarak replike olabilen bakteri kromozomundan daha küçük genetik elementlerdir
(Bilgehan, 2002).
Plazmidler antimikrobiklere ve ağır metallere direnç genleri yanında değişik
virulans faktörlerini de taşıyabilirler. R-plazmidi denen direnç plazmidleri bir veya
daha çok sayıda antibiyotiğe karşı direnç genlerini taşımaktadır. Direnç plazmidleri
diğer duyarlı bakterilere transdüksiyon, transformasyon ve konjugasyon olaylarıyla
geçerek direnç gen paketini aktarır ve böylece direncin yayılmasına neden olur
(Gür, 1994).
Bilinen başlıca plazmidler şunlardır:
1. F faktörleri (Fertilite=Cinsel=Seks faktörleri)
2. F’ faktörleri
3. Col plazmidleri (Kolisinojenik faktörleri)
4. R plazmidleri-RTF faktörleri
5. Stafilokok plazmidleri
Bakterilerde antibiyotiklere ve kemoterapötik ilaçlara karşı ekstra
kromozomal dirençliliğin bakteriden bakteriye aktarılmasını yöneten kromozom dışı
elementlerin bulunduğu belirlenmiştir. Bu faktörlere kısaca RTF (rezistans transfer
faktörü) adı verilir. Bakteri hücresi içinde çembersel ya da düz olarak bulunurlar
(Bilgehan, 1994). Bakteri kromozomu ile de integre olabilirler (Arda, 1995). RTF
faktörü bulunduran bakterilerden bu faktörü olmayanlara kemoterapötiklere karşı
direnç genlerinin aktarılması, bu faktörlerin kontrolü altında yapılır (Bilgehan,
1994).
Mikroorganizmalar arasında gerek in vitro ve gerekse in vivo koşullarda
gen veya genetik madde aktarımı meydana gelmektedir. Mikroorganizmalar
arasında genetik madde aktarımı beş farklı tipte meydana gelmektedir. Bunlar;
1- Transformasyon
2- Konjugasyon
3- Transdüksiyon
4- Elektroporasyon
5- Protoplast füzyon (Akan, 1992).
24
Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2009 Cilt:20-1
Materyal ve Metot
Materyal
Bakteri Suşları
Balcı (2007), tarafından Seyhan Baraj Gölü’nden 02.11.2005,
29.12.2005,22.03.2006 ve 20.06.2006 tarihlerinde, arazi üzerinde belirlenen 7
farklı istasyondan alınan su örnekleri laboratuara getirilip, bakteri izolasyon
yöntemleri uygulanarak saf kültür halinde elde edilen, identifikasyonları ve
antibiyogramları yapılan bakteri suşları çalışmamızda kullanılmıştır.
Plazmid izolasyon Kiti
Çalışmamızda
kullandığımız
bakteri
suşlarının
plazmidlerinin
izolasyonunda hazır plazmid izolasyon kiti kullanılmıştır (Roche applied science
high pure plazmid isolation kit. Cat no: 11 754 777 001).
Metot
Çizelge 1. Örnek Toplama İstasyonlarının Özellikleri (Balcı, 2007)
İstasyonlar
Özellikleri
Birinci istasyon
Seyhan nehrinin ilk giriş noktasıdır.
İkinci istasyon
Seyhan nehrinin baraj suyuyla karıştığı nokta olup yeni yapılmış
henüz kullanımda olmayan yerleşim yerlerinin bulunduğu
istasyondur.
Üçüncü istasyon
Çakıt nehrinin baraja döküldüğü ilk noktadır.
Dördüncü istasyon
Çakıt nehrinin yerleşim yerlerine olan başlangıç noktasıdır.
Beşinci istasyon
Çakıt ile Seyhan nehrinin baraj suyuyla birleştiği yerdir.
Altıncı istasyon
İki su kaynağının gölün suyuyla karıştığı bölge, Adnan
Menderes yarımadasının orta bölgesidir
Yedinci istasyon
Suyun drenaj noktasına gittiği bölge, Kayıkhanenin karşısıdır.
Çoklu Antibiyotik Direnci (MAR) İndeksi
Çoklu antibiyotik dirençliliği (MAR) indeksi test organizmalarının dirençli
olduğu antibiyotik sayısının toplam denenen antibiyotik sayısına oranı ile
hesaplanmaktadır. Çoklu antibiyotik dirençliliği (MAR) indeksi verilen
populasyonlarda bakteri direnç yayılımını göstermektedir. Hesaplanan MAR
indeksi sonucu eğer 0.2’den daha büyükse birkaç antibiyotiğin kullanıldığı ortam
kökenli bakteri suşlarının varlığını gösterir (Ehinmidu, 2003).
Çalışmamızda kullandığımız 88 izolatın plazmid izolasyonu yapılmıştır ve
agaroz jel elektroforez yöntemi uygulanmıştır.
