M.C.P.C

M.C.P.C.
Bir tavuğun intestinal mikroflorası çok kolay harap edilebilir ve intestinal hastalıklara sebep
olabilir. Yakında, veteriner labaratuarlarında geniş bir uygulama ile yeni bir tekniğin gelişimi
sayesinde, intestinal problemlere sebep olan mikroorganizmaları belirlemek için bir araca
sahip olunabilir.
Henk Panneman, Dr. Van Haeringen Lab. b.v.,Wageningen,Hollanda
www.vhlgenetics.com
Değişik sahalarda,çiftlik hayvanlarının intestinal mikrofloralarının çabuk ve eksiksiz
saptama ve görüntülemeleri gittikçe önemli hale gelmektedir. Bu amaç için,Dr. Van
Haeringen Laboratorium (VHL) Wageningen-Hollanda’da ‘Mikrobiyal Topluluğun Profil ve
Karakterizasyonu(M.C.P.C.) metodu geliştirildi.Bu, sağlık ve yaşam stokunu arttıran gıda
ürünlerinin gelişimine yardım etmek için farklı gıda diyetlerinin etkilerini görüntüleyebilmek
için kullanılabilir. M.C.P.C.’nin bir diğer uygulaması intestinal enfeksiyonların çabuk teşhisi
olabilir. Koruyucu antibiyotik tedavisinin gittikçe kısıtlanması, bu metodun enfeksiyon
üzerinde uygun bir cevabın verilmesinde esansiyel olacaktır.
Genel olarak, M.C.P.C., kompleks ve değişken mikrobiyal populasyonun analizi için
faydalıdır. Örneğin hayvanların sindirim, solunum veya ürogenital sistemlerinin analizi.
Diğer mümkün uygulamalar, bitkilerin atıklarından oluşan çamurun analizi veya oluşturulmuş
üretim işlemlerindeki mikrobiyal populasyonun görüntülenmesidir.
-Mikroorganizmaların İdentifikasyonu:
Pekçok DNA temel metodları, mikroorganizmaların isimlendirilmesi için
kullanılmaktadır. Bununla beraber bugün kullanılan pek çok protokol, bir seferde tek veya
sınırlı sayıda türü belirleyebilmektedir. Bizim şu anda geliştirmek için üzerinde çalıştığımız
metod, 16S rRNA T-RFLP metodudur (Marsh-1999), ve basit bir örnekte mikrobiyal floranın
izinin(Profilinin) çıkmasıyla sonuçlanır. Bu metod, DNA’daki spesifik bir bakteriyel genin16S rRNA geni tüm mikroorganizmalarda bulunan genel bir gendir- üzerine kuruludur.Bu
gen, mikrobiyal alemin pek çoğunda korunan bölgeleri içerir.(Bu bölgeler pek çok
mikroorganizma için aynıdır.) Bu korunan bölgeler, geniş sayıda farklı mikroorganizmadan
basit bir reaksiyon olan Polimeraz Zinciri Reaksiyonu(P.C.R.), 16S rRNA geninin enzimatik
yükseltilmesini (çoğaltılmasını) sağlar.Yükseltilmiş 16S rRNA geninin korunmamış
bölgelerindeki farklar bize çeşitli mikroorganizmalardaki ayırımı yapmamızı sağlar.Ayrıca, in
vitro ortamda üretilemeyen mikroorganizmalar,klasik metodlara göre önemli bir avantaj
sağlayan bu metodla meydana çıkartılır. Bunların yanında M.C.P.C., özel olarak
mikroorganizmaların identifikasyonu için dizayn edilmemiştir, ayrıca bir örnekte hazır,
türlerin doğru bir belirtisini verecektir.Spesifik ilgilere bağlı olarak bu metod,, türlerin daha
kesin identifikasyonunu sağlamak için ayrıca düzenlenmiş olabilir.
