Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamit Gel Elektroforezi

KONU 8: MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN TEMEL TEKNİKLER
(Ar.Gör.Nagihan AKBULUT)
Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamit Gel Elektroforezi
Elektroforez, yüklü moleküllerin bir elektriksel alandaki hareketlerinin izlendiği tekniğe
verilen isimdir. Moleküllerin hareketi, moleküllerin yüküne, boyutuna, biçimine, kimyasal
içeriğe ve uygulanan elektriksel alana bağlıdır. Jel elektroforezi en çok kullanılan elektroforez
yöntemidir. Jel elektroforez yöntemleri
 Poliakrilamit jel elektroforezi (PAGE)
 Agaroz jel elektroforezi
olarak ikiye ayrılmaktadır.
SDS-PAGE (Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamit Gel Elektroforezi)
Yüklü moleküllerin elektriksel alanda ayrılmaları temeline dayanan elektroforez tekniği
proteinlerin analizinde ve ayrılmasında geniş çapta kullanılır.
Bir proteinin büyüklüğü ve altbirimlerinin niteliği SDS poliakrilamit elektroforezi ile
belirlenebilir. Proteinler içerdikleri amino asitlere bağlı olarak genellikle net bir artı veya eksi
yüke sahiptir. Protein molekülünü içeren bir çözeltiye elektrik alan uygulandığında protein net
yüküne, büyüklüğüne ve biçimine bağlı olarak belirli bir hızla hareket eder.
SDS poliakrilamit jel elektroforezi’nin (SDS-PAGE) geliştirilmesi rutin protein analizinde
çığır açmıştır. Bu yöntemde proteinlerin içinde hareket ettiği ortam olarak çok sayıda çapraz
bağı bulunan poliakrilamit jel kullanılır. Jel monomerlerin polimerleşmesi ile hazırlanır,
gözeneklerin boyutu istenilen proteinin ilerlemesini geciktirecek ölçüde küçük olarak
ayarlanır. Jel sentetik bir madde olan akrilamit ile akrilamit türevi olan N-N’-metilen bisakrilamidin polimerleşmesiyle oluşturulur ve örnekler bu jel üzerinde yürütülür. Polimerleşme
reaksiyonunda akrilamit molekülleri yan yana bağlanarak düz zincirler oluştururlar.
Bisakrilamit molekülleri ise iki akrilamit zinciri arasında çapraz bağlanmalar oluşturur.
Böylece ağımsı bir yapı meydana gelir. Polimerleşme derecesi sıcaklık, pH, amonyum
persülfat (APS) ve N,N,N’,N’-tetrametil-etilendiamin (TEMED) miktarına göre farklılık
gösterir. Polimerleşme için serbest radikal oluşumuna sebep olan APS reaksiyon başlatıcı,
TEMED ise katalizör olarak rol oynar.
Proteinler sulu çözelti içinde değil, güçlü eksi yük taşıyan bir deterjan, sodyum dodesilsülfat
ya da SDS içeren bir çözelti içinde bulunur. Deterjan proteinlerin hidrofobik alanlarına
bağlanarak protein yapısının açılmasına, bağlı proteinlerin birbirinden ya da lipit
moleküllerinden ayrılmasına ve deterjan çözeltisi içinde serbestçe yüzer durumda kalmasına
neden olur. Ayrıca, proteinlerdeki S-S bağlarını kırmak amacıyla betamerkaptoetanol gibi bir
indirgeyici ajan kullanıldığında çok alt birimli molekülleri oluşturan polipeptitlerin ayrı ayrı
analizi mümkün olur.
Şekil 1 : Proteinin doğal konformasyonu değişimi, proteinler eşit yük yoğunluğuna sahip olması ve
poliakrilamit jel içerisinde sadece molekül ağırlığına göre ayrılması.
SDS ile çözülmüş proteinlerden meydana gelen bir karışım poliakrilamit jelde yürütülünce ne
olur?
Her protein molekülü çok sayıda eksi yüklü deterjan molekülü bağlar. Bunlar deterjanın
gerçek yükünü örterek voltaj uygulandığında artı elektroda doğru ilerlemesine neden olur.
Aynı büyüklükteki proteinler jel içinde aynı hızla hareket ederler çünkü;
1) doğal yapıları SDS yüzünden bozulup açıldığından hepsi aynı şekildedir,
2) aynı oranda SDS bağladıklarından hepsi aynı eksi yüke sahiptir.
Yükü daha fazla olan büyük proteinler daha büyük elektriksel kuvvet etkisinde kaldıklarından
daha hızlı ilerlemeleri gerekir. Serbest çözeltide bu etki birbirini dengeler. Ama bir çeşit
moleküler elek olarak davranan poliakrilamit jel içinde büyük proteinler ilerlerken küçüklere
kıyasla daha fazla zorlanır. Sonuçta karmaşık bir protein karışımı moleküler ağırlıklarına göre
bir dizi belirli protein bantlarına ayrılır. Bu karışımdaki önemli proteinler Coomasie mavisi
gibi bir boya ile saptanabilir. Gümüş ya da altın içeren boyalar kullanılarak daha az (10 ng
kadar) protein içeren bantlar da belirlenebilir.
Şekil 2 : Poliakrilamit jel elektroforezi (PAGE). (a) elektroforez işleminin görünüşü. (b) Protein
karışımının jeldeki hareketi.
SDS poliakrilamit jel elektroforezi protein analizi açısından güçlü bir yöntemdir çünkü
prensip olarak suda çözülmeyenler dahil, bütün proteinlerin ayırımı için kullanılabilir. Zar
proteinleri, hücre iskeletinin protein bileşenleri ve daha büyük hücresel topakların
bileşenlerini oluşturan proteinlerin hepsi bu yöntemle ayrılabilir. Yöntem polipeptitleri
büyüklüklerine göre ayırdığından molekül ağırlıkları ve protein kompleksindeki altbirimlerin
bileşimi hakkında bilgi verir.
Düşük derişimde hazırlanan jellerin gözenekleri daha büyük olup, daha büyük moleküler
ağırlıklı biyomoleküllerin ayrılmasında kullanılır. Örneğin;
% 5’lik jel için 60-212 kDa (kiloDalton)
% 10’luk jel için 18-78 kDa
% 15’lik jel için 15-45 kDa arasındadır.
SDS-PAGE proteinler için çok uygun olduğu gibi poliakrilamit jel elektroforezi DNA ve
RNA elektroforezleri için de kullanılabilir.
Kaynaklar:
 Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff , M., Roberts, K., Walter, P., Molecular
Biology of the Cell, Fourth Edition, Garland Science, 2002.

Cooper, G.M., Hausman, R.E., The cell: A Molecular Approach, Third Edition, ASM
Press, 2004.

Yıldırım, A., Bardakçı, F., Karataş, M., Tanyolaç, B., Moleküler Biyoloji, 1. baskı,
Nobel basımevi, 2007.

http://en.wikipedia.org/wiki/SDS-PAGE