Biyokimya Laboratuvarında Kullanılan Cihazlar
advertisement
ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOKİMYA BİYOKİMYA LABORATUVARINDA KULLANILAN CİHAZLAR VE EKİPMANLAR DERYA ÜNAL DOKTORA ANKARA 2017 İÇİNDEKİLER 1. ALETLER ..................................................................................................................................................................... 3 1.1 Terazi: ....................................................................................................................................................................... 3 1.2 Işık mikroskobu: ....................................................................................................................................................... 3 1.3 Santrifüj .................................................................................................................................................................... 3 1.4 Spektrofotometre ...................................................................................................................................................... 3 1.5 Su banyosu................................................................................................................................................................ 3 1.6 Etüv........................................................................................................................................................................... 4 1.7 pHmetre .................................................................................................................................................................... 4 1.8 Saf su cihazı .............................................................................................................................................................. 4 1.9 Elektrikli karıştırıcı (vorteks) ................................................................................................................................... 4 1.10 Elektrik ocağı .......................................................................................................................................................... 4 2. CAM EŞYA.................................................................................................................................................................... 5 2.1 Kalitatif Cam Eşya: .................................................................................................................................................. 5 2.1.1 Beher...................................................................................................................................................................... 5 2.1.2 Erlenmeyer............................................................................................................................................................. 5 2.1.3 Piset ....................................................................................................................................................................... 5 2.1.4 Altı düz balon ........................................................................................................................................................ 5 2.1.5 Deney tüpleri ......................................................................................................................................................... 5 2.1.6 Santrifüj tüpleri ...................................................................................................................................................... 6 2.2 Volumetrik Cam Eşya ......................................................................................................................................... 6 2.2.1 Pipet ....................................................................................................................................................................... 6 2.2.1.1 Dereceli pipetler ................................................................................................................................................. 6 2.2.1.2 Büllü pipetler ...................................................................................................................................................... 6 2.2.1.3 Mikropipetler ...................................................................................................................................................... 6 2.2.1.4 Kapiller pipetler .................................................................................................................................................. 6 2.2.1.5 Otomatik pipetler ................................................................................................................................................ 7 2.2.2 Büret ...................................................................................................................................................................... 