-Clostridial enteritis/Dysbacteriosis:
Bu tekniği etkili olarak ilk defa saf bir bakteri kültürünün sayısı için kullandık.(E.
Coli, Staphylococcus aureus,Clostridium perfringens gibi)Mikroorganizma deneyi için
deneysel gözlenen DNA parçacıklarının boyları, bizim temel bilgilerimizdeki ölçülmüş
boylarla aynı çizgi üzerindeydi.Her ne kadar hala düzeltmeler, yeni gelişmeler ve etkili
teknikler üzerinde çalışılmaya devam edilse de, bu pozitif sonuç, daha fazla pratik uygulama
ile meşgul olmak için, harakete geçmeyi sağladı.
Bu araştırmalardan biri olan, tavuklarda Clostridial enteritis/Dysbacteriosis’in analizi
ve diagnozunu araştırmaktayız.İlk başta, laboratuvarlarımızda sağlıklı bir tavuk intestinal
kanalının mikroflora analizi yapıldı. İntestinal kanal, mide çıkışından secuma kadar 8 farklı
parçaya bölündü.(A1-A8)(Şekil 4) DNA, içeriklerden izole edildi ve sonradan M.C.P.C. ile
analiz yapıldı.Mavi çizgi için sonuç pik profillleri Şekil 5’te gösterilmektedir. İlişkili olarak
1/4
A1 ve A2 bölümlerinde bulunan küçük pikler, intestinal kanalın ilk parçasında (duodenum)
çok düşük miktarda mikroorganizma olduğunu gösterir. Sindirim kanalının aşağı bölümlerine
gidildikçe(A4,A5 bölümleri)piklerin boyutlarında bakteri sayısındaki artışı ifade eden bir
yükselme görülür. Ayrıca, mikrobiyal floradaki çeşitliliği temsil eden, gözlenen pik profili her
bir intestinal kısımda farklıdır. Bazı türler (pikler) intestinal kanalın pek çok kısmında
görünürlerken, diğer türler sınırlı bir şekilde,intestinal kanalın spesifik bir bölümünde ortaya
çıkarlar.
3 farklı Hollanda çiftliğinden Clostridial enteritis klinik semptomları gösteren
tavuklarda, duodenum’un ilk kısımlarından alınan örneklerde, 472 basepairs(bp) uzunluğu ile
bir DNA parçasını temsil eden, geniş bir pik bulundu.(Şekil 6) Bu boyuttaki önemli bir pik,
200’ün üzerinde sağlıklı tavuklardan alınan benzer örneklerde bulunamadı. Ayrıca ,
verilerimiz gösterir ki, tavuklarda Cl. Enteritis’in büyük bir patojen sebebi olan Cl.
perfringens, hasta tavukların duodenumlarının ilk kısımlarında önemli miktarda bulunmaz.
Bizim temel verilerimize göre Clostridium perfringens’in saf kültürü kullanılarak yapılan
denemelerle ispatlanmış olan,235 bp’lik bir pikle sonuçlanmalıdır.Yine aynı temel verilere
göre; hasta tavukların duodenumlarında 472 bp’lik pikten sorumlu mikroorganizmanın
Clostridium perfringens’den filogenetik olarak farklı, Clostridium paradoxum olması
mümkündür. Gram(+) antibiyotik tedavisinden sonra kuşlar iyileşir ve muhtemelen
antibiyotik tedavisinden dolayı duodenumlarının ilk kısımlarında az sayıda bakteri bulunur ya
da hiç bakteri bulunmaz.(Şekil 6)
-Clostridium perfringens İnvolvement??
Yaşanan tecrübeler gösterir ki; Clostridium enteritis semptomları gösteren tavukların
analizinde Cl. perfringens’e hiç rastlanmaz ya da çok az sayıda rastlanır. Bu sonuç birkaç
sebebe bağlı olabilir:
-Klinik semptomlar nekrotik enteritis(Cl. enteritis) tarafından yapılmamış olabilir.Diğer
hastalıklar benzer semptomlara sebep olabilir.
