elektroforez

20.05.2008
GÜVENLİ VE ETKİN
LABORATUVAR UYGULAMALARI
111-546
ELEKTROFOREZ
Doç. Dr. Hilâl Özdağ
Elektroforez
• Yüklü moleküllerin bir elektrik alanı içinde yürütülerek ayrıştırılması
tekniğine elektroforez denir.
• DNA, RNA ve Protein molekülleri ile yapılan çalışmaların öncelikle
basamakları arasında yer alır.
1
20.05.2008
Temel Kurallar
• Jel tankında işlem yapmadan önce güç kaynağını kapattığınızdan emin
olun.
• Yükleme ve yürütme yapmadan önce jelinizin iyice polimerleştiğinden
emin olun.
• Neyi hangi sırayla yüklediğinizi hemen kaydedin: Bunun için
yüklediğiniz örneklerin tüplerini tüplüğün üzerinde yükleme sırasıyla
deney bitip siz bunların sırasını kaydedinceye dek muhafaza edin.
• EtBr veya toz akrilamid kalıntılarına karşı muhakkak eldiven giyin.
Temel Kurallar
•
Jelinizi erittikten sonra EtBr ekleyin. EtBr eklenmiş jel solüsyonunu eritip kaynatmayın.
•
Kullanılmış jelinizi jel tankının içinde bırakmayın.
•
Kullanılmış jelleri jel atık çöpüne atın.
•
Jel tankının içindeki tampon çözelti defalarca kullanılabilir. Ancak bu tamponun
kullanım sıklığına bağlı olarak birkaç günde bir boşaltılıp karıştırılması ve buharlaşan
kısmı kadarının taze tamponla doldurulması gerekir.
•
Jel tankının en az haftada bir boşaltılıp yıkanması ve distile sudan geçirilmesi tankın
platin tellerinin uzun ömürlü olması açısından gereklidir. Zira yıkanmadığı takdirde
zaman içinde tamponun için tuz platin teller üzerinde birikecektir.
2
20.05.2008
Temel Kurallar
• Jelinizi yürütmeye başlamadan
bağlandığından emin olun.
önce
kutupların
doğru
• En doğrusu jeli yürütmeye başladıktan sonra 0.5-1 dak bekleyip
yürümenin doğru yönde olduğundan, akımın geçtiğinden emin
olmaktır.
Örnek hazırlama
•
Örnekler yükleme solüsyonu ile jele yüklenirler.
•
Yükleme solüsyonunun içinde örneğin kuyulara oturmasını sağlayan ağır bir
molekül (sukroz, ficoll, gliserol) ile yürümeyi takip etmeyi mümkün kılan
indikatör bir boya (BFB, XC) bulunur.
•
Yükleme solüsyonu uzun dönem için -20oC’de bölünerek saklanmalıdır.
•
Kullanımdaki yükleme solüsyonu oda ısısında kararlılığını uzun süre muhafaza
edecektir.
3
20.05.2008
Standartlar/Belirteçler
•
Moleküler ağırlık belirteçleri muhakkak jele dahil edilmelidir.
•
Bunların jele yüklenmesi hem jelin ve elektroforezin kalitesini standardize
edecek hem de örneklerin yorumlanmasını mümkün kılacaktır.
•
Yüklenecek belirteç analiz edilecek örneklere uygun olarak seçilmelidir.
•
Moleküler ağırlık belirtecinin yürüme profili belirtecin kullanım kılavuzundan
alınarak lab defterine, jel dokümantasyon sisteminin yanına konmalı,
gerektiğinde kolayca kontrol edilebilmelidir.
•
Gerektiğinde ve mümkün olduğunda jele pozitif ve negatif kontroller
yüklenmelidir.
Elektroforez Tipleri
•
Agaroz jeller genellikle yatay iken akrilamid jeller dikey olarak yürütülür.
