HÜCRE DÖNGÜSÜ
advertisement
HÜCRE DÖNGÜSÜ Biyolog Bahattin KARLANKUŞ CUMHURİYET LİSESİ Sultangazi HÜCRE BÖLÜNMESİ Hücre Bölünmesi • Tek hücreli ve çok hücreli organizmaların – Büyüme – Gelişme – Çoğalmaları hücre bölünmesiyle sağlanır. Hücre Bölünmesi • Prokaryotik ve ökaryotik hücreler DNA sentezinin koordinasyonu ve DNA’nın eşit olarak yavru hücrelere paylaştırılması yönünden birbirinden farklılık gösterirler. • Hücre bölünmesi iki tiptedir. – Mitoz: diploid somatik hücrelerde genetik özdeşlik – Mayoz: haploid germ hücrelerini meydana getirir Hücre Bölünmesi • Prokaryotlar ve ökaryotlar arasındaki hücre düzeyindeki farklılıklara rağmen hücre bölünme süreçlerinde birçok ortak özellik bulunmaktadır. – – – – Hücrenin büyümesi DNA’nın replikasyonu Orjinal ve kopyasının ayrılması Sitoplazmanın bölünmesi Hücre Bölünmesi • Bakterilerde hücre büyümesi ve replikasyon hücre siklusunun büyük bir bölümünde yer alır ve iki katına çıkan kromozomlar yavru hücrelere sitoplazmayla birlikte ayrılır. Hücre Siklusu • Hücreler içeriklerini iki katına çıkararak ve ikiye bölerek çoğalırlar. Bu süreç HÜCRE SİKLUSU (DÖNGÜSÜ) olarak adlandırılır. Prokaryotik Hücre Bölünmesi • • • • • • Prokaryotlar organizazyon bakımından ökaryotlara göre daha basittir. Ökaryotlar bir çok organel ve fazla sayıda kromozoma sahiptir. Prokaryotik hücrelerin bölünmesi genel olarak “binary fission” ikiye bölünme şeklinde olmaktadır. Prokaryotik kromozom tek bir DNA molekülüdür. Önce replikasyona uğrar ve daha sonra kromozomun her bir kopyası hücre membranının farklı bölgesine tutunur. Hücre uçlardan çekilmeye başlayınca orjinal ve kopya kromozomlar ayrılırlar. Sitolazmanında ikiye ayrılmasıyla (sitokinez) genetik içerik bakımından tamamıyle birbirinin aynı olan iki yeni hücre meydana gelir ( düşük oranda da olsa) eğer kendiliğinden mutasyon olmadıysa) • Prokaryot kromozomu araştırmak ökaryotik kromozoma göre daha kolay olduğundan prokaryotlarda genlerin yerleşimi ve kontrolu hakkında daha fazla bilgi bulunmaktadır. • Bu eşeysiz çoğalmanın bir sonucu, kolonideki tüm organizmaların genetiğinin aynı olmasıdır. Bir bakteriyel hastalığı tedavi eden bir ilaç kullanıldığında bu ilaçla karşılaşan koloninin diğer üyeleride ölecektir. ÖKARYOTİK HÜCRE BÖLÜNMESİ • Ökaryotlarda hücre siklusu çok daha karmaşıktır ve 4 farklı fazdan oluşur. – S fazı: DNA sentezi – G1 (ilk aralık) RNA ve protein sentezi, DNA için sentez hazırlığı – G2 (ikinci aralık) DNA sentezi tamamlanır, RNA ve protein sentezi devam eder. – S+G1+G2 = İNTERFAZ Hücre Siklusu • Hücreler interfaz süresince sabit bir hızda büyür. Bölünen hücreler için iki katına çıkma süresi iki mitoz arasında geçen süredir. • Sitokinezle sonlanan mitozdan sonraki faz DNA sentezi ile mitoz arasındaki G1 fazıdır.(gap1) Bu faz sırasında hücre metabolik olarak aktiftir ve sürekli olarak büyür ve DNA sentezi için gerekli proteinleri sentezler, fakat DNA’sının sentezini yapmaz. • G1 fazından sonra DNA replikasyonunun yer aldığı S fazı (sentez fazı) gelir. • DNA sentezinin tamamlanmasını G2 fazı (gap2) izler. Bu fazda hücre büyümeye devam eder ve mitoz için gerekli olan proteinler sentez edilir. Hücre Siklusu • Hücre siklusu fazlarının süreleri farklı hücre tipleri için oldukça çeşitlilik gösterir. • Toplam hücre siklusu 24 saat olan hızlı çoğalan bir insan hücresinde G1 fazı 11 saat, S fazı 8 saat, G2 4 saat ve M fazı 1 saattir. – Diğer hücreler örneğin maya hücresi tüm siklusunu yaklaşık 90 dakikada tamamlayabilir. Hücre Döngüsü • Daha da kısa hücre siklusları yumurtanın döllenmesinden sonraki erken embriyonik hücrelerde 30 dakika olabilir. Bu tip hücrelerde hücre büyümesi olmaz yumurta sitoplazması küçük hücrelere hızlı bir şekilde bölünür ve G1 ve G2 fazları yoktur. DNA sentezi hızlı bir şekilde çok kısa olan S fazında gerçekleşir Ökaryotik hücre siklusu • Hücre büyümesi kesintisiz bir süreç olmakla beraber DNA, hücre siklusunun sadece bir fazında sentez edilir ve replikasyona uğrayan kromozomlar daha sonra bir seri karmaşık işlemi kapsayan hücre bölünmesi ile yavru nukleuslara bölünür. • Hızlı çoğalan embriyonik hücrelerin dışında yetişkin hayvanlarda bazı hücreler bölünmeyi tamamıyla durdurur (sinir hücreleri, kas hücreleri) ve bazıları da sadece nadiren hücrenin yaralanması veya ölümüyle kaybolması sonucu yerine koymak için gerekli olduğunda bölünür. Bu ikinci tip hücreler deri fibroblast hücreleri ve karaciğer, böbrek ve akciğer gibi iç organ hücreleridir. Bu hücreler metabolik olarak aktif oldukları, uygun bir hücre dışı sinyal almadıkça çoğalmadıkları bir faz olan G0 fazına girmek üzere G1 fazından ayrılırlar (çıkarlar). Hücre Siklusu Kontrolu • Hücre siklusunun aşamaları arasındaki geçişler korunmuş bir düzenleme mekanizması (“checkpoints” sistemi) tarafından kontrol edilir. Bu mekanizma sadece hücre siklusunun farklı olaylarını kontrol etmez aynı zamanda hücre çoğalmasını kontrol eden hücre dışı sinyallerle hücre siklusu arasındaki ilişkiyi de sağlar. Hücre Siklusu Kontrolu • G1 evresindeki karar verme noktası (“Restriction point” sınırlayıcı nokta) hayvan hücresinin çoğalmasını düzenler. Mayalara zıt olarak hayvan hücrelerinin hücre siklusunu tamamlamaları öncelikle besin maddelerinin kullanılabilmesinden çok hücre dışı “growth” büyüme faktörleri tarafından düzenlenir. Hücre Büyümesi ve Hücre dışı Sinyallerle Hücre siklusunun Düzenlenmesi • Hücre siklusunun bölümleri arasındaki geçiş ve farklı hücre sikluslarında meydana gelen