Neden moleküler genetik tanı?

27.04.2016
Neden moleküler genetik tanı?
Nursel Kıratlı Yılmazçoban
Mikrobiyal organizmalarda
ribozomal DNA’ ya dayalı teşhis
Carl Woese (1928-2012)
• Farklı
türler arasındaki
lateral/horizontal gen geçişi
filogenetikte önemli bir
sorundur.
• Genomlarda
cok
iyi
korunmuş olan 16S rRNA
dizileri kullanılarak yapılan
taksonomi
bu
sorunu
çözmede
önemli
bir
gelişmedir.
1
27.04.2016
İsaret dizileri (signature sequences)
PCR’ da primer dizileri
• Bakterilerde 16S, 23S rRNA, ökaryotlarda 18S rRNA
• Genoma rastgele bağlanan primerler (RAPD/SCAR)
• Ozel genlerin primerleri
• Genler arası tekrarlı dizilere özgül primerler
rRNA Analizi
1.DNA Ekstraksiyonu
2.16S rRNA PZR
3.Pürifikasyon
4.Sekans döngüsü
5.Pürifikasyon
6.Sekans analizi
7.Elektroferogramların değerlendirilmesi
8.Verilerin yorumlanması
Klinik örnekten, çevreden, saflaştırılmış numuneden
izolasyon
2
27.04.2016
3
27.04.2016
Mikrobiyal Toplulukların Moleküler
(Kültürden Bağımsız) Analizleri
Mikrobiyal Toplulukların Möleküler
(Kültürden Bağımsız) Analizleri
 Boyanma teknikleri (Sayım ve Canlılık Testleri, Floresan Antikorlar,
 Mikroarray ve Mikrobiyal Çeşitlilik: Filoçip (Phylochips)
 Genetik boyamalar (FISH, in situ ters transkripsiyon (ISRT) FISH)
 Nükleik asit sequens analizleri (Sanger Dideoksi Metodu,
Otomatik sequensing, 454 Pirosequensing)
Yeşil Floresan Proteini kodlayan reportör genler)
 Nükleik asit probları
 PCR (RT-PCR, RAPD-PCR)
 rRNA analizi
 Metagenomiks
 DNA fragmentinin elektroforetik analizi (DGGE, T-RFLP, ARISA)
4
27.04.2016
Sayım Testi
(boyanma teknikleri)
• DAPI (4’,6-diamido-2-fenilindol), 400 nm (canlı, ölü hc. ayırt edilmez)
• Acridine orange, 500 nm (canlı, ölü hc. ayırt edilmez)
• SYBR Green I, 497 nm (aguatik virus pop. sayma)
Canlılık Testi
(boyanma teknikleri)
• Yeşil, tüm hücrelere penetre olur.
• Kırmızı (propidiyum ioydid içerir), sitoplama memranını koruyamayan ve
ölen hücreleri boyar.
Spesifik olmayan floresan boyalar ile boyanmış numuneler a) DAPİ b) Akridin turuncusu (Yeşil
olan boyanma düşük rRNA düzeyindendir) c) SYBR Green I
LIVE/DEAD Bac Light TM
Bacterial Viability Stain ile boyanmış
Micrococcus luteus (koklar) ve Bacillus cereus’ un (çubuklar) canlı (yeşil) ve
ölü (kırmızı) hücreleri.
Floresan Antikorlar
(boyanma teknikleri)
Floresan Antikorlar
(boyanma teknikleri)
• Direkt yöntemde yüzey antijenine yöneltilmiş antikor,
floresan boya ile kovalent bağlıdır.
• İndirekt yöntemde, bir hc.nin yüzeyindeki floresan
olmayan antikorun mevcudiyeti, bu floresan olmayan
antikora karşı yöneltilmiş floresan bir antikorun
kullanılmasıyla saptanır.
Mikrobiyal yüzey antijenlerinin floresan antikor metodu ile belirlenmesi.
Yeşil Floresan Protein
(boyanma teknikleri)
Southern Blot
Green flourescen protein (GFP), protein lokalizasyonunu in vivo etiketlemek
için kullanılır. Bu örnekte, S. cerevisiae mayasında bir DNA-bağlanma
proteini olan Pho2’ yi kodlayan geni, GFP yi kodlayan gen ile
birleştirilmiştir. Oluşturulan rekombinant gen tomurcuklanan maya hc. nde
transform edilmekte ve çekirdekte lokalize olan floresan füzyon proteini
ifade olabilmektedir.
5
27.04.2016
Northern Blot
Floresan in situ hibridizasyon (FISH)
• Fluoresan işaretleme, in situ hibridizasyon
prensibine göre, prob ve örnek arasında melez bir
yapı meydana gelmesiyle sinyale dönüşen bir
işlemdir.
• FISH, Southern blot tekniğinin analoğudur.
