enstrümantal analiz-6

10/12/2015
Elektoforez
• Elektroforez yüklü moleküllerin bir elektriksel alandaki
hareketlerinin izlendiği bir tekniktir. Bir örnekteki maddelerin
tümü veya bazıları iyonlaşabiliyorsa karışım bir elektrik alana
konularak bileşenlerin ayırımı yapılabilir.
ENSTRÜMENTAL ANALİZ
Elektroforez
• Elektrik alanda yüklü moleküller hareket eder. Bu hareketin
hızı iyonun cinsine, yüküne, alanın şiddetine bağlıdır. Bu
yöntem elektroforez olarak isimlendirilir.
1
Elektroforezin prensibi: Zıt yükteki elektrotlara doğru,
farklı hızlarda hareket eden değişik yükteki
moleküllerin elektriksel alanda birbirinden
ayrılmasına dayanır.
2
• Bu sistemde analizi yapılacak örnek bir destek
ortamına uygulanır. Destek maddesi içerisinde
uygun bir tampon bulunan bir elektroforez
cihazına yerleştir ve elektrik akımı verilerek
işlem gerçekleştirilir.
• Yüksüz moleküller elektriksel alandan etkilenmezler,
hareket etmezler.
• Farklı büyüklükteki moleküller farklı hızlarda yol
alırlar. Büyük moleküllerin hızları daha yavaştır
• Analizi yapılacak örnek destek maddesine bir
leke ya da ince bir bant şeklinde uygulanır.
3
Destek maddeler
 süzgeç kağıdı,
 Selüloz asetat zarları,
 Nişasta jeli,
 Agaroz jeli
 Akrilamid jeli olabilir
4
Kağıt elektroforezi
• ucuz ve kolay bir yöntemdir.
• Kağıt elektoforezinde elektrotların daldırıldığı
ve kağıdın ıslatılmasında kullanılan
tamponların konsantrasyonları önemlidir.
Çünkü organik asitlerin çoğu ancak belli pH’da
iyonlar oluşturur.
 Modern elektroforetik tekniklerde daha çok jeller tercih edilir
5
6
1
10/12/2015
Poliakrilamid jel
elektroforezi(PAGE)
• Kağıt elektroforezi kağıt kromatografisine
benzer. Burada örnek kağıdın uç bölgelerine
değil de ortasına uygulanır. Örnekler
bileşenleri + veya – kutuplara doğru hareket
eder.
• Kağıt elektroforezi karbonhidratlar ve
aminoasitler gibi düşük molekül ağırlıklı
bileşiklerin belirlenmesinde kullanılır.
•
Küçük boyuttaki nükleik asit ve proteinler için çok yüksek
ayrıştırma
gücüne
sahiptir.
Proteinlerin
analizinde
ayrıştırılmasında en fazla kullanılan yöntemlerden biridir.
•
Temelde protein tanımlama (molekül ağırlığını, oligomerik mi,
monomerik mi olduğunu, miktarını, saflığını belirlemek vs) ve
saflaştırma amacıyla kullanılan bu yöntem bir proteinin
sentezlenip sentezlenmediği; sentezleniyorsa işlevsel olup
olmadığı hakkında da bilgi verir.
7
• Destek materyali olarak akrilamit ve bisakrilamidin serbest
radİkaller eşliğinde polimerizasyonu ile hazırlanan
poliakrilamid jeller kullanılır.
• Poliakrilamid miktarı değiştirilerek jeldeki gözeneklerin
büyüklüğü kontrol edilebilir.
• Göç eden moleküllerle destek materyali arasındaki etkileşim
en düşük düzeydedir.
