Okuma parçası
advertisement
Begüm Akman, Taner Tuncer; Yaşamın Şifresi: İnsan Genom Projesi; ODTÜ Yayıncılık, 2007, sayfa 51-59. GENOM NASIL DİZİLENİR? İnsan Genom Projesi’ nin en temel amacı olan insan genomundaki 3 milyar bazın dizilimini ortaya çıkarmak teknik anlamda zorlu bir girişim olmuştur. Uzun uğraşlar sonunda insan genom dizisi elde edilmiş ve bu dizi, bilim insanlarının kullanımına sunulmuştur. Peki, insan genomunun dizilenmesi nasıl yapılmıştır? Genomu dizilemeye başlamadan önce tabii ki hücrelerden DNA izole edilmesi gerekir. Bilim insanları günümüzde çok kolay yöntemlerle DNA’ yı saf olarak elde etmektedirler. Hatta o kadar kolaydır ki siz de evde DNA izole edebilirsiniz. Öncelikle, saflaştırma işlemini hangi dokudan yapacağınıza karar verin. Canlı hücrelerin hepsinde DNA bulunduğu için çeşitli hayvansal ya da bitkisel ürünleri kullanabilirsiniz. Fakat evde ezmesi daha kolay olacağı için muz iyi bir seçim olacaktır. Deneyin başında 2 çay kaşığı şampuanı küçük bir kaseye koyun ve üzerine 1 çay kaşığı tuz ekleyin. Şampuan ve tuzun üzerine 4 çay kaşığı musluk suyu ekleyin ve kaşıkla baloncuk yapmadan karıştırın. Daha sonra bir muzu ikiye bölün ve yarısını miksere atın, diğer yarısını afiyetle yiyebilirsiniz. Mikserdeki muzun üzerine 1 bardak musluk suyu ekleyin ve 20 saniye boyunca iyice pürüzsüz bir hal alana kadar mikserde çırpın. Eğer mikseriniz yoksa aynı işlemi kaşıkla ezip karıştırarak da yapabilirsiniz. Şimdi muz püresinin üzerine 4 çay kaşığı şampuan ve tuz içeren karışımdan ekleyin köpürtmemeye özen gösterin; köpürme DNA moleküllerinin kırılmasına neden olabilir. Şimdi bir kasenin içine huni şekline getirmiş olduğunuz kahve filtresini yerleştirin. Elinizdeki muzlu şampuan karışımını bu filtreye yavaşça dökün, kasenin içinde 2-3 çay kaşığı karışım birikene kadar bekleyin. Şimdi 4 çay kaşığı buzda soğutulmuş alkolü ki bu votka olabilir, ince uzun bir cam tüpe koyun ve filtrelenmiş karışımı çay kaşığıyla yavaşça üzerine ekleyin. Birkaç dakika içerisinde beyaz bir bulut oluşacaktır. Kürdanla bu bulutu alabilirsiniz ve evet elinizde tuttuğunuz DNA’ nın ta kendisidir. İsterseniz bu DNA’ yı koyu renkli bir karta yerleştirin, kurudukça ipliksi yapısını daha iyi fark edebilirsiniz. Ya da içinde alkol bulunan küçük bir şişede saklayabilirsiniz. Gözle gördüğünüz bu DNA’ da binlerce DNA molekülü birbirine yapışmış şekilde bulunmaktadır. Bu yöntemde kullanılan şampuan, hücre çeperlerini parçalayarak DNA’ nın dışarı çıkmasını sağlarken, tuz (NaCl) da yapısında bulunan artı yüklü sodyum iyonları sayesinde eksi yüklü DNA moleküllerine bağlanarak, DNA’ nın çevresinde bir kalkan oluşturur. Genom dizilemesinde kullanılan yöntemler aslında hücre içinde gerçekleşen DNA’ nın kendi kendini kopyalaması işlemine dayanılarak geliştirilmiş yöntemlerdir. İnsan gibi çok hücreli canlılarda hücreler, bölünmeden önce çekirdekte bulunan DNA’ yı eşlemek durumundadır. Hücre döngüsünün bu eşlenme fazında kromozomlar belirginleşir ve birtakım değişiklikler gerçekleşir. DNA normalde sıkıştırılmış halde bulunduğundan, bunu bir yün yumağı gibi de düşünebilirsiniz, önce bu yumağın açılması gerekir. Daha sonra enzimler sayesinde ikili sarmalın iki dizisi birbirinden ayrılır ve eşlemeye yardımcı enzimler sayesinde ayrılmış olan tümleyici DNA dizilerinin birer kopyası yapılır. Sonuçta hücredeki DNA miktarı iki katına çıkmış olur, hücre bölündüğünde bu sayı yine eskiye döner. Hücre döngüsü içerisinde DNA kendini bu şekilde çoğaltmaktadır. Laboratuvarlarda DNA ile çalışan bilim insanları da hücrenin kendisini taklit ederek, benzer enzimleri ve molekülleri kullanarak DNA’ yı çoğaltabilirler. İnsan Genom Projesi başladığında birçok gönüllüden kan örneği alınmıştır. Gelişmiş laboratuvar teknikleri ile bu kan örneklerinden DNA izolasyonu yapılmış ve daha sonra bu örnekler, dünyanın dört