7 2.2.3 Ölçü silindiri (mezür) ............................................................................................................................................ 7 2.2.4 Ölçü balonu (Balon joje) ....................................................................................................................................... 8 3. DİĞER GEREÇLER ...................................................................................................................................................... 9 3.1 Bunzen beki-ispirto ocağı ......................................................................................................................................... 9 3.2 Porselen kroze........................................................................................................................................................... 9 3.3 Porselen kapsül ......................................................................................................................................................... 9 3.4 Sacayak ..................................................................................................................................................................... 9 3.5 Spatül ........................................................................................................................................................................ 9 3.6 Havan ........................................................................................................................................................................ 9 3.7 Port-tüp ..................................................................................................................................................................... 9 3.8 Baget ....................................................................................................................................................................... 10 3.9 Tahta maşa .............................................................................................................................................................. 10 3.10 Kıl fırça ................................................................................................................................................................. 10 3.11 Desikatör............................................................................................................................................................... 10 3.12 Huni ...................................................................................................................................................................... 10 3.13 Ayırma hunisi ....................................................................................................................................................... 11 3.14 Saat camı .............................................................................................................................................................. 11 3.15 Lastik puar ............................................................................................................................................................ 11 3.16 Vakumlu tüp sistemi ............................................................................................................................................. 11 4. CİHAZLAR .................................................................................................................................................................. 12 4.1 Spektrofotometre .................................................................................................................................................... 12 4.1.1 Işık spektrumu ..................................................................................................................................................... 12 4.2 Atomik Absorpsiyon Spektrofotometre Cihazı ..................................................................................................... 15 4.3 Otoanalizör ............................................................................................................................................................. 16 4.3 Kromotografi .......................................................................................................................................................... 18 4.4.1 Adsorpsiyon kromatografisi: ............................................................................................................................... 19 4.4.2 Partisyon kromatografisi ...................................................................................................................................... 19 4.5 Elektroforez ............................................................................................................................................................ 