-Nekrotik enteritis çeşitli mikroorganizmalarca şekillenmiş olabilir.Nekrotik enteritis tek bir
spesifik patojenle şekillenecek diye bir zorunluluk yoktur.
-Nekrotik enteritis mikroorganizmalarca şekillenmeyebilir. Bilinmeyen bir faktör(Çevresel
faktörler/Sistemik hastalık) mikroorganizmaların, örneğin Clostridium
perfringens’in
duodenuma kolonize olmasına ve nekrotik enteritis’e neden olabilir.
-Cl. perfringens’in (ya da başka bir mikroorganizmanın) duodenum’da yüksek sayıda
görülmesi Nekrotik enteritis’in yapıcı bir ajanı değildir fakat sadece bu durumun bir
sonucudur.
Cl. perfringens’in yüksek miktarı, sıklıkla Nekrotik enteritis ile birlikte ortaya çıksa da
bu mikrobun, bu hastalığın ilk sebebi olduğu henüz tam bilinememektedir. Nekrotik
enteritis’in deneysel gerçekleştirilmesi sıklıkla, Cl. perfringens’den önce Eimeria acervulina
ile enfeksiyon vasıtasıyla başarılmıştır.
Duodenum’un mikrobiyal florasının doğru analiz ve görüntülenmesi bu probleme iyi
bir anahtar olabilir. Bu problemin bir analizi, sahadan ve deneysel olaylardan iyi belgelenmiş
örneklere ihtiyaç duyar. Örnek bir araştırma projesi, ırk yetiştiricilerinin,ilaç sektörü ve
araştırmacıların katılıma çabalarıyla olmalıdır.
M.C.P.C. METODU:
M.C.P.C. prosedürü, örnekten totoal DNA izolasyonu ile başlar.(İntestinal içerikten)
Bu, bir dahaki basamak olan ve çok hassas olan PCR ile DNA’nın amplifikasyonuna kadar
kritik bir basamaktır.Substanslarının (Polimerik şeker,metal ions gibi.) geniş bir alanının
küçük bir miktarı, onları engelleyecektir. Ya da PCR yükseltmesinin belirtilmesini
etkileyecektir. Bugün DNA’nın izolasyonu için kullandığımız metod, DNA’nın katı, taşıyıcı
bir materyale absorbsiyonu üzerine kuruludur.İlk önce bakteri hücre duvarı, mekanik ayırma
2/4
ve kimyasal erime kombinasyonu ile yıkımlanır.Daha sonra DNA, katı taşıyıcı bir
materyale(matrix) emdirilir.Ve matrix’e bağlanmayan örnekteki kirler, farklı solüsyonlarla
ard arda yıkanarak uzaklaştırılır.Sonunda DNA, ultrapure suyla matrixten sıyrılır.Prosedür,
örnekteki bakteriden DNA karışımı ile sonuçlanır.
Metoddaki bir sonraki basamak, PCR’la DNA örneğindeki çeşitli 16S
ribozomalRNA’nın özel amplifikasyonudur.(Şekil 1 I-IV) PCR tekniği, sabit ısıda DNA
polimeraz kullanılarak DNA’nın özel parçalarının amplifikasyonuna(multifikasyon) izin
verir.Polimeraz, örnek bir DNA molekülü üzerine kurulu, yeni bir DNA meydana getirir.