bir tarafında bulunan İnsan Genom Projesi merkezlerine dağıtılarak dizileme işlemi başlatılmıştır. DNA dizileme birden fazla adımda yapılan, pek çok farklı teknolojinin kullanıldığı bir işlemdir. Dizilemenin amacı DNA dizisindeki bazların (A,T,G,C) yan yana sıralanmış doğru dizisini bulmaktır. İnsan genomunun dizilenmesinde 2 farklı grubun çalıştığını ve farklı yöntemler kullandığını hatırlayalım. Öncelikle İGP grubunun hangi yöntemi izlediğini anlatıp daha sonra Celera’ nın kullandığı yöntemin farklarını açıklamak daha rahat anlamamızı sağlayacaktır. İnsan Genom Projesi’ nde çalışan bilim insanları öncelikle insan genomunun genel haritasını çıkarmışlardır. İnsan genomunda 23 kromozomun bulunduğunu ve bu kromozomların her birinin 50 ile 250 milyon baz içerdiğini hatırlarsak, öncelikle her bir kromozomun haritasının çıkarıldığını daha sonra ise detaylı bir iş olan dizilemenin yapıldığını rahatça anlayabiliriz. Bir kromozom haritalanırken, kromozom üzerinde sabit aralıklarla belirteçler saptanır, böylece kromozom üzerinde yön belirlemek daha kolay olur. Dizileme işlemine başlandığında, işi kolaylaştırmak için kromozom binlerce parçaya bölünür ve bu parçalar teker teker dizilenir. Daha önceden haritalamada saptanan belirteçler dizileme işlemi sonucunda elde edilen parçaları tekrar bir araya getirmede kullanılır. Bunu bir çeşit yap-boz gibi de düşünebilirsiniz; sonuçta dizilenen her parçanın tam olarak oturduğu tek bir uygun yer vardır. Aşağıdaki ‘İGP, DN’ANIN KEŞFİNİN ELLİNCİ YILDÖNÜMÜNDE TAMAMLANMIŞTIR’ cümlesini bir DNA parçası olarak düşünürsek, bu DNA parçası birbiriyle örtüşen dizilenmiş parçaların yardımıyla bilgisayar yazılımları sayesinde bir araya getirilerek ortaya çıkarılabilir. ÖNÜMÜNDE TAMAMLANMIŞTIR DNA’ NIN KEŞ KEŞFİNİN ELLİNCİ YILDÖNÜMÜNDE TAMAM İGP, DNA’ NIN KEŞFİN FİNİN ELLİNCİ YILDÖNÜMÜ NA’ NIN KEŞFİNİN ELLİ LLİNCİ YILDÖNÜMÜNDE TAM DE TAMAMLANMIŞTIR İGP, DNA’ NIN FEŞFİNİN ELLİNCİ YILDÖNÜMÜNDE TAMAMLANMIŞTIR Dizileme işlemi ise yaklaşık 2000 baz uzunluğundaki DNA parçalarına yapılır. Bir deney tüpüne dizisi belirlenecek DNA parçası, serbest bazlar, DNA eşleme başlatıcı dizileri adı verilen yaklaşık 20 baz uzunluğundaki diziler ve DNA polimeraz enzimi konulur. DNA polimerazın normalde hücrelerimizde bulunan ve DNA’ nın kendini eşlemesini sağlayan enzim olduğunu hatırlayın. Test tüpünde DNA’ nın kendini eşleyerek milyonlarca kopyaya çoğalmasını da aynı enzim sağlar. DNA polimeraz tek DNA ipliğini kalıp olarak kullanıp A bazının T bazına ve G bazının da C bazına bağlanma prensibine göre eşlenmesini sağlar. Bu olay şöyle de açıklanabilir: bir A bazı nerede tek başına duran bir T bazı bulsa gider ve ona bağlanır, aynı şekilde G bazı da C bazına bağlanır. Ancak dizileme yapılırken kullanılan serbest bazların bir kısmına DNA sentezini sonlandırma özelliğine sahip ekstradan kimyasallar ve floresan boyalar eklenir; böylece bu bazlar floresan boyama özelliği kazanırlar. İşte dizilemenin kilit noktası bu floresan boyalı özel bazlarda saklıdır. A, T, G ve C bazlarının her birinde farklı renkte bir floresan boya vardır. Normalde deney tüpümüze kalıp DNA, normal bazlar, eşleme başlatıcı diziler ve enzim koyduğumuzda başta koyduğumuz kalıp DNA’nın birebir kopyalarını elde ederiz. Ancak bu karışıma floresan boyalı özel bazlar ilave edildiğinde DNA eşlemesi sürekli olmaz; floresan boyalı bir A bazı normal bir T bazına bağlandığında reaksiyon sona erer. Böylece yeni kopya DNA dizisinin sonunda floresan boyalı A bazı bulunur ve jel elektroforezi denilen bir sonraki işlemde A bazına bağlı renk ayırt edilebilir. Deney tüpündeki milyonlarca kalıp DNA’dan eşleme başlatıcı diziler ile başlatılan DNA kopyaları, floresan boyalı sonlandırıcı bazların rastgele bağlanması ile kalıp DNA‘nın her nükleotidinde sonlanan DNA parçalarını temsil etmektedir. Sonuçta elimizde