19 KAYNAKLAR ................................................................................................................................................................. 23 1. ALETLER Soğutucu ve derin dondurucu: Bazı kimyasalların ve biyolojik materyallerin (doku, kan, vb.) saklanmasında gereklidir. 1.1 Terazi: Tartımlarda kullanılır. 1.2 Işık mikroskobu: Biyolojik sıvılarda gözle görülemeyecek kadar küçük cisimlerin saptanması amacıyla kullanılan, merceği çok güçlü optik aygıttır. 1.3 Santrifüj: Dönme ile sağlanan merkez çekim kuvvetinden yararlanılarak çökeltiyi çözeltiden ayırmak için kullanılan alettir. 1.4 Spektrofotometre: Belirli dalga boyundaki bir ışığın çözelti tarafından emilimini (absorpsiyon) veya geçirgenliğini (transmitans) ölçmekte kullanılan alettir. 1.5 Su banyosu: Belirli sıcaklıkta nemli ortam sağlanması gereken deneylerde kullanılır. 1.6 Etüv: Bazı deneylerde (hücre kültürü vb.) gerekli olan sabit basınç ve sıcaklıkta kuru ortam sağlamak, rutin çalışmalarda maddeleri (kimyasal madde, doku vb.) ve cam eşyayı kurutmak için kullanılır. 1.7 pHmetre: Biyolojik sıvıların, tamponların ve çözeltilerin pH’ını ölçmek ve ayarlamak için kullanılır. 1.8 Saf su cihazı: En basit şekliyle, suyu buharlaştırarak gaz fazına geçiren ve daha sonra yoğunlaştırarak arıtan alettir. Çok geliştirilmiş tipleri vardır. 1.9 Elektrikli karıştırıcı (vorteks): Üzerindeki küçük oyuğa yerleştirilen deney tüpünü motor gücüyle döndürerek karıştıran alettir. 1.10 Elektrik ocağı: Isıtmalarda ilk seçenektir. 2. CAM EŞYA Sıvıların hacim ölçümünde kullanılan volümetrik cam eşya ile sıvı ve katı maddelerin tartım, titrasyon, ısıtma gibi işlemlerinde kullanılan, üzerinde alabileceği maksimum hacim yazılı olan kalitatif cam eşya olarak gruplandırılır. 2.1 Kalitatif Cam Eşya: 2.1.1 Beher: Geniş ağızlı, kenarı sıvı aktarmaya uygun, silindir biçiminde cam kaplardır. Kimya laboratuvarlarında kullanılan bardağa benzer cam eşyadır. Çözelti hazırlama, maddelerin karıştırılması, aktarılması, ısıtma ve kristallendirme gibi birçok işlemde kullanılan silindirik biçimƖi cam malzemelerdir. Yüksek sıcaklığa dayanıklı temper camdan üretilmiştir. Ağız kısmında sıvının kolayca akması için oluklu bir kısım vardır. Temper cam, işlemsiz cama göre yaklaşık 5 kat daha dayanıklı olup kırıldığında zar büyüklüğünde parçalara ayrılır. Bu özelliğinden dolayı yaralanma riskini azaltır, güvenlik camı olarak da kullanılır. Beher Erlenmeyer Piset 2.1.2 Erlenmeyer: Kalitatif işlemlere uygun, özellikle titrasyonda kullanılan, dar boyunlu, tabanı düz, koni biçiminde cam kaplardır. Alman kimyacı Carl Emil Erlenmeyer tarafından 1861’de oluşturulmuş ve onun adını almıştır. Özellikle analitik kimya laboratuvarlarında titrasyon işlemƖerinde kullanılır. Çözelti hazırlamaktan çözelti saklamaya kadar, kristalizasyon işleminden ve benzer laboratuvar işlemƖerine kadar daha birçok amaçla kullanılmaktadır. 2.1.3 Piset: Camdan veya plastikten yapılmış, saf su koymaya ve aktarmaya yarayan kaplardır 2.1.4 Altı düz balon: Çözelti hazırlamakta kullanılır. Bu balonlar açık aleve tutulduğu takdirde amyant üzerine yerleştirilmelidir. Direkt ısıtmak için yuvarlak balonlar daha uygundur. Düz balon Deney tüpleri Santrifüj tüpleri 2.1.5 Deney tüpleri: Silindir biçimindedir. Alt kısmı yuvarlak olduğundan porttüp (tüp taşıyıcı) ile kullanılır. Çöktürme, renklendirme ve diğer laboratuvar işlemleri için gerekli temel eşyadır. İnce uzun, bir tarafı kapalı bir tarafı açık, içine kimyasalların konulduğu 100 °C sıcaklığa dayanabilen deney aracıdır. Maddelerin birbirleriyle etkileşimini gözlemek amacıyla kullanılan silindirik biçimƖi, küçük çaplı cam malzemelerdir. Çeşitli ebatlarda olanları vardır. En sık kullanılanları 15 x 1,5 cm ebadında olanlarıdır. Kalitatif analizlerde basit tanıma deneylerinde kullanılır. Tüpe konacak saf sıvılar ve çözeltiler tüpün 1/4'ünü geçmemelidir ve analizden sonra tüpler hemen yıkanmalıdır. Altı dar ve sivri olanları santrifüj tüpü olarak adlandırılır ve küçük tanecikli çökeleklerin çöktürülmesi için santrifüj cihazı içinde kullanılan cam tüplerdir. 2.1.6 Santrifüj tüpleri: Santrifüj aletinde kullanılır. Altları genellikle koni şeklindedir. Bazı santrifüjlerde altı yuvarlak tüpler kullanılır. Santrifüj tüplerinin biçimi, kullanıldığı santrifüj tipine özgüdür. 2.2 Volumetrik Cam Eşya: 2.2.1 Pipet: Bir sıvıdan belirli bir miktar çekmek ve başka bir kaba aktarmak için kullanılan cam borulardır. Çalışmanın niteliğine göre kullanılmak üzere çeşitli tipleri vardır. 2.2.1.1 Dereceli pipetler: Bu tip pipetlerin, maksimum hacimlerinin altındaki ölçümlerde kullanılması daha uygundur. Çünkü son damlayı uzaklaştırmak için üflemek gerekir. Örneğin 2 mL’lik bir dereceli pipetle 2 mL’den daha az hacimler ölçülür. Tam 2 mL ölçmek gerektiğinde büllü pipet tercih edilir. 2.2.1.2 Büllü pipetler: Dereceli pipete göre daha hassas kalibre edilmiş pipetlerdir. Sıvıyı aktarırken bül (karın) kısmı avuç içerisinde tutularak içindeki havanın genleşmesi ve uçtaki damlayı itmesi sağlanır. 