•
Jeller farklı ebatta olabilir. Dizileme jelleri büyük olmak zorundadır ancak
tarama ve transfer için kullanılan jeller mini veya midi boyutta tercih edilir.
•
Kapiller elektroforezde ince kapillerler için DNA, RNA, proteinleri otomatik
olarak yüksek verimde ayrıştırılırlar. Ayrışma kromatografide olduğu gibi
tespit ve analizle beraber gerçekleşir.
4
20.05.2008
Jel Tipleri
•
Agaroz ve akrilamid her ikisi de porlu yapıdadır. Yüzdeleri ne kadar yüksekse
por çapı o kadar küçülür. Gerekli ayarlamalar yapıldığında her ikisinde de
DNA, RNA ve Protein incelenebilir.
•
Düşük konsantrasyondaki akrilamid jelleri manipüle etmek zordur. Düşük
konsantrasyondaki agaroz jellerin manipülasyonu daha kolaydır.
•
Jel konsantrasyonunun ilgilenilen fragmentin boyutuna uygun olması gerekir.
•
Önceden dökülmüş hazır akrilamid jeller birçok firma tarafından
üretilmektedir. Bu jeller buzdolabında aylarca bozulmadan kalabilir.
Yürütme Tamponları
•
Yürütme tamponları konsantre olarak (5X veya 10X) hazırlanır. 0.5X veya 1X
konsantrasyonda kullanılır.
•
Her tamponun belirli bir amperde belirli bir voltajı vardır. Kullandığınız
tamponun özelliklerini farkedin, öğrenin ki problem oluştuğunda teşhis edin.
5
20.05.2008
Güç Kaynağı
•
Güç kaynağının çıkışı sabit voltaj (mV), sabit akım (amps) veya sabit güç (W)
şeklinde olabilir. Birçok güç kaynağı modelinde bu modlar arasında otomatik
değişimler mümkündür.
•
Her güç kaynağı sizin için uygun olmayabilir. Deneyiniz için gerekli olan amper
veya voltu öğrenin ve buna uygun güç kaynağını seçin.
•
Dizileme jelleri yüksek wattlı, elektroforetik transferler yüksek akımlı ve
agaroz veya akrilamid jel elektroforezleri geniş voltaj aralıklı güç kaynaklarına
ihtiyaç duyar.
•
DNA, RNA ve protein jellerinde örnekler eksiden artıya yürürler. Eksi (katod)
siyaha, artı (anod) kırmızıya bağlanmalıdır.
Güç Kaynağı
•
Güç kaynağının zaman ayarı varsa mutlaka kullanın yoksa jelinizi yürütmeye
başladıktan sonra kronometrenizi ayarlayın. Özellikle küçük fragmentleri
unutup fazla yürütüp jelden kaybetmeniz mümkündür.
•
Güç kaynağını kapatmadan jel tankına müdahale etmeyin!
6
20.05.2008
Fiksasyon
•
Boyanacak jellerin boyamadan önce fikse edilmesi gerekmekdir.
•
Fiksasyon jellerin şişmesini engellediği gibi örneklerin denatürasyonunda da
etkindir.
Kurutma
•
Jeller jel kurutucuda ısı ve vakum altında kurutulur.
•
Otoradyografide daha keskin bant verir.
•
Jellerin uzun yıllar saklanmasına imkan verir (Gümüş Boyama)
7
20.05.2008
Kurutma
•
Jeller jel kurutucuda ısı ve vakum altında kurutulur.
•
Otoradyografide daha keskin bant verir.
•
Jellerin uzun yıllar saklanmasına imkan verir (Gümüş Boyama)
Boyama
•
Agaroz jel içine EtBr eklenerek DNA ve RNA jellerinin boyanması sağlanır.
•
DNA yürütülen poliakrilamid jelleri yürütme sonrasında jelin ebadına göre
EtBR veya gümüş nitrat ile boyanır.
•
Protein jelleri de elektroforez sonrası gümüş nitrat veya coomasie mavisi ile
boyanır.