çeşitli işlemler hücre içi sinyallerin yanı sıra çevreden gelen hücre dışı sinyallerle de düzenlenir. • Hücre dışı sinyallerle hücre siklusunun düzenlenmesine bir örnek hayvan hücrelerinin çoğalmasına büyüme faktörlerinin etkisidir. • Hücre büyümesi, DNA replikasyonu ve mitoz gibi hücresel süreçler hücre siklusu sırasında farklı kontrol noktalarında düzenlenirler. Hücre Siklusu • Büyüme (“Growth”) Faktörleri – “Platelet-derived Growth factor” (PDGF): Bağ doku ve nöroglia hücrelerinin çoğalmasını – “Epidermal Growth Factor” (EGF):Birçok hücre tipinin çoğalmasını – “İnsulin like Growth factor” (IGF-1): yağ hücreleri ve bağ doku hücrelerinin çoğalmasını – “Trasforming Growth Factor” (TGF): Hücre tipine bağlı olarak hücrelerin farklılaşmasını düzenler – “Fibroblast Growth Factor” (FGF): Fibroblast ve endotel hücrelerin çoğalmasını – “Nerve Growth FActor” (NGF): Bazı duyu ve merkezi sinir sistemi nöronlarının hayatta kalma süresini uzatır. – İnterlökin 2: T lenfositlerim çoğalmasını – “Hemopoietic Cell Growth Factors” : Kan hücrelerinin oluşumunu etkiler • Birçok hücre tipinde hücre siklusu ana kontrol noktası, G1’den S fazına geçişi kontrol eden geç G1 noktasıdır. Bu düzenlenme noktası ilk kez Saccharomyces cerevisiae’de saptanmıştır. START olarak bilinen bu noktayı geçen hücreler S fazına girerler ve hücre bir hücre bölünmesi geçirir. • • START noktasının geçilmesi oldukça yüksek düzeyde kontrol edilen bir süreçtir. Besin maddelerinin varlığı, hücrenin boyutu gibi hücre dışı sinyallerle kontrol edilir. Örneğin eğer maya besin açlğı ile karşılaşırsa hücre siklusunu START noktasında durdurur ve S fazına geçmeden uyku (dinlenme) durumuna geçer. Maya eşleşmesinde etkili olan polipeptit faktörler de hücre siklusunu START noktasında durdurur. Bu faktörler maya hücresini S fazına sokmak yerine haploid maya hücrelerinin birbiriyle birleşmesini sağlar • Hücre dışı sinyallerin izlenmesinde bir karar noktası gibi iş görmesine ek olarak START noktası hücre çoğalmasının; DNA replikasyonu ve hücre bölünmesi ile koordine olduğu bir noktadır. • Bu düzenlenme özellikle tomurcuklanan mayalar için önemlidir. Çünkü ana hücre çok büyük, yavru hücreler çok küçüktür. Bu hücrelerin tekrar bölünmeden sabit bir boyda olması için küçük yavru hücrelerin hızlı bir şekilde en az annesi kadar büyümesi gerekmektedir. • START noktasındaki kontrol ve düzenleme bölünecek hücrenin belirli bir büyüklüğe ulaşmasını sağlar. • Bu düzenlenme her bir hücrenin START noktasını geçmeden önce minimum boyuta ulaşmasını gerektiren kontrol mekanizmasıyla birlikte olur. Sonuç olarak küçük yavru hücre G1’de daha uzun zaman harcar ve ana hücreden daha fazla büyüyerek tekrar bir tomurcuk oluşturma konumuna girer. Bu nedenle mayada G2 fazı oldukça kısadır. Hücre siklusu kontrolu • • • Birçok hücrenin çoğalması G1 fazında düzenlenmekle beraber bazı hücrelerin çoğalmasının kontrolu özellikle G2 fazında yapılır. Buna bir örnek Schizosaccharomyces pombe (“fission yeast”) mayasının hücre siklusudur. G2 fazından M fazına geçişte hücre boyutu ve besin varlığının etkili olduğu nokta temel kontrol noktasıdır. Bu maya heriki ucundan uzayarak büyür ve hücrenin ortasında hücre duvarı oluşturarak ikiye bölünür. S.cerevisiae’den farklı olarak normal G1,S,G2 ve M fazlarına sahiptir. Sitokinez G1 de olur. Hücre boyutu (uzunluğu) hücrenin siklusun hangi aşaşmada olduğunu gösterir. Hayvanlarda hücre siklusunun G2 fazında kontroluna örnek oositlerdeki kontrol mekanizmasıdır. Omurgalı oositleri G2 fazında çok uzun yıllar kalabilirler. M fazına geçişleri hormonol uyarılma ile birlikte olur. SONUÇ : Hücre dışı sinyaller hücre siklusunda G2 fazından M fazına ve G1 den S fazına geçişleri düzenleyerek hücre çoğalmasını kontrol eder. Schizosaccharomyces pombe’nin birbirini izleyen mitoz ve sitokinez aşamalrının mikroskobik görüntüsü, Robinow • • • • Hücre Siklusu Kontrol Noktaları Hücre siklusunun farklı fazları arasındaki koordinasyon, hücre siklusunda bir fazın işlemi tamamlanmadan bir sonraki faza geçişini engelleyen kontrol noktalarına ve “feedback” kontroluna bağlıdır. Bazı kontrol noktaları tamamlanmamış veya zarar görmüş kromozomun replikasyonunun yapılmamasından ve yavru hücreye geçmemesinden sorumludur. Bu noktalardan en iyi bilineni G2’dedir ve DNA replikasyonu tamamlanmadan mitoza girişi engeller. Bu G2 kontrol noktası replikasyon olmamış DNA’ya duyarlıdır. Böyle bir DNA hücre siklusunu durdurmaya yol açan bir sinyal oluşturur. Böylece G2 kontrol noktası S fazı tamamlanmadan önce Mitoza girişi engeller. G2’deki kontrol noktası zarar görmüş DNA’ya karşı da duyarlıdır. Bu noktada hücre siklusu durdurularak zarar görmüş DNA’nın onarılması için zaman kazanılır. • Her bir hücre döngüsü için DNA replikasyonunu bir kereyle sınırlayan moleküler mekanizmada, MCM proteinleri başlangıç noktasına replikasyon kompleksi (ORC) ile birlikte bağlanır. • MCM proteinleri, kopyalamanın başlamasına izin veren “yetki faktörleri” olarak davranırlar. • DNA’ya bağlanmaları G1’de bağlanabilecek şekilde düzenlenmiştir ve DNA replikasyonunun, sadece hücre S evresine girdiğinde başlamasına izin verir. Başlama gerçekleşince MCM proteinleri orijinden ayrılır, böylce hücre mitozdan geçip bir sonraki hücre döngüsünün G1 evresine girene kadar kopyalama tekrar başlatılamaz. Hücre Siklusu Kontrol Noktaları • DNA hasarı hücre siklusunu sadece G2’de tutmaz aynı zamanda S fazından hücrenin çıkışını da yavaşlatır ve G1’deki kontrol noktasında