• FISH,
fluoresan
işaretlerle
etiketlenen,
tamamlayıcı DNA’ya, bu DNA dizilerinin yerleşimini
görebilmek için hibridizasyona uğrayan veya
bağlanan tek zincirli DNA (prob) kısa dizilerini
gerektiren bir yöntemdir.
FISH
Floresan in situ hibridizasyon (FISH)
Floresan in situ hibridizasyon (FISH)
FISH
• Fluoresan işaretleme, in situ hibridizasyon
prensibine göre, prob ve örnek arasında melez
bir yapı meydana gelmesiyle sinyale dönüşen bir
işlemdir.
• FISH, Southern blot tekniğinin analoğudur.
• FISH, fluoresan işaretlerle etiketlenen,
tamamlayıcı DNA’ya, bu DNA dizilerinin
yerleşimini görebilmek için hibridizasyona
uğrayan veya bağlanan tek zincirli DNA (prob)
kısa dizilerini gerektiren bir yöntemdir.
Arıtma çamurun FISH analizleri. a) Nitrifikasyon bakterileri. Kırmızı olanlar
amonyak okside edin bakteriler, yeşil renktekiler nitrit oksitleyen bakterilerdir. b)
Konfokal Lazer Mikroskobu ile görüntülenen aktif çamur örneği
6
27.04.2016
CARD (Catalyzed reporter deposition) FISH
CARD FISH
Catalyzed reporter deposition CARD FISH ile Archaea analizleri. DAPİ (mavi) ile
boyanan türlere göre yeşil renk oldukça belirgindir.
Mikrobiyel topluluktaki tek gen çeşitliğinin analiz adımları
Denatüre Edici Gradient Jel Elektroforezi
(DGGE): Benzer Genlerin Ayrılması
Terminal Restriksiyon Uzunluk Polimorfizmi
(T-RFLP)
PZR ve DGGE analizleri
7
27.04.2016
T-RFLP
ARDRA: Amplified ribosomal DNA
restriction analysis
• 16S rRNA geninin son bolge parca uzunluklarının gruplar
arasındaki farklılığına dayanır.
• 5’ primer floresan boya ile etiketlenir, 16S parçalarının
kesiminden
sonra
hibridize
edilir,
bu
parçaların
uzunluklarındaki baz farkları kapiler elektroforez ile
saptanabilir.
Automated
ribosomal
intergenic
spacer
analysis
(ARISA).
(a)
Structure
of
rRNA
operon
spanning the 16S rRNA gene (positions 1–1540), an internal transcribed spacer (ITS) region of variable length,
and the 23S rRNA gene (positions 1–2900). The PCR primers, one labeled with a fluorescent dye, are
complementary to conserved sequences near the ITS region. (b) Amplified DNA fragments of different
lengths, each corresponding to a community member.
Mikroarray ve Mikrobiyal Çeşitlilik:
PhyloChips
Neden bu teknolojiye ihtiyaç duyuldu?
Bir organizmada bulunan binlerce gen ve bu genlerin ürünleri
olan RNA ve proteinlerin ortaklaşa fonksiyon görmeleri
hayatın gizemini oluşturmaktadır.
Berkeley Lab’ ın PhyloChip adında geliştirdiği, DNA Mikroarray teknolojisi
kullanılarak mikrobiyal populasyonun hızlı profilini çıkarmak için kullanılan teknoloji
8
27.04.2016
Milyonlarca DNA bazının dizilişini bilmek,
genlerin;

ne yaptıklarını,
nasıl çalıştıklarını,
hücreden organizmaya giden aşamaları,
hastalıkla hangi mekanizmaların değiştiğini,
yaşlanmanın nedenlerini

vs. öğrenmek anlamına gelmez.
• Bu bilgiler metabolik yollara ait şemalar
ile birleştirildiğinde, değişen şartlar
altında bu yolların nasıl etkilendiği
öğrenilebilmektedir.
• Fakat tüm genleri eş zamanlı çalışmak
oldukça karmaşık bir olaydır ve geniş
kapsamlı teknolojilere ihtiyaç vardır.
Affymetrix Gen Çipleri
GeneChip Prob Array’i
Hibridize edilmiş prob
Tek zincirli hedef RNA
Oligonükleotit prob
*
*
*
*
*
24µm
Spesifik bir oligonukleotidin
Milyonlarca kopyası
1.28cm
>200,000 farklı
tamamlayıcı prob
Hibridize edilmiş prob dizilimi
Bir hücrenin tipi veya içinde bulunduğu evre, o
hücrede eksprese olan gen profili yani sahip
olduğu genlerin mRNA düzeyindeki değişiklikleri
ile belirlenir.
Daha önce tanımlanmamış birçok genin
ekspresyon profili incelenerek ve diğer bilinen
gen profilleri ile karşılaştırarak o genlerin olası
fonksiyonları
hakkında
ipuçları
elde
edilmektedir.
