Sub G1 pik ve DNA analizi

FLOW SİTOMETRİ
(AKAN HÜCRE ÖLÇER)
Dr.Handan Aksoy
Akım Hücre Ölçer (AHÖ)

Çeşitli hücrelerin bir süspansiyon halinde bir akış kanalı
boyunca tek tek geçmesi ve bu sırada hücre büyüklüğü
ve granülaritesine göre sınıflandırılması esasına dayanan
bir cihazdır.
Tarihçe

1870-Savart- hızla akan sıvının yüksek frekansla vibrasyonu sonrası
ayrımını (SORTİNG) geliştirmiş

1934-Moldoven-fotoelektrik alıcıyı geliştirmiş akım boyunca kan
hücrelerinin sayımı sağlanmıştır

1949-1956 Coulter kan sayım cihazı geliştirilmiş

1969-Van Dilla- argon lazer sisteme ilave edilmiş

1980- Becton Dickinson ile flow sorter (floresan aktive cell sorter)
geliştirilmiştir.

1 milyon hücre bir dakikadan daha kısa bir
sürede değerlendirilebilir ve çok
parametreli bir değerlendirme yapılabilir
Kullanım alanları













İmmün fenotipleme
DNA analizi
Hücre prolifersyonu
Hücre ölümü
RNA ve protein içerik analizi
Membran permeabilite ve potansiyellerinin değerlendirilmesi
Drug uptake ölçümü
Mikroorganizma tayini
Hücre içi kalsiyum iyon teknikleri
PH ölçümleri
Glutatyon ölçümleri
Virüs ve viral ürün tayinleri
Transplantasyon….
Çalışma prensibi

3 ana sistemden oluşur
– Hidrolik sistem
 Akış sistemi; partiküllerin lazer önünden geçişi için taşıyıcı sistem
– Optik sistem
 Lazer önünden geçen hücrelerden açığa çıkan floresan saçılımının
çapraz ve silindirik filtereler ile toplanarak düzgün bir şekilde
fotodedektörlere aktarılmasında görev alır
– Elektronik sistem
 Elde edilen optik sinyalin Photo Multiplier Tubes (PMT) ile
amplifiye edilerek elektrik sinyaline çevriminden ve analiz için
bilgisayara aktarımından sorumludur.
LAZER


Vücut sıvıları doğal süspansiyon halindedir
Ancak taze ve fikse edilmiş solid dokularla çalışmak için süspansiyon
haline getirmek gerekir
– Süspanse hale getirilmiş hücrelerin analizi için floresan işaretli
monoklonal antikorlarla direkt/indirekt olarak işaretlenmesi gerekir

Sistem floresan yoğunluğu ölçümü prensibine bağlı olduğundan
işaretli hücrelerden bu floresanı açığa çıkaracak güç kaynağı olarak
LAZER kullanılmaktadır
– Bu kaynak; Argon, Kripton, Helium-Kadmiyum,Helium-Neon veya daha
yüksek yoğunluktaki ışık kaynakları olabilir.
– Masa üstü sistemlerde genellikle argon kullanılır ve FITC(fluorescein
isothiocyanate), PE(phycoerytrine) gibi floresan boyaları 488nm’de
aktive ederek hücre düzeyinde ve/veya içinde floresan yoğunluğu
ölçümüne olanak sağlamaktadır.