2.2.1.3 Mikropipetler: 0.005 ten 0.25 mL’ye kadar olan hacimleri ölçmekte kullanılır. 2.2.1.4 Kapiller pipetler: Çok ince cam borucuklardır. Elektroforez ve kromatografi gibi ayırma yöntemlerinde örneği uygulamak amacıyla kullanılır. Büllü pipet Mikropipet 2.2.1.5 Otomatik pipetler: Sabit (tek hacimlik) ve ayarlanabilir tipleri vardır. 2.2.2 Büret: Sıfırdan başlayarak aşağıya doğru derecelendirilmiş, 1, 2, 5, 25, 50 mL’lik kapsamlarda, altta musluğu olan cam borulardır. Metal kıskaç ile ayaklı bir çubuğa tutturulur ve titrasyonda kullanılır. Rodajsız Balon Büret Mezür Ölçü balonu 2.2.3 Ölçü silindiri (mezür): Sıvıların ve idrar gibi biyolojik örneklerin hacim ölçümünde kullanılan, silindir şeklinde cam borulardır. Ölçümlerdeki kesinliği çok yüksek değildir. Kabataslak bir tanım yapmak gerekirse mezür için dereceli silindir demek yeterli olabilir. Saf sıvıların ve çözeltilerin hacmini ölçmek için kullanılan, üzerinde mƖ cinsinden bölmeler bulunan cam kap olarak da tanımƖayabiliriz. Genel olarak 50-1000 mƖ arası sıvıların hacimƖerini çok daha iyi ölçer. Biyokimya laboratuvarlarında besiyeri ve boyaların hazırlanışı sırasında kullanılır. Temel kimya ve analitik kimya laboratuvarı derslerinde ise saf su ya da tampon çözelti gibi sıvı maddelerin ölçülerek kullanılmasını sağlayan cam malzemedir. Ancak sıvıların yaklaşık hacimƖerinin ölçümƖerinde ve aktarılmalarında kullanılır, çok hassas ölçü kapları değildir. 2.2.4 Ölçü balonu (Balon joje): Yuvarlak karınlı ve uzun boyunlu, tek bir hacim ölçmeye uygun, boyunlarında bu hacmi sınırlayan çizgi bulunan kaplardır. Çözelti hazırlamakta kullanılır. Ölçüm kesinliği yüksektir. İçinde bazı kimyasal reaksiyonların gerçekleştirildiği, biyokimya laboratuvarlarında besi yeri hazırlamak için diğer laboratuvar derslerinde de bazı çözeltileri hazırlamada, ısıtma ve kaynatma işlemƖerinde ve geri soğutucuya takılarak çeşitli deney düzeneklerinin hazırlanmasında kullanılan cam malzemelerdir. iki veya üç ağızlı olanları da vardır. Özellikle karıştırma, ekleme ve gaz geçirme gibi işlemƖerin aynı anda yapılması gerektiği durumƖarda iki ya da üç ağızlı balonlara gerek duyulur. Altı yuvarlak veya düz olabilir. Düz altı olan balonlar toplama kabı olarak yuvarlak altı olan balonlar ise daha dayanıklı olmaları sebebi ile basınç ve sıcaklık değiĢmelerinin olduğu durumƖarda kullanılır. Bir de altı armut şeklinde olan balonlar vardır. Bu tip balonlar ise alçak basınçta çalışıldığında kullanılır. Ağız kısımƖarı rodajlı olan balonlar da mevcuttur. Resimde gördüğünüz balon, ağız kısmı tek ve rodajsız olan balon türlerindendir. 3. DİĞER GEREÇLER 3.1 Bunzen beki-ispirto ocağı: Isıtma işleminde kullanılır. 3.2 Porselen kroze: Çözeltileri kuruluğa kadar buharlaştırmak için kullanılan yüksek kenarlı kaptır. Porselen kroze Porselen kapsül Sacayak 3.3 Porselen kapsül: Katı maddelerin açık alevde kurutulmasında kullanılan yuvarlak ve yayvan kaptır. Bu işlem sırasında ısınan kapsüller bir tahta maşayla alınarak amyant levhalar üzerine konur. 3.4 Sacayak: Cam eşya veya porselen kapların ısıtma işlemi sırasında üzerine konulduğu metal ayaktır. 3.5 Spatül: Katı maddelerin aktarılmasında kullanılan metal veya plastik kaşıklardır. Spatül Havan 3.6 Havan: Katı maddelerin öğütülmesinde kullanılır. 3.7 Port-tüp: Üzerinde tüplerin çapına uygun delikler bulunan ve deney tüplerini taşımaya yarayan, metal, tahta veya plastikten yapılmış desteklerdir. 3.8 Baget: Çeşitli amaçlarla sıvıları karıştırmak ve sıvıların ısıtılması sırasında sıçramaları önlemek için kullanılan ucu yuvarlatılmış cam çubuktur. Kimyasal karışımƖarın hazırlanması sırasında maddeleri karıştırmak için kullanılan kalın cam çubuk olarak tanımƖanabilir. Süzme işlemi sırasında kullanılarak iri taneli çökeleklerin tutunmasını ve süzgeç kâğıdının tıkanmasını engeller. Kristalizasyonda, beherden huniye madde aktarılırken cam baget kullanılır. Katı maddelerin ezilip sıvıya karışması için kullanılan baget mutlaka cam olmalıdır çünkü metaller asidik sıvıyla reaksiyona girip paslanabilir. 3.9 Tahta maşa: Sıcak cam eşyaları tutmak veya açık alevde ısıtmak için kullanılır. 3.10 Kıl fırça: Deney tüplerinin temizliğinde kullanılır. 3.11 Desikatör: Az miktardaki ayıraçları veya katı maddeleri kurutmak ve nemden korumak için kullanılır. Desikatörün alt kısmında nem çekici maddeler (CaCl2 ve MgCl2) bulunur. 3.12 Huni: Çökeltiyi çözeltiden ayırma işleminde kullanılır. 3.13 Ayırma hunisi: Birbiriyle karışmayan (ayrı fazlar oluşturan) sıvıları ayırmak için kullanılan, armut şeklinde veya silindirik, ağzı kapaklı cam kaplardır. 3.14 Saat camı: Bazı deneylerde ve tartımda kullanılır. 3.15 Lastik puar: Pipetlerin kullanılmasına yardımcı olan küçük yuvarlak pompalardır. 3.16 Vakumlu tüp sistemi: Adaptör, iğne ve özel vakumlu tüpten oluşan bu sistemle damar yoluyla gereken miktarda ve özellikte kan alınır. Tüpler, örneğe uygulanacak yönteme göre gereken antikoagülanı içerir ve kullanım kolaylığı için değişik kapak renkleriyle tanımlanır. 