tnf alpha 1031 real tıme pcr kđtđ

TNF ALPHA 1031 REAL TIME PCR KĐTĐ
Kat. No: SNPTNF
GĐRĐŞ
SAKLAMA KOŞULLARI
TNF - Alfa molekülü, inflamatuar ve immün sistem aracılı cevapta önemli rol
•
Tüm bileşenler – 20°C de ve karanlıkta saklanmalıdır.
oynayan bir sitokindir. TNF - Alfa genindeki polimorfizmler, TNF üretimi ile ilişkili
•
Tüm bileşenler, ürün kutusunun üzerinde belirtilen son kullanma tarihine
bulunmuştur. Bu nedenle pek çok inflamatuar ve infeksiyöz hastalık ile
kadar kullanılabilir.
polimorfizmler arasında ilişkiler araştırılmaktadır. Genin 1031 lokalizasyonundaki
•
Sürekli eritip çözdürmek, ürünün hassasiyetinde azalmalara neden olabilir.
T/C değişimi de bu polimorfizmlerden birisidir ve sözkonusu rahatsızlıklarla
ilişkilendirilmektedir.
DNA ĐZOLASYONU
Örnekler steril, EDTA’lı (mor kapaklı) tüplere alınmalı, örnek alındıktan sonra
TEST SĐSTEMĐNĐN PRENSĐBĐ
kanın pıhtılaşmasına engel olmak amacı ile tüp hafifçe karıştırılmalıdır. Alınan kan
Test prensibi, Taq DNA polimerazın 5’-3’ exonuclease aktivitesine dayanmaktadır.
örnekleri izolasyon aşamasına kadar +4°C’de saklanmalı, kan örnekleri bir aydan
Probun 5’ ucunda bir reporter boya ve 3’ ucunda da bir quencer boya
fazla bir süre bekletilecek ise -20°C’de muhafaza edilmelidir.
bulunmaktadır. Quencer boya reporter boyanın ışımasını baskılamakta aynı
Sistemimiz, MN NucleoSpin®Blood kitine göre optimize edilmiştir. Đzolasyonun
zamanda da probun primer gibi davranarak uzamasına engel olmaktadır. PCR
son aşamasında, elde edilen DNA’ nın 150 µl elüsyon solüsyonu ile
esnasında enzim aktivitesi ile birlikte reporter ve quencer arasında bulunan prob
sulandırılması tavsiye edilmektedir.
parçalanarak ayrılır, baskılanmanın ortadan kalkmasıyla ışıma meydana gelir. Bu
işlem sadece hedef bölge üzerinde hibridize olmuş problarda gerçekleşir.
TEST PROSEDÜRÜ
Amplifikasyon miktarı arttıkça, reporter boyanın açığa çıkmasıyla birlikte ışıma
•
Mutasyonun T ve C master miksleri ayrı ayrı tüplerde hazırlanmalıdır.
doğrusal olarak artmakta ve bu artış cihaz tarafından eş-zamanlı olarak tespit
•
Bir örnek için, her optik kapaklı strip veya tüpe, 20,5 µl master miks ve
edilmektedir.
0,3 µl Hot Start Taq DNA Polimeraz kullanılır.
•
ÜRÜN ÖZELLĐKLERĐ
Daha sonra 4,5 µl (~10-100 ng) örnek DNA ‘sı her tüpe ayrı ayrı
konulur.
Her hasta için mutasyon bölgesine uygun, patenti alınmış T ve C olmak üzere iki
•
Hafifçe pipetlenerek karıştırılır ve aşağıda belirtilen programla çalıştırılır.
master miks çalışılır. Sistem patenti alınmış SNP analizinde kullanılan 5’ nükleaz
•
Birden fazla örnek için, Master miks ve Hot Start Taq çalışılacak örnek sayısı
PCR için özel olarak hazırlanmış kullanıma hazır kimyasalları sağlamaktadır.
ile çarpılmalı, gerekli miktarda T ve C master miks ilgili tüplere aktarılmalı ve
Sistem, ilgili mutasyonlara uygun sekans spesifik primerler ve prob için
gerekli miktarda Hot Start Taq DNA Polimeraz eklenmelidir. Taq DNA
hazırlanmıştır.
Polimeraz’ ın her tüpe eşit dağılması amacı ile striplere dağıtmaya
Sistem iki farklı primer-prob seti içermektedir. Mutasyon analizleri için FAM
başlamadan önce pipetlenerek iyice karıştırılması gerekmektedir. Daha sonra
işaretli, sistemin doğru şekilde çalışıp çalışmadığını kontrol eden internal kontrol
striplere 20.5’ar µl master miks dağıtılır ve DNA lar ayrı ayrı konulur.
analizi için ise HEX/JOE boyası ile işaretli prob kullanılmaktadır.
