PAI-1 REAL TIME PCR KĐTĐ

PAI-1 REAL TIME PCR KĐTĐ
Kat. No: SNPPAI
GĐRĐŞ
SAKLAMA KOŞULLARI
PAI, pıhtılaşma mekanizmasında görevlidir. Plazminojen, aktivatörü sayesinde
•
Tüm bileşenler – 20°C de ve karanlıkta saklanmalıdır.
plazmine dönüşür, ortamdaki plazminojen aktivatörleri, inhibitörleri sayesinde
•
Tüm bileşenler, ürün kutusunun üzerinde belirtilen son kullanma tarihine
düzenlenir. Bu mekanizmada olabilecek bir mutasyon Koroner Arter hastalıklar
kadar kullanılabilir.
açısından önemlidir. En önemli mutasyonu promotor bölgedeki -675 de 4G/5G
•
Sürekli eritip çözdürmek, ürünün hassasiyetinde azalmalara neden olabilir.
insersiyon/delesyondur. Mutasyon, çoğunlukla, FV Leiden, Prothrombin, MTHFR
677 ve 1298 mutasyonları ile birlikte bakılır.
DNA ĐZOLASYONU
Örnekler steril, EDTA’lı (mor kapaklı) tüplere alınmalı, örnek alındıktan sonra
TEST SĐSTEMĐNĐN PRENSĐBĐ
kanın pıhtılaşmasına engel olmak amacı ile tüp hafifçe karıştırılmalıdır. Alınan kan
Test prensibi, Taq DNA polimerazın 5’-3’ exonuclease aktivitesine dayanmaktadır.
örnekleri izolasyon aşamasına kadar +4°C’de saklanmalı, kan örnekleri bir aydan
Probun 5’ ucunda bir reporter boya ve 3’ ucunda da bir quencer boya
fazla bir süre bekletilecek ise -20°C’de muhafaza edilmelidir.
bulunmaktadır. Quencer boya reporter boyanın ışımasını baskılamakta aynı
Sistemimiz, MN NucleoSpin®Blood kitine göre optimize edilmiştir. Đzolasyonun
zamanda da probun primer gibi davranarak uzamasına engel olmaktadır. PCR
son aşamasında, elde edilen DNA’ nın 150 µl elüsyon solüsyonu ile
esnasında enzim aktivitesi ile birlikte reporter ve quencer arasında bulunan prob
sulandırılması tavsiye edilmektedir.
parçalanarak ayrılır, baskılanmanın ortadan kalkmasıyla ışıma meydana gelir. Bu
işlem sadece hedef bölge üzerinde hibridize olmuş problarda gerçekleşir.
TEST PROSEDÜRÜ
Amplifikasyon miktarı arttıkça, reporter boyanın açığa çıkmasıyla birlikte ışıma
•
Mutasyonun 4G ve 5G master miksleri ayrı ayrı tüplerde hazırlanmalıdır.
doğrusal olarak artmakta ve bu artış cihaz tarafından eş-zamanlı olarak tespit
•
Bir örnek için, her optik kapaklı strip veya tüpe, 20,5 µl master miks ve
edilmektedir.
0,3 µl Hot Start Taq DNA Polimeraz kullanılır.
•
ÜRÜN ÖZELLĐKLERĐ
Daha sonra 4,5 µl (~10-100 ng) örnek DNA ‘sı her tüpe ayrı ayrı
konulur.
Her hasta için mutasyon bölgesine uygun, patenti alınmış 4G ve 5G olmak üzere
•
Hafifçe pipetlenerek karıştırılır ve aşağıda belirtilen programla çalıştırılır.
iki master miks çalışılır. Sistem patenti alınmış SNP analizinde kullanılan 5’
•
Birden fazla örnek için, Master miks ve Hot Start Taq çalışılacak örnek sayısı
nükleaz
PCR
için
özel
olarak
hazırlanmış
kullanıma
hazır
kimyasalları
ile çarpılmalı, gerekli miktarda 4G ve 5G master miks ilgili tüplere aktarılmalı
sağlamaktadır. Sistem, ilgili mutasyonlara uygun sekans spesifik primerler ve
ve gerekli miktarda Hot Start Taq DNA Polimeraz eklenmelidir. Taq DNA
prob için hazırlanmıştır.
Polimeraz’ ın her tüpe eşit dağılması amacı ile striplere dağıtmaya
Sistem iki farklı primer-prob seti içermektedir. Mutasyon analizleri için FAM
başlamadan önce pipetlenerek iyice karıştırılması gerekmektedir. Daha sonra
işaretli, sistemin doğru şekilde çalışıp çalışmadığını kontrol eden internal kontrol
striplere 20.5’ar µl master miks dağıtılır ve DNA lar ayrı ayrı konulur.
analizi için ise HEX/JOE boyası ile işaretli prob kullanılmaktadır.