4. CİHAZLAR 4.1 Spektrofotometre Fotometri, çözeltilerin emdiği ışığın şiddetini ölçerek çözeltinin içindeki madde konsantrasyonunu saptama yöntemidir. Günümüzde bu amaçla spektrofotometre kullanıldığından bu yolla yapılan tayinlere spektrofotometrik yöntemler adı verilir. Prensibi: Bir elektromanyetik radyasyon türü olan ışık, dalga veya foton denilen tanecikler halinde boşlukta yol alır. Işığın dalgalar halinde hareket ederken oluşturduğu iki tepe noktası (pik) arasındaki uzaklık ışığın dalga boyunu verir. Dalga boyu nanometre (=10-9m) ile ifade edilir ve lambda () ile gösterilir. Güneş ışığı veya tungsten lambadan çıkan beyaz ışık, farklı dalga boylarındaki radyasyondan oluşan bir karışımdır. Beyaz ışığı oluşturan farklı dalga boylarındaki tek ışıklar kümesine spektrum denir. İnsan gözü spektrumun 380-750 nm arasındaki dalga boylarına ait radyasyonu görebilir (görünür ışık). Daha kısa dalga boyuna sahip olanlar ultraviyole (UV), daha uzun olanlar infrared (IR) olarak adlandırılır. UV Görünür ışık 380 IR 750 Dalga boyu (nm) 4.1.1 Işık spektrumu Beyaz ışık renkli bir çözeltiden geçirilirse, ışığın bazı dalga boyları çözelti tarafından seçilerek emilir. Emilmeden geçen ışıkların bileşkesi çözeltinin görünen rengini oluşturur. Spektrofotometrede renksiz ve saydam görünen örneklerde ise UV absorbansı ölçülerek konsantrasyon tayini yapılabilir. Örneğin proteinler, yapılarında bulunan aromatik amino asitlerden dolayı 260-280 nm.de UV ışığı absorbe eder. Spektrofotometrede 330 nm.den düşük dalga boylarında ölçüm yapılırken kuartz küvetler kullanılır. Renkli çözeltilerde görünür ışık alanında absorbans ölçümü yapılır. Renkli bir çözeltiye ışık girdiğinde belirli bir dalga boyundaki bölümü emilir. Emilen dalga boyu, çözeltinin tam karşıt rengindeki ışığa aittir. Örneğin sarı renkli çözelti, sarı ışığı geçirir, bunun karşıtı olan mor ışığı maksimum oranda absorbe eder. Bu nedenle spektrofotometrede absorbans ölçülecek ise, sarı çözeltiden geçen ışığın rengi mor olacak şekilde, 380-440 nm. dalga boyundaki ışık kullanılır. Absorbans ölçümü için karşıt renkler Newton Çarkında görülmektedir. Turuncu Kırmızı Sarı Mor Yeşil Mavi Newton Çarkı Aşağıdaki tabloda spektrofotometrede belirli bir dalga boyu aralığında görünen ışığın rengi verilmektedir. Örneğin spektrofotometre, 450 nm. dalga boyuna ayarlandığında deney tübüne gelen ışık mavi renkte olur. Işığın dalga boyu (nm) Spektrum aralığı <380 380-440 440-500 500-580 580-600 600-620 620-750 > 750 Işığın rengi - UV Görünür " " " " " IR mor mavi yeşil sarı turuncu kırmızı - Spektrofotometrelerde görünür ışık kaynağı olarak tungsten lamba, UV kaynağı olarak hidrojen veya döteryum lambası kullanılır. Basit bir spektrofotometre düzeneği aşağıda görülmektedir. Monokromatör, tek renkli (monokromatik) ışık seçimini sağlayan bir tür ışık ayırım filtresidir. Çıkış aralığı, dar bir ışık huzmesi eldesini sağlar. Absorbansı ölçülecek sıvıların konulduğu küvetler, kuvartz, plastik veya camdan yapılmış, çapı 1 cm olan silindir tüp veya bir kenarı 1 cm olan dikdörtgen prizma biçiminde haznelerdir. Küvetten çıkan ışık dedektörde elektrik enerjisine çevrilir. Transmitans veya absorbans, göstergeden okunur. Spektrofotometrelerde, çözeltilerin emdiği ışık şiddeti ölçülür. Renkli bir çözeltiden monokromatik bir ışık geçirildiğinde giren, çıkan ve emilen ışık şiddetleri çözeltinin konsantrasyonu ile ilişkilidir. Spektrofotometrede ışığın renkli çözelti tarafından emilen kısmı absorbans, çözeltiden emilmeden geçen kısmı ise transmitans ölçümleriyle saptanır. Eğer çözeltinin absorptivitesi yüksekse daha az ışık geçirilir, yani transmitans (geçirgenlik) azalır. Emilen ışık miktarı (absorbans), monokromatik ışığın çözelti içerisinde kat ettiği yolla ve maddenin konsantrasyonuyla doğru orantılıdır. Lambert-Beer Yasasının basitçe ifadesi olan bu kural bütün spektrofotometrik yöntemlerde geçerlidir. Spektrofotometre şeması Giren ışığın şiddeti I0 ile gösterilir. Çözeltiden çıkan ışığın şiddeti, giriş şiddetine eşit değildir ve Is şeklinde gösterilir. Çözeltide renk oluşturan madde, konsantrasyonu ölçülecek maddedir. Bunun yanında bir de referans (kör=blank) çözelti kullanılır. Kör çözelti içerisinde ölçülecek madde dışında kalan tüm ayıraçlar bulunur. Bu tübe giren ışık şiddeti I0, çıkan ışık şiddeti Ir’dir. Diğer bir deyişle kör tübünün ışığı absorbansı, distile suyun ışığı absorbansından daha fazla, deney tübünün absorbansından daha azdır. Spektrofotometrik tayinlerde absorbansı ölçülecek maddenin bulunduğu ortama katılan ayıraçlar, ortama katıldıkları miktarda küvete konulup absorbans sıfır ayarı yapılır. Böylece ayıraçların absorbansa katkıları yok edilmiş (sıfırlanmış) olur. Sıfır ayarı için distile su kullanılırsa renkli çözeltinin geçirgenliği (transmitans=T) distile suya karşı: T = Is / I0 (Deneyden çıkan ışık/Giren ışık) olur. Sıfır ayarı için kör kullanıldığında deneyin