Yeni oluşturulmuş DNA, orijinalinin tam bir kopyasıdır.DNA örneğinin, yükseltilecek olan
özel parçası, amplifikasyon reaksiyonunda kullanılan primerler tarafından belirlenir. Bir
primer, DNA’nın suni olarak yapılmış küçük bir parçasıdır ve sabit ısıda DNA polimerazıyla
yeni DNA’nın jenerasyonu için başlangıç noktası olarak ihtiyaç duyulur.Amplifikasyon
reaksiyonu için 2 primere gereksinim duyulur. Primerler örnek DNA’nın spesifik bölgelerine
uyarlar.Ve polimeraz iki primer arasında DNA’nın çeşitli kopyalarını meydana getirirler.Bu
özel durumda(M.C.P.C) primerler, bakteriyel 16S rRNA genine uymak için dizayn edilirler.
Bakteriyel 16S rRNA geni, her bir bakteri türü için farklıdır. Bununla beraber, bu
genin bazı parçaları, bakteri türlerinin geniş bir kısmında aynıdır.(Korunmuş bölgeler)Biz,
PCR amplifikasyon için primerlerin dizaynıyla, bu faktörün avantajını kullanırız. Bu yolla,
mikroorganizmaların büyük çoğunluğunun 16S rRNA genleri, basit bir reaksiyonla
yükseltilebilir.
PCR reaksiyonu, örnekte bulunan bakteriden 16S rRNA geninden orijin alan DNA
parçacıklarının karışımı ile sonuçlanır. Bu DNA parçacıklarının boyutları, farklı bakteriler
için farklı olacaktır ve uygulamalarımızda kullandığımız primerler için 850-950 bp’lik alan
içinde olacaktır. Bununla beraber, aynı boyutların bir parçasını veren geniş bir sayıda
mikroorganizma da olacaktır.(Şekil 2) DNA parçacıkları daha sonra sınırlayıcı bir enzim
kullanılarak daha küçük parçalara kesilir.(Şekil 1 V-VII) Sınırlayıcı enzim, birkaç
basepairs’in sınırlanmış sırasında DNA’yı keser. Bu spesifik sıra farklı bakterilerde farklı
yerlerde olacaktır. Farklı boyutlarda parçacıklar meydana getirilir.Bu yolla, bakteri sayısı,
azaltılmış aynı boyutta parçacıklarla sonuçlanacaktır.(Şekil 3),ortalama 5-10 farklı
mikroorganizma ile ilgili olan bir spesifik parçacık, aynı boyutta bir parçacık ile
sonuçlanacaktır. Aynı boyutta parçacıklarla sonuçlanan bakteri, sıklıkla(ancak mutlaka
değil)filojenik olarak akrabadırlar.
Sindirimden sonra, DNA parçacıkları,Applied Biosystems 377 kullanılarak boylarına
bağlı olarak ayrılırlar.Sadece flüoresans özelliği gösteren primerler içeren DNA parçacıkları
meydana çıkartılacaktır. Bu, sonunda her bir örnek için kullandığımız iki farklı flöuresans
özelliği gösteren primerler, iki farklı modelle sonuçlanacaktır; mavi ve yeşil model. Her bir
pik, spesifik bir boyutta bir DNA parçacığını gösterir. Önceden bilinen DNA parçacıklarının
boyutları hesaplanabilir. Biz, bu hesaplamaları her bir yayınlanmış 16S rRNA sıraları için
yaptık ve temel verileri kombine ettik. Bu temel veriler, teorik olarak MCPC metoduyla
meydana çıkartılan ve tahmin edilen boyutlarda DNA parçacıklarıyla sonuçlanan, 2750
mikroorganizmayı içermektedir. Mavi primer için, farklı DNA parçacıklarının boyutları
370’dir, ortalama 7-8 mikroorganizma aynı boyutta bir parçacıkla sonuçlanacaktır. Mavi ve
yeşil primerlerin her ikisinden sonuçların kombinasyonuyla, çoğunlukla yalnızca bir ya da az
sayıda mikroorganizma için bir pik ayırmak mümkündür.
