MTHFR 1298 REAL TIME PCR KĐTĐ

MTHFR 1298 REAL TIME PCR KĐTĐ
Kat. No: SNP1298
GĐRĐŞ
SAKLAMA KOŞULLARI
Metilen tetrahidrofolat reduktaz (MTHFR) homosistein metabolizmasında rol
•
Tüm bileşenler – 20°C de ve karanlıkta saklanmalıdır.
oynayan bir enzimdir. Bu enzimin aktivite eksikliği “hiperhomosistein” ve
•
Tüm bileşenler, ürün kutusunun üzerinde belirtilen son kullanma tarihine
“homosistinüri’ye sebep olmaktadır. Enzimi kodlayan genin 1298 pozisyonunda
kadar kullanılabilir.
yer alan tek nokta baz değişimi (A>C) glutamat alanine dönüşümüne neden
•
Sürekli eritip çözdürmek, ürünün hassasiyetinde azalmalara neden olabilir.
olarak MTHFR aktivitesini azaltmaktadır. C677T mutasyonu ile birlikte nöral tüp
defektlerinin önemli bir risk faktörüdür.
DNA ĐZOLASYONU
Örnekler steril, EDTA’lı (mor kapaklı) tüplere alınmalı, örnek alındıktan sonra
TEST SĐSTEMĐNĐN PRENSĐBĐ
kanın pıhtılaşmasına engel olmak amacı ile tüp hafifçe karıştırılmalıdır. Alınan kan
Test prensibi, Taq DNA polimerazın 5’-3’ exonuclease aktivitesine dayanmaktadır.
örnekleri izolasyon aşamasına kadar +4°C’de saklanmalı, kan örnekleri bir aydan
Probun 5’ ucunda bir reporter boya ve 3’ ucunda da bir quencer boya
fazla bir süre bekletilecek ise -20°C’de muhafaza edilmelidir.
bulunmaktadır. Quencer boya reporter boyanın ışımasını baskılamakta aynı
Sistemimiz, MN NucleoSpin®Blood kitine göre optimize edilmiştir. Đzolasyonun
zamanda da probun primer gibi davranarak uzamasına engel olmaktadır. PCR
son aşamasında, elde edilen DNA’ nın 150 µl elüsyon solüsyonu ile
esnasında enzim aktivitesi ile birlikte reporter ve quencer arasında bulunan prob
sulandırılması tavsiye edilmektedir.
parçalanarak ayrılır, baskılanmanın ortadan kalkmasıyla ışıma meydana gelir. Bu
işlem sadece hedef bölge üzerinde hibridize olmuş problarda gerçekleşir.
TEST PROSEDÜRÜ
Amplifikasyon miktarı arttıkça, reporter boyanın açığa çıkmasıyla birlikte ışıma
•
doğrusal olarak artmakta ve bu artış cihaz tarafından eş-zamanlı olarak tespit
Mutasyonun
normal
ve
mutant
master
miksleri
ayrı
ayrı
tüplerde
hazırlanmalıdır.
edilmektedir.
•
ÜRÜN ÖZELLĐKLERĐ
•
Bir örnek için, her optik kapaklı strip veya tüpe, 20,5 µl master miks ve
0,3 µl Hot Start Taq DNA Polimeraz kullanılır.
Her hasta için mutasyon bölgesine uygun, patenti alınmış Normal ve Mutant
Daha sonra 4,5 µl (~10-100 ng) örnek DNA ‘sı her tüpe ayrı ayrı
konulur.
olmak üzere iki master miks çalışılır. Sistem patenti alınmış SNP analizinde
•
Hafifçe pipetlenerek karıştırılır ve aşağıda belirtilen programla çalıştırılır.
kullanılan 5’ nükleaz PCR için özel olarak hazırlanmış kullanıma hazır kimyasalları
•
Birden fazla örnek için, Master miks, Hot Start Taq ve aktivatör çalışılacak
sağlamaktadır. Sistem, ilgili mutasyonlara uygun sekans spesifik primerler ve
örnek sayısı ile çarpılmalı, gerekli miktarda normal ve mutant master miks
prob için hazırlanmıştır.
ilgili tüplere aktarılmalı ve gerekli miktarda Hot Start Taq DNA Polimeraz
Sistem iki farklı primer-prob seti içermektedir. Mutasyon analizleri için FAM
eklenmelidir. Taq DNA Polimeraz’ ın her tüpe eşit dağılması amacı ile
işaretli, sistemin doğru şekilde çalışıp çalışmadığını kontrol eden internal kontrol
striplere dağıtmaya başlamadan önce pipetlenerek iyice karıştırılması
analizi için ise HEX/JOE boyası ile işaretli prob kullanılmaktadır.
gerekmektedir. Daha sonra striplere 20.5’ar µl master miks dağıtılır ve DNA
lar ayrı ayrı konulur.