Süspansiyon halindeki hücreler hava basıncı ile sıvı içinden geçirilir,
Sıvının çok hızlı akışı yüksek bir hidrostatik basınç oluşturur
Bu basınçla hücreler cam ve ya kuartzdan yapılmış (flow cell) akış kabinine gelirler
Bu kabinin geometrik şekli ve sıvının laminer akışı hücrelerin tek bir sıra halinde lazer
kaynağı önünden geçişini sağlar
–
Sistemde Forward scatter(FS), Side scatter(SS) ve floresan (FL-1,2,3…) dedektörleri bulunur


FS: hücre yüzey alanı ve büyüklüğü
SS: granülarite ve iç yapısı
•Side scatter dedektörü
Forward scatter dedektörü
Işık kaynağı
Floresan boyama teknikleri



İmmünfenotipleme:
Hücre yüzeyinde eksprese olan antijen moleküllerine karşı özgül
antikorlar kullanılarak hücrelerin tanımlanmasıdır.
Hücre yüzeyindeki bu antijenik yapılar CD(cluster of differentiation)
molekülleri olarak adlandırılmaktadır
AHÖ kullanılarak CD molekülleriyle hücrelerin fenotipik özellikleri
tespit edilmekte ve istenilen hücreler saflaştırılabilmektedir

Örnek hazırlama için en sık kullanılan yöntem tam kan lizis
yöntemidir.
(Eklem ve plevra sıvılarından hücre süspansiyonu hazırlarken lizis
metoduna gerek yoktur.)

Lizis solüsyonu NH4Cl, KHCO3 ve EDTA karışımından oluşmaktadır
ve ticari olarak bulunmaktadır.
Antikorlar özgül olarak epitopa, Fc reseptörlerine veya nonspesifik
olarak bağlanabilir.

– İzotipik kontrol antikoru ve
– Otofloresan kontrol analizi yapılmalıdır. (bu iki analizin benzer sonuç
vermesi gerekir, öyle değilse problem vardır)
İsotip kontrol
Mouse anti human CD14-FITC –Ig2a
 Mouse isotip-FITC-Ig2a : nonspesifik
kontrol

Temel boyama prosedürü
1.
Primer mAb ve florokrom işaretli ikinci antikorlar




2.
Primer mAb ve biyotinlenmiş veya hapten konjuge antikorlar


3.
Hücre süspansiyonu+epitop özgül işaretsiz mAb inkübasyon, santrifüj
Florokrom işaretli ikinci antikor ile inkübasyon
Yıkama+%2 formaldehitli PBS
ANALİZ
Epitop özgül işaretsiz biyotinlenmiş veya hapten konjuge mAb inkübasyonu, santrifüj
Florokrom işaretli avidin veya anti hapten antikorla inkübasyon
Direkt konjuge antikorlar


Epitop özgül florokrom konjuge mAb
İnkübasyon, yıkama, fiksasyon
Çok renkli immünfenotipleme




Boyama yöntemleri aynı anda kullanılır
Çok farklı lenfosit alt gruplarının fenotipik ve fonksiyonel analizleri
yapılmaktadır.
Cihazın lazer kompozisyonuna göre aynı anda 20 farklı yüzey
antijeni analizi yapılabilmektedir
Rutinde 4 renkli boyama kullanışlı olmaktadır
Florokromlar





FITC (fluorescein isothiocyanate)
PE (phycoerytrin)
PETR (phycoerytrin-texas red tandem kompleksi)
PECy5 (phycoerytrin-cyanin 5 tandem kompleksi)
PerCP (perdinin chlorophil-P)
 Tümü 488nm’de eksite olurlar, çok renkli boyama yapılırken kompensasyon
ayarlarına dikkat edilmelidir
Önemli noktalar

Analiz yapılacak hücre konsantrasyonu önemlidir
–
–
–
–
Boyama ve yıkama sırasında hücreler kaybedilirler
Hücre pelleti 0.3-1ml’de süspanse edilir
Cihazdan saniyede 100-1000 hc geçmesi normaldir
<1000/hc zaman kaybı, >1000/hc kümeleşmeye sebep olur
Önemli noktalar

İnkübasyon oda ısısında olmalıdır (22’C)
– Prosedür ve kimyasal kitlere bağlı olarak buzdolabı(4’C) veya buzda
yapılabilir