hücre siklusunun ilerlemesini durdurur. • G1 tutuklanması, hasarlı DNA’nın replikasyonunun yapılacağı S fazına girmeden önce hatanın onarılmasına izin verir. Hücre Siklusu Kontrol Noktaları • S’deki kontrol noktası hasarlı DNA’nın replike olmadan onarılması için DNA’nın bütünlüğünü sürekli izler. • DNA replikasyonu sırasında yanlış baz eşleşmesi ya da DNA bölümlerinin eksik replikasyonu gibi oluşabilecek hataları bulma ve onarma şeklinde kalite kontrol görevi yapar Hücre Siklusu Kontrol Noktaları • Bir başka hücre siklusu kontrol noktası kromozomların mitoz sırasında dizilimlerini kontrol eder. • Böylece tam bir kromozom takımının yavru hücrelere geçirilmesi sağlanır. • Eğer hatalı dizilim olursa mitoz fazının metafazında siklus, kromozomların tam bir takımının yavru hücrelere dağılımı düzenleninceye kadar durdurulur. Hücre Siklusu Kontrol Noktaları • G2 kontrol noktası S fazı tamamlanmadan mitoza girişi engeller. Böylece replikasyonu tamamlanmamış DNA yeni yavru hücrelere geçmez • En az bunun kadar önemli olan bir diğer nokta genomun her bir hücre siklusunda sadece bir kere replikasyon olmasıdır. Böylece DNA bir kere replikasyon olduktan sonra mitozdan önce yeni bir S fazına girişi engelleyen kontrol mekanizmaları olmalıdır. Bu kontrol, hücrelerin G2’de tekrar S fazına girmesini engeller ve mitozdan önce bir başka DNA replikasyon döngüsüne girmesini durdurur. G1, S ve G2’deki kontrol noktalarında hücre döngüsünün durdurulması: Algılayıcı proteinler kompleksi hasarlı ya da replike olmamış DNA’ya bağlanarak ATM ve ATR protein kinazları aktive eder. ATM ve ATR sırasıyla Chk2 ve Chk1 protein kinazları fosfatlayarak aktive eder ve hücre döngüsünün durmasını sağlar. • • • Araştırıcılar (Potu Rao ve Robert Johnson, 1970) siklusun farklı fazlarındaki hücreleri izole ettikten sonra hibrit hücreler elde etmek için hücreleri birbirleriyle birleştirdiler. S fazı hücreleri G1 hücreleri ile birleştirildiğinde G1 nukleusu hemen replikasyona başlar. S faz hücreleri G2 hücreleri ile birleştirilirse sadece S faz nukleusu DNA replikasyonuna devam eder. G2 nukleusunun, M fazını geçmek zorunda olduğu ve birbaşka DNA replikasyonuna başlamadan önce G1 fazına girmesi gerektiği ortaya çıkmaktadır. • SONUÇ: Mitoz oluşuncaya kadar G2 nukleusunda kontrol mekanizması DNA replikasyonunu durdurmaktadır Hücre Siklusu Kontrol Noktaları • Memeli hücrelerinin G1 kontrol noktasında durması p53 proteini olarak bilinen protein aracılığı ile olmaktadır. Bu protein hasarlı DNA tarafından çok hızlı bir şekilde indüklenir. Hücre Siklusu Kontrol Noktaları • Bir çok kanser tipinde p53 proteinini şifreleyen gende mutasyon saptanmıştır. • Bu mutasyonların sonucu olarak p53 işlevinin kaybolması DNA hasarına cevap olarak G1 de durma olayı gerçekleşmez. Böylece hasarlı DNA replikasyona uğrar ve yeni yavru hücrelere onarılmadan geçer. Hasarlı DNA’nın bu şekildeki kalıtımı mutasyon sıklığının ve kanser gelişimine eşlik eden hücre genomunun genel kararsızlığının artmasına neden olur. • P53 genindeki mutasyonlar insan kanser tiplerinde en sık görülen genetik değişikliklerdir. • SONUÇ: Çok hücreli organizmaların hücre siklusunun kontrolu ÇOK ÇOK ÖNEMLİDİR !!!!! Hücre siklusu fazlarının belirlenmesi • Mitoz fazındaki hücreler mikroskobik olarak kolaylıkla ayırt edilebilir. • Siklusun diğer fazları (G1, S ve G2) biyokimyasal kriterlerle ayrılır. S fazındaki hücreler DNA sentezi sırasında kullandıkları timidinin radyoaktif işaretli olmasıyla ayrılırlar. Örneğin hızlı çoğalan bir insan hücresi populasyonunda kültür kısa bir süre (15 dakika) radyoaktifli timidin etkisinde bırakılıp otoradyografi ile analiz edilirse hücrelerin yaklaşık 1/3 ünün işaretlendiği görülür ve hücrelerin S fazında olduğu anlaşılır. • Hücre siklusunun farklı aşamalarındaki hücreler DNA içeriklerine göre de ayırt edilebilir. Örneğin hayvan hücreleri G1 fazında 2n’dir. S fazının sonunda DNA içeriği 4n olur. Hücreler S fazında 2n-4n arasında DNA içeriğine sahiptir. G2 ve M fazlarında 4n olarak kalır Sitokinez sonrası DNA miktarı tekrar 2n olur. Deneysel olarak DNA miktarındaki bu değişim DNA’ya bağlanan özel fluorosan boyaların “flow cytometer” ile tek bir hücredeki fluorasan yoğunluğun ölçülmesiyle saptanır ve hücreler G1, S ve G2/M fazlarında ayrılırlar. Hücre Döngüsü Gelişiminin Düzenleyicileri • Hücre döngüsünün düzenlenmesi ile ilgili şu anki bilgilerimiz: maya, deniz kestanesi, kurbağa ve memelilerden elde edilmiştir. • Ökaryotların hücre döngülerinin korunmuş bir seri protein kinaz tarafından kontrol edildiği gösterilmiştir. Hücre Siklusunun Düzenlenmesinde etkili olan moleküller • Ökaryotik hücrelerin hücre siklusunun kontrolünde protein kinazlar görev alır. • Kontrol noktalarını geçişte önemli rol oynarlar. • Mayalarla yapılan çalışmalar sonucunda işlevleri ortaya çıkarılmıştır. • MPF: Cdc2 ve Siklin Dimeri Olgunlaşmayı ilerleten faktör. G2’den M’ye geçişte genel düzenleyici görevi vardır. • Siklin ve Siklin Bağımlı Kinaz Aileleri Cdc2 ve siklin B birbiriyle ilişkili geniş ailelerin üyeleridir. Bu ailelerin farklı üyeleri hücre döngüsünün farklı evrelerinde kontrolü sağlarlar. Hücre Siklusunun Düzenlenmesi • Hücre siklus düzenlenmesinde anahtar rol oynayan molekülün varlığı çeşitli araştırmalarla saptanmıştır. Bu çalışmalardan ilki kurbağa yumurtaları ile yapılmıştır. • G2 evresinde bekletilen yumurtalar progesteron hormon uyarısı alınca Mayoz evresine geçmektedir. G2 de iken progesteron uyarısı