8
•
Poliakrilamid jeller akrilamid ve çapraz
bağlayıcı N,N’-metilen-bis-akrilamidin
polimerizasyonu ile hazırlanır. Çapraz
bağlayıcı jelde polipeptitlerin geçeceği
porları oluşturur
•
Reaksiyon başlatıcı ve katalizör olarak
amonyum persülfat, katalizör olarak
daTEMED (tetrametilenetilendiamin)
kullanılır
•
Bir jelin ayrıştırma gücü ve molekül
boyutu aralığı akrilamid ve bisakrilamidin
konsantrasyonuna bağlıdır.
•
Düşük konsantrasyonda daha büyük
porlar oluşur ve yüksek molekül ağırlıklı
biyolojik moleküllerin analizi yapılabilir.
• Moleküller yük ve büyüklüklerine göre ayrılırlar
• Ayrıca destek materyali oldukça kararlı ve dayanıklıdır.
9
• Jellerin hazırlanmasında kullanılan akrilamid
bir nörotoksindir ve kanser oluşturma tehlikesi
vardır. Bu nedenle eldivenle çalışılması
gerekmektedir.
11
10
• Poliakrilamid jellerde yapılan elektroforez örnekteki
bileşenlerin daha iyi ayrılmalarına yol açar, çünkü ayırım hem
moleküler elekleme (jel filtrasyon) hem de elektroforetik
harekete dayanır.
• Jel filtrasyondan farkı küçük moleküllerin büyük
moleküllerden daha hızlı hareket etmeleridir
12
2
10/12/2015
•
• PAGE çubuk (tüp) biçiminde veya düzlemsel
biçimde hazırlanan jellerde gerçekleştirilebilir.
Düzlemsel poliakrilamid jel belli uzaklıkta (0.5-2 mm) tutulan
iki cam plaka (jel kaseti) arasında ve genellikle 8x10 cm veya
10x10 cm boyutunda hazırlanır. Polimerizasyon plakaların
içinde gerçekleştirilir.
• Düzlemsel jellerde daha fazla örneği analiz
etmek mümkün olduğu için daha çok bunlar
tercih edilir.
13
14
• Polimerizasyon sırasında jelin üst kısmına yerleştirilen plastik
bir tarak ile kuyucukların oluşumu sağlanır.
• Jeli oluşturmak için kullanılan çözeltiler belirli
oranlarda karıştırılarak hava kabarcığı
kalmayacak şekilde iki cam plaka arasındaki
boşluğa bir pipetle dikkatlice dökülür.
• Polimerizasyondan sonra tarak çıkarılır.
• Jel kaseti tampon küvetine yerleştirilir,
• Örnekler kuyucuklara uygulanır ve akım geçirilir.
• İşlemin izlenmesi için örnekler bir boya maddesi (bromofenol
mavisi) ile karıştırılarak uygulanır
15
16
17
18
• Üst kısımda katot alt
kısımda ise anot
bulunur. Biyolojik
moleküllerin çoğu
negatif yüklü olduğu
için anoda doğru
hareket ederler.
• Elektroforez bitiminde
jel uygun bir boya
(Coomassie brillant blue
veya gümüş nitrat)ile
boyanarak görüntülenir
3
10/12/2015
SDS-PAGE (Sodyum dodesil sülfatpoliakrilamid jel elektroforezi)
•
PAGE’in modifiye edilmiş şeklidir.
•
Sodyum dodesil sülfat (SDS) kullanılarak proteinler
denatüre edildikten sonra poliakrilamidde ayrılırlar.
• SDS-PAGE’de proteinler molekül büyüklüklerine göre ayrılır.
SDS-PAGE’in en büyük yararı proteinlerin molekül ağırlıklarının
belirlenmesine olanak vermesidir.
•
SDS-PAGE molekül ağırlığı belirlemesinde kullanılır. Jele
yüklenen standart standart protein örnekleri (marker)
yardımı ile molekül ağırlığı belirlenir.
•
PAGE’de ise proteinin molekül ağırlığı hakkında bilgi
edinmek mümkün değildir. Çünkü buradaki ayırımı
molekül büyüklüğü yanında molekül şekli ve yükü de
etkiler.