transmitansı (T): Deneyden çıkan ışık / Körden çıkan ışık (Is / Ir) olur. Transmitans değerinin 100 ile çarpımı %T i verir. %T tek renk (monokromatik) ışığın renkli çözeltiden geçiş oranını belirtir. Renkli çözeltinin emdiği ışık miktarı ise absorbans terimi ile ifade edilir. Absorbans (A) ile transmitans arasında şu bağıntı vardır: A= -log T A= -log Is/Ir Fotometrinin prensiplerini düzenleyen iki temel kanun vardır. Lambert Kanunu: Monokromatik bir ışık, renkli bir çözeltiden geçerken ışık şddeti katedilen yolun (b) üstel fonksiyonu olarak azalır. Renkli çözeltinin konsantrasyonu sabit tutulup küvetin çapı iki katına çıkarılırsa, ışığı absorbe eden çözeltideki molekül sayısı da iki katına çıkar. Bu nedenle absorbans, katedilen ışık yoluyla doğru orantılıdır. Beer Kanunu: Çözeltinin absorbe ettiği ışık miktarı (absorbans), çözeltinin konsantrasyonunun bir fonksiyonudur. Çözeltinin konsantrasyonu arttıkça ışığın şiddeti üstel olarak azalır. Renkli madde ne kadar çok ışık emerse o ölçüde az ışık geçirir 4.2 Atomik Absorpsiyon Spektrofotometre Cihazı Atomik Absorbsiyon Spektroskopisi (AAS), gaz halindeki ve temel enerji düzeyinde bulunan atomların, UV ve görünür bölgedeki ışığı absorblaması ilkesine dayanır. Işıma şiddetindeki azalma ortamda absorbsiyon yapan elementin derişimi ile doğru orantılıdır. Atomik absorpsiyon spektroskopisinde metallerin çoğu ile az sayıda ametal analiz edilir. Atomik absorpsiyon spektroskopisinde element, elementel hale dönüştürüldükten sonra buharlaştırılır ve kaynaktan gelen ışın demetine maruz bırakılır. Aynı elementin ışın kaynağından gelen ışınları absorplar. Sulu numune bir alev içine yükseltgen gaz karışımı ile püskürtülür. AAS’ nin temel çalışma prensibi gaz halindeki atomların ışığı absorplaması ilkesine dayandığı için hazırlanan çözeltinin gaz halindeki atomlarına dönüştürecek bir atomlaştırıcıya ihtiyaç duyulmaktadır. Birimimizdeki AAS grafit yakma sistemine sahiptir. Elektrotermal atomlaştırıcı olarak grafit fırın adı verilen 2-3 cm uzunluğunda 1 cm iç çapındaki tüp kullanılır. Bu tüpün her iki yanına bağlanmış direnç telleri ile ısıtma yapılır. Fırın elektriksel dirençle 3000 oC’ ye kadar istenirse kademeli olarak ısıtılabilmektedir. Alevli sistemlere göre daha pahalı fakat daha avantajlıdır. Özellikle ağır metal elementlerinin analizinde ppb düzeyine kadar inebildikleri için daha fazla tercih edilmektedir. Atomik absorbsiyon spektrofotometresi, elementel analizlerde kullanılan önemli bir araçtır. Örnekteki aranan elementler, o elemente has dalga boyundaki ışığı soğurması yardımıyla bulunmaktadır. Katot lambada, aranan elementin dalga boyu genelde elementin kendisinin uyarılması ile elde edildiği için, örnekteki miktarlar için keskin sonuçlar verebilmektedir. Genellikle metaller için kullanılır. AAS kimyasal işlem labaratuvar analizlerinde kullanıldığı gibi, günlük hayatta su kirliliği, toprak kirliliği ve hava kirliliği oluşturan elementlerin limit miktarları doğrultusunda uyumluluk analizleri için de kullanılmaktadır. 4.3 Otoanalizör Otoanalizörler, klinik biokimya laboratuarlarında her türlü analiz işlemlerini tam otomatik olarak bilgisayar kontrolü altında gerçekleştiren cihazlardır. Örnek alma, seyreltme, filtreleme, karıştırma, ısıtma ve renk belirlenmesi gibi elle yapılan analizlerin vakit alan prosedürlerini otomatikleştirir. Bütün işlemler mikroişlemcinin kontrolü altında gerçekleştirilir. Otoanalizör, bu prosedürleri, otomatik olarak, doğru ve hızlı bir şekilde yapar. Analiz hızı saatte 240 test olabilmektedir. Çoğu örneklerde, belli bir renk gelişimi ve kimyasal bir reaksiyon meydana getirmek için örnekler, belirteçler, standartlar ile önceden belirlenmiş bir program ile kontrol altında karşılaştırılır. Sıvının optik yoğunluğunun sıvı konsantrasyonuna bağlı olarak ifade edilmesi bir kolorimetre içinde fotoelektrik olarak gerçekleştirilebilir. Kolorimetrenin çıkış değerleri hareketli bir grafik kağıdı üzerinde belirlenecektir. Daha sonra, kaydedilen örneklerin değerleri grafik üzerindeki bilgiler yardımıyla bilinen standartlar ile karşılaştırılır. Basit bir otoanalizör, plastik tüpler, cam halkalar ve bağlantı elemanları ile birbirine bağlanmış modül olarak adlandırılan altı üniteden meydana gelir. Modüllerin sayı ve tipleri, sadece analitik sınırlamalar ile belirlenir. Diğer birtakım modüllere ihtiyaç duyulduğunda kolayca otoanalizör sistemine eklenebilir. Otoanalizör ile glikoz, üre, ürik asit, kolestrol, trigliserit, albümin, total protein, billirubin, kreatin, kalsiyum, fosfor, ast(sgot), alt(sagt), alkalen fosfatoz, CPK, CDH, CGT, amilaz, IgG, IgA, IgM, transferrin C3C4, klorutr, demir testleri yapılabilir. Otoanalizör bakımı, diğer çoğu analitik cihazda olduğu gibi, temizlik ve kalibrasyon ağırlıklıdır. Sistemde su veya deterjanla yıkama yoktur. Reaktifler arası ve numuneler arası kontaminasyonu önlemek için reaktif ve numune problarının iç ve dış yüzeyleri sürekli olarak invert ve hidrofob bir sıvı ile kaplanmıştır. Bu cihazlarda elektronik devre arızası pek görülmez. Çoğunlukla mekanik düzenlerin ayarlarının bozulması, örnek ve diğer sıvıların geçtiği ince kanalların tıkanması, cihaza yeterli bakım yapılmaması nedeniyle oluşan sorunlar şeklindedir. Otoanalizör sisteminin her modülünün çalışma prensibi aşağıda özetlenmiştir: 1-Örnekleyici, otoanalizör sistemine belli bir sıralama ile örnekler, standartlar verir ve eriyikler hazırlar. 