almış ve Mayoz evresine geçmiş yumurtalardan alınan sitoplazmalar enjeksiyonla horman etkisinde olmayan hücrelere aktarıldığında bu yumurtaların da Mayoz fazına geçtikleri gösterilmiştir. • Hormon tarafından uyarılmış sitoplazmadaki bir faktörün yumurtayı G2 den M fazına geçirmekten sorumlu olduğu saptanmıştır. • Bu faktör “Maturating Promoting Factor” (MPF) olarak adlandırılmıştır. Hücre Siklusunun Düzenlenmesi • Diğer bir çalışmada Lee Hartwell ve ark. (1970) S.cerevisiae’de hücre siklus işlemlerinde kusurlu, ısıya duyarlı bir mutant tanımlamışlar ve “Cell division cycle” kelimelerinin kısaltılması olan cdc adını vermişlerdir. • Bu mutant hücre siklusunu uygun sıcaklık olmadığında START noktasında durdurmaktadır. • Cdc 28 olarak adlandırılan proteinin G1 evresindeki bu kontrol noktasını geçmede önemli olduğu saptanmıştır. Hücre Siklusunun Düzenlenmesi • Paul Nurse ve ark. S.pombe mayasında benzer bir çalışma yapmıştır. • cdc2 mutantı hücre siklusunu G1’den S fazına ve G2’den M fazına geçişte durdurmaktadır. • cdc28 ve cdc2’nin birbirinin homoloğu olduğu saptanmıştır. • Moleküler klonlama ve dizi analizi çalışmaları bu genlerin bir kinaz şifrelediğini göstermiştir. Hücre Siklusunun Düzenlenmesi • Tim Hunt ve ark (1983) deniz kestanelerinin embriyolarında interfazda biraraya gelip mitoz sonuna doğru ayrılan 2 protein varlığını saptamışlardır. • Bu proteinler Siklin’ler (siklin A ve siklin B) olarak dlandırılmıştır. Hücre Siklusunun Düzenlenmesi • Tüm bu çalışmaların sonucunda hücre siklusu kontrol sistemi için bir kavram geliştirilmiştir. • 1988 yılında kurbağa yumurtasından saflaştırılmış MPF’nin iki alt birimden oluştuğu gösterilmiştir. – Siklin protein = düzenleyici alt birim ve işlevi için Cdc2’nin katalitik aktivitesine gerek duyar. – cdc 2 = kinaz Siklin ve Siklin-Bağımlı Kinaz Aileleri Mayada: Cdc2, hem START’dan geçişi hem de mitoza girişi kontrol eder. Yüksek ökaryotlarda: Cdc2 ve Cdc2-bağlantılı kinazlar (siklin-bağımlı kinaz, Cdk) hücre döngüsünün çeşitli aşamalarını kontrol ederler. Cdk’ların aktivitesi en az dört moleküler mekanizma ile düzenlenir. siklin sentezi ve parçalanmasıyla 1.Siklinlerle birleşme 3.Cdk/siklin kompleksine inhibitör proteinlerin bağlanması (CKI) 4.14 ve 15. tirozin bakiyesinin inhibitör fosforilasyonu Wee 1 protein kinaz tarafından gerçekleştirilir. Özellikle Cdc2 ve Cdk2 de oluşur. Geriye Cdc25 protein fosfataz ile döner 2.161. Threonin bakiyesinin aktive edici fosforilasyonu CAK (Cdk-aktifleştiren kinaz) tarafından gerçekleştirilir. CAK: Cdk7/siklinH. Bu kompleks TFII H ile de birleşir. Transkripsiyon, DNA tamiri ve Hücre döngüsünde yer alır. Hücre Siklusunun Düzenlenmesi • Memeli hücrelerinde siklin B sentezi hücre siklusunun S evresinde başlar. • Sentezlenen siklin B cdc 2 bir kompleks oluşturur. • Bu kompleks hücre siklusunun S ve G2 evrelerinde iş görür. Memeli hücrelerinde , iki Cdk inhibitör ailesi, farklı Cdk/siklin kompleksinin düzenlenmesinden sorumludur. Böylece, Cdk aktivitesinin düzenlenmesinde ilave bir kontrol mekanizması oluşur. Büyüme Faktörleri ve D-Tipi Siklinler • Hayvan hücrelerinin çoğalması, genellikle G1 evresindeki Restriksiyon (R) noktasında çeşitli hücre-dışı büyüme faktörleri tarafından düzenlenir. • Büyüme faktörlerinin yokluğunda, hücreler G0’a girer. Tekrar hücre döngüsüne girmeleri, ancak büyüme faktörlerinin • Siklin D regülasyonundaki bozukluklar kanser hücrelerinin karakteristik özelliği olan kontrolsüz çoğalmaya neden olur. • İnsan kanserlerinin – hücre döngüsü regülasyonundaki bozukluklardan – Büyüme faktörü reseptörleri tarafından aktive edilen hücre-içi sinyal yolaklarındaki anormalliklerden kaynaklanır. Lenfoma vb.bir çok kanserde, siklinD1’in sürekli sentezi ya da Cdk4,6/SiklinD’ye bağlanan Ink4 Cdk inhibitörlerini inaktive eden mutasyonlar bulunmaktadır. Siklin D ve biyüme faktör kontrolü ile kanser arasındaki ilişki, Cdk4/siklinD kompleksinde görev yapan Rp preoteini aracılığıyla kesin ortaya konmuştur. Rb proteininin DNA sentezi ve hücre döngüsünün ilerlemesi için gerekli genlerin anlatılmasını sağlayarak hücre döngüsünde anahtar rol oynadığı ortaya konmuştur. Rb’nin aktivitesi hücre döngüsü boyunca oluşan Rb fosforilasyonu tarafından düzenlenir. Rb G1 evresinde E2F’ye bağlanarak anlatımı E2F tarafından düzenlenen genlerin anlatımını baskılar, Cdk4,6/siklinD ile fosforlanan Rb E2F’den ayrılır ve ilgili genlerin anlatımı gerçekleşir. Hücre Döngüsü İnhibitörleri Hücre çoğalması sadece büyüme faktörleri tarafından değil, hücre döngüsünü inhibe edici uyaranlar tarafından da düzenlenir. Hücrede bir DNA hasarının oluşması, hücre içi P53 proteinin seviyesinde artmaya neden olur. P53 de Cdk inhibitörü olan p21’in sentezlenmesine yol açar. P21 bazı Cdk/siklin komplekslerini inhibe ederek hücre döngüsünün durmasına neden olur. Aynı zamanda doğrudan DNA replikasyonunu da inhibe ederler. p21 DNA pol. alt birimi olan çoğalan hücre nükleer antijeni (PCNA)’ne bağlanarak DNA replikasyonunu inhibe eder. Böylece hasarlı DNA’nın replikasyonu engellenir. S ve G2 kontrol noktalarında replike olmamış ya da hasara uğramış DNA’ların varlığında, Chk1 ve Chk2 protein kinazlar tarafından, hücre döngüsünün engellendiği farklı bir mekanizma daha vardır. Chk1 ve Chk2 bir protein fosfataz olan Cdc25C’i fosfatlayarak inhibe ederler. İnaktif Cdc25C Cdc/siklinB kompleksini defosforilleyemediğinden Cdc2 aktive olmaz ve hücre G2’de durur. • 2001 “Physiology or Medicine” Nobel ödülü Leland Hartwell, Tim Hunt ve Paul Nurse adlı araştırıcılara "key regulators of the cell cycle" çalışmaları için verildi. • Genetik ve biyokimyasal yöntemleri kullanarak bu moleküllerin siklin ve CDK olduklarını tanımladılar. • Bu temel keşif biyoloji ve tıp alanında derin bir etkiye sahip olmuştur. • CDK ve siklinler DNA sentezini, kromozom ayrılmasını ve hücre bölünmesini control ve koordine eden moleküllerdir. Leland Hartwell, 1939. Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA. L. Hartwell ve arkadaşları tomurcuklanan maya (Saccharomyces cerevisiae) ile çalışmışlar. Hücre döngüsünde kusur bulunan ısıya duyarlı mutant elde etmişler ve bu mutantlara “cell division cycle mutant” (cdc) adını vermişler. Bu mutantlar hücre döngüsünün bir aşamasında durmaktadır. Örneğin cdc28 hücre döngüsünü START’da durdurmaktadır. Belli ısı koşulu sağlanmayınca hücre bölünenmemektedir. İlgili proteinin G1 evresindeki kritik noktayı geçebilmek için gerekliliğini ortaya koymuştur. Paul Nurse, 1949. Imperial Cancer Research Fund, Lincoln's Inn Fields, London, UK. P. Nurse ve arkadaşları fizyon mayası (Schizosaccharomyces pombe) ile çalışmışlar. Hücre döngüsünü G1 ve G2’de durduran cdc2 mutantları elde etmişler. S. cerevisiae’deki cdc28 ile S.pombe’deki cdc2’nin homolog olduğunu ortaya koymuşlar. Bu gen ile yapılan moleküler klonlama ve nükleotid dizi analizleriyle cdc2’nin bir protein kinaz kodladığını ve aynı zamanda insanda da benzer fonksiyona sahip akraba bir genin varlığını ortaya koymuşlar. 1987’de ilgili insan geninden CDK1’i izole edip evrimde korunduğunu gösterdiler. CDK1 siklin bağımlı kinaz olarak adlandırılan bir ailenin üyesidir. CDK molekülleri hücre döngüsü boyunca vardır. Ancak aktiviteleri çeşitli siklinlerle birleşmeleriyle düzenlenir. Tim Hunt, 1943. Imperial Cancer Research Fund, Clare Hall Laboratories, South Mimms, UK. T. Hunt ve arkadaşları deniz kestanesinden (“sea urchin,Arbacia”) embriyolarıyla çalıştılar. 1982’de deniz kestanesi ve embriyolarında bir araya gelip ayrışan 2 protein tanımlamışlar. Bu proteinler interfazda bir araya toplanmakta ve sonra mitoz sonuna doğru bir birinden ayrılmaktadır. Hunt bunlara siklinA ve siklinB adını vermiştir. CDK moleküllerine bağlanan siklinleri keşfettiler. Siklinler CDK’nın aktivitesini düzenlerler ve fosforlanacak hedef proteinleri seçerler. Hunt mitoz boyunca yıkılan siklinlerin hücre döngüsünün temel bir kontrol mekanizması olduğunu ortaya çıkardı. MİTOZ • • Tipik bir insan hücresi 24 saatte bir bölünür. Hücre siklusu iki temel kısımdan oluşur. – MİTOZ (nukleus bölünmesi) ve İNTERFAZ – Mitoz ve sitokinez sadece yaklaşık bir saat sürmekle beraber hücre siklusunun yaklaşık %95’i iki mitoz arasındaki faz olan interfaz ile geçer – İnterfaz sırasında kromozomlar yoğunlaşır ve nukleus içinde dağılır Moleküler düzeyde interfaz hücrenin, bölünmeye hazırlık olarak hücre büyümesi ve DNA replikasyonu sırasındaki toplam zamandır. MİTOZ • Mitoz bir hücresel kopya etkisi yapmak üzere orjinal kromozomların replikasyonu ve bölünmesiyle birbirinin tıpa tıp aynısı iki yavru hücre oluşturma sürecidir. • Click here to view an animated GIF of mitosis from http://www.biology.uc.edu/vgenetic/mitosis /mitosis.htm. Mitoz • • • • • • Yoğunlaşmış replikasyon olmuş kromozomlar önemli yapılara sahiptir. Kinetokor : İğ ipliklerinin mikrotubullere bağlandığı çok proteinli bir komplekstir. Replikasyonu yapılan kromozomlar histon proteinlerle birleşmiş kromatid olarak bilinen iki DNA molekülünden meydana gelir. Sentromer: Her iki kromatininde birleştiği noktadır. Kinetokorlar sentromerin dış tarafındadır. Kromozomlar ise yoğunlaşmış kromatindir (DNA+histon proteinleri). • MİTOZ AYGITI İĞ MEKİĞİ – Kromozomal iğ iplikleri (kinetokor mikrotubulleri) • Herbir kinetokora yaklaşık 35-40 mikrotubul bağlanır • Kinetokorlar her kromozomu kutuplara bakacak şekilde yerleştirirler • Her kromozomu, mitotik iğciği ikiye bölen ekvator düzlemine yerleştirirler – Devamlı iğ iplikleri (polar mikrotubuller) Kutuplardan ekvatora doğru uzanırlar Mitoz Aygıtı • Mitoz sırasında replikasyonu yapılan kromozomlar sitoplazmanın ortasında yerleşir ve orjinal DNA’nın bir kopyası yavru hücrelerin herbirinde olacak şekilde ayrılır (örneğin 46 kromozom ile başlanmışsa yavru hücrelerin her biri 46 kromozom içermelidir). • Hücreler bunu başarmak için kromozomları yavru hücrelerin içine çeken mikrotubülleri kullanır. • Hayvan hücrelerinde iğ iplikleri mikrotubullerinin oluşumunda etkili olduğu düşünülen bir çift sentriol bulunmaktadır. Bitki ve bazı ökaryotlarda ise sentriol bulunmaz. Prokaryotlar iğ iplikleri ve sentriolleri olmadığından hücre zarının bölünme sırasında kromozomları çekme işini yaptığı tahmin edilmektedir. • Sentriol içeren hücreler aster adı verilen sentriolden hücre zarına doğru uzanan çok küçük mikrotubullere sahiptir. Aster iğ ipliklererini birarada tutan bir bağ gibi iş görür. • Metafaz kromozomlarının iki kutbada eşit uzaklıkta olması kinetokorlarla sağlanmaktadır. • Herbir kinetokor üzerindeki çekme gücü, o kinetokorun bağlı olduğu kutba yaklaştıkça azalır. • İki kutuptan birine bağlı olan kromozomun bir kutba çekilmesi zıt bir gücün ortaya çıktığını gösterir. Bu güçlerin nasıl oluştuğu ve nereden kaynaklandığı henüz bilinmemektedir. • Mitozun fazlarını ayırmak bazen oldukça güçtür. • Sürecin DİNAMİK olduğu unutulmamalı !!!! • PROFAZ mitozun ilk aşamasıdır. • Kromatin yoğunlaşır, nukleolus kaybolur • nukleus kılıfı