SĐSTEM ĐÇERĐĞĐ
Bileşen
•
MTHFR 1298 Normal PCR Master Miks
•
MTHFR 1298 Mutant PCR Master Miks
•
Hot Start Taq DNA Polimeraz
•
Kontrol DNA
20 Test
430 µl
430 µl
25 µl
20 µl
PCR PROGRAMI
95 °C
10 Dk.
95 °C
15 Saniye
60 °C
1 Dk.
32 Döngü
60 °C’de floresan boya olarak FAM ve HEX/JOE seçilmelidir.
Eğer;
•
ABI Prism® sistemi kullanıyorsanız, lütfen pasif referans olarak “none”
seçeneğini seçiniz.
•
Mx3000p/Mx3005p kullanıyorsanız,
seçiniz.
Bu sistemin çalışabileceği cihazlar;
ABI Prism ® 7000/7300/7500/7900
Mx3000P/Mx3005P
Smart Cycler II, iCyler iQ™4 / iQ™5
Roche LightCycler® 480 System
lütfen referans boya olarak “rox” u
ANALĐZ
PCR işlemi bittikten sonra, sonuçlarınızı FAM ve HEX/JOE boyasında analiz
edebilirsiniz. Aşağıdaki analiz resimleri ABI7500 cihazına aittir.
Đnternal Kontrol pikleri HEX/JOE boyası ile analiz edilmelidir. DNA eklenmiş tüm
kuyularda internal kontrol pikleri gözlenmelidir. CT değeri ise 22 ≤ ct ≤ 26
aralığında olmalıdır.
OLASI PROBLEMLER
Eğer internal kontrol çalışmıyorsa,
•
DNA eksikliği,
•
Hot start Taq DNA Polimeraz eksikliği veya yetersizliği,
•
Test’te inhibitör varlığı söz konusudur.
Eğer pikler geç başlıyorsa,
Öncelikle örneklerinizin piklerini pozitif kontrol DNA pikleri ile karşılaştırın. Eğer
pozitif kontrol DNA da bir sorun yoksa,
•
Örneğinizin DNA’sı saf değildir veya az miktarda inhibitör içeriyor olabilir.
•
Yeterli miktarda DNA elde edememiş olabilirsiniz.
Daha fazla soru ve problem için, lütfen Ar - Ge bölümü ile temasa geçiniz.
Mutasyon değerlendirmesi FAM boyası ile analiz edilmelidir. Bu aşamada
cihazınıza
uygun
olarak
yapılması
gereken
analiz
ayarlar
hakkında
[email protected] adresinden bilgi alabilirsiniz. Bu boyada görülmesi gereken CT
değer aralığı ise 21 ≤ ct ≤ 25 dir. Bu değer, kullanılan DNA konsantrasyonuna
bağlı olarak 2-3 siklus öne veya arkaya kayabilmekle birlikte, güvenilir bir sonuç
için bu değerler arasında elde edilen pik değerleri kabul edilmektedir.
UYARILAR
•
Saklama koşullarına uygun olarak saklanmalıdır.
•
Oda sıcaklığında unutulmuş PCR master miksleri kullanılmamalıdır.
•
PCR master miksi oda sıcaklığında tamamen eritilip, baş aşağı edilerek
hafifçe karıştırıldıktan sonra tüplere bölünmelidir.
•
Master miksler tüplere bölündükten sonra Hot Start Taq DNA Polimeraz ve
DNA eklenerek hemen PCR işlemine geçilmelidir.
Aynı şekilde heterozigot bir örnek için normal ve mutant piklerden elde edilen ct
değerleri arasında ki fark en fazla 3 siklus olmalıdır. Fark 7 siklustan fazla ise
geriden gelen pik ihmal edilbilmekte, fakat normal ve mutant pikler arasında ki ct
değerinin 4 ≤ ct ≤7 olduğu durumlarda testin tekrar edilmesi önerilmektedir.
•
Belirtilenden fazla Hot Start Taq DNA Polimeraz koyulmamalıdır.
•
Yukarıda belirtilen PCR programı uygulanmalıdır.
•
PCR master miksleri vücut içinde kullanıma uygun değildir. Sadece belirtilen
türlerin tespitinde vücut dışı test kiti olarak kullanılır.
•
PCR master mikslerin raf ömrü 6 aydır. Kullanmadan önce üretim tarihine
dikkat edilmelidir.
Düzenlenme Tarihi: 12.03.2012