25
Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2009 Cilt:20-1
Araştırma Bulguları
Çalışmada izole edilen bakterilerin toplamı hesaba katıldığında 14 bakteri
suşunun (% 15.90) MAR indeksi 0.142, 11 bakteri suşunun (% 12.5) MAR indeksi
0.285, 16 bakteri suşunun (% 18.2) MAR indeksi 0.428, 27 bakteri suşunun (%
30.68) 0.571, 17 bakteri suşunun (% 19.32) 0.714, 2 bakteri suşunun (% 2.27)
0.857 ve bir bakteri suşunun (% 1.14) 1,000’dir.
Yüzey sularından izole edilen bakterilerin antibiyotik kullanımına bağlı
olarak gösterdikleri çoklu antibiyotik dirençliliği artmaktadır. Benzer konularda
yapılan çalışmalarda elde edilen bulgular sonuçları desteklemektedir. Go-Ni-Urriza
ve arkadaşları (2000), nehrinden izole edilen Enterobacteriaceae spp. suşlarının
%72’sinin, Aeromonas sp. suşlarının ise %20’sinin nalidiksik aside karşı dirençli
olduğunu tespit etmişlerdir. Enterobacteriaceae sp izolatlarının tetrasikline %24.3,
beta-laktamlara %20.5 dirençli olduklarını, Aeromonas sp izolatlarının ise
tetrasikline %27.5, co-trimoksazole %26.6 dirençli olduklarını bulmuşlardır.
Bakterilerde çoklu antibiyotik dirençliliğinin gelişmesinde çeşitli faktörler rol
oynamaktadır. Colamiris ve ark., (1984), zararsız olarak tanımlanan bazı
bakterilerde R-faktörlerine bağlı MAR dirençliliği olduğunu tespit etmişlerdir.
Antibiyotiklere
karşı
geliştirilen
direnç
kromozomal
olabileceği
gibi
ekstrakromozomal kökenli de olabilmektedir.
Çalışmada izole edilen 88 Enterobacteriaceae grubu bakterilerin tamamı
kullanılarak plazmid izolasyonları gerçekleştirilmiştir.
Seçilen bakteri suşlarından izole edilen plazmidlerin büyüklükleri agaroz
jelde yürütülen marker DNA’sına göre belirlenmiştir.
Çalışmada izole edilen 88 bakteriden gerçekleştirilen plazmid
izolasyonunda 40 bakteride (% 45.5) plazmid saptanmıştır.
Plazmid izole edilen bakterilerde, 5 farklı antibiyotiğe dirençli olan 1
bakterinin (% 1.14) izole edilen 14 plazmid bandı olduğu, 1 bakterinin (% 1.14) 13
plazmid bandı olduğu ve bir bakterinin de (% 1.14) 12 plazmid bandı olduğu
belirlenmiştir. 6 farklı antibiyotiğe direnç gösteren 2 bakteride (% 2.27) ise 2
plazmid bandı olduğu belirlenmiştir. 2 farklı antibiyotiğe dirençli olan 2 bakteride
(% 2.27) ise 7 plazmid bandı olduğu belirlenmiştir. Tek antibiyotiğe dirençli olan 1
bakteride (% 1.14) ise 7 plazmid bandı olduğu belirlenmiştir. 5 farklı antibiyotiğe
dirençli olan 1 bakteride (%1.14) ise tek plazmid bandı olduğu belirlenmiştir.
7 farklı antibiyotiğe direnç olan 1 bakteride (% 1.14) ise plazmid bandı
gözlenmemiştir. Yine 4 farklı antibiyotiğe dirençli olan 21 bakteride de (% 23.86)
plazmid bandı gözlenmemiştir.
Shah ve Stille (1983), yaptıkları çalışmalar sonucunda Almanya’da betalaktam antibiyotiklere karşı Klebsiella pneumoniae ve Escherichia. coli suşlarının
dirençlilik kazandıklarını tespit etmişlerdir. Saunders (1984), farklı konaklardan
izole edilen suşlar arasında antibiyotik dirençliliğinin plazmidlerle aktarıldığını
bildirmiştir.
26
Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2009 Cilt:20-1
Tartışma ve Sonuçlar
Bu çalışmada Seyhan Baraj Gölünden 7 farklı istasyon belirlenerek 4 farklı
zaman aralığında yüzey suyu ve dip suyu örnekleri toplanarak bu örneklerden izole
edilen Enterobacteriaceae grubu bakterilerin antibiyotik dirençlilik düzeyleri tespit
edilmiş ve bu dirençliliğin plasmid kökenli olup olmadıkları, izole edilen plasmidlerin
büyüklükleri elektroforez yapılarak tespit edilmiştir.
2. 4. ve 6. istasyonlar insan aktivitelerinin en fazla olabileceği bölgeler olup
bu bölgelerden izole edilen Enterobacteriaceae grubu bakterlerde antibiyotik
dirençlilik düzeyinin yüksek olduğu belirlenmiştir.
İzolatların 14’ü bir antibiyotiğe dirençli iken 5. istasyondan izole edilen ve
Escherichia coli olarak tanımlanan 88 izolatın 1 tanesinin çalışmada kullanılan 7
antibiyotiğe karşı dirençli olduğu tespit edilmiştir. Diğer izolatların ise en az 2
antibiyotiğe dirençli olduğu belirlenmiştir.