erir, sentrioller (eğer varsa) ayrılır ve kutuplara göç eder, kinetokorlar ve kinetokor iplikler oluşur ve iğ iplikleri meydana gelir • METAFAZ: Kromozomlar (bu aşamada sentromerle birarada tutulan kromatitlerden ibarettir) iğ ipliklerinin kinetokor ipliklere bağlandığı iğin ekvatoruna (merkezine), doğru göç eder. • ANAFAZ: Sentromerlerin ayrılmasıyla başlar ve kromozomların kardeş kromatitleri iğ ipliğinin zıt kutuplarına çekilmesiyle ayrılma devam eder • TELOFAZ: Birbirinden ayrılmış kromatitlerin kutuplara ulaşmasıyla tamamlanır, nukleus kılıfı yeniden oluşur, kromozomlar kromatin yapısında şekillenir ve nukleolus yeniden oluşur. Bir hücrenin olduğu yerde şimdi tamamıyle aynı genetik bilgiye sahip iki küçük hücre oluşmuştur. Sitokinez • • • • • • • Bu olay genellikle anafazda başlar. Hücrenin orta bölgesinde hücre zarı, aktin ve miyozin flamentlerden oluşan kontraktil halkaların etkisiyle iğcik eksenine dik ve iki yeni nukleus arasında bir oluk oluşturur. Nuklear ve sitoplazmik bölünme birbiriyle her zaman bağlantılı olmayabilir.Ör:Drosphila’da embriyonun erken evresinde sitoplazma bölünmesi olmaksızın 13 nukleus bölünmesi geçirebilir. Daha sonra nukleusların etrafında sitoplazma bölünmeleri gerçekleşir. Ayrışma aktin flamentler ile miyozin II’den meydana gelen bir halkanın kasılması ile gerçekleşir. Bu halka hücre zarının sitoplazmik yüzeyine bağlanır. Anafaz başlangıcında henüz bilinmeyen bir mekanizma tarafından hücre zarı oluğun içine çekilir. Oluk hücrenin ortasında birleşene kadar derinleşmeye devam eder ve sonunda zarlar birbirine kaynaşır. Bitki hücrelerinde sitokinez • Yüksek bitkilerin hücreleri hücre çeperi ile kuşatılmış olduğundan sitokinez farklıdır. • Zar veziküllerinden yeni bir hücre zarı ve hücre çeperi oluşturarak bölünürler • Hücre çeperi yeni iki nukleusun arasındaki bir düzlemde oluşur ve polar fibril kalıntılarıyla birleşerek fragmoplast yapısını oluşturur. • İlk hücre plağı fragmoplastın iki yanındaki mikrotubulerle ilişkiye geçen hücre çeperi öncül molekülleri ile dolu olan veziküllerin ekvator düzlemine taşınmasıyla olur. • Hücre plağının şekli ve yeri ileride ana hüçre çeperi ile birleşeceği yer olan hücre zarının hemen altında yer alan aktin mikrotubul demetinden oluşan preprofaz bandıdır. • Hayvan Bitki MAYOZ BÖLÜNME Mayoz Bölünme • Eşeyli üreme sadece ökaryotik organizmalarda meydana gelir. • Eşem hücrelerinin (yumurta ve spermatazoon) gelişimi sırasında kromozom sayısının yarıya indirilmesini sağlayan özel bir hücre bölünmesidir. • Döllenme (fertilizasyon) sırasında iki eşem hücresinin birleşmesiyle kromozom sayısı tekrar iki katına geri döner. • Haploid ve diploid terimleri hücredeki kromozom takımlarının sayısını ifade eder. İnsan (eşem hücreleri hariç) hayvanların çoğu ve pek çok bitki diploittir. • Diploid = 2n Haploid = n • Poliploidi: 2 kromozom takımından daha fazla kromozoma sahip organizmalar • Homolog kromozomlar: Aynı genleri taşıyan kromozomlardır, farklı ebeveynlerden gelirler • Allel: Homolog kromozomlar üzerindeki herbir gen için olan farklılık Heterozigot Birey • Mayoz : Özel bir tip nukleus bölünmesi –herbir homolog kromozomun bir kopyası (her bir genin ya anneye ya da babaya ait olan kopyası) yeni gamete (eşem hücresine) geçer. • Mayoz bölünme iki önemli sonuca neden olur. – Kromozom sayısı yarıya iner – Genler arasında rekombinasyonlar (parça değişimi) olur. Bu da gen havuzunun zenginleşmesini ve genetik farklılaşmasının oluşumunu sağlar. • Mitoz: Hücrenin orjinal poliploidi düzeyini korur – örneğin, bir diploit hücre (2n) iki diploit (2n+2n) hücre bir haploit hücre iki haploit hücre (n+n) meydana getirir. • İnsan vücudunda hücrelerin çoğu mitozla üretilir. Bunlar somatik hücre hatlarıdır. Gametleri verecek hücreler germ hücre hatları olarak ifade edilir. • İnsan vücudunda hücre bölünmesi çoğunlukla mitozdur, mayoz gonatlarda sınırlıdır. Yaşam Siklusu • İnsan yaşam siklusunda diploit faz baskındır Haploit faz sadece gametlerde görülür. • Vücudumuzdaki hücrelerin çoğu diploittir ve diploit germ hücreleri gametleri meydana getirmek üzere mayoz geçirir ve bunu döllenme izler. Mayozun Fazları • Mayoz bölünme 2 ayrı bölünmeden oluşur. • I. Mayoz : Kromozom takımının yarıya inmesi • II. Mayoz : I. Mayozu izleyen ekvatoryal bölünme olarak da adlandırılır. Mitoz bölünmede olduğu gibi kromozomların kardeş kromatitleri farklı kutuplara giderek ilk oluşan her bir yavru hücreden 2 yeni yavru hücre daha meydana gelir. Sonuçta herbiri haploit sayıda kromozom taşıyan 4 yavru hücre meydana gelir. I.Mayoz • Profaz I: – Oldukça uzun sürer. 5 alt evreye ayrılır. – Leptoten, Zigoten, Pakiten, Diploten, Diakinez • homolog kromozomların eşleşmesidir. (henüz anlaşılamamış bir mekanizmayla) Replikasyon olmuş kromozomların birbirine bağlanma sürecine sinapsis denir. Oluşan kromozom her bir kromozomdan gelen iki kromatitten oluştuğu için tetrat olarak adlandırılır. Bu oluşum 4 iplikli kalın bir yapı şeklindedir. Krosingover bu aşamada meydana gelebilir. Krosing over sırasında kromatitler kırılır ve farklı homolog kromozomlar yeniden birleşirler • • • • ABCDEFG ABCDEFG abcdefg abcdefg • • • • ABCDEFG ABcdefg abCDEFG abcdefg Mayoz sırasında krosingover sonrası rekombinanat kromozomların gametlere dağılımı Profaz I de meydana gelen olaylar mitoz profazıyla aynıdır; (krosingover ve sinapsis dışında) kromatinin yoğunlaşarak kromozomları oluşturması, nukleolusun erimesi ve mekik yapısının oluşumu. • Metafaz