2-Pompa, manifold ile birlikte, örnekleri ve belirteçleri, belli oranlarda karıştırmak için kullanılır. Bu modül, söz konusu sıvıları, sistemin diğer modüllerine gerekli oranlarda verir. Manifold, pompanın üzerinde yer alır ve pompanın çalışması sırasında çeşitli sıvıları, belli oranlarda karıştırır ve sisteme doğru iletir. 3-Dializör, karışmış maddeleri örnek materyalinden seçici bir membran yardımıyla ayırır. 4-Isıtıcı, kimyasal reaksiyonu etkilemek için sıvıları devamlı olarak ısıtır. Renk gelişmesi, enzimsel olaylar, ısı ile yumuşatma hidroliz ve diğer prosedürler için kullanılabilir. 5-Kolorimetre, boru şeklindeki bir akış hücresine doğru akan sıvı akımının optik yoğunluğundaki değişmeleri belirler. Kolorimetre, optik yoğunlukların değerlerini kaydedici için, eşdeğer gerilim işaretlerine çevirir. Bir stabilizör ünitesi, kolorimetre lambası için sabit bir gerilim üretir. 6-Kaydedici, kolorimetreden gelen elektriksel işareti, hareketli bir çizelge üzerinde grafiğe çevirir. 4.3 Kromotografi Kromatografi geçen yüzyılın başında Rus botanikçi Mikhail Tsweet tarafından bulunmuştur. Tsweet bitki pigmentlerini ayırmak için, çözeltileri kalsiyum karbonat içeren bir kolondan geçirerek kolorofil ve ksantofilleri ayırmıştır. Ayrılan pigmentler kolonda renkli bantlar şeklinde görüldüğü için, Yunanca renk anlamına gelen chroma ve yazmak anlamına gelen graphein sözcüklerini birleştirerek, bu tekniğe kromatografi adını vermiştir. 4 Kromatografi bir ayırma tekniğidir. Örnek içerisindeki bileşenler bireysel olarak ayrılarak kantitatif olarak belirlenir. Kromatografide ayrılacak bileşenler iki faz (sabit faz ve hareketli faz) arasında dağılıma uğrar. Bu fazlardan birini geniş bir yüzey alanına yayılmış sabit bir yatak oluştururken, diğer faz hareketli olup, sabit fazın üzerinden akarak ilerler.Bu iki faz birbiriyle temas halinde olup, karışmazlar. Bir karışımdaki bileşenlerin her türlü fiziksel ve kimyasal özellikleri ne kadar farklı olursa, söz konusu karışım o kadar iyi ayrılabilir. Sistemde en az alıkonan bileşen önce taşınır, daha kuvvetle tutulan bileşen ise daha geç çıkar. Sabit faz katı veya sıvı olabilir. Hareketli faz da gaz veya sıvı halde bulunabilir. Kromatografide temel olarak iki ayrım tekniği vardır: 1. Adsorbsiyon kromatografisi 2. Partisyon kromatografisi Sabit fazın katı olması durumunda adsorbsiyon kromatografisi; sabit fazın bir sıvı olması durumunda ise partisyon kromatografisi söz konusudur. 4.4.1 Adsorpsiyon kromatografisi: Adsorpsiyon kromatografisi, çözeltide bulunan maddelerin katı tanecikler üzerinde seçimli adsorbsiyonuna dayanır. Katı sabit faz yüzeyinde absorbe edilen bileşikler bir süre burada tutulur. Daha sonra bu maddeler tekrar hareketli faza (sıvı veya gaz) geçerler (desorbsiyon). 4.4.2 Partisyon kromatografisi: Burada sabit faz, katı bir destek madde üzerine kaplanmış bir sıvıdır; hareketli faz ise sıvı veya gaz olabilir. Partisyon kromatografisinde maddeler hareketli ve sabit fazlar arasında dağılmaya uğrar. Nerst yasasına göre; 1.Birbirinde tam çözünmeyen iki sıvı faz ile dengede bulunan çözünmüş bir madde, bu iki faz arasında sabit bir oranda dağılmaya uğrar. Dağılma oranı ideal durumlarda, çözücü sistemleri hariç, yalnız sıcaklık ve basınca bağlı olup, genellikle çözünmüş madde konsantrasyonuna bağlı değildir. 2.İki faz içinde çeşitli maddeler çözünmüş ise, bir tür madde, sanki diğer türler yokmuş gibi dağılmaya uğrar. 4.5 Elektroforez Cihaz, protein ve enzimlerin ayrılmasında görevlidir. Sistem hacmi, düzgün olarak numunelere jel dağılımını, ısı, zaman ve reaksiyon oluşumlarını ve de hızlı sonuç almayı kontrol eder. Her numune kabına numuneler konur, reaksiyon şişesi ve rep jeli yerleştirilir. Bütün bu işlemler 20 dk. İçinde gerçekleştirilir. 12 adet CK, LD, alkalin, fosfat izoenzimleri, serum proteinler, lipoprotein, HDL kollesterol, hemoglobin ve CK izoformlarının analizlerini gerçekleştirir. Elektroforezin çalışma ilkesi; Molekül ağırlığı ve molekülde bulunun elektrik enerjisinin jel içinde bir yükten diğerine giderken kattettiği mesafe farklılıklarını ele almaktadır. Elektroforezde kat edilen mesafe, net yük ile doğru; molekül büyüklüğü ve elektroforetik ortamın viskozitesi ile ters orantılıdır. Elektroforez için dört şeye ihtiyaç vardır: İyonların hareket edebilegi uygun bir ortam (destek ortamı) Uygun pH’da bir tampon çözelti Elektriksel alanı oluşturmak için doğru akım sağlayacak güç kaynağı Birbirinden ayrılan bantları kantitatif olarak değerlendirebilen dansitometre. Elektroforetik destek