floresan boyalı bazların rastgele bağlandığı farklı uzunluklarda DNA dizileri olur ve bu DNA parçacıkları jel elektroforezi ile boylarına göre ayrıştırılır. Jel elektroforezi DNA’nın negatif yüklü bir molekül olması prensibine dayanan fiziksel bir işlemdir. DNA negatif yüklü bir molekül olduğundan elektrik akımında pozitif yüke doğru ilerler. Bu ilerleme esnasında daha kısa olan DNA parçaları daha hızlı ilerlerken, daha uzun olan DNA parçaları daha yavaş ilerlerler. Bu durumda bizim elimizde bulunan farklı uzunluklardaki DNA molekülleri uzunluklarına göre farklı mesafeleri katederler. Sonuçta bu uzunlukları ve floresan boyaların yansıttıkları dört farklı rengi analiz eden otomatik dizileme makineleri bize ilk kullandığımız DNA’nın dizisini verirler. İnsan Genom Projesi’ nin gelişimini hatırladığımızda projenin çok büyük bir yarışa tanık olduğu, Uluslararası Konsorsiyum ile Celera şirketinin kıyasıya mücadele ederek insan genomunun dizilenmesini ilk önce bitirmeye çalıştığı aklımıza gelmektedir. Daha sonradan ortaya çıkarak projeyi bir yarışa dönüştüren özel şirket Celera, dizilemeyi yaparken Uluslararası Konsorsiyum’dan farklı bir yöntem izlemiştir. Uluslararası Konsorsiyum kromozomlara belirteçler koyarak, kromozomlar üzerinde sırasıyla ve adım adım ilerleyerek, kromozomları birer birer dizilemiştir. Bu daha uzun zaman alan ve temkinli bir yöntemdir. Ancak Celera şirketi bu şekilde adım adım ilerlemektense, 23 kromozomu da içeren tüm genomu parçalara bölüp tüm parçaları dizilemiş, daha sonra bu sonuçları çok gelişmiş bilgisayar yazılımları aracılığıyla birleştirmiştir. Bu yönteme “ rastgele tüm genom dizilemesi” denir. Bu şekilde yapılan dizileme daha hızlı olduğundan projenin daha çabuk tamamlanması da mümkün olmuştur. ... İnsan Genom Projesi Konsorsiyumu’ nun kullandığı yöntemde önce kromozom üzerinde belirteçler saptanmış, daha sonra kromozom parçalara bölünerek dizilenmiş ve son olarak dizilenen parçalar ilk başta saptanan belirteçler yardımıyla birleştirilmiştir. Diğer taraftan, Celera şirketi en baştan tüm genomu küçük DNA parçalarına bölmüş ve bu DNA parçalarını dizilemiş, en son aşamada da gelişmiş bilgisayarlar sayesinde örtüşen dizileri kullanarak tüm diziyi elde edebilmiştir. Celera bu yötemi kullanırken Uluslararası Konsorsiyum’ un sürekli olarak internetteki veri bankalarına ilettiği sonuçları da kendi küçük parçalarını birleştirmek için zemin olarak kullanmıştır. İnsan genomunun 3 milyar bazdan oluştuğunu ve her bir dizilemenin en fazla 2000 bazlık DNA parçalarını dizleyerek yapıldığını ve bu işlemin emin olmak amacıyla birkaç kez tekrarlandığını göz önünde bulundurursak İGP’ nin fikri ilk ortaya atıldığında bir bilim insanının ‘insan genomunun dizilenmesi ancak suçlulara yaptırılabilecek, ceza gibi bir iştir’ demesini daha iyi anlayabiliriz. Dizileme işlemindeki bir sonraki adım, elimizdeki 2000 bazlık dizileri doğru şekilde bir araya getirmek için gelişmiş bilgisayarların yardımını almaktır. Bilgisayarlardaki yazılımlar veri olarak girilen binlerce farklı DNA dizisinin birbiriyle örtüşen parçalarını yap-boz gibi bir araya getirerek birleştirir. İşte insanın kromozomları da tek tek bu şekilde dizilenmiştir ve üst üste gelen yap-boz parçalarının kesin doğru dizilimini elde etmek amacıyla birden fazla kez dizilendiğini varsayarsak her bir baz yaklaşık 9 kez dizilenmiş olur. DNA parçaları dizilenirken aynı işlemlerden geçse de her biri aynı doğrulukta dizilenemez; bazı parçaların okunması daha kolay olurken bazılarınınki daha zordur. Bu nedenle zor olanların defalarca tekrarlanması gerekebilir. Sonuçta amaç yüksek kalitede, yani kesin doğrulukta bir dizi elde etmek olduğundan, aynı DNA dizilerinin emin olmak için tekrar tekrar dizilenmesiyle şu anda % 99.99 kesinlikte, yani 10 000 bazda 1 baz hata payıyla insan genomunun dizisine ulaşılmıştır.