PCR PROGRAMI
SĐSTEM ĐÇERĐĞĐ
Bileşen
•
TNF-Alpha T PCR Master Miks
•
TNF-Alpha C PCR Master Miks
•
Hot Start Taq DNA Polimeraz
•
Kontrol DNA
95 °C
20 Test
430 µl
430 µl
25 µl
20 µl
10 Dk.
95 °C
15 Saniye
60 °C
1 Dk.
32 Döngü
60 °C’de floresan boya olarak FAM ve HEX/JOE seçilmelidir.
Eğer;
•
ABI Prism® sistemi kullanıyorsanız, lütfen pasif referans olarak “none”
seçeneğini seçiniz.
•
Mx3000p/Mx3005p kullanıyorsanız,
seçiniz.
Bu sistemin çalışabileceği cihazlar;
ABI Prism ® 7000/7300/7500/7900
Mx3000P/Mx3005P
Smart Cycler II, iCyler iQ™4 / iQ™5
Roche LightCycler® 480 System
lütfen referans boya olarak “rox” u
ANALĐZ
PCR işlemi bittikten sonra, sonuçlarınızı FAM ve HEX/JOE boyasında analiz
edebilirsiniz. Aşağıdaki analiz resimleri ABI7500 cihazına aittir.
Đnternal Kontrol pikleri HEX/JOE boyası ile analiz edilmelidir. DNA eklenmiş tüm
kuyularda internal kontrol pikleri gözlenmelidir. CT değeri ise 22 ≤ ct ≤ 26
aralığında olmalıdır.
OLASI PROBLEMLER
Eğer internal kontrol çalışmıyorsa,
•
DNA eksikliği,
•
Hot start Taq DNA Polimeraz eksikliği veya yetersizliği,
•
Test’te inhibitör varlığı söz konusudur.
Eğer pikler geç başlıyorsa,
Öncelikle örneklerinizin piklerini pozitif kontrol DNA pikleri ile karşılaştırın. Eğer
pozitif kontrol DNA da bir sorun yoksa,
T ve C değerlendirmesi FAM boyası ile analiz edilmelidir. Bu aşamada cihazınıza
•
Örneğinizin DNA’sı saf değildir veya az miktarda inhibitör içeriyor olabilir.
•
Yeterli miktarda DNA elde edememiş olabilirsiniz.
Daha fazla soru ve problem için, lütfen Ar - Ge bölümü ile temasa geçiniz.
uygun olarak yapılması gereken analiz ayarlar hakkında [email protected]
adresinden bilgi alabilirsiniz. Bu boyada görülmesi gereken CT değer aralığı ise
UYARILAR
21 ≤ ct ≤ 25 dir. Bu değer, kullanılan DNA konsantrasyonuna bağlı olarak 2-3
•
Saklama koşullarına uygun olarak saklanmalıdır.
siklus öne veya arkaya kayabilmekle birlikte, güvenilir bir sonuç için bu değerler
•
Oda sıcaklığında unutulmuş PCR master miksleri kullanılmamalıdır.
arasında elde edilen pik değerleri kabul edilmektedir.
•
PCR master miksi oda sıcaklığında tamamen eritilip, baş aşağı edilerek
hafifçe karıştırıldıktan sonra tüplere bölünmelidir.
Aynı şekilde heterozigot bir örnek için T ve C piklerden elde edilen ct değerleri
arasında ki fark en fazla 3 siklus olmalıdır. Fark 7 siklustan fazla ise geriden
•
Master miksler tüplere bölündükten sonra Hot Start Taq DNA Polimeraz ve
DNA eklenerek hemen PCR işlemine geçilmelidir.
gelen pik ihmal edilbilmekte, fakat T ve C pikleri arasında ki ct değerinin 4 ≤ ct
•
Belirtilenden fazla Hot Start Taq DNA Polimeraz koyulmamalıdır.
≤7 olduğu durumlarda testin tekrar edilmesi önerilmektedir.
•
Yukarıda belirtilen PCR programı uygulanmalıdır.
•
PCR master miksleri vücut içinde kullanıma uygun değildir. Sadece belirtilen
türlerin tespitinde vücut dışı test kiti olarak kullanılır.
•
PCR master mikslerin raf ömrü 6 aydır. Kullanmadan önce üretim tarihine
dikkat edilmelidir.
Düzenlenme Tarihi: 12.03.2012