Minimum 1 saatlik fiksasyon zamanı önerilmektedir
– Aldehitle fikse edilmiş hücrelerin FSC/SSC dağılımları ilk 8 saatte
değişmektedir
– Fiksasyondan granülosit ve monosittler etkilenir (granüllü hücreler
boyamadan sonra hemen okutulmaalıdır)
– Fikse edilmiş hücre süspansiyonu 3 gün içinde analiz edilmelidir.
Veri analizi



AHÖ, geniş hc toplulukları hakkındaki verilerin hızlıca toplanmasını
ve analizini sağlar
Saniyede >70 000 partikül sayar ve her partikül veya hc için 9 farklı
renk ve iki yöne saçılan ışık sinyallerini saptar
yazılım:
– Cihaz kontrolü, veri kazanımı, analiz ve görüntüleme mümkün
– System II yazılımları firmalarca sağlanmakta
– WinMDI 2.9, FlowJo ücretsiz internetten indirilebilir
yazılımlarla analiz yapılabilir

Cihaz kontrolü
– Lazer ve dedektör kontrolleri, kalibrasyonu boyalı boncuklar
kullanılarak elde edilen histogram grafiklerle yapılır
– İki farklı histogramın üst üste getirilmesiyle (overlay) çoklu
örneklerden alınan elde edilen parametre verilerinin eşzamanlı
gösterilmesi mümkün olmaktadır
 Spesifik protein ekspresyon taranması
 Anormal gen ekspresyonu gösteren hücre sayılarının belirlenmesi
 Eksternel faktörlere yanıt olarak popülasyonun gen ekspresyonu ve
proliferasyonunun denetlenmesi

Verilerin lineer veya logaritmik ölçekle görüntülenmesi
– Floresan ve saçılan ışığın yoğunluğunun lineer veya logaritmik
olarak ölçmek mümkündür
– DNA’nın boyandığı hc siklusu ölçümünde her zaman lineer
amplifikasyon seçilmektedir
– İmmünfloresan için seçilen logaritmik amplifikasyon hem zayıf
hem de kuvvetli sinyallerin aynı skala üzerinde gösterilmesini
sağlar
Lineerden logaritmik görüntülemeye geçerek ölçek, pozitif olgular
için sıkıştırılırken, negatif olgular için genişletilir. Böylece pozitif
ve negatif olgular arasındaki farkı daha iyi değerlendirirken
sayılar aynı kalır

Kompensasyon(telafi)
– Çok renkli deneylerde çok yakın veya çakışan emisyon spektrumundaki
boya veya florokromların yarattığı floresan interferensi olasılığı
– Çok renkli veri yorumlarını basitleştirmek ve ikili parametre
histogramlarında popülasyonları ayırt etmek için çakışan floresanı
matematiksel olarak uzaklaştıran özgül yazılım veya donanım
manipülasyonu kastedilmektedir
– Çoğu zaman araştırıcının deneyimine bağlıdır

İstatistiksel analiz







Total sayım
Popülasyon yüzdeleri
Ortalama
Median
Varyasyon katsayısı (CV)
Standart sapma(SS)
Hücrenin floresan yoğunluğunun nicelendirilmesi
– Standart kalibrasyon birimi
– Eşdeğer solubl florokrom molekülleri
 MESF ( molecules of equivalent soluble fluorochrome)
 MFI (Mean fluoresence intensity)

Zaman parametresinin uygulanması
– Zamana karşı floresan yoğunluğunun değişiminin takip eden
kalsiyum flux gibi kinetik deneyler uygulanabilir
– Zaman ve floresan oranı kombine edilerek detaylı fagositoz,
kemotaksi veya oksidatif patlama gibi nötrofil fonksiyonları
gözlemlenebilir
Hücre içi sitokin ölçümü

İmmün hücrelerden sitokin salınımı ve üretimi hem protein hem de
mRNA seviyesinde çalışılabilir
– ELİSA, Bioassay, mRNA+ protein ve hc içi sitokin ölçümü gibi farklı
metodlar kullanılmaktadır

