1-MOLEKULER-BIYOFIZIK

Deney: M 1
POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PZR-PCR)
VE RESTRİKSİYON PARÇA UZUNLUĞU POLİMORFİZMİ (RFLP)
a) PCR yöntemi uygulaması
b) RPLF sonuçları değerlendirilmesi
I. Araç ve Gereç
 dNTP (deoksi Nükleotid Tri Fosfat; dATP, dCTP, dGTP, dTTP )
Dream Grien Taq Polimeraz Seti
 DNA primerleri
 Etil Alkol
 Restriksiyon Enzimi
 Otomatik Mikro Pipetler ve uçları
 Santrifüj
 ThermalCycler
 Vorteks
II. Genel Bilgi ve Amaç
II.1.PCR
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), in vitro olarak DNA çoğaltma metodudur. Reaksiyonlar
farklı sıcaklıklardaki üç olayın döngüler halinde tekrarına dayanmaktadır. PCR ile DNA
fragmentleri çoğaltılabilir ve çok küçük örneklerden analizler için yeterli miktarlar elde
edilebilir.
Gerekli olan materyaller:
1) kalıp DNA (genomik DNA);
2) iki tane tek iplikli sentetik DNA oligonükleotidi (primerler), PCR yapılmak istenen gen
dizisini belirler;
3)deoksiribonükleotid trifosfat (dNTPs);
4) DNA polimeraz (Taq DNA pol.).
PCR üç ana döngünün tekrarlarından meydana gelir:
denatürasyon 94ºC’de çift iplikçikli DNA’nın ayrılması;
annealing (eşleşme) 50-60ºC’de primerlerin kalıp DNA’ya bağlanmaları;
extension (sentez) 72ºC’de, sınırlandırılmış olan bölgenin çoğaltılması
II.2.RFLP
Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analizi restriksiyon endonükleazların çift
iplikli DNA’yı özel tanıma bölgelerinden kesmesi esasına dayanmaktadır. PCR ile çoğaltılan
DNA bölgesi restriksiyon enziminin kesimine tabi tutulur. Oluşan DNA parçaları jel
elektroforezi ile fragment büyüklüklerine göre ayrılırlar. DNA mutasyonları
fragment
sayısını değiştirir. Genomda kodlama yapan ve yapmayan bölgelerde restriksiyon enzim
tanıma bölgelerinin dağılımı farklıdır. RFLP analizleri genetik hastalıkların bağlantı ve ilişki
çalışmalarında kullanılmaktadır. Hastalıkla bağlantılı olduğu düşünülen gendeki RFLP’ler,
allel frekansları bulunarak; ilgili mutasyon ve hastalık ilişkisini gösterebilmektedir.
III. Yöntem ve Deneysel İşlem
Kullanılacak PCR primer dizileri.
İnsan örnekleri için PCR protokolü.
İnsan PCR döngü protokolü.
İnsan örnekleri restriksiyon enzim kesim protokolü.
IV. Bulgular
V. Tartışma ve Sorular
1-PCR yönteminde temel aşamaları anlatınız.
2-RFLP, tıp alanında uygulamalarını araştırınız.
3-Moleküler tıp hangi teknikleri kullanmaktadır?
4-Yöntemler hakkında “Pubmed” taraması yaptınız mı?
(Bir örnek çalışma sunumu hazırlayınız)
Kaynaklarınızı not ediniz:
(Hazırlık için kullandığınız WEB adresleri dahil)
Deney: M 2
AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ İLE DNA ANALİZİ
a) Agaroz jel hazırlama
b) DNA Elektroforezi sonuçlarının değerlendirilmesi
I. Araç ve Gereç


















Agaroz
Asetik Asit
Borik Asit
Etilendiamintetraasetikasit (EDTA)
Etil Alkol
Trisma Base
DNA cetveli
Agaroz Elektroforez Tankı
Buzdolabı
Dijital Fotoğraf makinesi
Güç Kaynağı
Karıştırıcı
Mikrodalga Fırın
Otomatik Mikro Pipetler ve uçları
Santrifüj
Terazi
Transilluminator
Vorteks
II. Genel Bilgi ve Amaç
II.1. JEL ELEKTROFOREZLERİ
Elektroforetik teknikler makromoleküllerin karekterizasyonu ve saflık derecelerinin
belirlenmesi amaçlı kullanılır. Temel prensibi DNA, RNA ve protein vb. moleküllerin
üzerinde taşıdıkları net yükü kullanarak, elektrik alan içerisinde hareketlendirmektir. Sonuç
olarak moleküller büyüklüklerine göre jelde sıralanırlar. Molekülün anoda mı (+ kutup) yoksa
katoda mı (- kutup) doğru hareket edeceği molekül üzerindeki net yüke bağlıdır. Elektroforez
tekniğinde tampon çözeltiler kullanılır.
II.2. AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ
Agaroz lineer bir polimer olup D-galaktoz ile L-galaktoz moleküllerinin glikosidik bağlarla
birleşmesi sonucu oluşmuştur. Kullanılan agaroz polimerleri yaklaşık 880 adet galaktozdan
oluşur. Agaroz saflık derecesi, erime sıcaklığını ve moleküllerini ayırma kapasitesini etkiler.
Aşağıdaki faktörler DNA nın koşma hızını belirler:
1. DNA nın moleküler büyüklüğü
2. Agaroz konsantrasyonu
3. DNA’nın konformasyonu
4. Etidium bromür olup olmayışı
5. Uygulanan Voltaj.
6. Elektroforez tamponu
II.3.Jel-Yükleme tamponları
DNA örneğinin yoğunluğu artırılarak jel üzerindeki kuyucuklara homojen olarak yerleşmesi
sağlanır. Yükleme tamponu içerisindeki brom fenol mavisi, örneklerinin koşma esnasında
hangi noktaya kadar geldiklerini de tespit etme imkanı verir.
III. Yöntem ve Deneysel İşlem
1. Jel tabağının kenarları uygun bir şekilde kapatılır.
2. Yeterli miktarda elektroforez çözeltisi hazırlanır. (1x TAE)
3. Gerekli miktarda agaroz tartılır. Tampon eklendikten sonra mikrodalga fırında veya
elektrikli ısıtıcı üzerinde eriyene kadar beklenir.
4. Sıvı hale dönüşmüş çözeltinin sıcaklığı elle dokunulabilecek noktaya geldiğinde jel
tabağına dökülür ve oda sıcaklığında yaklaşık 30 dk bırakılır. Kuyucukların oluşması
için tarağın jel polimerize olmadan yerleştirilmesi gerekir.
5. Jel oluştuktan sonra tarak dikkatli bir şekilde çıkarılır ve yürütme tankına yerleştirilir.
6. DNA örnekleri yükleme tamponu ile karıştırılır ve bir DNA örneği bir kuyucuğa
gelecek şekilde yüklenir. Sisteme akım verilerek koşu başlatılır.
IV. Bulgular
V. Tartışma ve Sorular
1-Elektroforez nedir?
2-Tıp alanında uygulamalarını araştırınız.
3-Yöntem hakkında “Pubmed” taraması yaptınız mı?
(Bir örnek çalışma sunumu hazırlayınız)
Kaynaklarınızı not ediniz:
(Hazırlık için kullandığınız WEB adresleri dahil)
Örnek:
www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/gelelectrophoresis.html