• Bir array, nükleik asit örneklerinin düzgün
bir şekilde sıralanması ile oluşmaktadır.
• Bilinen ve bilinmeyen DNA örneklerinin baz
eşleşmesi özelliğine göre hibridizasyonu için
uygun bir ortam sağlayarak bilinmeyen DNA
ların tanımlanabilmesi için kullanılır.
Şekil-1: DNA Mikroarray çip
yapımı. PCR ürünleri; geni veya genin
bir bölümünü temsil eder. Cam slayt
üzerine yerleştirilip sabitlenirler.
Sonuçta
tek
zincirli
DNA
fragmentleri, komplementleri (karşı
zincirleri)
ile
bağlanabilir
ve
işaretlenebilirler.
53
9
27.04.2016
Şekil-2: Gen ekspresyonları arasındaki farkın, iki RNA
örneği kullanılarak mikroarrayda belirlenmesi: (a)1 nolu
ortamdaçoğalan hücrelerden izole edilen RNA, oligo-dT
primerler kullanılarak cDNA ya dönüştürülmüş ve yeşil
floresan boya ile işaretlenmiştir (Cy3). Benzer şekilde; 2
nolu ortamda çoğalan hücrelerden izole edilen RNA, oligodT primerler kullanılarak cDNA ya dönüştürülmüş ve
kırmızı floresan boya ile işaretlenmiştir (Cy5). cDNA
örnekleri eşit oranlarda karıştırılarak mikroarray ile
hibridize edilmiştir. Mikroarrayın floresan mikroskop
görüntüsü renkli noktacıklardan oluşur.Yeşil renkli
noktacık ilgili genin sadece 1 nolu büyüme ortamında
ekspresyonunun olduğunu; kırmızı renkli noktacık ise genin
sadece 2 nolu büyüme ortamında ekspresyonunun olduğunu
gösterir. 1 ve 2 nolu ortamlardan eşit miktarda cDNA ,
mikroarrayın tek zincir DNA sına bağlanırsa eşit
miktarlardaki kırmızı ve yeşilin karışımını ifade eden sarı
renkli ışınım ortaya çıkar. (b) Fare gen dizilerinden
türetilmiş gen ekspresyonlarını ifade eden farklı RNA
örneklerinin
bir
mikroarray
görüntüsü
Örneğin; Şekil-2’de görüldüğü gibi eğer 1 nolu ortamdaki
hücrelerde bir genin ekspresyonu yapılıyor, 2 nolu ortamda
yapılmıyorsa karıştırılan cDNA’da sadece Cy3 işaretli
cDNA’nın tamamlayıcısı olan, mikroarrayda yeşil ışınım
yapan noktacıktaki cDNA ile hibridize olacaktır.
Benzer şekilde, bir gen sadece 2 nolu ortamda ifade
ediliyorsa mikroarrada kırmızı renkte ışınım yapacaktır.
Genler her iki ortamda da eşit şekilde ifade ediliyorsa
ışınım, renklerin karışımı olan sarı renkte olacaktır.
Mikroarrayın, her bir örneğin mRNA düzeylerine göre
kesin kalibrasyonu önemlidir. Yeşil ve kırmızı floresan
sinyaller arasındaki oran, genomik DNA içeren değişik
noktacıklarda (spot) hesaplanmalıdır. Floresan dedektörü,
bileşenlerin ölçülen bağıl yoğunluk yüzdesi 1.0 olacak
şekilde kalibre edilebilir. Yeşil ve kırmızı sinyallerin
relatif yoğunluğu, her bir örnekteki spesifik mRNA ‘nın
relatif yoğunluğu ile kıyaslanarak hesaplanır. Bu durum
gelecekte, DNA mikroarrayla tüm genomu kapsayacak
şekilde gen ekspresyonunu analiz
edebileceğimiz
(Transkript
Profili)
anlamına
gelmektedir.
• Microarray yüksek hızda çalışan robotlar
tarafından imal edilmektedir.
• Genellikle cam, bazen de naylon yüzeyler
üzerine DNA dizisi bilinen problar dizilir.
Dizileme İçin Gerekli Olan Teknikler
• Restriksiyon Enzimleri – DNA’yı parçalara
ayırmada
• Klonlama – DNA’yı 2-200kb’lık diziler halinde
çoğaltma
• Dizileme – Kısa DNA dizisinin okunması.
– fluoresan maddeler ve jel-elektroforezi
kullanılarak.
• Dizilerin Birleştirilmesi – parçaların bir araya
getirilmesinde kullanılan bilgisayarlı aşama.
