rekDNA3

REKOMBİNANT DNA TEKNİKLERİ
III
DR. ONUR YILMAZ
2017
KLONLAMA VEKTÖRLERİ
KLONLAMA VEKTÖRLERİ ??????
 Vektörler, kendilerine eklenen yabancı DNA parçasını konakçı hücreye taşıyan ve
burada çoğalmasını sağlayan küçük DNA parçalarıdır.
3
KLONLAMA VEKTÖRLERİNİN TAŞIMASI GEREKEN ÖZELLİKLER
 Kendini ve taşıdığı herhangi bir DNA parçasını bağımsız olarak replike edebilmelidir.
 Klonlanacak DNA parçasının insersiyonuna olanak tanıyan birçok tanıma dizisi
içermelidir.
4
KLONLAMA VEKTÖRLERİNİN TAŞIMASI GEREKEN ÖZELLİKLER
 Vektörde seçicilik sağlayan “marker genler” bulunmalıdır. Bunlar, vektör taşıyan ve
taşımayan konak hücreleri ayırmak için gereklidir.
 Bunlar; antibiyotik direnç genleri ya da koloni rengini değiştirecek genler olabilir.
 Vektör ve vektörün taşıdığı DNA parçası konaktan kolaylıkla ayrıştırılabilmelidir.
5
KLONLAMA VEKTÖRLERİ
 Plasmidler
 Bakteriyofajlar
 Cosmidler
 Bakteri Yapay Kromozomları (BAC)
 Maya Yapay Kromozomları (YAC)
 Memeli Yapay Kromozomları (MAC)
 İnsan Yapay Kromozomları (HAC)
 İfade Vektörleri
6
SIK KULLANILAN KLONLAMA VEKTÖRLERİ
 Günümüzde en sık kullanılan vektörler
 Plasmid
 Bakteriyofaj
 Cosmid
 Yapay Kromozomal vektörlerdir
PLAZMİDLER
Joshua Lederberg (1925-2008)
1947-59 --Professor of genetics at the University of Wisconsin. Conducts research in the
genetics of E. coli and Salmonella as well as on antibody formation. Discovers and names
plasmids, particles of DNA in bacterial cells that replicate separately from chromosomal
DNA
PLAZMİDLER
 Plasmid, çoğu bakteri türünde doğal
olarak bulunan,
 Bağımsız olarak replike olabilen,
 Bakterinin kendi kromozomu dışındaki
çift zincirli halkasal veya süper sarmallı
DNA molekülleridir.
PLAZMİDLER
 Plazmid varlığı genellikle bulunduğu bakteriye avantaj sağlar.
 Bunlar; antibiyotiklere, ağır metallere ve olumsuz çevre şartlarına direnç sağlayan
genleri taşıyabilir.
 Klonlama vektörleri olarak kullanılan ilk plazmidler 1970’li yıllarda kullanılan ve E.
coli’de doğal olarak bulunan bakteriyel plazmidlerdi.
PLAZMİDLER
 Klonlanmak istenen DNA fragmanını, plazmid vektöre aktarmak için restriksiyon
enzimleri kullanılır.
hedef
DNA fragmanı
yabancı
DNA segmenti
aynı restriksiyon
enzimi ile kesim
hedef DNA’nın
plazmid vektöre
aktarılması
rekombinant plazmid
Plazmid vektör
PLAZMİDLER
 Restriksiyon enzimleri ile kesilerek doğrusal hale getirilen plazmid ile aynı yapışkan
uçlara sahip yabancı DNA fragmanı birbirlerine kolayca tutunur ve birlikte tekrar
halkasal forma dönerler.
EcoRI
Yapışkan uçlar
PLAZMİDLER
 Her restriksiyon enzimi yapışkan yapışkan uçlar üretir mi?
PLAZMİDLER
 DNA ligaz enzimi, plazmid DNA'sı ile hedef DNA fragmanının birbirlerine kovalent
olarak sıkı bir şekilde bağlanmasını sağlar.
hedef
DNA fragmanı
DNA ligaz
rekombinant plazmid
PLAZMİDLER
 Oluşturulan rekombinant DNA kendisini alabilecek ve replikasyonuna olanak
sağlayacak uygun bir alıcı hücreye aktarılır.
PLAZMİDLER
 pBR322 plazmidinin alıcı hücresi bu
plazmidlerin ait olduğu E. coli
 pUB110 plazmidi için uygun alıcı hücre
Bacillus subtilis 'tir.
PLAZMİDLER
ori
AmpR
ori
Plazmid vektör
+
DNA fragmanının
Plasmid vektöre
eklenmesi
Plazmidi alamayan
E. coli ölür
Amp R.
E.coli ile plazmid
CaCl
2
ve ampisilinli nütrient
Rekombinant
agarda inkübasyon
plazmid
Plazmidi alan
E. coli yaşar
Klonlanacak
DNA fragmanı
Plazmidin
replikasyonu
üreme
PLASMİD VEKTÖRLERİN ALICI HÜCRE İÇİNDEKİ VARLIĞININ
TESPİTİ
 Yabancı DNA fragmanı, direnç genlerinden birini kodlayan bölge içerisine
yerleştirilirse, bu direnç geni insersiyonel olarak inaktive olur.
DNA fragmanlarının
plazmide bağlanması
MAVİ-BEYAZ TARAMA YÖNTEMİ
PLASMİD VEKTÖRLERİN ALICI HÜCRE İÇİNDEKİ VARLIĞININ
TESPİTİ
 pUC18 plazmid vektörü ampisilin direnç
genine ve -galaktozidaz enzimini
kodlayan lacZ gen bölgesine sahiptir .