PCR PROGRAMI
SĐSTEM ĐÇERĐĞĐ
Bileşen
•
PAI-1 4G PCR Master Miks
•
PAI-1 5G PCR Master Miks
•
Hot Start Taq DNA Polimeraz
•
Kontrol DNA
20 Test
430 µl
430 µl
25 µl
20 µl
95 °C
10 Dk.
95 °C
15 Saniye
60 °C
1 Dk.
32 Döngü
60 °C’de floresan boya olarak FAM ve HEX/JOE seçilmelidir.
Eğer;
•
ABI Prism® sistemi kullanıyorsanız, lütfen pasif referans olarak “none”
seçeneğini seçiniz.
•
Mx3000p/Mx3005p kullanıyorsanız,
seçiniz.
Bu sistemin çalışabileceği cihazlar;
ABI Prism ® 7000/7300/7500/7900
Mx3000P/Mx3005P
Smart Cycler II, iCyler iQ™4 / iQ™5
Roche LightCycler® 480 System
lütfen referans boya olarak “rox” u
ANALĐZ
PCR işlemi bittikten sonra, sonuçlarınızı FAM ve HEX/JOE boyasında analiz
edebilirsiniz. Aşağıdaki analiz resimleri ABI7500 cihazına aittir.
Đnternal Kontrol pikleri HEX/JOE boyası ile analiz edilmelidir. DNA eklenmiş tüm
kuyularda internal kontrol pikleri gözlenmelidir. CT değeri ise 22 ≤ ct ≤ 26
aralığında olmalıdır.
OLASI PROBLEMLER
Eğer internal kontrol çalışmıyorsa,
•
DNA eksikliği,
•
Hot start Taq DNA Polimeraz eksikliği veya yetersizliği,
•
Test’te inhibitör varlığı söz konusudur.
Eğer pikler geç başlıyorsa,
Öncelikle örneklerinizin piklerini pozitif kontrol DNA pikleri ile karşılaştırın. Eğer
pozitif kontrol DNA da bir sorun yoksa,
4G ve 5G değerlendirmesi FAM boyası ile analiz edilmelidir. Bu aşamada
cihazınıza
uygun
olarak
yapılması
gereken
analiz
ayarlar
•
Örneğinizin DNA’sı saf değildir veya az miktarda inhibitör içeriyor olabilir.
•
Yeterli miktarda DNA elde edememiş olabilirsiniz.
Daha fazla soru ve problem için, lütfen Ar - Ge bölümü ile temasa geçiniz.
hakkında
[email protected] adresinden bilgi alabilirsiniz. Bu boyada görülmesi gereken CT
UYARILAR
değer aralığı ise 21 ≤ ct ≤ 25 dir. Bu değer, kullanılan DNA konsantrasyonuna
•
Saklama koşullarına uygun olarak saklanmalıdır.
bağlı olarak 2-3 siklus öne veya arkaya kayabilmekle birlikte, güvenilir bir sonuç
•
Oda sıcaklığında unutulmuş PCR master miksleri kullanılmamalıdır.
için bu değerler arasında elde edilen pik değerleri kabul edilmektedir.
•
PCR master miksi oda sıcaklığında tamamen eritilip, baş aşağı edilerek
hafifçe karıştırıldıktan sonra tüplere bölünmelidir.
Aynı şekilde heterozigot bir örnek için 4G ve 5G piklerden elde edilen ct değerleri
arasında ki fark en fazla 3 siklus olmalıdır. Fark 7 siklustan fazla ise geriden
•
Master miksler tüplere bölündükten sonra Hot Start Taq DNA Polimeraz ve
DNA eklenerek hemen PCR işlemine geçilmelidir.
gelen pik ihmal edilbilmekte, fakat 4G ve 5G pikleri arasında ki ct değerinin 4 ≤
•
Belirtilenden fazla Hot Start Taq DNA Polimeraz koyulmamalıdır.
ct ≤7 olduğu durumlarda testin tekrar edilmesi önerilmektedir.
•
Yukarıda belirtilen PCR programı uygulanmalıdır.
•
PCR master miksleri vücut içinde kullanıma uygun değildir. Sadece belirtilen
türlerin tespitinde vücut dışı test kiti olarak kullanılır.
•
PCR master mikslerin raf ömrü 6 aydır. Kullanmadan önce üretim tarihine
dikkat edilmelidir.
Düzenlenme Tarihi: 12.03.2012