I :Mekiğin ekvatoruna tetratların dizilmesiyle başlar. İğ iplikleri herbir homolog kromozom çiftinin sentromer bölgesine bağlanır. Diğer olaylar mitozla aynıdır. • Anafaz I :Tetratların ayrılmasıyla başlar ve iğ iplikleriyle zıt kutuplara çekilir. Sentromer bozulmadan kalır. Metafaz I’de kromatidlerin kinetekorları birbirine birleşik veya bitişiktir. Bu nedenle, iğin aynı kutupundan gelen mikrotubuller kardeş kromatidlerin kinetekoruna tutunurken, zıt kutuplardan gelen mikrotubuller , eş kromozomların kinetekorlarına tutunur. Kiyazmalar anafaz I’de açılır ve eş kromozomlar iğin zıt kutuplarına hareket ederler • Telofaz:Mitoz telofazına benzer sadece replikasyon olmuş kromozom takımının bir seti hücreye geçer. Türlere bağlı olarak yeni nukleus kılıfı oluşur ya da oluşmaz. Bazı hayvan hücreleri bu faz sırasında sentriol bölünmesine sahip olabilir. • Profaz II: Nukleus kılıfı erir (eğer telofazda oluşmuşsa) ve iğ iplikleri yeniden oluşur. Diğer tüm olaylar mitozun profaz ile aynıdır. • Gerçekte Mayoz II mitoza çok benzemektedir. • Metafaz II: Mitoza benzer şekilde kromozomlar ekvatör bölgesine sentromerleri birbirine zıt olacak şekilde sıralanır. • Anafaz II : Sentromerler ayrılır ve kromatitler (şimdi kromozomlar ) hücrenin zıt kutuplarına doğru çekilir. • Telofaz II: tamamıyla mitoz telofazının aynısıdır. Sitokinez ile hücreler ayrılır. • Mayoz sonunda haploit sayıda kromozom taşıyan 4 hücre oluşur !!!! MİTOZ ve MAYOZ ARASINDAKİ FARKLAR Mitoz ploidi düzeyi korurken mayoz yarıya indirir. Mayoz sadece çok hücreli organizmalrın bir kaç hücresinde oluşurken mitoz daha yaygındır. • Mitoz • Mayoz Mitoz Mayoz • Mitoz sonucu oluşan hücreler birbirinin tam olarak benzeri iken mayoz bölünme sonucunda hücreler genetik açıdan farklıdır. • Kromozomlar yavru hücrelere rasgele dağıldığından ve ayrıca aralarında krosingover oluştuğundan mayoz bölünme sonucu oluşan her gamet kendine özgü genetik yapı taşır. Mitoz ve mayoz arasındaki fark Gametogenez • • Germ hattı hücrelerinden (diploit, 2n) gamet oluşum sürecidir. Spermatogenez: gonat olarak bilinen özelleşmiş organlarda bitkilerde mitoz yoluyla hayvanlarda mayoz yoluyla sperm oluşum sürecidir. Bölünmeden sonra hücreler sperm hücrelerini oluşturmak üzere farklılaşma geçirir. • Oogenez: Ovaryum olarak bilinen özelleşmiş organlarda bitkilerde gametofitte mitoz yoluyla hayvanlarda mayoz yoluyla ovum (yumurta hücresi) oluşum sürecidir. • Spermatogenezde tüm 4 mayotik ürün gamet olarak gelişirken oogenezde sitoplazmanın çoğu tek büyük bir yumurta hücresi içinde yer alır, diğerleri gelişmez. Tüm sitoplazma ve organeller yumurta hücresinde toplanır. • İnsanlarda erkekler günde 200.000.000 sperm üretirken dişiler herbir menstural siklusta genellikle bir yumurta üretir • Spermatogenez: ergenlik döneminde başlar yaşam süresince devam eder ve her gün milyonlarca sperm üretimi yapılır. Sperm oluşunca olgunlaştıkları ve depolandıkları epididiymise hareket ederler. Oogenez • • • Ovaryum folikül hücrelerin dış tabakasıyla çevrelenmiş gelişmiş bir yumurtanın oluşacağı pek çok folikül içerir. Her bir yumurta primer oosit (yumurta hücresi) olarak oogeneze başlar. Bir dişi, doğumuyla bereber her biri Profaz I’de olan yaşam boyu yumurta deposunu taşır. Ergenlikten itibaren menapoza kadar toplam 400-500 bin yumurtadan genellikle bir tanesi gelişmiş yumurta (sekonder oosit) olarak her ay serbest duruma geçer. Oosit mayoz diploten aşamasında durdurulur ve bu bekleme süresinde oosit büyür. Oosit daha sonra, hormonal uyarı ile uyarılır, mayoza yeniden başlar ve ilk mayotik bölünmeyi küçük bir kutup cismi oluşturan asimetrik sitokinezle tamamlar. Çoğu omurgalı oositler döllenme anına kadar metafaz II’de tekrar durdurulur. Metafaz II’deki bir yumurtanın sitoplazması iki hücreli embroyonun bir hücresine mikroinjeksiyonla aktarıldı. Enjekte edilen hücre metafazda durdurulurken enjekte edilmeyen hücre bölünmeye devam etti. Metafaz II’deki yumurtanın sitoplazmasında bulunan bir faktör (sitositatik faktör) enjekte edildiği embriyo hücresinde metafaz aşamasındaki duraklmayı uyarıyordu. Somatik hücre klonlamsı (nukleus transferi) • Somatik hücre nukleusunun nukleusu çıkarılmış metafaz II oositine transferiyle somatik hücre vericisiyle aynı genetiğe sahip yeni bireylerin geliştirilmesi • Doku farklılaşması sırasında inaktive olan genlerin nukleusun yeniden programlanması ile tekrar aktive olması TOTİPOTENSİ durumu • Yüksek genetik özelliklere sahip çiftlik hayvanlarının çoğaltılması • Farmasötik ürünlerin üretimi için transgenik hayvanların üretimi • Soyu Tükenen hayvanların çoğaltılması • Gen fonksiyonunun çalışılması, genomun yeniden programlanması gelişimin düzenlenmesi genetik hastalıkların tedavisi ve gen terapi konularının çalışılması • 100 klonlanan emriyodan 0-10 gelişimini tamamlayabilmektedir. • Çalışmalar çok çeşitli faktörler denenerek optimizasyonu sağlama yönünde yapılmaktadır. Hücre siklusunun ve kontrolunun kopyalamadaki önemi • 1938 de Alman embriyolog Hans Spemann "fantastical experiment“ olarak adlandırdığı deneyde yumurta hücresinin nukleusunu çıkardı ve başka bir hücrenin nukleusunu yerleştirdi. Sonuç başarısızdı • 1952 de iki Amerika’lı bilim adamı, Robert Briggs ve T. J. King çok ince bir pipet yardımıyla kurbağa yumurtasından nukleusu uzaklaştırdılar ve nukleusu çıkarılmış yetişkin bir kurbağanın vücut hücresine koydular. Sonuç başarısızdı. • 1984’de Danimarka’lı embriyolog Steen Willadsen, erken