 Bu plasmidi barındıran E.coli’ler
ampisilin ve X gal içeren besi yerinde
üreyerek mavi renk verirler.
 Hedef DNA’nın bu bölgeye eklenmesi
bu genin transkripsiyonunu durdurur.
PLASMİD VEKTÖRLERİN ALICI HÜCRE İÇİNDEKİ VARLIĞININ
TESPİTİ
 Bu durumda E.coli kolonileri beyaz renkte olacaktır
Ap dirençli, lac negatif
beyaz koloni
RE ile kesim
DNA fragmanlarının
plazmide bağlanması
Ap dirençli, lac pozitif
mavi koloni
PLASMİD VEKTÖRLERİN ALICI HÜCRE İÇİNDEKİ VARLIĞININ
TESPİTİ
 Mavi-beyaz tarama yönteminde kullanılan pUC serisi plazmidler aynı zamanda çoklu
klonlama bölgesine sahiptirler.
PLASMİD VEKTÖRLERİN ALICI HÜCRE İÇİNDEKİ VARLIĞININ
TESPİTİ
 Bu tür vektörler, alıcı hücre tarafından aktive edilebilecek promotor bölgelerini de
taşırlar. Böylece plazmidin ekspresyon şansı arttırılmış olur.
BAKTERİYOFAJLAR
BAKTERİYOFAJLAR
 Bakterileri enfekte eden virüslerdir.
 Tüm virüsler gibi basit bir yapıya sahiptirler.
 Genellikle baş, boyun, kuyruk ve kuyruk
fibrillerinden oluşmakla birlikte filamentöz
yapıda olanları da vardır
BAKTERİYOFAJLAR
 Bakteriyofajlar, enfekte ettikleri bakteride litik ve lizojenik olmak üzere iki farklı
hayat döngüsüne sahiptirler
Litik
Lizojenik
-DNA
profaj
BAKTERİYOFAJLAR
 En çok çalışılmış bakteriyofajlardan birisi E. coli’ye ait
lambda () bakteriyofajıdır.
BAKTERİYOFAJLAR
 Bakteriyofaj DNA’sının her iki ucunda (5’ uçlarında) 12 bazlık ve birbirinin
tamamlayıcısı olan nükleotid dizileri mevcuttur.
 Bu uçlar tıpkı restriksiyon enzimi kesimi sonucu oluşan yapışkan uçlara benzer
(cos-cohesive end)
 Faj Genomu
cos
cos
BAKTERİYOFAJLAR
 Bu yapışkan uçlar sayesinde doğrusal yapıda olan faj genomu, bakteri hücresine
girdiğinde halkasal hale gelir. Bağlanma bölgesi, plazmidlerde olduğu gibi ligaz
enzimleri sayesinde onarılır.
Konak genomu
Halkasal
faj genomu
BAKTERİYOFAJLAR
 Bakteriyofaj genomuna eklenecek hedef DNA’nın büyüklüğü en fazla 20 kb kadar
olabilir.
BAKTERİYOFAJLAR
KOZMİD VEKTÖRLER
 Kosmid vektörler, bir bakteriye ait ve replikasyon orijin bölgesine sahip plasmidle,
buna birleştirilmiş lambda fajı yapışkan ucundan (cos, cohesive ends)
oluşturulmuşlardır
KOZMİD VEKTÖRLER
 35-40 kb uzunluğunda yabancı bir DNA fragmanını kabul edebilir ve alıcı hücreye
aktarabilir.
 Restriksiyon enzimiyle kesim ve hedef DNA fragmanı ile ligasyondan sonra oluşan
DNA,  faj partiküllerine paketlenir.
Yabancı DNA fragmanı
MCS
cos
kozmid
Ori
Ampr
MCS
cos
ori
Ampr
Ampr
cos
ori
YAPAY KROMOZOM VEKTÖRLERİ
 Daha büyük DNA parçalarının (1 Mb’dan daha fazla) klonlanmasına olan ihtiyaç
duyulması yapay kromozom vektörlerinin geliştirilmesine neden olmuştur.
 İlk olarak Saccharomyces cerevisiae’da geliştirilmiştir.
 Bu mayanın genomu temel alınarak inşa edilen rekombinant kromozomlar (yeast
artifical chromosomes,YAC’s).
 Önceleri genetik inceleme için
 Daha sonra çok büyük DNA parçalarının klonlanmasında kullanılmıştır:
YAPAY KROMOZOM VEKTÖRLERİ
 Yapay kromozomlarda maya genomuna ait telomer, sentromer, otonom olarak
çoğalan diziler (ARS) izole edilmiş ve plazmid üzerinde birleştirilmiştir.
YAPAY KROMOZOM VEKTÖRLERİ
 Bakteriyel yapay kromozomlar YAC’lardan daha küçük DNA fragmanları (300-
350 kb) taşıyabilen klonlama vektörlerdir. Buna rağmen çok önemli bazı
avantajlara sahiptirler.
 YAC’lar, kararsız bir yapıya sahip olduklarından çoğalma sırasında taşıdıkları
DNA fragmanlarını kaybedebilmektedirler.
 Bakteriyel yapay kromozomlar ise hem oldukça kararlı bir yapıya sahiptirler
hem de E. coli gibi çok hızlı ve kolaylıkla üreyen bir bakterinin tranformasyon
kolaylığına sahiptirler.