İşaretli anti sitokin antikorlar kullanılarak yapılmaktadır



Sander, paraformaldehit fiksasyonu sonrası saponinle permeabilize
hücrelerin İndirekt immünfloresan ile boyanması ile tek hücrede
sitokin üretimini göstermiş
Jung, hc içi protein transportunu önleyerek sitokinlerin golgi
cihazında birikimini sağlayan monensin varlığında uygulanmış ve
AHÖ ile gösterilmiş
Süspansiyon haldeki hücrelerde sitokin ölçümü için ön bir uyarım ve
monensin ve brefeldin A ile amplifikasyon sağlanmalıdır
 İonomisin ve PMA kan T hücreleri için iyi bir uyarandır
 BAL T hücreleri için anti-CD2 ve anti-CD28 antikoru iyi uyarandır

Sitokin özgül antikorların hc içine penetrasyonu ve
sitokin proteinlerine bağlanması için fiksasyon ve
permeabilizasyon gereklidir
– %4 paraformaldehit ve %1 saponin Thc ve monosit için
optimaldir

Prensip;
– Geçirgenliği sağlanan hedef hücre
membranından diffüze olabilen floresan
işaretli antikorların ölçülmesi esasına dayanır.
yöntem

Salgılanan protein boyamaları
– Sitokin
– Hormon
 Protein transportu engellenmeli
– Brefeldin A ile inkübasyon
 Golgiden hücreye hareketin engellenmesi
– Monensin ile inkübasyon
 Protein hareketi inhibitörü
 Hücreler arası hareketi sağlayan metalloproteinazları da etkilediği
gösterilmiş
1.
Hedef hücre fiksasyonu

Formaldehit (paraformaldehit)




2.
Metanol
Aseton
Permeabilizasyon
1.
2.
Tween 20 (zayıf membran çözücüleri)
Saponin
3.
NP-40 (kuvvetli membran çözücüleri, nükleus membranını çözer,
nükleer antikor boyaması için uygun)
Triton
4.
3.
Antikorla boyama
1.
2.
4.
Fiksasyonu diğerlerinden daha güçlü
Formaldehit ve metanol, protein yapılar arasında bağlantılar
yaparak antijenik yapıları bozar
Yüzey boyama
Hücre içi boyama
AHÖ ile ölçüm
Hücre içi stokin boyamasını klinik kullanımı



Asemptomatik HIV+ hastaların CD4 T hücrelerinde IFNg üretiminin
azaldığı, IL-4 üretiminin arttığı saptanmış
Semptomatik hastalarda IL2 ve IFNg üreten hücrelerin azaldığı, ileri
dönemlerde ise IL-10 üreten hücrelerin sayısında artış olduğu
saptanmış
Astımda çocuklarda IL5 üreten Thc sayısı fazlayken, erişkin astımlıda
daha az sayıda IFNg sekrete eden Thc ve normal IL5 üreten hücre
saptanmış.(yaşa bağlı immünolojik değişiklikler)
DNA analizi

Kanser hücresinde hücrelerin ploidisi ve malign
hücrelerin çoğalma kapasitesi saptanabilir
– İstenen hücre tipinin biraraya getirilmesi ve istenen bilgiye sahip
materyalin boyanması ve görünür hale getirilmesi

DNA içeriği ve hücre döngüsü saptanması
DNA boyaları
DNA’ya 1:1 oranda bağlanma (stoişiyometrik)
 Okunan boya ile DNA miktarı arasında ilişki kurulması mümkün olmakta