•
SDS-PAGE’DE proteinler denatüre edildiğinden
biyolojik aktiviteleri ortadan kalkar.
•
PAGE’de ise proteinler ya da enzimler biyolojik
aktivitelerini kaybetmeksizin ayrılabilirler.
19
20
• Agaroz jel elektroforezi
•
PAGE daha çok proteinlerin ve küçük DNA parçalarının ayırımı ve analizi için
kullanışlıdır. Poliakrilamid jeldeki küçük por boyutları büyük DNA
molekülleri için uygun değildir. Büyük DNA moleküllerinin ayırımında
agaroz destekli elektroforez kullanılır.
•
Agaroz: bir algden elde edilen agaroz, galaktopiranoz türevlerinin lineer bir
polimeridir.
• Jel elektroforez tamponuna konmuş agarozun
yüksek sıcaklıkta çözündürülmesi ile hazırlanır.
Agaroz çözeltisi yaklaşık 50 C’ye kadar
soğutularak jel tepsisine dökülür.
• Agaroz konsantrasyonu % 0.3-2.0 arasındadır.
Büyük moleküller için düşük konsantrasyon,
küçük moleküller için yüksek konsantrasyonda
hazırlanır.
21
• Ayırımı yapılacak örnek taraklarla
oluşturulmuş kuyucuklara yerleştirilir ve
ayırım yapılıncaya kadar voltaj uygulanır.
22
• UV ışık altında floresan etki gösteren etidiyum
bromür boyası kullanılarak oluşan bantların
görüntülenmesi sağlanır (Boya hazırlanırken
jele ilave edilir.
• Küçük moleküller daha hızlı hareket
ederler. Büyük moleküller de yavaş hareket
ederler.
• Etidiyum bromür mutajendir. Mutlaka
eldivenle çalışılmalı.
• Aynı jelde molekül ağırlığı bilinen
standartlar da yürütülerek örneklerin
molekül ağırlıkları belirlenir.
23
24
4
10/12/2015
•
Elektroforez, çeşitli süt proteinlerinin ayrımında da kullanılmaktadır.
Örneğin, başlıca proteini olan kazein, elektroforez işleminden önce ph 4.6
da asit ile çöktürülerek çeşitli fraksiyonlara ayrılmış
•
Albümin ve laktoglobinlerin ise yine a, β, γ olarak alt gruplarının olduğu
belirlenmiştir.
•
Elektroforez bazı süt karışımlarının belirlenmesinde de etkili bir yoldur.
•
Koyun ve inek sütlerinden yapılmış çeşitli peynirlerin belirlenmesinde de
elektroforez tekniği kullanılmaktadır.
•
Yumurta proteinleri elektroforezde karakteristik bant verirler. Bu
yöntemle yumurta akının protein içeriği belirlenebilir.
•
Etlerdeki yabancı et karışımları da belirlenebilmektedir.
Elektroforezin Gıda Analizlerindeki Uygulamaları
• Gıda proteinlerinin çeşitli amaçlarla tayinlerinde elektroforez
çok kullanılan bir analiz yöntemidir. Hemen hemen tüm
gıdalarda elektroforez tekniği kullanılabilmektedir.
• Örneğin, buğday ve diğer tahıl ürünlerindeki protein
fraksiyonları elektroforez ile izole edilip ayrılabilmektedir. Yine
tahıllarda bulunan ve ekmek yapımında önemli bir yere sahip
glutenin alt ünitelerinin yapısı, SDS-PAGE ile incelenebilmiştir.
25
26
• Elektroforez, proteinlerin ve enzimlerin
saflığının kontrolünde,
• Oligonükleititlerin analizinde, proteinlerin
moleküler ağırlıklarının tespitinde,
• Proteinlerin izoelektrik pH larının
belirlenmesinde,
27
• Protein ve enzimlerin preparatif amaçlarla
elde edilmesinde de kullanılır.
28
5