8
20.05.2008
Belgeleme
•
Poloroid fotoğraf
•
Dijital dokümantasyon: Lazer yazıcı veya termal yazıcı. Termal yazıcı çıktısının
rezolüsyonu çok daha yüksektir.
•
Otoradyografi veya kemilüminesens sonuçları X-Ray film üzerine alınabilir.
Belgeleme
•
Poloroid fotoğraf
•
Dijital dokümantasyon: Lazer yazıcı veya termal yazıcı. Termal yazıcı çıktısının
rezolüsyonu çok daha yüksektir.
•
Otoradyografi veya kemilüminesens sonuçları X-Ray film üzerine alınabilir.
9
20.05.2008
DNA Jelleri
http://a32.lehman.cuny.edu/molbio_course/gelel.GIF
DNA Jelleri
•
6X yükleme solüsyonu: %30 (V/V) gliserol, %0.25 (W/V) BFB, %0.25 XC distile
su içinde hazırlanır.
10
20.05.2008
DNA Jelleri
DNA Jelleri
11
20.05.2008
DNA JELLERİ
Agaroz Jel Elektroforezi
Denatüre edici olmayan (Native)
Denatüre edici (Formaldehitli)
Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)
Denatüre edici olmayan (Native)
Denatüre edici (Üreli)
Kapiller Elektroforez (CE)
Denatüre edici olmayan (Native)
Denatüre edici
ELEKTROFOREZ
Elektroforezde nükleik asitler boy ve konformasyonlarına göre yürür.
Denatüre edici olmayan (native) ortamda DNA ve RNA daha ziyade
konformasyonlarına bağlı olarak yürür.
Denatüre edici ortamda ise bu moleküller ikincil yapı oluşturamayacakları
için moleküler ağırlıklarına göre yürürler.
12
20.05.2008
ELEKTROFOREZ
Agaroz Jel Elektroforezi
Denatüre edici olmayan (Native)
Büyük moleküler ağırlıklı DNA yürütülecekse (genomik DNA gibi) %0.81 arası jel hazırlanmalıdır.
PCR örneklerinin kontrolünde (100 bç- birkaç kb arası) %2’lik jele
ihtiyaç vardır.
RFLP benzeri uygulamalarda birbirinden 10-20 bç farklı fragmentleri
ayırmak için NuSieve benzeri agaroz türevleri ile rezolüsyon arttırılabilir.
Metaphor agaroz ile 3-4 bç farkı ayırmak mümkündür.
ELEKTROFOREZ
Agaroz Jel Elektroforezi
Agaroz jeller TBE (Tris Borik asit EDTA) veya TAE (Tris Asetik asit EDTA)
ile hazırlanır.
DNA düşük voltajda uzun yürütmek gerektiğinde (RE ile kesilmiş
genomik DNA’yı Southern öncesi yürütmek gibi) TAE tamponu uygundur.
Kısa süreli yüksek voltajda yürütmek için TBE seçilmelidir.
13
20.05.2008
ELEKTROFOREZ
Agaroz Jel Elektroforezi
TBE 5X veya 10X konsantrasyonda hazırlanıp 1X konsantrasyonda
kullanılır. Uzun süre beklediğinde çökelti oluşturur.
TAE 50X konsantrasyonda hazırlanabilir.
TAE’nin hazırlama maliyeti TBE’ye göre daha düşüktür.
ELEKTROFOREZ
Agaroz Jel Elektroforezi
Denatüre edici (Formaldehitli) RNA analizlerinde kullanılır. Özellikle
Northern blot analizi yapılacaksa jeli bu şekilde hazırlamak şarttır. Ancak
yalnızca RNA’nın varlığına/yokluğuna ve bütünlüğüne bakılacaksa rutin agaroz
hazırlanabilir. Her durumda RNA analizlerinde jelin RNaz’sız ortama uygun
şekilde hazırlanması gerekmektedir.