embriyo hücrelerini kullanarak koyun klonlamayı başardı ve daha sonra domuz ve maymunlarla da aynı sonuçlar elde edildi. Hücre siklusunun ve kontrolunun kopyalamadaki önemi • Önceleri yapılan çalışmalar sadece hayvan embriyo hücrelerinin tüm bir organizmayı klonlamada etkili olduğunu gösteriyordu. Farklılaşmış hücrelerin nukleuslarını kullanarak klonlama yapmanın mümkün olmadığına karar verilmişti. • Hayvan hücre siklusu ile ilgili araştırmalar yapan İskoçyalı genetikçi Keith Campell çalışmalarıyla günümüzde bu sonucun değerini kaybetmesine neden olmuştur. • 1990’ların başlarında kanser araştırmalarıyla ilerleyen hücre siklusunun nasıl kontrol edildiğinin anlaşılması hücrelerin koşullar uygun olmadıkça bölünmediğini ortaya koymuştur. • Aynı çamaşır makinesinin sıkma fazına geçmeden önce suyun tamamen boşaldığını kontrol etmesi gibi hücreler de hücre bölünmesine geçmeden önce gerekli olan herşeyin kontrol altında olmasını isteyeceklerdir. • Campbell aynı nedenle yumurta ve verici nukleusun hücre sikluslarının aynı evrede olmaları gerektiğini düşündü. Hücre siklusunun ve kontrolunun kopyalamadaki önemi • Bu önemli nokta bu olayın anahtar aşamasıydı. • 1995 de Campbell ve üreme biyologu Ian Wilmut aç bırakılmış hücrelerden (böylece hücreleri G1 kontrol noktasında durdurarak) ilerlemiş embriyonik hücrelerden koyunu başarıyla klonladılar. • • Tek bir hücreden hızlı bir şekilde bölünerek embriyonun gelişimi ve farklılaşması sağlanır. Bu düşünce ile pek çok biyolog tarafından saç, barsak ve deri hücreleri gibi çok hızlı hücre siklusuna sahip hücrelerin nukleusunun embriyo gelişimde kullanılabileceği ortaya atıldı. • Pek çok kez denenen bu teori başarısızlıkla sonuçlandı. • Campell ve Wilmut gelişmiş bir koyunun meme bezi hücrelerinin nukleusunu VERİCİ nukleus olarak kullandılar. • Hücreler hücre kültürü ortamında önemli besin gereksinimleri bakımından aç bırakılarak büyümeleri ve dolayısıyla bölünmeleri durduruldu. Böylece dinlenme durumuna getirilerek hücre siklusu bakımından senkronize edildi. • İskoçyada yaygın olarak bulunan “Blackface” dişi koyununun yumurta hücresinden nukleus çok ince bir iğneyle çekildi. • “Fin Dorset” adı verilen başka bir tip koyunun meme hücrelerinden aynı yöntemle çekilen nukleus nukleusu çıkarılmış yumurta hücresi (“enucleated” hücre) içine yerleştirildi. • Çok kısa bir elektrik şokuyla sitoplazma ve nukleusun birleşmesi sağlandı. • Bu şok aynı zamanda hücreleri aktive etmek için tekrar bölünmeye başlamaları için de yardımcı olmaktadır. • Bu yeni hücreler “blackface” dişi koyunun çoğalma hattını oluşturacaktır. • Roslin enstitüsünden bilim insanları bu operasyonu 276 kez denediler. • Normal gelişim süreci olan 148 gün sonra Dolly’nin doğumu gerçekleşti. • Dolly normal sağlıklı görünüşlü bir “Fin Dorset “tipi koyundu. Dolly’nin “blackface” siyah yüzlü olmaması araştırıcıları doğru klon olup olmadığının Parmakizi yöntemiyle kontrol edilmesi şeklinde yönlendirdi. • Dolly’nin taşıyıcı anneyle değil nukleusunun alındığı annesiyle aynı DNA parmak izine sahip olduğu saptandı. • Yerleştirilen 29 embriyodan 13’ü uterusa tutunabildi. • Bu nedenle sadece bir embriyo gelişimini tamamlayabildi. Ve Dolly doğdu. • 1999 da yayınlanan raporda Dolly’nin hücrelerinin doğum yaşından daha yaşlı olduğu (verici hücre 6 yaşındaki bireyden alınmıştı) bildirildi. • Dolly doğumdan 6 sene sonra öldü Gerçek yaşı neydi? • Koyunların normal yaşam süreleri 12-15 yıldır. • Çalışmalar Dolly’nin hücrelerindeki telomerlerin aynı yaştaki normal bir koyunun telomerlerinden daha kısa olduğunu göstermiştir. • Telomerler herbir bölünmeden sonra kısalır. Birçok bölünmeden sonra kromozomlar kararsız uçlara sahip olur hücre bölünmeyi durdurur ve ölür. Sonuç olarak; • Son yıllarda yapılan çalışmalara göre verici hücrenin siklus fazı G0 veya G1 olmalı • Verici hücrenin tipi • Verici hücrenin yaşı önemlidir. Döllenme, metafaz II’den anafaz II’ye geçişi indükleyerek , oosit mayozunun tamamlanmasına ve ikinci kutup cisminin çıkışına yol açar. Sperm çekirdeğini yoğunluğunu kaybeder ve böylece döllenmiş yumurta (zigot) iki haploid nükleusa (dişi ve erkek pronükleus) sahip olur. Memelilerde iki pronükleus birbirine doğru hareket ederken DNA’larını kopyalarlar. Sonra dişi ve erkek kromozomları ortak bir iğ üzerine dizilir ve mitoz başlar. Mitozun ve sitokinezin taqmamlanmasıyla herbir hücrenin diploid genoma sahip lduğu iki hücreli embriyo oluşur. İn vitro fertilizasyon • In Vitro Fertilizasyon Embryo Transfer (IVF-ET) ilk kez 1978 de İngiltere’de Dr Edwards (Embriyolog) ve Dr. Steptoe (Jinekolog) tarafından yapılmıştır. • Teknik daha sonra embriyologlar ve fizikçiler tarafından geliştirilmiştir ve tüm dünyada 20 000 nin üzerinde tüp bebek doğmuştur. İn vitro fertilizasyonun aşamaları • a) Inducing and monitoring the development of eggs in the ovaries after the administration of fertility drugs. b) Collecting eggs from the ovaries. c) Collecting sperm from the husband. d) Combining the eggs and sperm together in the laboratory to facilitate fertilization and growth of early embryos. In appropriate cases, artificial fertilization using intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is employed. e) Transferring the embryos into the uterus. f) Supporting the initial growth of the embryos in the uterus with hormonal treatment. g) Freezing extra fertilized embryos for transfer in subsequent cycles should pregnancy not occur after the initial treatment.