Yoğun antibiyotik kullanımı genellikle plazmide bağlı dirençliliğinin ortaya
çıkmasında önemli rol oynamaktadır. Seyhan Nehri’nin mikrobiyal kontaminasyona
maruz kalması, izole edilen bakteriler arasında 7 antibiyotiğe dirençli organizma
izole edilmiş olması bu durumların halk sağlığı açısından ciddi problemler teşkil
edebileceğini düşündürebilir.
Sulak alanların mikrobiyal kirlilikten kurtarılması ve daha fazla kirlenmesini
engellemek için göle giren fekal kökenli kirlilik kaynaklarının ve atık su deşarjlarının
önlenmesi büyük öneme sahip olacaktır. Bu sulak alanlara yakın bölgelerde imara
açılacak olan sitelerin özellikle atık suların sulak alanlara verilmemesi ve
kaçaklardan kaynaklanacak kirlenmenin önüne geçilmesi öneriler arasında
sunulabilir.
Kaynaklar
AKÇAM, F. Z., GÖNEN, İ., KAYA, O., ve YAYLI, G., 2004. Hastane İnfeksiyonu
Etkeni Enterobakterilerde Beta-laktam Antibiyotiklere Duyarlılık ve ESBL
Sıklığının Araştırılması. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fak. Dergisi,
11(1):6-9
BAŞTÜRK, S., 2005. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
aeruginosa ve Acinetobacter baumannii Suşlarında Çeşitli Kinolon Grubu
Antibiyotiklerin Duyarlılıklarının Araştırılması. Haseki Eğitim ve Araştırma
Hastanesi İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği Uzmanlık
Tezi, 61:7
BALCI, R. S., 2007. Seyhan Baraj Gölünün Bakteriyolojik Kirlilik Düzeyinin
Belirlenmesi ve Enterobacteriaceae Üyelerinde Antibiyotik Dirençliliği.
Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi.
BERZEG, D., 2005. Çeşitli Klinik Materyallerden İzole Edilen Enterokok Suşlarında
Antibiyotik Direnci, Yüksek Düzey Aminoglikozid Direnci ve E Test ile
Vankomisin MİK Değerlerinin Değerlendirilmesi. Haseki Eğitim ve
Araştırma Hastanesi İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği
Uzmanlık Tezi, 95:5-6
27
Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:2009 Cilt:20-1
BİLGEHAN, H., 1994. Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi. Fakülteler Kitap Evi
Barış Yayınları, 589:145-178.
BİLGEHAN, H., 2002. Klinik Mikrobiyolojik Tanı, Fakülteler Kitap Evi Barış
Yayınları, 777s.
COLAMIRIS, J. J., ARMSTRONG, J. L., SEIDLER, R. J., 1984. Association of
Metal Tolerance with Multiple-Antibiotic Resistance of Bacteria Isolated
from Drinking Water, Apply. Environ. Microbiol. 47:1238–1242.
DEMİRTÜRK, N., ve DEMİRDAL, T., 2004. Antibiyotiklerde Direnç Sorunu.
Kocatepe Tıp Dergisi 5 sf:17-21
DOĞANCI, L., 2001. Antibiyotik Direncinin Sıklığı Üzerine Antibiyotik Kullanımının
Etkisi. Klinik Dergisi Cilt 14(2) sf:57-61
EHINMIDU, J. O., 2003. Antibiotics Susceptibility Patterns of Urine Bacterial
Isolates in Zaria, Nigeria. Tropical Journal of Pharmaceutical Research,
2(2):223-228
GÜR, D., 1994. Antibiyotiklere Direnç Gelişmesi. Klinik Uygulamalarda
Antibiyotikler ve Diğer Antimikrobiyal İlaçlar. Güneş Kitabevi Limitet Şirketi.
Ankara, s.19–37
HALKMAN, K., A., 2005. Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamaları (Editör, Halkman). Merc
Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamarı. s. 261-281.
KARAYAKAR, F., AY, Ö., CİCİK, B., 2004. Mersin Kıyı Şeridinden Alınan Su
Örneklerinden İzole Edilen Escherichia coli Suşlarının Bazı Antibiyotiklere
Karşı Plasmid Kökenli Dirençliliğin Saptanması. Eko. Çev. Kor. 13,52: 28–
32.
ROBINSON, J. B., TUOVINEN, O. H., 1984. Mechanism of microbial resistance
and detoxification of mercury and organomercury compounds:
Physiological, Biochemical, and Genetic Analyses. Microbiological Reviews
48(2), 95-124.
SAUNDERS, J.R., 1984. Genetics and Evolution of antibiotic Resistance, British
Medical Bulletin, 40:54-60.
SHAH, P. M ., STILLE, W., 1983. Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
Strains More Suspectible to Cefoxitin than to III-Generation Cephalsporins
. J. Antimicrob cChemother., 11: 597-598.
28