 DNA aminoasit dizileri arasına girerek DNA boyanmasını sağlar
 Boyanın ve AHÖ cihazının özellikleri bilinmelidir
– 3 grup DNA boyası var
 Ethidium bromide ve propidium iodide
– RNA boyama özelliği
 Benzimidler
– Hoechst 33342 boyası: DNA’da özellikle A-T zengin bölgelere
bağlanma gösterir
 Antibiyotikler
– Mitramisin ve Kromamisin A: G-C zengin bölgelere bağlanır
 Acridine orange
– Çift sarmal DNA molekülleri arasına girme özelliğine sahiptir
Amaç tek hücre süspansiyonu haline getirmektir

Vücut sıvıları
– Kan, BAL, asit sıvısı, BOS
– Hücre membranının kaldırılması, gerekirse RNaz kullanılarak DNA’nın
boyanmaya açık hale getirilmesi gerekir

Doku ve parafin bloklar
DNA analizi



Hücre döngüsü fazlarındaki ortalama DNA içeriği
Hücre sayısı
Analiz sırasında normal hücrelerin DNA içeriklerinin histogramda
düştüğü kanal sayısını doğrulamak amacıyla iç ve dış kontrol
materyali kullanılır
– Sağlıklı bireyin lenfositleri
– Solid tm incelenirken, tm dokusu dışında kalan sağlam dokudan benzer
örnekler hazırlanması gibi..
 Dış kontrol: DNA örneğinden önce AHÖ cihazından ayrı bir tüpte geçirilen
örnekler
 İç kontrol: DNA analizinin yapıldığı tüpe eklenen ve tek bir defada
değerlendirilen konrol
DNA ANALİZ TERİMLERİ

CV (coefficent variation)
– Yapılan DNA analizinin geçerli olması için önemli
CV= G0/G1 orta yüksek genişliği/pik kanal sayısıx2.35
– Değerlendirilen hücrelerden elde edilen G0/G1 pikinin ince ve
uzun olması olarak ifade edilir
 Taze dokularda CV<4, parafin bloklarda<6 olması istenir
 CV değerleri bu düzeyde olmayan DNA örnekleri asla
değerlendirilmez
DNA ANALİZ TERİMLERİ

DNA indeksi (DI)
–
Çalışılan hücre popülasyonunun G0/G1 fazında bulunan hücrelerin DNA içeriğinin diploidi
içeren normal hc popülasyonunun G0/G1 fazındaki DNA içeriğine bölünmesi ile edinilen
değer
 DI = 1 diploidi
 DI<1 hipodiploidi
 DI>1 hiperdiploidi
Germ hc: haploid (n)
Somatik hc: diploid (2n)
Mitoz: tetraploid (4n)
DNA ANALİZ TERİMLERİ

Proliferatif indeks
– Araştırılan hücrelerin çoğalma kapasitesi
(S+G2+M/G0G1+S+G2+M)X100
Özellikle malignitelerde yapılan çalışmalarda önemli ve
malign hc çalışma kapasiteleri hakkında bilgi verir.
Klinik kullanımı
Malignite varlığının gösterilmesi
 Tedavi yanıtının değerlendirilmesi
 Prognoz
 Sağlıklı kişilerde tarama testi
 Patolojik olarak malignite (-) örneklerin, DNA
analizi+nükleer hacim ölçümü ile malignite
saptanmaktadır

Cross-Match (CM) teknikleri




Transplantasyonda antikorları belirlemek için kullanılan standart
teknik komplemana bağlı sitotoksik CM (CDCCM)’dir
CM, alıcı serumunda vericinin HLA antijenlerine karşı
antikor oluşması esasına dayanır
AHÖCM tekniği 1983’de kullanılmaya başlandı
Hedef lenfositlere bağlanan insan alloantikorlarını saptamak için
indirekt immünfloresan kullanılır
– Süspansiyon haldeki hücrelere işaretsiz antikor bağlanır
– İkinci olarak işaretli antikor eklenir ve ilk antiikora bağlanır