Her bir bireysel pikin alanı, mikroorganizmadan orijin alan ve bu pik için sorumlu
olan, orijinal DNA örneğindeki DNA miktarı ile ilgilidir. Pikin alanı bundan dolayı, orijinal
örnekteki mikroorganizma sayısı ile ilgilidir. Mikroorganizma sayısı ile pik alanı arasındaki
ilişki, henüz tam kurulamamıştır. Ve farklı mikroorganizmalar için, farklı olabilir. Pratik
olarak bunun anlamı, bu teknik, kısmen sayılabilirdir.
3/4
ŞEKİL 1 = T-RFLP Metudu
Dalgalı kırmızı çizgiler, 16S rRNA’yı içeren bakteriyel genomik DNA’nın küçük bir
parçasını gösterir. I-IV arası, PCR amplifikasyonunun ilk dört basamağını(siklusunu) gösterir.
Genel olarak bir PCR reaksiyonu, 30 ya da daha fazla siklustan oluşur ve har bir siklusta
oluşanların sayısı iki katına çıkartılır. DNA örneğinin basit bir kopyasıyla başladığında, bu 2
30
(1073741824) kopya ile sonuçlanacaktır. V-VII arası ,PCR’ dan sonra DNA’nın
sınırlanmasını gösterir.
ŞEKİL 2 = PCR’dan Sonra Parçacıkların Dağılımı
Şekilde, PCR’dan sonra DNA parçacıklarının dağılım boyutları teorik olarak
görülmektedir.Bu grafik, basit bir örnekte, temel verilerimizdeki tüm mikroorganizmaların
bulunduğu bir durumu gösterir. Yatay eksen basepairs’daki genel DNA parçacıklarının
boylarını gösterir, her bir belirlenmiş boy için parçacıkların sayısı, dikey eksende
gösterilmiştir.
ŞEKİL 3 = PCR ve Sindirimden Sonra ‘Mavi’ Primerleri İçeren Parçacıkalrın Dağılımı
Şekilde, PCR ve sınırlayıcı bir enzimle sindirim sonrası mavi primerleri içeren, DNA
parçacıklarının teorik dağılım boyutları görülmektedir.(bakınız şekil 1 ve metin) Bu grafik,
basit bir örnekte, temel verilerimizdeki tüm mikroorganizmaların bulunduğu bir durumu
gösterir. Yatay eksen basepairs’daki genel DNA parçacıklarının boyutlarını gösterir, her bir
belirlenmiş boy için parçacıkların sayısı, dikey eksende gösterilmiştir. Şekil 2 ile
karşılaştırıldığında görülür ki; DNA’nın sindirimi, total parçacıkların sayısında artışa neden
olur ve ayrıca daha fazla bir dağılımla sonuçlanır.
ŞEKİL 4 = Tavuk İntestinal Kanalı
Şekilde sağlıklı bir tavuğun bağırsağı görülmektedir. Bağırsak aynı boyutlarda 8 parçaya
bölünmüştür.İlk ve son parçalar belirlenmiştir.Her bir parçanın içeriği M.C.P.C ile analiz
edilmiştir.(Ayrıca bakınız şekil 5’e)
ŞEKİL 5 = Sağlıklı Bir Tavuk İntestinal Kanalının M.C.P.C. Analizi
Şekilde duodenumdan alınan örnekle(A1) başlayarak sağlıklı tavuk bağırsağının farklı
bölgelerinden profiller görülmektedir. A3 örneğinin profili A2 ile aynı olduğundan
gösterilmemiştir. Sadece geniş pikler görülebilirdir.Çok sayıdaki küçük pikler
görülememektedir.
ŞEKİL 6 =Clostridial enteritis’in Klinik Semptomlarının Görüldüğü Tavuğun M.C.P.C.
Analizi
İlk 3 profilde, tedavi öncesi duodenum örnekleri bulunmaktadır. Son 3 profil gram(+)
antibiyotik olan Tylan’la tedavi sonrası alınan örnekleri göstermektedir.Kırmızı ok 472 bp’lik
piki belirlemektedir.
4/4