Fikse edilen örneğe ait noktanın büyüklüğüne göre
makroarray ve microarray olmak üzere ikiye ayrılırlar. 300
mikron
ve
daha
büyük
noktacıklardan
oluşan
makroarray,jelde ve blot tarayıcılarda kolayca görülür.
Mikroarrayde ise örnek çapı 200 mikrondan küçüktür.
Bu nedenle bir array üzerinde binlerce örnek
bulunabilir.
Microarray çalışmalarında özel robotlara ve görüntüleme
donanımlarına ihtiyaç vardır.
DNA Dizilemesi
DNA dizilemesi, bir DNA molekülündeki nükleotit
bazlarının (adenin, guanin, sitozin ve timin) sırasının
belirlenmesidir.
• İki temel dizileme stratejisi
- Düzenli klon dizilemesi
* fiziksel bir haritayı oluşturan klonlardan
yapılan birleştirme
* pozisyonların bilinmesinden dolayı tekrarlı
diziler için uygun yerleştirilme
10
27.04.2016
Dizi analiz cihazı: ABI 3700
• Tüm genom shot-gun dizilemesi
rastgele
birleştirilmesi
dizilenen
klonların
* küçük (ör:bakteri) genomlar için uygun
boşluklar primer yürüme ile doldurulur
Otomatik Jel Okuyucu
Kapiler elektroforez cihazı
11
27.04.2016
DNA Dizilemesi
• Çoğunlukla dideoksi metodu (zincir sonlandırma
metodu) ile yapılır.
• Dizilemesi yapılacak olan DNA dizilerinin birçok
kopyası aşağıdaki bileşikler ile karıştırılır.
– Primer
• DNA tek zincirine bağlanan kısa dizi (~20bp)
– Normal (deoksi) nükleotidler
• dNTP – dATP, dGTP, dCTP, dGTP
– dideoksi nükleotidler
• ddNTP –
– DNA polimeraz I
• Enzim
ddATP, ddGTP, ddCTP, ddGTP
DNA
Dizilemesinde
Zincir
Sonlandırma
Metodu
Hibridizasyon ile DNA Dizilemesi
Bu strateji, bilinmeyen etiketli DNA parçasının tüm kısa oligonükleotidlere bağlanmasını (ör:
8-merlik 65,336 kombinasyon ) ve bilinmeyen dizinin bağlanma kalıbından görüntülenmesini
içerir.
12
27.04.2016
Basamak 1
Pirodizilemenin Temeli
Bir dizileme primeri tek zincirli, PCR ile çoğaltılmış, DNA kalıbına, hibridize
edilir ve DNA polimeraz, ATP sulfurilaz, lusiferaz ve apiraz, enzimleri, adenozin
5´ fosfosülfat (APS) ve lusiferin substratları ile inkübasyona bırakılır.
Basamak 2
Basamak 3
ATP sülfürilaz, adenozin 5´ fosfosülfat varlığında kantitatif olarak PPi’yi ATP’ye
dönüştürür. Bu ATP molekülü, lusiferaz temelli reaksiyon lusiferinin oksilusiferine
dönüşümünü sağlarken, ATP miktarı ile orantılı olarak görünür ışık oluşumu
gerçekleşir. Lusiferaz katalizli reaksiyon sonucunda üretilen ışık CCD kamera
(charge coupled device) ile belirlenir bir pirogramda pikler halinde görüntülenebilir.
Her bir ışık sinyali yapıya katılan nükleotid sayısı ile orantılıdır.
İlk önce dört adet deoksinükleotidtrifosfat (dNTP) reaksiyona ilave edilir.
DNA polimeraz deoksinükleotid trifosfatların, DNA zincire katılmalarını kataliz
eder. Yapıya katılan dNTP ile orantılı olarak PPi (pirofosfat) açığa çıkmaktadır.
Basamak 4
Bir nükleotid parçalayıcı enzim apiraz, sürekli olarak; yapıya girmeyen dNTPleri ve
fazla ATP’yi parçalar. Parçalama bittiğinde, diğer dNTP eklenir.
Pirodizilemenin Özeti
Pirodizileme, DNA’nın enzimatik DNA sentezi ile dizilenmesidir, DNA dizisi
sentezi sırasında açığa çıkan fotonların oluşturduğu sinyallerin şiddetine göre
belirlenir .
Basamak 5
Her bir işlem için dNTPlerin eklenmesi bir kez gerçekleştirilir. Doğal deoksiadenozin
trifosfat (dATP) DNA polimeraz tarafından etkin bir şekilde kullanılmasına rağmen,
lusiferaz tarafından tanınmadığından deoksiadenozin alfa-tiyo trifosfat (dATPaS)
kullanılmaktadır. Süreç devam ederken, kalıp DNA zinciri yapılır ve nükleotid dizisi
pirogramdaki piklerin oluşturduğu sinyaller ile belirlenir.
13
27.04.2016
TEŞEKKÜRLER…
14