AHÖCM’de 2.antikor önemli
–
–
–
–
İyi saptanan özgüllüğü olmalı(AHÖ özgül)
Arka plan boyamayı azaltmak için Fab2 veya fab fragmenti olmalı
Fare ve at IgG’leri ile çapraz reaksiyon vermemeli
2.antikor florokrom seçimi mAb ‘a göre belirlenir
 Solid organ CM’inde CD3 T hc, CD19 ve CD20 B hücreleri tanınır
 CD3 PE, CD19 PE/CD20-PE ve IgG-FITC kullanılır (ikili boyama)
 CD3-PerCP, CD19-PE ve IgG-FITC (üçlü boyama)
Kontrol serumları

AHÖCM’de negatif ve pozitif kontrol serumları kullanılır
– Pozitif serum, yüksek HLA antikoru bulunduran serumların
havuzlanması ile oluşturulur
– Negatif serum, anti HLA ab içermez




Kan transfüzyonu yapılmamış
Transplantasyon yapılmamış
Kadın ise gebeliği olmayan
AB kan grubuna sahip sağlıklı bireylerin serumları olmalıdır

Cut off (pozitiflik) değeri
– Negatif serum ve en az 20 kişiden alınan serum karışımının, yine
20 kişiden alınan hücrelerle ayrı ayrı testlenmesi ile elde edilir
– Çalışmanın negatiflik sınırını her laboratuvar farklı parametrelerle
belirleyebilir
 Median veya yüzde değerler verilebilir
 T AHÖCM için ortalama 2SS, B için ortalama 3 SS olarak hesaplanır
Tranplantasyon kime yapılır?

AHÖCM (-), CDCCM(+) nakil yapılmaz
– Komplemanı bağlamayan antikorlar nedeniyle
Hiperakut rejeksiyon riski yüksek!

AHÖCM(+), CDCCM(-)
– Öncesinde transplantasyonu olmayan
– Gebelik geçirmemiş
– Kan transfüzyonu yapılmamış kişilere transplantasyon yapılabilir

Apoptoz tayininde AHÖ ölçümleri
– Hc büyüklük ve granülaritesindeki değişiklikler
 Işık saçınımının analizi
– Plazma membran geçirgenliğindeki
değişiklikler
 Höechst 33342 ve PI ile boyama
–
–
–
–
–
Hc yüzeyindeki değişiklikler
 Annexin V bağlanması
 F actin kaybı
Mitokondri ve lizozomlardaki değişiklikler
 Rhodamine 123 ve PI ile boyama
 JC-1 ile boyama
 Lizozom protein pompası
DNA fragmentasyonu
 TUNEL yöntemi
 Sub G1 pik ve DNA analizi
Kaspaz aktivasyonu
Hc içi Ca değişikliklerinin ölçümü

PI, membran bütünlüğü bozulmuş ölü hücrelerin içine
girip, DNA veya çift sarmal RNA’ya bağlanarak kırmızı
floresan veren bir boyadır
– Membran bütünlüğünü koruyan hücreler PI’i
hc içine almazlar ve boyanmazlar
– Canlı hücreler aktif olarak HO33342’yi alır ve hücresel DNA’yı
mavi floresan şeklinde gösterir
 Canlı hc--- mavi
 Nekrotik hc--- kırmızı
 Apoptotik hc---sönük mavi
HO/PI BOYAMASI
Erken apoptozisi göstermemesi
 Deneyin duyarlılığının zamana bağlı oluşu
 HO boya eksitasyonu için UV kullanımı
nedeniyle pratikte sınırlıdır

ANNEXİN V bağlanması
Annexin V’in FITC ile konjuge edilmesiyle
apoptotik hc görülebilir
 Annexin V-FITC /PI boyaması ölü ve canlı
hücrelerin ayrımına olanak verir

– Bu teknik solid dokular ve yapışan hücrelerde çalışılmamalıdır
– Ayrılma sırasında plazma membran hasarı olduğundan