ortamı, elektrot bölmeleri arasına yerleştirilir. Destek ortam, tamponla doğrudan veya fitiller aracılığı ile ilişkilendirilir. Her iki tampon tankında elektrot yer alır ve bu elektrotlar güç kaynağına bağlanmak sureti ile devre tamamlanır. Dansitometri absorbans ölçümüdür ve destek ortamdaki boyanın absorbansını ölçer. Dansitometrenin temel bileşenlerini; ışık kaynağı, monokromatör, tüm plağın taranması için hareketli bir taşıyıcı, optik sistem ve fotodedektör oluşturur. Fotodedektörle saptanan sinyaller, numunenin konsantrasyonuyla orantılı olan, destek ortamdaki boyanın absorbansıyla ilişkilidir. Destek ortam sabit bir hızla ışık demetinden geçilir ve farklı noktalardan alınan çoklu dansite okumalarının sunduğu bir grafik oluşur. Elektroforez çeşitleri: Poliakrilamid jel elektroforez Agaroz jel elektroforez Değişken alanlı jel elektroforez İzoelektrik odaklama İki boyutlu elektroforez Kılcal (kapiller)elektroforez İmmünfiksasyon elektroforez İmmüno elektroforez Elektroforez kullanım amacı Elektroforez, patolojik durumların tamınlanmasında ve takibinde sıklıkla kullanılır. Serumda, dokuda, hemoglobinde ve idrarda, patolojik durumlar sonucunda ortaya çıkan normal olmayan proteinlerin varlığını, normal proteinlerin yokluğunu veya tedavi sırasında hastalığın seyrini izlemek amacıyla kullanılır. Son yıllarda proteomiks teknolojisinin, en önemli yöntemlerinden biri haline gelmiştir. Bu yöntem ile protein miktarlarındaki çok küçük değişikliklerin dahi analizi yapılabilmektedir. Böylece, patolojik durumlarda ortaya çıkan yeni proteinler kolaylıkla tanımlanabilmektedir. Otomatize edilmiş olması nedeniyle, başta kimya, farmakoloji, biyokimya, toksikoloji, adli tıp bilimlerini kapsayan çeşitli bilimsel alanlarda pratik ve uygun bir biçimde kullanılmaktadır. Elektroforez kullanım alanları: Saflaştırma Saflık kontrolü Molekül ağırlığı saptama Kalıtsal ve kalıtsal olmayan hastalık saptama Enzim izoenzimlerinin saptanması (tanısal amaçlı, populasyon çalışması için, adli tipta) İmmünolojik ve moleküler biyoloji Elektroforez Aygıtlarında İki Temel Eşitlik Önem Taşır 1-Ohm yasasına göre elektrik alanı, akım ile direncin çarpımına eşittir. Elektroforez aygıtında oluşan direncin hemen hemen tamamı jel tarafından oluşturulur. Direnç, akımın geçtiği bölgenin alanının ve kullanılan tamponun iyonik kuvveti ile ters orantılıdır. Belli bir akım için, jelin kalınlığının veya tamponun miktarının ve iyonik kuvvetinin azalması direnci arttırır; böylece jel boyunca oluşan voltaj derecelenmesi ve jele uygulanmış molekülün elektroforetik göç hızı artar. 2-Sistemin ürettiği güç direnç ile akımın karesinin çarpımına eşittir. Üretilen güç ısı şeklinde ortaya çıkar ve elektoforez aygıtı, jelin sıcaklığını artırmaksızın ancak belli miktarda gücü dağıtabilir. Bu nedenle voltajın üst sınırı genellikle elektroforez aygıtının ısıyı dağıtma yeteneğine bağlıdır. Elektroforez tamamlandıktan sonra, destek ortam boya ile Muamele edilerek ayrılmı fraksiyonlarıni dentifikasyonu Dansitometri sağlanır. absorbans Boyanmı ölçümüdür ve destek destek ortam ortamdaki dansitometride boyanın absorbansını okunur. ölçer. Dansitometrenin temel bileşenlerini; ışık kaynağı, mono kromatör, tüm plağın taranması için hareketli bir taşıyıcı, optik sistem ve fotodetektör oluşturur. Fotodetektörle saptanan sinyaller, numunenin konsantrasyonuyla orantılı olan, destek ortamdaki boyanın absorbansıyla ilişkilidir. Destek ortam sabit bir hızla ışık demetinden geçirilir ve farklı noktalardan alınan çoklu dansite okumalarının sunduğu bir grafik oluşur. Elektroforez cihazında örnek yüklemesi tamamlandıktan sonra aplikatör uçları otomatik olara yıkama yapar. Aplikatörler, manyetik sistemler tarafından otomatik olarak kontrol edilir. Uygulama zamanı, sayısı ve türü istenilen şekilde programlanabilir. Farklı deney fazlası arasında, mekanik kollar otomatik olarak ve manyetik sistemle kontrol edilir.İşem sonucunda jel dansitometre bölümüne gönderilir, okuması sağlandıktan sonra grafik bilgisayar ekranında görüntülenir. Tam otomatik elektroforez cihazları ile; Serum protein elektroforezi İdrar protein elektroforezi B1-b2 protein elektroforezi İmmunofiksasyon elektroforezi Pentavalent immünofiksasyon Bence-jones immünofiksasyon Yüksek çözünürlük protein elektroforezi Testleri yapılabilmektedir. Hemoglobin elektroforezi Lipoprotein elektroforezi LDH izoenzim elektroforezi Alkali fosfat izoenzin elektroforezi CK izoenzim elektroforezi Her test için kullanılan kitler birbirlerinden farklıdır. KAYNAKLAR Anonim 2011. Laboratuvar Araç Gereçleri. http://www.fenhane.com/deneyaracgerecleri.pdf.Kimya Teknolojisi, 53. Anonim 2014. Tıbbi biyokimya anabilim dalı laboratuvar uygulamaları (tıp fakültesi 1. sınıf öğrencileri için) http://istanbultip.istanbul.edu.tr/ogrenci/wp-content/uploads.pdf. İstanbul Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı, 55. Demirtaş, S., Can, M. Ve Güven B. 2014. Tıbbi Laboratuvar El Kitabı. Nobel Tıp Kitapevi, 16.