14
20.05.2008
ELEKTROFOREZ
Poliakrilamid Jel Elektroforezi
Akrilamid ve bisakrilamid molekülleri arasında Amonyum Persülfat (APS)
aracılığıyla TEMED’in katalizörlüğünde çapraz bağların oluşması ile
polimerleşen bir jeldir.
APS her defasında taze hazırlanmalıdır.
ELEKTROFOREZ
Poliakrilamid Jel Elektroforezi
Akrilamid ve bisakrilamid tampon çözeltide karıştırılarak çözüldükten sonra
filtreden geçirilerek süzülmelidir.
Akrilamid ve bisakrilamid polimerleşinceye dek nörotoksiktir.
Akrilamid ve bisakrilamid arasındaki oran çapraz bağlarla oluşan porların
çapını dolayısıyla jelin rezolüsyonununu belirler; 19:1/29:1/39:1 gibi
MDE (Mutation Detection Enhancement) Jel
15
20.05.2008
ELEKTROFOREZ
Kapiller Elektroforez
Donmayan akrilamid bazlı özel polimerler kullanılır. Bu polimerlerin nativ
veya denatüre edici özellikte olanları mevcuttur.
PROTEİN JELLERİ
SDS-PAGE
Örneklerin içine 2-mercaptoethanol veya dithiothreitol indirgeyici ajan olarak konulur.
Böylece disülfid bağları indirgenmiş olur ve proteinler “random coil” konfigürasyonlarını
koruyarak moleküler ağırlıklarına göre yürürler.
İndirgeyici ajanların stokları çeker ocak altında açılıp çalışılır.
Yükleme solüsyonu -20oC’de saklanmalıdır.
Örnekler yüklenmeden önce 95oC’de ısıtılır veya kaynatılır. Örnekler kaynatıldıktan sonra
buz üzerinde bekletilmelidir.
Kaynatılan tüplerin kapağı basınçla açılıp etrafa saçılabilir. Bunu önlemek için plastik
kapak kilitleri kullanılmalıdır.
16
20.05.2008
PROTEİN JELLERİ
Standartlar
Standartlar yüksek, düşük ve geniş aralıkta olabilir. Boyasız veya boyalı versiyonları
mevcuttur. Boyalı olanlar daha kullanışlıdır. Aksi belirtilmediği sürece -20oC’de
saklanmalıdır.
Gökkuşağı standartları çok kullanışlı ancak pahalıdır.
Boyaları kovalent bağlı boyalar bantları göçlerinde varyasyon yaratabilir. Kesin moleküler
ağırlık belirlenmesinde kalibre standartlar kullanılmalıdır.
MEMBRANA TRANSFER
Southern blot: Membran üzerindeki DNA DNA ile problanır.
Northern blot: Membran üzerindeki RNA DNA veya RNA ile problanır.
Western blot: Membran üzerindeki protein antikor ile problanır.
Southwestern blot: Membran üzerindeki DNA protein ile problanır.
Middle eastern blot: PoliU türevli membran mRNA ile problanır.
17
20.05.2008
MEMBRANA TRANSFER
Kapiller Transfer
MEMBRANA TRANSFER
Vakum Transfer
18
20.05.2008
MEMBRANA TRANSFER
Elektroforetik Transfer
MEMBRAN
Membranlar rulo veya değişik ebatta kesilmiş olarak satılır. Tek boy jel
kullanılmadığı sürece rulo olarak satın almakta fayda vardır.
Membranlara çıplak elle asla dokunulmaz.
Membranları almak için temiz bir forseps kullanmak gerekir.
Naylon membran nükleik asit için en uygun olanıdır. Dayanıklıdır. Soyulup
yeniden defalarca problanabilir. Yüksek konsantrasyonda bloklayıcı ajanla
muamele etmek gerekir geriplan boyanmayı engellemek için.
Nitroselüloz bazı proteinler için en iyi seçimdir. Nükleik asitler elektroforetik
olarak nitroselüloza transfer edilemezler.
19