F- actin kaybı
– Erken apoptoz sırasında plazma membran
yapılarının hızlı kaybı (psödopod ve
mikrovillus)
– F-actin pödopodunu yapısında
– Phallotoxinler ise F-actine bağlanan ve
depolimerizasyonu engelleyen toksik
peptidlerdir
– Floresanla konjuge phallotoxinler, F-aktin
probu olarakı kullanılır
 Apoptoz sırasında f-actin kaybı nedeniyle
phallotoxin bağlanmaz
 Paraformaldehit ile hc fiksasyonu sonrasında factin ve DNA sırasıyla FITC işaretli phalloidin ve PI
DNA FRAGMANTASYONU

TUNEL yöntemi
– Endonüleazların aktivasyonu sonucunda
yoğun DNA kırılmaları ile oluşan DNA
fragmantasyonu apoptotik hc gösterilmesinde
altın standarttır
 Sarmal kırıklarında açığa çıkan 3’OH uçları ekzojen
enzimler kullanılarak kataliz edilip modifiye
nükleotidler ile işaretlenir(FITC-dUTP,biotin-dUTP)
 Ekzojen enzimler olarak tek zincirlerin kırılması
TdT, tek zincirli kırılmalar için DNA polimeraz
kullanılır
Biotinlenebilmesi için sırayla floresanla
konjuge avidin, digoksigenin ve Br-dU
antikorları kullanılır
 Yönteme

– Terminal deoxynucleotidyl transferasemediated d-UTP Nick End Labeling ‘’TUNEL’’
adı verilir, DNA analizi ile birlikte
değerlendirilir

Apoptoz sırasında DNA içeriği ve morfolojik değişiklikler
olmadan erken dönemde DNA kırıklarının gösterilmesi
Tüm hc tiplerine uygulanabilir olması
Apoptototik hc siklusunun takibi

Kantitatif olması


avantajken
 Pahalı, zor, apoptotik hc hazırlık aşamasında
kaybedilmesi, TdT ve DNA polimeraz gibi
enzimlerin ısıya çok duyarlı olması gibi
dezavantajları vardır

Sub G1 pik ve DNA analizi
– Subdiploik DNA piki apoptozun özgül belirtecidir
– Apoptotik hücreler G0/G1 evresindeki hücrelere göre daha az PI
bağlayabilir ve subdiploid floresan yoğunluğu gösterir
– DNA degradasyonu için deterjenlar kullanılarak floresan
boyaların (PI/DAPİ) hc membranınıdan içeri girmeleri sağlanır
 İşlem öncesi RNAaz ile muamele edilmelidir
 Yöntemin avantajı hc DNA içeriği ve apoptoz hakkında bilgi sağlamasıdır



Kaspaz aktivasyonu
Kazpaz uyarımlı substratlar renklenir ve ya floresan ürünler
oluştururlar
Kaspaz 1, 3 ve 8 için ticari kitler vardır
– Kaspazların ölüm substratlarından olan poly ADP-riboz polimerazın
(PARP) tespit edilmesi yöntemleri vardır
 PARP, DNA hasarına cevap olarak aktive olan DNA tamirinde yer alan bir
enzimdir
 Erken apoptozda , PARP özellikle kaspaz 3ile kesilir, 89 ve 24kDa PARP
fragmanları oluşur
 89 kDa parçayı tanıyan antikor ve DNA için farklı boyalarla apopyotik hc
popülasyonları ve hc siklusu,DNA ploidisini kapsayan ayrıntılı analizler
yapılabilir

Canlı hücrelerdeki kaspazların değerlendirilmesi
– FLİCA (fluorochrome labelled inhibitor of caspase) ile
kaspaz aktivasyonu gösterilir
 Kaspazların aktif enzim merkezlerinin ligandlarına benzer
olarak yapılmışlardır
 Bütünlüğü bozulmamış plazma membranlarından
geçebilmesi, aktif kaspazlara kovalan bağlanması nedeniyle
canlı hücrede aktif kaspazlar incelenebilr